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Developmental Biology

ひと多能性幹細胞からのニューロンとアストロ サイトの三次元共培養系によるシナプス局所回路におけるモデリング

Published: August 16, 2018 doi: 10.3791/58034
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Neuroregeneration, Department of Neurosurgery, Houston Methodist Research Institute

Summary

このプロトコルの結合解離ひと多能性幹細胞由来神経細胞の再現性のある手法を目指して、アストロ サイト 3 D に一緒に球共培養系、これら球無料浮動小数点条件とその後の維持免疫分析によって行い電極の録音と球のシナプス回路活性を測定します。

Abstract

シナプス回路機能に貢献するさまざまなセルタイプおよび信号の私達の理解への障壁は、人間の脳の研究に関連するモデルの欠如です。この問題に対処する 1 つの新興技術、'organoids' または '楕円'、細胞接着分子を含む細胞間相互作用の長期保全のためと呼ばれる 3 つの次元 (3 D) 神経細胞文化の使用であります。ただし、これらの文化のシステムは時間がかかり、体系的に生成されません。ここでは、我々 は急速にかつ一貫して神経細胞の三次元共培養系を生成する方法を詳しく説明、アストロ サイトひと多能性幹細胞。まず、あらかじめ差別化アストロ サイトと神経前駆細胞は解離し、カウントされます。球の形成にセルを結合する次に、Rho キナーゼ阻害剤と再現可能なサイズの球を生成する特定の比率の料理。浮球として文化の数週間後共培養系 (「小惑星」)、最後に染色の断面またはシナプス密度と強度を測定する多配列にメッキ。一般に、このプロトコルが制限されて成熟細胞型マーカーを表示機能性シナプスを形成、自発的なシナプス ネットワーク バースト活動の展示、3 D 神経球をもたらすことが期待されます。一緒に、このシステムは、単層培養と比較してより適切なモデルの薬剤のスクリーニングおよび病気のメカニズムへの調査を許可します。

Introduction

アストロ サイトは、さまざまな構造サポートを超える機能責任中枢神経系 (CNS) の中で非常に豊富なグリア細胞型。確立および開発1の中に成熟したシナプスのクラスタ リングによるシナプス形成可溶性因子と細胞外マトリックス (ECM) の分泌をアストロ サイトを支援します。彼らはまたから細胞外シグナル伝達2,3,4、5シナプスの可塑性、健康を維持するために重要な役割を果たすし、恒常性の長期的な安定性に貢献細胞外カリウム、グルタミン酸とエネルギー基質および ATP6,7,8の分泌を調節することによって環境。最後に、彼らは櫛谷電流9に影響を与える神経伝達に貢献できる、髄鞘化10の推進など他のセルタイプを通じた活動に直接に影響を与えることができます。重要なは、異常やアストロ サイトの機能不全は、多くの神経発達症候群や成人神経につながることができます、ので、改良するために設計された神経回路網内のニューロンとアストロ サイトを含めるには明白な必要性内因性の脳環境のモデル。アストロ サイトの不可欠な特性は、神経シナプス1,11,12フォーム動的相互作用する能力です。グリア細胞がない場合は、ニューロンは、シナプスは、一般的にも不足機能成熟度13の限られた数を形成します。

人間のアストロ サイト、転写、形態学的および機能的特性を表示-増加のサイズと、分岐として種特異的な遺伝子の複雑さなど-ことがない齧歯動物12,14で締めくくっています。 15。その結果、ひと多能性幹細胞 (hPSC) を利用した研究-派生神経細胞文化パラダイム16 や傷害モデル、新規治療法を開発しながら培養中枢神経系疾患を調べる手段として広くなるが ,17。さらに、hPSCs は、人間のシナプス形成と一次組織18,19を必要とせず関数の研究を許可します。

シナプス回路機能に貢献するさまざまなセルタイプおよび信号の理解にバリアは、人間の脳の関連モデルの欠如です。そのシナプス ネットワーク高再現性と再現性を要約する適切なプラットフォームの必要性があります。3次元培養システムの生産に関心が最近、浮上している ('organoids、' として広く知られている「回転楕円体、' または 'ミニ脳') 携帯とマクロのレベルで構造の複雑な三次元 (3 D) をモデル化する20 。3次元培養システムは、典型的な 2D 共パラダイム21,22の中には通常不在か限られた ECM と細胞間の相互作用を保持します。テクニックの豊富さは 3 D 神経スフェロイド23,24,25; を養殖、します。しかし、多くは長い培養期間を必要とする (月への年) 自発的な開発とレイヤー保存、ユーザーと出展出力を非常に小さな制御。

