في هذا البروتوكول، ونحن نهدف إلى وصف أسلوب استنساخه للجمع بين فصل البشرية pluripotent الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا العصبية وأستروسيتيس معا في 3D المجال كوكولتوريس، الحفاظ على هذه المجالات في ظروف العائمة مجاناً، وفي وقت لاحق قياس نشاط الدائرة متشابك المجالات إيمونواناليسيس وتسجيلات مولتيليكترودي الصفيف.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
النمذجة سليكون متشابك مع 3D كوكولتوريس أستروسيتيس والخلايا العصبية من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
حاجزاً لفهم كيف مختلف أنواع الخلايا وإشارات تسهم في حلبة متشابك الدالة هو عدم وجود نماذج ذات الصلة لدراسة الدماغ البشري. التكنولوجيا الناشئة واحد للتصدي لهذه المشكلة هو استخدام الأبعاد (3D) الخلايا العصبية الثقافات الثلاث، ووصف 'أورجانويدس' أو 'الماغنيسيوم'، للحفاظ على المدى الطويل للتفاعلات بين الخلايا، بما في ذلك جزيئات الالتصاق خارج الخلية. ومع ذلك، هذه الأنظمة الثقافة مضيعة للوقت ولا يتم إنشاؤه بشكل منهجي. هنا، نحن بالتفصيل طريقة سرعة واستمرار إنتاج 3D كوكولتوريس من الخلايا العصبية وأستروسيتيس من البشر pluripotent الخلايا الجذعية. فصل astrocytes أولاً، قبل متمايزة وفروعه الخلايا العصبية وتحسب. بعد ذلك، يتم دمج الخلايا في مجال تشكيل الأطباق مع مثبط رو-كيناز وفي نسب معينة لإنتاج مجالات حجم استنساخه. بعد عدة أسابيع من الثقافة كمجالات عائمة، وأخيراً كوكولتوريس (الكويكبات) مقطوع ل immunostaining أو مطلي على صفائف مولتيليكترودي لقياس كثافة متشابك وقوتها. وبصفة عامة، فمن المتوقع أن هذا البروتوكول سوف تسفر عن المجالات العصبية 3D عرض علامات نوع الخلية الناضجة مقيدة، وتشكل نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية ومعرض نشاط الشبكة متشابك عفوية الاندفاع. معا، يسمح هذا النظام فحص المخدرات والتحقيقات في آليات للمرض في نموذج أكثر ملاءمة بالمقارنة مع ثقافات أحادي الطبقة.
المقدمة
أستروسيتيس نوع خلية الدبقية عالية وفيرة داخل الجهاز العصبي المركزي (CNS) مع مجموعة متنوعة من المسؤوليات الوظيفية خارج نطاق الدعم الهيكلي. من خلال إفراز العوامل سينابتوجينيك للذوبان ومكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM)، المعونة astrocytes في إنشاء وتجميع نهايات ناضجة خلال التنمية1. كما تلعب دوراً حاسما في الحفاظ على الصحة واللدونه من الاشتباكات العصبية إلى خارج الخلية إشارات2،3،،من45، والإسهام في تحقيق الاستقرار الطويل الأجل من التماثل الساكن البيئات التي تنظم البوتاسيوم خارج الخلية وغلوتامات، فضلا عن إفراز ركائز الطاقة ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-الخلية الثقافة وإعداد كاشف
ملاحظة: يتم كتابة البروتوكولات في هذا القسم بالترتيب الذي تظهر به في البروتوكول التمييز (المادة 2). انظر الجدول للمواد اللازمة للمواد وإعداد النشرة المصورة.
-
إعداد لوحات المغلفة للخلية والثقافة.
- تمييع الحل طلاء المصفوفة خارج الخلية (ECM) مع وسائط الإعلام DMEM/F12 لإعداد 1 ملغ/مل الحل الأسهم. الكوة ECM المخفف الأسهم الحل في أنابيب مخروطية الشكل 30 مل 3 كل وتخزينها مباشرة في-20 درجة مئوية. لإيجاد حل عملي، ريسوسبيند 3 مل أسهم ECM إلى 33 مل مبردة مسبقاً وسائل الإعلام DMEM/F12، يصل الحجم الإجمالي لمل 36 لتركيز 80 ميكروغرام/مل.
