Summary
Ribonucléotides sont parmi les plus abondantes nucléotides non-canoniques incorporés dans le génome au cours de la réplication de l’ADN nucléaire eucaryote. Si pas correctement supprimé, ribonucléotides peuvent provoquer de mutagenèse et dommages à l’ADN. Nous présentons ici deux approches expérimentales qui sont utilisés pour évaluer l’abondance de l’incorporation de ribonucléotide dans l’ADN et de ses effets mutagènes.
Abstract
La présence des ribonucléotides dans l’ADN nucléaire s’est avérée être une source d’instabilité génomique. La mesure de l’incorporation de ribonucléotide peut être évaluée par hydrolyse alcaline et électrophorèse sur gel que l’ARN est très sensible à l’hydrolyse en milieu basique. Ceci, en combinaison avec une analyse Southern peut servir à déterminer l’emplacement et le chapelet dans les ribonucléotides qui ont été incorporés. Toutefois, cette procédure est seulement semi-quantitative et peut-être pas assez sensible pour détecter de petits changements dans le contenu de ribonucléotide, bien que le volet spécifique Southern blot sonder améliore la sensibilité. Titre de l’un des plus frappants conséquences biologiques des ribonucléotides dans l’ADN, mutagenèse spontanée peut être analysée à l’aide d’un test de mutation vers l’avant. En utilisant les gènes appropriés, des mutations rares qui entraîne la perte de fonction peuvent être sélectionné et global et taux de mutation spécifique peuvent être mesurées en combinant les données des expériences de fluctuation avec le séquençage de l’ADN du gène rapporteur. L’essai de fluctuation est il y a lieu d’examiner un large éventail de processus mutagènes dans les antécédents génétiques spécifiques ou des conditions de croissance.
Introduction
Au cours de la réplication de l’ADN nucléaire eucaryote, ribonucléotides sont incorporées dans le génome de tous les trois principaux replicases de l’ADN, ADN polymérases (PPS) α, ε et δ1,2. Réparation par excision de RNase H2-dépendante ribonucléotide (RER3) supprime la plupart de ces ribonucléotides incorporés.
Un ribonucléotide dans l’ADN est sensible à l’hydrolyse, le 2' groupe hydroxyle de la portion de sucre peut attaquer la liaison phosphodiester adjacente, libérant une extrémité avec un 2' - 3' phosphate cyclique et l’autre avec une 5'-OH4. Conditions alcalines peuvent grandement accélérer cette réaction. Ainsi, l’hydrolyse des ribonucléotides embarqués durant l’incubation dans une solution basique provoque la fragmentation de l’ADN génomique, qui peut être visualisé par alcalin-agarose électrophorèse sur5. Cet ADN peut être transféré sur une membrane et sondé par Southern blot à l’aide des sondes de brin spécifiques qui permettent l’identification des sites alcali-sensibles causés par ribonucléotides incorporés dans le naissant conduisant ou en retard de développement-brin ADN, respectivement.
Dans les cellules de levure dépourvues d’activité RNase H2, enlèvement des ribonucléotides peut être lancée lorsque la topoisomérase I (Top1) pseudos l’ADN à la ribonucléotide incorporé6,7. Toutefois, lorsque Top1 s’attache sur le côté 3' de la ribonucléotide, cela génère 5'-OH et 2' - 3' phosphate cyclique ADN extrémités qui sont réfractaires aux RELIGACIÓN. Défaut de réparation ou transformation aberrante de ces « fins Sales » peut conduire à l’instabilité génomique. En outre, si l’incision survient dans une séquence d’ADN répétée, le processus de réparation peut conduire à des mutations de suppression. Ceci est particulièrement problématique pour les répétitions en tandem, où court destructions (d’entre deux et cinq paires de bases) sont couramment observés dans les cellules déficientes en RNase H2. Les effets délétères de Top1 dépendante, en l’absence de levure RNase H2 activité sont exacerbés dans un mutant ε ADN polymérase (pol2-M644G) promiscuous pour incorporation de ribonucléotide au cours de la synthèse du brin principal naissant.