ここでは、急速に体系的な方法を示すし、一貫して複数の細胞のタイプ (前分化ニューロンとアストロ サイト) 間強酸細胞間相互作用に由来する hPSCs 球共培養系 (「小惑星')26 に細胞を組み立てることによって3 D で人間固有の形態学的複雑さを要約します。この高密度の神経システムは、時間をかけて成熟したプロパティとすることができます上映または高スループット方法で試金される均等に分散ニューラル サブタイプを生成します。初めて人間のアストロ サイトがこれらの三次元共培養系におけるシナプス ネットワーク バースト活動を誘発することを示す.さらに、このプロトコルは、中枢神経系の地域別の id に指定されたセルを利用して必要に応じて他の複数の細胞型の相互作用を研究する、異なるサイズの球体を生成に容易に適応。

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Protocol

1. 細胞培養と試薬の準備

注: このセクションのプロトコルは、分化プロトコル (セクション 2) の順番で記述されます。材料のカタログ番号材料表を参照してください。

  1. 細胞培養のコーティング プレートを準備します。
    1. 1 mg/mL の原液を準備する DMEM/F12 メディアで細胞外マトリックス (ECM) コーティング液を希釈します。分注希釈 ECM 貯蔵液 3 mL の 30 の円錐管におよびすぐに-20 ° C で保存実用的なソリューションは、33 mL 中古冷蔵 DMEM/F12 メディア、80 μ g/mL の濃度の 36 mL に合計ボリュームをもたらすに ECM 株式の 3 mL を再懸濁します。
    2. 作業の ECM ソリューションと 6 も細胞培養プレートのウェルあたり 1 mL をコートします。井戸の表面が完全に覆われていることを確認する (必要に応じて) ウェルあたりの追加 1 mL DMEM/f12 キーを追加します。コーティングの 6 も細胞培養皿を使用する前に、少なくとも 1 時間室温で放置を許可します。
      注: コーティング プレート、または格納されます、インキュベーターで 4 ° C で 2 週間。
  2. メディア製剤、成長因子および小さい分子を準備します。
    1. ひと多能性幹細胞 (hPSC) の中の27の 500 mL を準備するには、20 x とメーカーの指示に従って 500 x サプリメントを追加します。
    2. ニューラル媒体 (NM) の 500 の mL を準備するには、以前詳細28として最終濃度 2 mg/mL、抗生物質/抗真菌ソリューション、1 つ x B27 の補足または L-グルタミンのサプリメントで DMEM/F12 の 500 mL ボトルを 1 つ x N2 の補足の 1 x にヘパリンを追加します。
    3. 10 mM を準備する (1、000 x) 貯蔵液の Rho キナーゼ阻害剤 Y27632 (Y)、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 3 mL に粉の 10 mg を追加。フィルター、因数を殺菌し、-20 ° C で保存メディアで 10 μ M 使用濃度で使用します。
    4. 20 mM を準備する (10, 000 x) SB431542 のソリューションを株式、ジメチルスルホキシド (DMSO) の 1.3 mL に粉の 10 mg を追加。2 mM を準備する (1、000 x) DMH1 のソリューションを株式、DMSO の 13.1 mL に粉の 10 mg を追加。フィルター、因数を殺菌し、-20 ° C で各ソリューションを格納メディア (NM + SB431542 + DMH1) で各 2 μ M 作業濃度を使用します。
      注: このプロトコルは、両方の SB431542 の 2 μ M 作業濃度をお勧めします、29この濃度が hPSCs からの神経誘導を効果的に促進することを示す私たちの観察と他のユーザーからの報告に基づいて DMH1。高い濃度はまた報告された30をされています。さらに、代替メディアとそれまた示されている小さい分子は高いニューラル変換31の必要ないこと。したがって、作業濃度は、代替セル文化環境によって異なります、至適濃度は、個々 の研究者によってテスト必要があります。
    5. 個々 の 100 μ g/mL を準備する (10, 000 x) 上皮成長因子 (EGF)、繊維芽細胞成長因子 2 (FGF2) の原液 10 mL の PBS + 0.1 %bsa にそれぞれ 1 mg を追加。因数の EGF と FGF2 50 μ 因数にソリューションを株式-80 ° C で保存各メディアで 10 ng/mL 使用濃度で使用例えば、5 μ L EGF と 5 μ L を追加 FGF2 海里 (NM + EGF + FGF2) 50 mL に。
    6. ドキシサイクリン塩酸塩 (Dox) のストック溶液を準備するには、最初を 100 mg/mL の DMSO の粉末を溶解し、-20 ° C で保存さらに 2 mg/mL に希釈 (1、000 x) PBS、-20 ° C でストアにソリューションを株式媒体を 2 μ G/ml 使用濃度で使用します。例えば、50 μ L を追加 NM (海里 + Dox) 50 mL に Dox。
      注: が、融解後のソリューションを再に凍結しないでください。

