Saat Gen ifadesinin etkisi moleküler desen patojen ilişkili değerlendirmek için fare Splenocytes kullanımı
Summary
Bu protokolü moleküler saat gen ekspresyonu alter patojen ilişkili moleküler desenleri bulmak için fare splenocytes kullanarak bir teknik anlatılmaktadır.
Abstract
Davranış-gen ekspresyonu sirkadiyen ritim fizyolojisi neredeyse tüm yönlerini düzenleyen. Burada, fare splenocytes moleküler desenleri (PAMPs) patojen ilişkili lipopolysaccharide (LPS), ODN1826 ve ısı öldürdü Listeria Monositogenez meydan ve moleküler üzerindeki etkileri sirkadiyen incelemek için bir metodoloji mevcut saat. Daha önce çalışmalar LPS etkisi a değişiklik-in vivo ve ex vivo yaklaşımlardan modelleri (Örneğin, fare, sıçan ve insan) bir ürün yelpazesine kullanarak moleküler saat inceleyerek üzerinde odaklanmıştır. Bu iletişim kuralı yalıtım ve saat gen ifade sonrası meydan kantitatif PCR ile değerlendirmek için meydan okuma splenocytes yanı sıra metodoloji açıklanmaktadır. Bu yaklaşım sadece etkisi mikrobiyal bileşenleri ifade saatin değiştirebilir moleküler saat diğer moleküller de ama değerlendirmek için kullanılabilir. Bu yaklaşım ayrı nasıl etkilediği PAMP Toll benzeri reseptör etkileşim saat ifade moleküler mekanizması kızdırmak için yararlanılabilir.
Introduction
Neredeyse tüm yönleri için 24 h salınımlarını fizyolojisi ve davranış orchestrates, ana saat memelilerde, suprachiasmatic çekirdek hipotalamus1,2içinde (SCN) yer alır. Bir organizma düzeyinde biyolojik süreçleri düzenleyen ek olarak, ana saatini de periferik hücresel saatler boyunca vücut3,4,5eşitler. En az üç birbirine translasyonel transkripsiyon geri besleme döngüleri moleküler saat makine oluşur ise, çekirdek dönemi (Per1-3), Cryptochrome (Cry1-2), Bmal1oluşur, ve saat genler6,7. Çekirdek moleküler saat doğru zamanlama sürdürmek, yanı sıra bazı yardımcı saat gen ürünleri (Örneğin, Rev erbα ve Dbp) da ifade olmayan genlerine düzenleyen, Yani, kontrollü genler (CCGs)6 saat , 7.
Fonksiyonel moleküler saatler çeşitli bağışıklık dokuları (Örneğin, dalak ve lenf bezleri)8 ve hücreleri (Örneğin, B hücreleri, dendritik hücreler, makrofajlar)8,9tarif edilmistir. Bu hücreler algılamak ve moleküler desenleri patojen ilişkili (PAMPs), doğuştan gelen bağışıklık tanıma reseptörleri Toll benzeri reseptörler (TLR)10gibi ile korunmuş mikrobiyal bileşenleri yanıt. Bugüne kadar 13 fonksiyonel TLRs, hangi bakteri hücre duvarı bileşenleri, kamçılı protein ve mikrobiyal nükleik asitler10gibi mikrobiyal bileşenleri tanımak tarif edilmistir. PAMP, lipopolysaccharide (LPS), gram-negatif bakteri TLR4 tarafından tanınan bir hücre duvarı bileşeni sirkadiyen ritim, organizma ve moleküler düzeyde değiştirmek için gösterilmiştir. Örneğin, LPS vivo içinde meydan etkinlik fareler11 tarafından ölçülen fotosentez benzeri faz gecikmeler indüklenen ve indirimli saat gen ekspresyonu SCN (sahne) ve in situ hibridizasyon ve kantitatif PCR ile belirlendiği gibi karaciğer yol açtı, sırasıyla, içinde12sıçanlar. Sonra bir vivo içinde sorun LPS ile qPCR ile ölçülen birkaç saat genlerin değişmiş ifade insan periferik kan lökosit13 ve deri altı yağ dokusu14 analizi ortaya koydu. Son olarak, insan makrofajlar ve fare peritoneal makrofajlar, ayrıca yol açtı ex vivo LPS sorunları qPCR14tarafından ölçülen saat ifade değiştirdi.