Traitement des ribonucléotides ADN conduit à des mutations spontanées et ce mutagenèse peut être détectée en utilisant les gènes appropriés et en sélectionnant le changement phénotypique qui l’accompagne. Un test de fluctuation ou l’expérience de Luria et Delbrück est une des méthodes plus couramment utilisés pour mesurer le taux de mutation spontanée à l’aide de gènes de journaliste sélectionnable8,9. Chez les levures, les gènes URA3 et CAN1 peuvent servir de reporters dans un test de mutation directe, ce qui permet une détection de tous les types de mutations qui entraînent la perte de la fonction du gène. Le taux de mutation spontanée est estimé à la médiane de celle observée pour plusieurs cultures parallèles a commencé à partir des colonies individuelles sans mutations dans le gène rapporteur de cible. Une levure RNase H2-deficient souche tels que rnh201Δ a un taux modérément élevés de mutation spontanée dans l’ensemble qui est en grande partie dû à une incidence élevée de destructions bp 2-5 en tandem Répétez les séquences. Ainsi, pour caractériser complètement les effets mutagènes des ribonucléotides dans le génome, taux de mutations spécifiques doivent être déterminées. Dans ce cas, les gènes URA3 ou CAN1 peuvent être amplifiés et séquencés pour déterminer les types et les emplacements des mutations et des taux de mutation spécifique peuvent être calculées. Compilation des mutations identifiées chez plusieurs mutants URA3 ou CAN1 indépendants peut alors servir pour générer un spectre de mutation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. alcaline hydrolyse et Strand spécifiques Southern Blot (Figure 1)
- La croissance cellulaire et l’isolement d’ADN génomique
- Isoler l’ADN génomique de levure à l’aide d’une levure kit de purification d’ADN suivant les instructions du fabricant. Utilisez les cultures qui se trouvent dans la phase exponentielle de croissance entre (densité optique de 0,5) et 1. Resuspendre le culot d’ADN final dans 35 mL de 1 x tampon TE (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 1 mM).
- Ajouter 1 mL de 5 mg/mL RNase A dans l’ADN et incuber 30 min à 37 ° C.
- Précipiter l’ADN à l’aide de volumes 0,1 M 3 d’acétate de sodium (pH 5,2) et 2,5 volumes d’éthanol à 100 % pendant 20 minutes sur la glace.
- Centrifuger à 16 000 x g pendant 20 min à 4 ° C. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette.
- Laver le culot deux fois avec 500 mL d’éthanol à 70 %. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette.
- Sécher le culot sur banc et resuspendre dans 35 ml de 1 x tampon TE.
- Quantifier l’ADN à l’aide d’un fluorimètre (Table des matières) avec le dsDNA BR trousse.
- 5 mg de l’ADN de chaque échantillon à l’aide de volumes 0,1 d’acétate de sodium 3M, volumes de pH 5,2 et 2.5 de 100 % de précipiter EtOH pour un volume total de 200 mL (Ajouter H2O, si nécessaire, d’autres 5 mg d’ADN est requise si le contrôle de gel neutre est nécessaire). Incuber sur glace pendant 20 min.
- Centrifuger à 16 000 x g pendant 20 min à 4 ° C. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette.
- Sécher le culot sur le banc. Remettre en suspension l’ADN en 14 mL d’H2O.
- Électrophorèse de gel et hydrolyse alcaline
- Ajouter 6 mL de 1 M KOH et incuber à 55 ° C pendant 2 h.
- Incuber les échantillons sur la glace pendant 5 min.
- Ajouter 4 mL de 6 x tampon alcalin chargement d’ADN : 300 mM KOH, 6 mM EDTA, pH 8,0, 18 % polysucrose (Table des matières), 0,15 % vert de bromocrésol et 0,25 % de xylène cyanol FF.
- Monter un gel alcalin qui se compose de 1 % d’agarose, 50 mM NaOH, EDTA 1 mM, pH 8,0. Utilisez un peigne qui permet pour 24 mL de l’échantillon d’ADN d’être chargé par couloir.
- Exécutez le gel à température ambiante dans 1 x tampon d’électrophorèse alcaline : 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8,0. Inclure un marqueur de taille d’ADN approprié.
- Tournez en bas des tubes brièvement et charger l’échantillon entier 24 mL dans le gel d’agarose alcaline. ELECTROPHORESE pendant 30 min à 30 V, suivie de 18-20 h à 10V.
- Neutraliser le gel pour les 2 incubations de 45 min chacun, à température ambiante en agitant doucement dans le tampon de neutralisation I: 1 M Tris-HCl, 1,5 M de NaCl.
- Colorer l’ADN en trempant le gel neutralisé dans 200 mL d’eau contenant une dilution au 1/10 000 de SYBR Gold tache pendant 2 h à température ambiante avec agitant doucement.