2. ひと誘導多能性細胞 (hPSCs) から神経のサブタイプの世代

注: すべての細胞培養は、37 ° C で 5% CO2インキュベーターで維持されるべきこれらの文化より低いレベルに利用されるかもしれないにもかかわらず部屋の酸素濃度に保たれます。

  1. 生成し、hPSCs からアストロ サイト前駆細胞 (hAstros) を維持します。
    注: このセクションは、簡潔かつ簡単分化プロトコルを提供します。詳細については (胚様体形成、ロゼット選択地域パターン形成手順と) 上記プロトコル28 (図 1 a、緑色のボックスの点線) を参照してください。
    1. ウェルあたり 2 ml hPSC ミディアム + Y の種子群、hPSCs は細胞外マトリックス コート 6 ウェル プレート (手順 1.1 参照) の上に (図 1 b)。毎日彼らは約 50%、合流と必要に応じて分割まで幹細胞をフィードします。
      1. HPSCs を分割するには、井戸に継試薬 1 mL を追加し、吸引後、5 分間室温で 1 分加温細胞 hPSC 培地 1 mL を追加、分割集計 1:10 ウェルあたり Y + hPSC 媒体の 2 mL で新たな細胞外マトリックス コート井上にします。
    2. 約 50% 合流し、NM + SB431542 + DMH1 (0 日) 神経分化誘導にメディアを変更されるまでは、幹細胞を維持します。約 95% のセルの合流、同一の媒体において新たな細胞外マトリックス コート井 1:6 に分割します。
    3. 14 日に剥離液と集合体の形成を促進するために Y と非コーティング フラスコへの転送細胞を分離します。
      注: Y 添加を利用して細胞の生存と球の形成を促進するが、すべてのフィードの中には含まれていません。
    4. 神経前駆細胞とニューロン (hNeurons) の生成、以下の説明に従ってこれらの日 14 セルを使用します。また、神経細胞の成熟が発生するまたは gliogenesis を開始する前に単分子膜や球の文化からそれ以降の時点でこれらの細胞を活用します。
      注: 既定では、このプロトコルは背側皮質アストロ サイトを生成されます。しかし、アストロ サイトのサブタイプは28,32,33を必要な場合モルフォゲンをパターニングの添加による地域指定できます。レチノイン酸 (RA) は、脊髄に細胞を caudalize に表現型、ソニック ・ ザ ・ ヘッジホッグ (SHH) ながら滑らかアゴニスト (サグ) または腹表現型が生成されます purmorphamine に追加可能性があります。
    5. アストロ サイト前駆細胞と自発的に形成された 3 D 集計 (hAstrospheres) におけるアストロ サイトの生成、FGF2 + EGF NM に切り替え、以前詳細34として毎週 (または安定した pH を確保するため必要に応じて) をフィードします。
      1. 中心部が暗い表示、自発的に添付球を取り外すと、優しく剥離ソリューション hAstro 集計を切り離して考えます。破る球優しく週球健康を維持して壊死のコアを避けるために。
        注: は、剥離溶液の 5 分を超えないようにします。
      2. 膨張、4-6 ヶ月を確認後セル id およびいずれかの凍結 (製造元の指示に従って) 凍結保存中または代替ストレージで長期保存のための条件液体窒素、またはすぐのための使用実験。
    6. HAstrospheres の冷凍ストックを雪解けすぐ解凍室温、転送内容空 15 mL の円錐管と 1 分 300 × gで遠心分離を慎重に上清を吸引、DMEM/f12 キーで洗うし、の合計 2 つの洗浄を繰り返すバイアル手順を実行します。NM + EGF + FGF2 Y の 6 mL の容量と T25 フラスコに追加 (または必要に応じてスケール アップ)。
  2. 生成し、hPSCs から誘導性神経細胞 (iNeurons) を維持します。
    1. (安定したドキシサイクリン誘導ニューロジェニン 2 遺伝子 (35) と種子遺伝子組換え hPSCs 2 mL hPSC ミディアム + Y (と非形質転換線の上記) ウェルあたりで細胞外マトリックス コート 6 ウェル プレートに。70% の confluency に持ち上げする準備ができるまでよく当たり 2 ml のメディアの毎日を送り。2.1.2 の手順で説明したように、セルを分割します。
    2. 細胞が約 35% であるとき、合流追加 NM + Dox iNeurons への分化を誘導します。3.2 の手順に進む前に 2 日間の NM + Dox 単層培養として維持します。
      注:、細胞が神経前駆細胞への移行しますが、ないまだ神経突起 (図 1) を拡張します。