Burada, biz PAMPs LPS, (sentetik oligonucleotides içeren bazlar CpG motifler) ODN1826, etkisini değerlendirmek için bir protokol tanımlamak ve TLR4, TLR9 ve TLR2, tarafından tanınan ısı öldürdü Listeria Monositogenez (HKLM), sırasıyla, Moleküler saat Gen ifadesinin içinde fare splenocytes. Protokol fare splenektomi, splenocyte yalıtım ve meydan okuma, RNA ayıklama, cDNA sentezi ve qPCR birkaç saat genlerin ifade değerlendirmek için içerir. Bu iletişim kuralı çok az hayvan ile bağışıklık hücreleri çok sayıda zamanında edinimi için izin verir veya daha sonra olabilir hücresel manipülasyon ex vivo çeşitli PAMPs ile meydan. Moleküler saat bağışıklık yanıtı8,15,16, çeşitli açılardan modüle gösterilmiştir, bu nedenle, moleküler saat çalışmasının büyük olasılıkla uygun zamana bağımlı varyasyonu zarar bağışıklık yanıtı. Sirkadiyen ritim kesintileri ciddi patolojiler17,18,19,20‘ ye neden olabilir beri Ayrıca, araştırmacılar splenocytes geniş bir yelpazede meydan okumak için ilgi olabilir moleküller ve saat onların etkisi değerlendirmek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde, microvolume spektrofotometre ölçmek ve gen ekspresyonu belirlemede kullanılan RNA saflığı değerlendirmek için kullanılabilir. Nükleik asitler absorbe UV ışığı 260 nm, proteinler genellikle 280 ışığı absorbe bir RNA çıkarma işlemi (Örneğin, fenol) sırasında kullanılan diğer potansiyel kirletici 230 tespit olmakla birlikte nm, nm. Bu nedenle, absorbans (bir) oranında 260/280 değerlendirme tarafından nm (RNA protein) ve 260/230 nm (protein olmayan kirletici için RNA) …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser tarafından desteklenmiştir fakülte araştırma hibe Hartford Üniversitesi, üniversite Sanatlar ve Bilimler Dekan’ın ofisinden.
Materials
| Frosted slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Cell strainers | Fisher | 22363547 | |
| Lipopolysaccharide | InvivoGen | ltrl-eklps | |
| ODN1826 | InvivoGen | Tlrl-1826-1 | |
| HKLM | InvivoGen | Tlrl-hklm | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| PBS | Gibco | 20012-043 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 or 74106 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| 6-well cell culture plate | Denville | T1006 | |
| 50 ml tubes | Corning | 352070 | |
| 15 ml tubes | Corning | 352097 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| TaqMan Gene Expression Assays b-actin | ThermoFisher | Mm00607939_s1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Per2 | ThermoFisher | Mm00478113_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba | ThermoFisher | Mm00520708_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Bmal1 | ThermoFisher | Mm00500226_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Dbp | ThermoFisher | Mm00497539_m1 | |
| qPCR machine StepOnePlus | ThermoFisher | ||
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher | 4369016 | |
| MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 ml) | ThermoFisher | 4346907 | |
| Statistical Analysis Software | Prism 7.0a |
References
- Bell-Pedersen, D., et al. Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms. Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).
- Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals. Annu. Rev. Neurosci. 35, 445-462 (2012).
- Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U. A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93, 929-937 (1998).
- Yoo, S. -. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 5339-5346 (2004).
- Yamazaki, S. Resetting Central and Peripheral Circadian Oscillators in Transgenic Rats. Science. 288, 682-685 (2000).
- Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. Genetics of circadian rhythms in mammalian model organisms. Adv. Genet. 74, 175-230 (2011).
- Curtis, A. M., Bellet, M. M., Sassone-Corsi, P., O’Neill, L. A. J. Circadian Clock Proteins and Immunity. Immunity. 40, 178-186 (2014).
- Keller, M., et al. A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21407-21412 (2009).
- Silver, A. C., Arjona, A., Hughes, M. E., Nitabach, M. N., Fikrig, E. Circadian expression of clock genes in mouse macrophages, dendritic cells, and B cells. Brain. Behav. Immun. 26, 407-413 (2012).
- Kawai, T., Akira, S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity update on Toll-like receptors. Nat. Publ. Gr. 11, 373-384 (2010).
- Marpegán, L., Bekinschtein, T. A., Costas, M. A., Golombek, D. A. Circadian responses to endotoxin treatment in mice. J. Neuroimmunol. 160, 102-109 (2005).
- Okada, K., et al. Injection of LPS Causes Transient Suppression of Biological Clock Genes in Rats. J. Surg. Res. 145, 5-12 (2008).
- Haimovich, B., et al. In vivo endotoxin synchronizes and suppresses clock gene expression in human peripheral blood leukocytes. Crit. Care Med. 38, 751-758 (2010).
- Curtis, A. M., et al. Circadian control of innate immunity in macrophages by miR-155 targeting Bmal1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7231-7236 (2015).
- Silver, A. C., Arjona, A., Walker, W. E., Fikrig, E. The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity. Immunity. , (2012).
- Gibbs, J. E., et al. The nuclear receptor REV-ERB α mediates circadian regulation of innate immunity through selective regulation of inflammatory cytokines. PNAS. 109, 582-587 (2012).
- Zee, P. C., Attarian, H., Videnovic, A. Circadian rhythm abnormalities. Contin. Lifelong Learn. Neurol. 19, 132-147 (2013).
- Bovbjerg, D. H. Circadian disruption and cancer: sleep and immune regulation. Brain. Behav. Immun. 17, 48-50 (2003).
- Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat. Rev. Cancer. 3, 350-361 (2003).
- Germain, A., Kupfer, D. J. CIRCADIAN RHYTHM DISTURBANCES IN DEPRESSION. Hum. Psychopharmacol. 23, 571-585 (2008).
- . Basic Mouse Care and Maintenance. JoVE. , (2018).
- Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals : 2013 Edition. AVMA. , (2013).
- Silver, A. C. Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes. PLoS One. , 12-15 (2017).
- Silver, A. C., et al. Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells. Heliyon. , 00579 (2018).