- Visualiser l’ADN à l’aide d’un Transilluminateur UV. Alcali-sensibilité accrue provoque l’apparition de petits fragments d’ADN, ce qui indique une densité plus élevée des ribonucléotides non réparés à l’ADN5.
- Transfert du Sud
- Transfert de l’ADN du gel alcalin à la membrane en nylon chargé positivement par capillarité10. Un exemple de comment ce transfert peut être mis en place est prévu le Sambrook et Russell manuelle10.
- Faire tremper le gel alcalin pendant 15 min à température ambiante dans le tampon de transfert alcalin : 0,4 M NaOH, 1 M NaCl.
- Mouiller la membrane en nylon (coupée à la taille du gel) brièvement avec de l’eau et puis laissez tremper pendant 5 min dans un tampon de transfert alcaline.
- Mettre en place la plate-forme de transfert en retournant 3 béchers en verre (100 mL) dans un verre plat allant au four. Ce plat doit être légèrement supérieur à la taille du gel d’agarose. Mettre une plaque de verre au-dessus d’eux.
- Drapez 2 gros morceaux de papier pour chromatographie CHR 3 MM (coupé à la taille de la largeur du gel plus les bords les plus longs qui peuvent faire passer par-dessus les bords dans le réservoir tampon) sur la plaque de verre.
- Versez le tampon alcalin de transférer sur le papier pour chromatographie et moitié remplir le plat en verre. Adoucissez les bulles à l’aide d’une pipette de verre de 5 mL.
- Poser le gel d’agarose dessus, lisser à nouveau les bulles. Entourer toutes les arêtes du gel avec parafilm. Versez une petite quantité de tampon alcalin de transférer sur le gel.
- Placer la membrane en nylon préalablement trempé sur le dessus du gel. Adoucissez les bulles.
- Mouillée 2 morceaux de papier coupé à la taille du gel d’agarose. Les placer sur le dessus de la membrane et lisser toutes les bulles.
- Mettez une grande pile de serviettes en papier (coupe à une taille légèrement plus grande que le gel d’agarose) sur le dessus de la "sandwich" de transfert. Placer soigneusement une plaque de verre sur le dessus de l’essuie-tout. Ajoutez un objet pondéré en haut (un livre d’une masse de 400 g fonctionne bien).
- Laissez le transfert aller de l’avant une nuit à température ambiante.
- Soigneusement démonter la pile de transfert et tremper la membrane pendant 15 min à température ambiante dans la neutralisation tampon II : 0,5 M Tris-HCl, pH 7,2, 1 M NaCl.
- Crosslink l’ADN à la membrane en nylon chargé à l’aide d’une RETICULATION UV. Placer la membrane dans le court et utilisez le paramètre autocrosslink.
- Préparation de la sonde du Sud
Note : L’approche décrite ici pour détecter les sites alcali-sensibles dans l’attaque naissante-versus en retard-brin de brin d’ADN est basé sur un protocole publié précédemment11. Pour notre expérience, sonder est effectué au gène URA3 journaliste qui a été inséré dans l’un des deux orientations (ou 1 ou OR2) adjacentes à l’origine de réplication ARS306 sur le chromosome III (Figure 3 a). La présence de sites sensibles alcalins dans l’ADN génomique de levure est un indicateur de l’incorporation de ribonucléotide, permettant l’utilisation de ribonucléotides comme les biomarqueurs de l’ADN polymérase activité12,13,14. Cette approche, en utilisant une séquence d’ADN adjacente à l’origine de ARS306 efficace de réplication, de cible devrait être prête à d’autres sites génomiques et les gènes cibles aussi bien.- Segment de paires de PCR-amplifier un 520-base du gène URA3 reporter à l’aide de la paire d’amorces suivant : URA3-F1 (5´-GCTACATATAAGGAACGTGCTGC) et URA3-R1 (5´-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC).
- Effectuer la réaction de PCR à l’aide de 10-20 ng d’ADN génomique de la levure comme modèle, 4 μL de chaque amorce (stock de 10 μM), 10 μL de 10 x Ex le tampon Taq (Mg2 + plus), 8 μL de mélange dNTP (2,5 mM), 0,5 μL d’Ex Taq DNA polymérase (5 U/μl) et ajuster le volume final de 100 μL, avec H2O.
- Exécutez le programme PCR suivant : 95 ° C pendant 5 min ; 30 cycles de 95 ° C pendant 1 min, 55 ° C pendant 1 min, 72 ° C pendant 2 min ; 72 ° C pendant 10 min et maintenez à 4 ° C.