3 準備および 3 D 球共培養系のメンテナンス

  1. 懸濁液 (2.1.5.1 のステップで説明します)、3 D 集計から hAstros を切り離して考えます。
  2. HNeurons または 2D 単分子膜から iNeurons を切り離して考えます。
    1. 6 ウェル プレートからメディアを削除し、それぞれよく単層培養を含む剥離液の 500 μ L を追加します。5 分は軽く 2-3 mL DMEM/f12 キー接続されたセルを削除するを追加、37 ° C で孵化させなさい。
    2. セルと 15 mL の円錐管と 1 分、上清を吸引 300 × gで遠心分離でメディアを収集新鮮なメディアの 1 つの mL を追加し、単一細胞懸濁液を達成するために 1,000 μ L ピペットで軽く上下にピペットします。
  3. マイクロウェル培養皿を使用してフォームの 3 D 球。
    1. マイクロウェル プレートの各ウェルに反付着洗浄溶液 0.5 mL を追加してプレートを準備します。2,000 x gで 5 分間吸引洗浄ソリューションでプレートを遠心分離機、洗って、もう一度吸引を各ウェルに DMEM/f12 キーの 1 つの mL を追加します。
      注: 常に、遠心分離機の使用中にバランスがとれているを確認します。
    2. 検定または自動化された細胞カウンターを使用して各セルの種類をカウントします。NM + Y (iNeurons を使用する場合は、Dox を含む) の 2 mL の容量の各ウェルに解離 hAstros、hNeurons または iNeurons の任意の比率を追加します。3 分間 100 x gでプレートを遠心し、インキュベーターに戻る。
      注: 24 ウェル マイクロウェル プレート (材料の表を参照してください) は、ウェルあたり 300 マイクロウェルを含まれています。よく当たりメディア 2 ml (2 x 103細胞の球) の 6 x 10 の5セルの最小値と最大 6 x 10 の6セル (2 x 104細胞の球) を追加します。この範囲内の特定の密度の実行可能な球は、細胞の定義された量を使用し、300 球あたりのセル数を計算する除算。代替球形成方法とツールは、必要な場合にも利用されるかもしれない。セル密度の許容範囲について製造元の指示に従ってください。
    3. (図 2 a) 次の 2 日にわたってマイクロウェル プレート内の密集の球を組み立てて自己細胞を許可します。文化は黄変は、50% のメディアを交換してください。
      注: 半分だけメディアを交換、ピペットのそっと取り外し、球を妨げるためにメディアを追加する場合。持ち上げてマイクロウェルから一緒に力の高いヒューズを球があります。
    4. 2 日後 1,000 μ L ピペット (図 1) とマイクロウェルから球慎重に取り外します。軽く任意の追加の付着の球を削除するメディアとマイクロウェルの下部に力を適用されます。球 15 mL の円錐管に定住、古いメディアを吸引、新鮮なメディアを追加しなさい
  4. 3 D の球体を形成するスピナー フラスコ バイオリアクター システムを設定します。
    1. 70% エタノールを電磁攪拌板の表面をきれいに、細胞培養孵卵器に入れます。滅菌するオートクレーブ個々 スピナー フラスコ。
    2. 各スピナー フラスコに 50 – 60 mL のメディアの最小の球を追加 (図 1、挿入)。電磁攪拌プレート 60 rpm でセットにフラスコを配置します。データ コレクションの準備ができるまでは、スピナー フラスコで球を文化します。
      注: 文化の 3 週間の最小値は、シナプスの形成のため必要です。スピナー フラスコ バイオリアクター システムを必要ない場合は球は細胞培養フラスコや料理で静止した条件で培養があります。球は、ECM またはゲルで埋め込むことができます。