- معطف 1 مل كل من صفيحة ثقاف....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
عند تنفيذها بشكل صحيح، هذا البروتوكول سوف تنتج معرفة السكان من كوكولتوريس الفنية أستروسيتيس28،،من3334 والخلايا العصبية35 المتولدة من هبسكس (الشكل 1A-1C)، كما مفصلة قبل26 والموصوفة هنا في الخطوات 2.1-2.2. هذا الإجراء التدريجي، مع استخدام لوحات ميكروويل، ومن المتوقع أن تسفر عن المجالات العصبية 3D حجم ثابت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا البروتوكول، يمكننا وصف أسلوب منهجي لإنتاج 3D مجالات كوكولتوريس العصبية. المجالات تتألف من أستروسيتيس، والخلايا العصبية، مستمدة بشكل مستقل من هبسكس. على الرغم من عدم تركيز هذا البروتوكول، توليد نقية السكان astrocytes من هبسكس28 خطوة بالغة الأهمية ويمكن أن يكون تحديا تقنيا إذا كان أداؤها دون خبرة سابقة. يجب إجراء هذه الخطوة الأولى في توليد هذه رقائق متشابك مع التوقيت الدقيق والاهتمام بالتفاصيل. حد من استخدام astrocytes المستمدة من هبسك هو عملية التمايز مطولة؛ ومع ذلك، استخدام إنتاج كميات كبير.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
ونود أن نشكر الدكتور إريك أليان (UCSF) للمدخلات الفكرية في تصميم هذه الإجراءات، الدكتور مايكل وارد (المعاهد الوطنية للصحة) للمشورة التقنية بشأن المفاضلة إينيورون، و "سابا برلاس" لتحليل الصورة الأولية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 6 ألواح جيدة | فيشر ساينتفيك | 08-772-1B | |
| 15 مل أنابيب مخروطية | أوليمبوس بلاستيك | 28-101 | |
| Accutase | Sigma | A6964-100ML | حل انفصال |
| AggreWell Stem | Cell Technologies | 34850 | |
| محلول شطف مضاد للالتصاق | تقنيات الخلايا الجذعية | 7010 | منع الخلية الالتصاق بألواح microwell مضاد |
| / مضاد | للرصيد الحراري | 15240062 | |
| B27 | Thermofisher | 17504044 | Media |
| Supplement BrainPhys العصبية المتوسطة | تقنيات الخلايا الجذعية | 5790 | الفيزيولوجية العصبية البديلة المتوسطة |
| الوسيطة أغطية زجاجية دائرية | Neuvitro | GG-12-oz | |
| Cryostor CS10 | Stemcell Technologies | 7930 | وسيط الحفظ بالتبريد مع 10٪ DMSO |
| DMEM / F12 | Thermofisher | 10565-042 | مع مكمل GlutaMAX |
| DMH-1 | تقنيات الخلايا الجذعية | 73634 | خطر: سام إذا ابتلع. تركيز العمل: 2 مو ؛ مصل M |
| Donkey | Lampire Biological Laboratories | 7332100 | تركيز العمل: 5٪ في مخزن المانع الأولي ، 1٪ في المخزن المؤقت الثانوي |
| Doxycycline Hydrochloride (Dox) | Sigma | D3072-1ml | HAZARD: سام للنساء الحوامل. تركيز العمل: 2 مو ؛ جم / مل |
| عامل نمو البشرة (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | تركيز العمل: 10 نانوغرام / مل |
| عامل نمو الخلايا الليفية -2 (FGF) | Peprotech | 100-18B | تركيز العمل: 10 نانوغرام / مل |
| محلول تركيب Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| شرائح زجاجية | Fisherbrand | 22-037-246 | |
| مصل | الماعزمختبرات لامبير البيولوجية | 7332500 | تركيز العمل: 5٪ في المخزن المؤقت للحجب الأولي ، 1٪ في مقياس الدم العازلة للحجب الثانوي |
| أو عداد الخلايا الأوتوماتيكي | تقنيات الحياة | AMQAX1000 | |
| Heparin | Sigma | H3149-50KU | تركيز العمل: 2 مجم / مل |
| لوحة مغناطيسية | DLAB | 8030170200 | |