- Purifier le produit de la PCR à l’aide d’un kit de purification de PCR et éluer l’ADN à l’aide de 50 mL de H2O. Maintenant, cela peut être utilisé comme modèle dans la réaction radiolabeling.
- Utiliser les amorces suivants pour volet spécifique radiomarquage : utilisation URA3-A (5´-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC) pour visualiser l’ADN qui recuits à sonde A. Cela correspond à l’ADN de brin principal naissant lorsque URA3 est OR2 et le tnascent retard brin ADN URA3 est dans ou 1. Utilisez URA3-B (5´-CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG) pour visualiser l’ADN naissante qui recuits à sonde B. Cette opération correspond à l’ADN de brin principal naissant lorsque URA3 est ou 1 et en retard de développement naissant brin ADN lorsque URA3 OR2 (Figure 3).
- Effectuer la réaction radiolabeling à l’aide de 10-20 ng amplifié URA3 fragment en tant que modèle ADN, 2 μL d’apprêt (stock de 10 μM), 5 μL de 10 x Ex tampon Taq (Mg2 + plus), 4 μL des dNTPs 2,5 mM (moins dCTP), 5 μL (50 μCi) d’une -32P-dCTP , 0,5 μL d’ExTaq ADN polymérase (5 U/μl) et ajuster le volume final à 50 μL, avec H2O. Run programme de ce qui suit pour radiomarquage : 94 ° C pendant 5 min ; 25 cycles de 94 ° C pendant 1 min, 55 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 1 minute ; 72 ° C pendant 5 min et maintenez à 4 ° C.
- Utilisez une colonne G-25 pour supprimer le marqueur radioactif non constituées en société. Avant d’ajouter l’échantillon radioactif, centrifuger la colonne pendant 1 min à 720 x g et POURRETIRERLEPISTONPNEUMATIQUEETREMPL tampon de pipetage. Charger le produit de réaction radiomarquées et centrifuger pendant 2 min à 720 x g pour Éluer la sonde.
- Incuber à 95 ° C pendant 5 min dénaturer la sonde immédiatement avant l’hybridation. Cool brièvement sur la glace.
- Hybridation Southern
- Rouler la membrane mouillée dans un tube d’hybridation et ajouter 25 mL de tampon d’hybridation fraîchement préparé : tampon de phosphate de sodium 0,5 M, pH 7,2, 7 % dodécylsulfate de sodium (SDS), 1 % d’albumine sérique bovine (BSA). Incuber à 65 ° C pendant 1 à 2 h avec rotation dans un four à hybridation.
- Avec précaution, décanter la solution et ajouter 25 mL de tampon d’hybridation plus la sonde radiomarquée. Incuber à 65 ° C pendant 16-18 h avec rotation.
- Décanter la solution dans un conteneur de déchets radioactif. Effectuer 5 lavages de 5 min à température ambiante avec un tampon phosphate de sodium Phosphate-SDS lavage Solution i : 40 mM, pH 7,2, chacun 5 % pH de SDS, 0,5 % de BSA, 1 mM EDTA, 8.0.
- Effectuer 2 lavages de 15 min chacun, à 65 ° C avec la Solution de lavage Phosphate-SDS II : tampon de phosphate de sodium de 40 mM, pH 7,2, 1 % SDS, 1 mM EDTA, pH 8,0.
- Retirer la membrane du tube hybridation à l’aide de la pince à épiler et placer dans un protecteur de manchon en plastique ouvert. Couvrir et exposer à une plaque d’imagerie. Essayer un certain nombre d’expositions différentes périodes allant de 4 h à 4D.
- Si nécessaire, dépouillez et re-sonde la tache à l’aide d’une sonde différente environ 3 - 4 fois. Pour enlever, incuber la membrane pendant 2 h à 65 ° C dans 25 mL d’un 50 % formamide, 2 x SSPE solution.
Remarque : 20 x SSPE solution-mère : 3 M NaCl, 0,2 M NaH2PO4, EDTA de 0,02 M, pH 7,4. - Décanter la solution dans un conteneur de déchets radioactif. Effectuer 2 lavages de 15 min chacun, à 65 ° C en Solution de lavage Phosphate-SDS II.
- Vérifiez la membrane avec un compteur Geiger et répétez le protocole décapage si signal reste.
- Effectuer avant l’hybridation et l’hybridation comme décrit ci-dessus.