4. 多配列 (Mea) のライブのシナプス機能の測定

  1. 細胞培養のため測定を準備します。
    1. 無菌純水 (DI) で 1 h. リンス用洗剤の 1 ml 各 MEA のきれいな表面、殺菌し 70% エタノールでリンス、バイオ セーフティ キャビネット UV 光の下での乾燥、空気します。
      注: 測定は無菌条件下で 4 ° C で DI 水で使用するまで格納できます。
    2. 100 mL のホウ酸バッファーに PLO の 50 mg を溶解することによりポリ オルニチン (PLO) の 0.5 mg/mL の溶液を準備します。コート表面の親水性をレンダリング, 4 h 削除 PLO の最低 37 ° C で、DI 水で表面を洗って、ECM の 1 mL を追加する PLO の 1 ml 各 MEA の表面 (1.1.1 のステップを参照)、4 時間の最小値の 37 ° C で孵化させなさいと。
    3. ECM を除去し、電極アレイ上に球の位置を確保する MEA 表面上のメディアの 1.5 mL で球を置き (図 3 a、3 a ')。2 日間の付着することができます。2-3 日ごと (またはより多くのために必要な場合)、球を及ぼさないことを確保するメディアの半分を変更します。
      注: 文化の生存と成熟、成長因子の添加が向上します。
  2. 神経球の電気的活動を測定します。
    1. 温度制御パッチアンプ用アダプターと電極 (MEA) システムを設定します。5 Hz のハイパス フィルターと 200 Hz の低域通過フィルター 5 x 標準偏差 (SD) のスパイクしきい値とソフトウェア プログラムを作成します。
    2. パッチアンプ用アダプター、レコード自発電気活動 (図 3 b、B') に MEA を配置します。スパイクの頻度と振幅の統計的な分析などを含む生データを保存します。
      注: 灌流システムは、MEA の薬理学的エージェントを追加するまたは新鮮な長期的な記録媒体の流れを高めるために利用されるかもしれない。スパイクの追加の後処理が必要な36,37として行われます。