| مصفوفة | غشاء Matrigelحل طلاء Corning | 354230 | ECM. تركيز العمل: 80 مو ؛ جم / مل. استعد على الثلج وتأكد من تبريد الماصات والأنابيب والوسائط مسبقا. |
| MEA 2100 | نظام أنظمة متعددة القنوات | MEA2100 | |
| حل | |||
| N2 | Thermofisher | 17502048 | Media |
| Supplement OCT | Tissue-Tek | 4583 | حل تضمين الأنسجة لتقطيع عنق الرحم بالتبريد |
| (Aqua Hold) | مختبر الأجهزة العلمية | 9804-02 | |
| بارافورمالدهايد ( PFA) | Acros Organics | 169650025 | خطر: سامة إذا تم استنشاقها. تركيز العمل: 4٪ في محلول |
| ملحي مخزن بالفوسفات PBS (PBS) | تقنيات الخلايا الجذعية | CA008-300 | |
| بولي ل أورنيثين (PLO) | سيجما | P3655-100 | مجم تركيز العمل: 0.5 مجم / مل |
| زلات غطاء زجاجي مستطيل | Fisherfinest Premium Superslip | 12-545-88 | |
| ReLeSR | Stemcell Technologies | 5872 | الانفصال والمرور كاشف |
| Rho-Kinase Inhibor Y27632- (Y) | Tocris | 1254 | تركيز العمل: 10 ميكرومتر |
| SB431542 | تقنيات الخلايا الجذعية | 72234 | تركيز العمل: 2 و mu ؛ قوارير M |
| Spinner | فيشر Scientific | 4500-125 | |
| السكروز | فيشر الكيميائية | S5-3 | تركيز العمل: 20٪ أو 30٪ في قارورة ثقافة PBS |
| T25 | Olympus Plastics | 25-207 | أغطية ذات تهوية |
| T75 قارورة ثقافة | أوليمبوس بلاستيك | 25-209 | أغطية تهوية |
| Terg-A-zyme | Sigma | Z273287-1EA | Detergent. تركيز العمل: 1٪ |
| TeSR-E8 متوسطة القاعدية | تقنيات الخلايا الجذعية | 5940 | مكملات الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) |
| متوسطة TeSR-E8 | تقنيات الخلايا الجذعية | 5940 | مكملات للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات وسط |
| TritonX-100 | Sigma | X100-500ML | منظف لنفاذية الخلايا. تركيز العمل: 0.25٪ في حجب العازلة |
| Trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| antibodies< / strong> | |||
| AlexaFluor 488 | Thermofisher | A-11029 | الجسم المضاد الثانوي |
| AlexaFluor 594 | Thermofisher | A-11037 | الجسم المضاد الثانوي |
| Ezrin | Thermofisher | MA5-13862 | الجسم المضاد الأولي؛ الخلايا النجمية حول المشبكي |
| GFAP | Chemicon | MAB360 | الجسم المضاد الأولي؛ الخلايا النجمية |
| GFP | Aves | GFP-1020 | الجسم المضاد الأساسي؛ الخلايا النجمية |
| Glt1 | هدية من الدكتور جيفري روثستين | غير | المضاد الأولي؛ الخلايا النجمية |
| هومر | أنظمة المشبكية | 160 011 | الجسم المضاد الأولي؛ الخلايا العصبية، ما بعد التشابك |
| MAP2 | Synaptic | Systems 188 004 | الجسم المضاد الأساسي؛ الخلايا العصبية |
| PSD95 | Abcam | ab2723 | الجسم المضاد الأساسي؛ الخلايا العصبية، ما بعد التشابك |
| S100 | Abcam | ab868 | الجسم المضاد الأولي؛ الخلايا النجمية |
| Synapsin 1 | Synaptic Systems | 106 103 | الجسم المضاد الأساسي؛ الخلايا العصبية، ما قبل التشابك |
| TuJ1/&beta؛ 3-توبولين (TUBB3) | Covance | MMS-435P | الجسم المضاد الأساسي. الخلايا العصبية |
المراجع
- Ullian, E. M., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Role for Glia in Synaptogenesis. Glia. 47, 209-216 (2004).
- Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
- Molofsky, A. V., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