2. mesurer le taux de Mutation et de la spécificité dans les souches de S. cerevisiae
- Préparer la culture cellulaire
- Ensemencer une seule colonie (levure saine cellules prend 2 ou 3 jours à 30 ° C à la forme correcte en taille de colonies), cultivée sur gélose YPD avec l’adénine 100 mg/mL à 5 mL de bouillon YPDA additionné d’adénine de 250 mg/mL (lorsqu’il s’agit de l’adénine est nécessaire uniquement si la souche utilisée est un auxotrophe adénine). Grandir dans un incubateur shaker ou sur un rotateur à 30 ° C jusqu'à ce que la culture devient saturé (36-48 h pour une souche sans un défaut de croissance sévère).
- Tournez en bas les cellules à ~ 2000 x g pendant 5 min.
- Jeter le surnageant et laver les cellules avec 5 mL d’eau stérile.
- Remettre en suspension les cellules dans 500 mL d’eau stérile.
- Dilution de la culture cellulaire et placage
- Pour les contrôles de non sélection, diluer les cellules dans une plaque à 96 puits par un facteur de 1 600 000 et plaque 100 mL de chaque culture dans une assiette (COM) complete.
- Pour sélectionner des mutants ura3 , ensemencer 100 mL de cellules non dilués sur une plaque de 5-FOA pour une souche de type sauvage (WT). Diluer les cellules en conséquence si le taux de mutation de la souche d’intérêt devrait être plus élevé que chez une souche WT.
- Pour sélectionner des mutants can1 , diluer les cellules 5 fois et ensemencer 100 mL sur une plaque contenant canavanine (CAN) pour une souche WT. Le facteur de dilution est de 0,5.
- Incuber les plaques à 30 ° C jusqu'à ce que la forme de colonies de levures. Pour les souches sans un défaut de croissance, 2 ou 3 jours suffisent généralement pour COM et peut les plaques et 3-5 jours pour plaques 5-FOA. Pour comparer les taux de mutation entre les différentes souches, il est préférable de choisir le jour même de la croissance à dénombrer les colonies. Stocker les plaques prêtes à être comptées dans la chambre froide (~ 4 ° C).
- Calcul du taux de mutation spontanée
- Dénombrer les colonies visibles sur chaque plaque et prenez note du nombre de colonies
- Calculer le taux de mutation à l’aide de la formule de Drake : μ = f ÷ ln (μNt). f est la fréquence de mutation calculée par nombre de mutants divisé par le nombre de cellules dans la culture finale. NT est le nombre de cellules dans la culture finale et μ est le taux de mutation. Cette équation peut être résolue par une méthode itérative telle que la méthode de Newton-Raphson. Il existe d’autres méthodes d’estimateur, incluant le test de Lea et Coulson, pour calculer le taux de mutation15.
- Calculer l’intervalle de confiance en supposant distribution log-normale des taux utation d’isolats individuels. L’intervalle de confiance de 95 % est plus souvent utilisé.
- Analyse du spectre de mutation
- Prélever une colonie unique sur chaque 5-FOA ou peut sur plaque et rafraîchir sur une plaque YPDA.
- Effectuer la colonie PCR pour amplifier le gène URA3 ou CAN1 et séquence afin de détecter des mutations en utilisant les amorces suivants : URA3-F (5'-CGCATATGTGGTGTTGAAGAA-3') et URA3-R (5'-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3') pour les deux l’amplification par PCR et séquençage du gène URA3 bp 800 ; CAN1-F (5'-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3') et CAN1-R (5'-CAGAGTTCTTCAGACTTC-3') pour l’amplification et CAN1-AR (5'-TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3'), CAN1-9R (5'-CCTGCAACACCAGTGATA-3'), CAN1-10R (5'-GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3') et CAN1-BR ( 5'-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3') pour le séquençage du gène rapporteur 1800 bp CAN1 .
- Pour effectuer la PCR sur colonie, remettre en suspension une seule colonie en 5 μL de H2O et utiliser 1 μL comme modèle. Ajouter 1 μl de chacune des amorces (stock de 5 μM), 2 μL de tampon de x KAPA2G 5 (Mg2 + plus), 0,5 μL de dNTP (2,5 mM), 0,5 μL de KAPA2G Fast ADN polymérase, 12 μL de H2O.