5. 免疫細胞化学シナプス密度の測定

  1. 試薬を準備します。
    1. 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の 500 mL の原液をするためには、ガラス ビーカーまたは換気フードで撹拌プレートに 400 mL の 1x PBS を追加します。攪拌棒と熱を攪拌; 中 60 ° C に追加します。沸騰していません。温水の PBS ソリューションに PFA 粉末 20 g を追加し、ゆっくりと滴下 1 N 水酸化ナトリウムを追加することによって 6.9 に pH を上げます。
      注: 4 %pfa ソリューションは、最大 1 ヶ月間、避けようと 4 ° C で保存されますを使用できます。
    2. ショ糖の 20% と 30% のソリューションをそれぞれに PBS の 100 mL に 20 g か 30 g のショ糖を追加します。
    3. 洗剤の 1 mL を 10 mL の PBS 10% ストック溶液を調製するに追加します。均質化する数回を反転します。
    4. プライマリのブロック バッファーを準備する 10 mL の PBS に 10% 洗剤原液 (最終濃度 0.25%) の 250 μ L とヤギとロバ血清 (最終濃度 5%、それぞれ) の 500 μ を追加します。
    5. 10 mL のブロック バッファーを準備する PBS にヤギとロバ血清 (最終濃度 1% それぞれ) 各 100 μ を追加します。
  2. サンプルを準備します。
    1. 15 mL の円錐管に球を転送、管の下部に解決できるように、古いメディアを吸引します。500 μ L の PBS、解決、PBS を吸引させて球をすすいでください。4 を 500 μ l 添加 %pfa (または十分に球をカバーするため) し、4 ° c 30 分間加温します。
    2. PFA を吸引し、優しく PBS で 2 回洗ってください。20% ショ糖液を追加し、, 4 ° C でいくつかの時間または一晩します。慎重に吸引、30% ショ糖液を追加して、, 4 ° C でいくつかの時間または一晩します。
      注: サンプルは、次のステップに進む前に 1 週間 PBS またはサッカロースの 4 ° C で保存されるかもしれない。されていない場合はスライス、1.5 mL チューブの 3 D 球 (図 4 aC) として維持し、5.3 の手順に進みます。
    3. 球をスライスしたドライアイスの上に埋め込み低温金型に球を転送慎重に。30% ショ糖液を吸引、それは完全に空気の泡を避け、サンプルをカバーするまで金型埋め込むソリューション組織をゆっくり注ぎなさい。ソリューションがフリーズ クライオスタット スライスまで-80 ° C で保存するまで待ちます。
    4. -20 ° C、スライス埋め込みのブロック 30 μ m のセクションに (または必要に応じて) スライド ガラスへの転送、クライオスタットを用いた。染色する準備ができるまで-80 ° C で保存します。
  3. Immunostain 球。
    1. 液体の流出を防ぐため疎水性 PAP ペンでスライドの端を概説します。抗体 (材料の表を参照) をプライマリとセカンダリのブロッキング ソリューションを準備します。各スライドまたはチューブにプライマリ バッファーの妨害の 500 μ L を追加し、30 分間室温でインキュベートします。
    2. 液体を削除し、各スライドまたはチューブに新鮮な一次ブロック バッファー希釈した一次抗体との 500 μ L を追加し、4 ° C で一晩インキュベート一次抗体のソリューションを削除し、PBS で 10 分間の x 3 を洗ってください。
    3. 各スライドまたはチューブに希釈した二次抗体とセカンダリのブロック バッファーの 500 μ l 添加し 1 h. 二次抗体溶液を削除、PBS で 10 分間の x 3 を洗って 4 ° C で孵化させなさい。
      注:テーブルの材料で推奨される抗体のリストが提供されます。他の抗体または染料を使用することが望ましい。(ステップ 5.3.3 以降) を点灯する蛍光サンプルを公開しません。
    4. 50 μ L 滴下し表面をカバーし泡を回避、スライドの上観察を慎重に配置ソリューションの実装を追加します。24 時間室温で乾燥し、4 ° C で保存するスライドを許可します。
  4. スライドをイメージします。
    1. 球スライス (図 4) 内の共存とシナプス蛋白質の豊富なイメージの前に油浸対物レンズ × 63 と共焦点または 2 光子蛍光顕微鏡を使用します。20 X、40 X 目的を使用して、hAstros の形態学的特徴を視覚化します。
    2. ImageJ ソフトウェアで開いている蛍光画像ファイル。以前詳細38、または別の方法で公平な計測方法を使用してプラグイン、携帯カウンターを使用して手動で事前・事後のシナプス涙点を数えます。

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Representative Results

正しく実行される、アストロ サイト28,33,34とニューロンの35 (図 1 a-1C)、hPSCs から生成された機能共培養系の定義された集団としてこのプロトコルを生成します。以前26の詳細し、手順 2.1-2.2 でここで説明します。マイクロウェル プレートを使って、このステップワイズ見込まれて一貫性のあるサイズと形状 (ステップ 3.3; 3 D 神経球図 1)均等に分散した細胞と細胞死の重要な兆候なし。セル密度から始まるセルの種類の任意の比率の範囲は、さまざまなサイズの球になります。マイクロウェル プレートがない場合では、セルの結合 (> 2 mm) 直径は拡散の限界を超える著しく大きく、不均一の集合体を形成する (図 2 a-2B)。スピナー フラスコまたは同等のバイオリアクターの使用が球間の均一性を維持され、融合 (ステップ 3.4; を減らすことが予想されます。図 2)。ただし、スピナー フラスコ球の文化週間が可能、それらの使用は必要はありません。