- Pour l’amplification du gène URA3 , exécutez le programme PCR suivant : 95 ° C pendant 5 min ; 5 cycles de 95 ° C pendant 10 s, 61 ° C pendant 15 s, 72 ° C pendant 30 s ; 35 cycles de 95 ° C pendant 10 s, 61 ° C pendant 15 s, 72 ° C pendant 30 s ; 72 ° C pendant 2 min et maintenez à 4 ° C. Pour l’amplification du gène CAN1 , exécutez le programme PCR suivant : 95 ° C pendant 5 min ; 5 cycles de 95 ° C pendant 10 s, 61 ° C pendant 15 s, 72 ° C pendant 45 s ; 35 cycles de 95 ° C pendant 10 s, 61 ° C pendant 15 s, 72 ° C pendant 45 s ; 72 ° C pendant 2 min et maintenez à 4 ° C.
- Aligner les résultats de séquençage d’une séquence de référence en utilisant un programme tel que DNASTAR Seqman Pro ou Sequencher pour identifier les mutations.
- Compiler les données des mutations de type (Figure 4) de la mutation ou mutation emplacement (Figure 5). Calculer les taux de mutation spécifique par la fréquence d’une mutation (le nombre d’événements observés divisé par le nombre de mutants séquencé) multiplié par le taux de mutation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Traitement d’ADN génomique à l’alcali, suivi par électrophorèse sur gel alcalin permet une détection semi-quantitative de la fragmentation de l’ADN en raison de l’abondance des ribonucléotides stablement incorporés. La figure 2 montre les images de gel de levure ADN génomique traité avec ou sans KOH5. La variante M644L de Pol2, la sous-unité catalytique de la Polε, a réduit la capacité d’incorporer des ribonucléotides tandis que le mutant M644G renferme des ribonucléotides plus que la polymérase WT. Comme il est indiqué dans le protocole, le gel alcalin peut être encore sondé par analyse Southern brin spécifiques. Avec la connaissance de l’emplacement du site génomique sondé par rapport à ses origines adjacentes, nous pouvons sélectivement sonde ribonucléotides incorporés dans le naissant en avance ou brins. La figure 3 montre les résultats de Southern blot sonder le gène rapporteur URA3 inséré dans deux orientations opposées à proximité d’une origine de réplication précoce-tir, ARS30616. En utilisant menant des sondes spécifiques strand, nous observons que le patron de fragmentation d’ADN causées par l’alcali-clivage à ribonucléotides naissant premier brin ADN chez une souche WT en souches exprimant les variantes des polymérases α, δ et ε promiscuités pour incorporation de ribonucléotide.
À l’aide d’une expérience de fluctuation, nous pouvons mesurer les taux de mutation des souches de levures contenant des gènes rapporteurs. La figure 4 montre les taux de mutation à l' URA3 et CAN1 locus de souches exprimant la polymérase WT ou le mutant pol2-M644G avec ou sans fonctionnelle RNase H2. L’absence de RNase H2 provoque une augmentation modérée des taux de mutation globale dans les deux milieux. Toutefois, un examen plus attentif de la spécificité de la mutation révèle que chez les souches des lacunes RNase H2 (Figure 5), il y a une forte augmentation dans le taux de mutation des suppressions court, particulièrement dans les séquences répétées en tandem. Figure 5 a compare la spécificité de la mutation chez les souches201Δ WT et rnh et Figure 5 b affiche l’effet mutationnel des plus élevées de ribonucléotide incorporation dans le brin d’ADN leader naissant par Pol ε.
Figure 1 : protocole étapes impliquées dans la détection de brin spécifiques des sites sensibles alcali causée par l’incorporation de ribonucléotide dans l’ADN génomique de levure. Un aperçu des différentes étapes majeurs impliqués dans cette procédure, en commençant par l’isolement d’ADN génomique de levure et passant par l’analyse finale Southern blot. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : une image représentative des résultats obtenus par électrophorèse sur gel d’agarose-alcaline. Ce chiffre a été adapté de Nick McElhinny, S. A. et al. 5. levure ADN génomique des souches de différents génotypes a été traité avec KCl (neutre) ou KOH (alcaline) et ensuite séparés sur un gel d’agarose neutre ou alcalin. « EM » et « M644G » indiquent le statut de Pol ε. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Strand spécifiques détection de gel d’agarose-alcaline par Southern blot. Ce chiffre a été adapté de Williams, J. S. et al. 13. (A) les sondes radioactives recuisent pour le brin d’ADN leader naissant dans le gène rapporteur URA3 qui a été inséré près de ARS306 dans les deux orientations opposées (ou 1 et OR2). (B) les résultats représentatifs du transfert de Southern sert des sondes de brin spécifiques principaux naissantes. Affichées sont les résultats de sondage pour le brin principal naissant dans une souche avec WT ADN polymérases, ou le pol1-L868M, pol2-M644G ou le L612M-pol3 souches variantes avec ou sans RNase H2. POL1, POL2 et POL3 gènes codent des sous-unités catalytiques de Pols α, ε et δ, respectivement. Les variantes sont plus ubiquistes pour incorporation de ribonucléotide5,12,17. (C) la Quantification du signal radioactif par fraction du total dans chaque ruelle de (B). Les valeurs sont exprimées en pourcentage du total. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : taux de mutation spontanée chez les souches de levure. Ce chiffre a été adapté de Nick McElhinny, S. A. et al. 5. les gènes URA3 et CAN1 ont été utilisés dans l’essai de mutation directe pour mesurer le taux de mutation des souches indiquées. URA3 reporter est en « orientation 2 » (OR2, Figure 3 a). L’intervalle de confiance 95 % (IC) est inclus pour chaque mesure. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : spectre de Mutation du gène de journaliste URA3-OR2. Ce chiffre a été adapté des précédentes publications5,18,19,20. Le type de position et de la mutation observé dans chaque colonie 5-FOA-résistant indépendant sélectionné lors de l’essai de mutation directe sont représentés dans le 804 bp URA3 séquence codante. Lettres indiquent la base de substitutions, triangles ouverts indiquent des destructions de base unique, fermés triangles indiquent les insertions de base unique et traits pleins indiquent quelques destructions. (A) les spectres de Mutation chez les souches WT et rnh201Δ . Des étiquettes rouges au-dessus de la séquence sont des mutations observées chez WT tandis que les étiquettes bleus au-dessous de la séquence sont ceux observés chez une souche rnh201Δ . (B) les spectres de Mutation chez les souches pol2-M644G et pol2-M644G rnh201Δ . Des étiquettes rouges au-dessus de la séquence sont des mutations observées chez pol2-M644G tout en bleu ci-dessous la séquence pour les souches pol2-M644G rnh201Δ . S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nous décrivons ici les protocoles des deux séries d’expériences qui sont fréquemment utilisés pour analyser quantitativement semi ribonucléotides constituées au cours de la réplication de l’ADN et les effets mutagènes des ribonucléotides non réparés. Bien que ces approches impliquent l’eucaryote modèle S. cerevisiae, ces techniques peuvent être facilement adaptés à d’autres microbes et eucaryotes supérieurs même.
De détection des ribonucléotides non réparés dans l’ADN à l’aide d’alcaline-d’agarose couplé avec transfert de Southern fournit des informations importantes concernant le nombre de ribonucléotides présents et le brin dans lequel ils ont été incorporés. Cependant, il est important de noter qu’alcali-la sensibilité peut aussi être causée par d’autres lésions de l’ADN, tel qu’un site ABASIQUE. Un autre moyen de détection des ribonucléotides dans l’ADN est par le traitement avec l’enzyme RNase H2 purifié, comme a été fait dans les cellules de mammifères,21. Notre approche consiste à sonder pour les sites sensibles alcali naissant attaque contre brins dans le gène rapporteur URA3 utilisées dans nos expériences d’analyse mutationnelle du retard, mais il est possible de concevoir les sondes qui recuisent à d’autres endroits dans l’ordre pour obtenir des informations importantes au sujet de la densité de ribonucléotide sur d’autres sites génomiques. La partie de la tache méridionale de la procédure peut également servir de référence pour d’autres expériences de détection ADN génériques.