電気生理学的解析のための共培養系を安定させるために基板の ECM 模倣可能に 3次元構造を維持しながら容易に付着する球 (図 3 a、3 a ')。録音中に測定上に配置 iNeurons の健康的な球は自発的に一貫した発火周波数 (手順 4.1-4.2; ± 40 μ V を超える電圧スパイクを引き出すため図 3B-C、3 f)共球は、スパイク (図 3 b'-3 C') の同期ネットワークのバーストの増加の結果、hAstros の存在の大きいネットワーク接続を表示する予定です。CNQX35,39,40, シナプスの AMPA 受容体拮抗薬のアプリケーション軽減ネットワーク共球バースト同期 (図 3 D'-3 e')。

神経細胞型制限蛋白質のマーカーは、均等に分散配置と 3 D 球内のニューロンとアストロ サイトの成熟度を視覚的に示します。アストロ サイト形態と分岐の最大投影はまばらに膜結合型 GFP 標識 hAstros と代表的な 3D の球体で図 4 aに表示されます。成熟した hAstros エクスプレス マーカー GFAP (図 4 b) や、S100B Glt134express 微小管関連タンパク質 2 (MAP2; hNeurons と iNeurons に対し、図 4)チューブリン ベータ 3 (Tuj1/TUBB3)。最後に、iNeurons は、それぞれ Synapsin 1 (Syn1) とホーマーや PSD95 を含む前およびシナプス後細胞の蛋白質を表現、しかしシナプス密度が大幅に向上共 (図 4)26hAstros の存在によって。利用可能な場合、技術と光シート顕微鏡クリア脳の代替使用はそのまま球の迅速な画像になります。