Mesure du taux de mutation à l’aide d’un test de Fluctuation a été largement utilisé pour l’analyse des divers événements mutagènes chez les micro-organismes et donc ne se limite pas à l’analyse des conséquences mutagènes des ribonucléotides dans l’ADN. Pour cette expérience, la multiplication des cultures indépendants peut améliorer considérablement la précision de mesure. On trouvera des colonies indépendantes par l’ensemencement d’une souche d’intérêt sur support YPDA ou par l’analyse des colonies de spores indépendants obtenus par la technique de la tache de levure diploïdes tétrade. Idéalement, l’utilisation de plusieurs souches de levure haploïde indépendant (e.g., de dissection de la tétrade) est encouragé à minimiser l’impact de la variation de la souche-à. Ceci est particulièrement important lorsque le taux de mutation spontanée est élevé ou lorsque la souche présente un défaut de croissance. Une méthode supplémentaire qui peut être utilisée pour mesurer spontanée du taux de mutation est une accumulation de mutations expérimenter22. Dans cette analyse, fréquence de mutation est déterminée pour les cellules après croissance extensive et peut être utilisé pour calculer le taux de mutation. Couplage d’une expérience d’accumulation de mutation avec la technologie de séquençage en profondeur a été démontré pour être un outil puissant pour analyser le taux de mutation et de la spécificité au sein du génome.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions tous les membres actuels et anciens Kunkel Lab pour leur travail et les discussions relatives au protocole et réutiliser les données présentées ici. Ce travail a été soutenu par projet Z01 ES065070 à T.A.K. de la Division de la recherche intra-muros des National Institutes of Health (NIH), National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| YPD media | 20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H2O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave. | ||
| COM plates | 1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H2O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 – 35 ml per plate. | ||
| CAN plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 56 °C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution. | ||
| 5-FOA plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 60 °C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution. | ||
| L-Canavanine sulfate | US Biological | C1050 | |
| 5-FOA | US Biological | F5050 | |
| 20 mL glass culture tube | Any brand | ||
| Culture rotator in 30 °C incubator | Shaker incubator can be used instead | ||
| 96 well round bottom plates | Sterile, any brand | ||
| 3 mm glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | Autoclave before use |
| 12-channel pipettes | Any brand | ||
| Ex Taq DNA Polymerase | TaKaRa | RR001 | |
| Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit | Epicenter | MPY80200 | |
| 3 M sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| 100% ethanol | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | Newer model available |
| dsDNA BR Assay kit | Invitrogen | Q32850 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Ficoll 400 | Dot Scientific Inc. | DSF10400 | |
| Bromocresol green | Eastman | 6356 | |
| Xylene cyanol FF | International Technologies Inc. | 72120 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.0) | Teknova | T5080 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | |
| UV transilluminator | |||
| Amersham Nylon membrane Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN303B | |
| 3 MM CHR Chromotography paper | Whatman | 3030-392 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| G-25 spin column | GE Healthcare | 27-5325-01 | |
| 1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2) | Sigma-Aldrich | NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390) |
|
| SDS | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671 | |
| Geiger counter |
References
- Joyce, C. M. Choosing the right sugar: how polymerases select a nucleotide substrate. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 94 (5), 1619-1622 (1997).
- Nick McElhinny, S. A., et al. Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (11), 4949-4954 (2010).
- Sparks, J. L., et al. RNase H2-initiated ribonucleotide excision repair. Molecular Cell. 47 (6), 980-986 (2012).
- Li, Y., Breaker, R. R. Kinetics of RNA Degradation by Specific Base Catalysis of Transesterification Involving the 2'-Hydroxyl Group. Journal of the American Chemical Society. 121 (23), 5364-5372 (1999).
- Nick McElhinny, S. A., et al. Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA. Nature Chemical Biology. 6 (10), 774-781 (2010).
- Williams, J. S., Kunkel, T. A. Ribonucleotides in DNA: origins, repair and consequences. DNA Repair (Amst). 19, 27-37 (2014).
- Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (6), 350-363 (2016).
- Jones, M. E., Thomas, S. M., Rogers, A. Luria-Delbruck fluctuation experiments: design and analysis. Genetics. 136 (3), 1209-1216 (1994).
- Zheng, Q. A new practical guide to the Luria-Delbruck protocol. Mutat Research. 781, 7-13 (2015).
- Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. The major roles of DNA polymerases epsilon and delta at the eukaryotic replication fork are evolutionarily conserved. PLoS Genetics. 7 (12), e1002407 (2011).
- Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. Ribonucleotides are signals for mismatch repair of leading-strand replication errors. Molecular Cell. 50 (3), 437-443 (2013).
- Williams, J. S., et al. Topoisomerase 1-mediated removal of ribonucleotides from nascent leading-strand DNA. Molecular Cell. 49 (5), 1010-1015 (2013).
- Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 185-191 (2015).
- Foster, P. L. Methods for determining spontaneous mutation rates. Methods Enzymology. 409, 195-213 (2006).
- Williams, J. S., et al. Evidence that processing of ribonucleotides in DNA by topoisomerase 1 is leading-strand specific. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (4), 291-297 (2015).
- Pavlov, Y. I., Shcherbakova, P. V., Kunkel, T. A. In vivo consequences of putative active site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta. Genetics. 159 (1), 47-64 (2001).
- Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).
- Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon. DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).
- Lujan, S. A., et al. Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity. PLoS Genetics. 8 (10), e1003016 (2012).
- Reijns, M. A., et al. Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development. Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).
- Lujan, S. A., et al. Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition. Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).