一緒に取られて、自発活動と共に成熟した神経マーカーの発現は機能的なシナプス回路の三次元共培養系の生産に上記プロトコルの成功を確認します。

Figure 1
図 1: 3 D 神経球の形成と分化の段階的な描写は、hPSCs から派生します。(A) プロトコルでの重要なステップのタイムライン。(B) 神経細胞の純粋な人口は、ひと誘導多能性幹細胞 (hPSCs) から生成できます。アストロ サイト前駆細胞 (緑点線) の生成手順 2.1 として Ref28を参照してください。(C) 誘導性ニューロン (iNeurons; セクション 2.2 を参照) を介してニューロジェニン 2 の誘導発現形質転換 hPSCs から生成される 2D ECM (7 日目) の神経細胞形態を示すし、MAP2 の肯定的な (インセット)。マイクロウェル プレート (手順 3.1 – 3.3 参照) から削除 (D) 球は、高スループット スクリーニングのための一貫したサイズを示しています。球はスピナー フラスコ バイオリアクターで培養があります (インセット; ステップ 3.4 を参照) の融合を防ぐために必要な場合。スケールバー = 50 μ m (C を挿入)。スケール バー = 200 μ m (D)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: 遺伝子組み換え 3 D 神経球の体系的で再現可能な生成します。(A) 体系的かつユーザー指定方法、一貫性のあるサイズと形状で目的の密度とニューロン ・ グリア比の 3 D 神経球を形成する (μ-よく) マイクロウェル培養皿を使用します。画像には、球の形成の後の 1 日が表示されます。スケール バー = 200 μ m. (B) 開始 (4 x 103 2 × 104細胞マイクロウェルあたり) から細胞の密度の範囲がさまざまなサイズの球を生成します。マイクロウェル プレートがない場合は、hPSCs は直径が 1 週間後の拡散の限界を超えるフォーム著しく大きく、不均一凝集体に結合 (n = グループと時間のポイントごとの 6-14 球)。(C) iNeuron 80 rpm でスピナー フラスコ培養球少ないフュージョンを展示し、かなり小さかったため、3 週間の期間にわたって固定文化のそれらと比較してより多くのと制服と展示の大きい循環 (n = 6-51グループと時間のポイントごとの球)。プロットは、平均 ± SD;* 2 尾tを使用して決定されるグループ間の意義 (p < 0.05) を示します-テスト。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: 神経球多配列 (Mea) の代表的なライブ シナプス機能します。(A、A')測定は、神経球のライブ シナプス機能を測定するため利用されています。INeurons (A) または iNeurons と hAstros の共培養系の球 (A') MEA (手順 4.1 参照) ECM 模倣基板表面上に培養することができます。(B、B')ラスターは、代表的な自発活動記録ウィンドウ (水平軸) の中にすべての電極 (垂直軸) にわたって測定のプロットします。神経生理学的基礎培地41文化の 4 週間後 iNeuron 球 (B) 表示自発的なスパイク、共球 (B') 同期発火パターン (オレンジの矢印) の増加ネットワーク バーストを明らかにしました。(C, C')代表的な電極から MEA 記録 windows 中スパイクのヒストグラムを測定しました。(D、D')自発活動のラスター プロットは 50 μ M CNQX、AMPA 受容体拮抗薬 (B、B' と同じ規模の時間) の適用後すべての電極で測定。CNQX 除去共培養系におけるスパイクの同期バーストの存在 (D')。  (E, E') 50 μ M CNQX アプリケーション後代表的な電極からの MEA 録音ウィンドウ中にスパイクのヒストグラムを測定 (同じ時間スケール c、C')。スパイクの痕跡は (左) 時間をかけてすべての電極から iNeuron 球、(F) 地図。実証の単一電極 (中央); 時間をかけて複数のクラスター化されたトレースを表示します。個々 のスパイク跡を並べ替えおよび個別に分析が可能 (右)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: シナプス回路の特徴的な免疫組織化学。膜結合型 GFP (mGFP) (A) の記者、3 D 神経球の hAstros の形態と配置を調べるのに役立ちます。HPSCs から区別される (B) hAstros は、GFAP 陽性です。HAstros と iNeurons を含む (C) 球は視覚化することができ、GFAP など MAP2 セル型制限のタンパク質マーカーを用いています。スケール バー = 50 μ m。 (D) 代表的な画像の前およびシナプス後細胞の密度 (Syn1 と PSD95、それぞれ) (左) なし iNeurons の球で (右) と hAstros を遊走と。日 35、シナプス形成を誘導する hAstros の能力を示す iNeuron 球と比較して共培養球で観察されたコードして, Syn1 と PSD95 の大幅増加密度 (n = 3 の独立した複製を各; Ref からデータの転載26権限を持つ)。スケール バー = 10 μ m. プロットを表す平均 ± SEM;有意差 (* p < 0.05; を示します * * p < 0.01 を示します) 2 尾tを使用したグループ間-テスト。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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Discussion

このプロトコルでは神経共培養系の 3 D 球の生産のための体系的な方法をについて説明します。球は hPSCs から独立して派生はニューロンとアストロ サイトので構成されます。しかしこのプロトコルのフォーカスではない、hPSCs28からアストロ サイトの純粋な人口の世代の重要なステップし、経験することがなく実行される場合、技術的に挑戦することができます。これらのシナプス回路の生成のこの最初のステップは、細部への細心のタイミングと実行必要があります。HPSC 由来アストロ サイトの利用制限は長い分化過程;ただし、将来のためを固定できる細胞の大量生産で解凍実験の時間 (手順 2.1.5 参照) hPSC 初期段階からプロセスを開始する必要があります。両方の特性がグリア12,35の存在によって強化特に形質転換 hPSCs から生成された iNeurons によるシナプス形成、自発的なシナプス後電流を展示する能力を持っているが、このプロトコルの詳細、hAstros を含みます。したがって、成熟や発達段階数、細胞の種類の選択は、このプロトコルの重要なコンポーネントとの調整は電気的活動またはシナプスの可視化でバリエーションあります注意必要があります。しかし、このプロトコルはまた可能な条件または結果研究者個人からの柔軟性を反映している方法で細胞密度または比率の操作を許可します。

神経器官毛細方法42,43, このシステムはの自己組織化と階層化の表現型を要約していない警告の代わりを生産するバイオ エンジニア リング ツールの活用する前述のように、可能性があります organoids20,44が望ましい。マイクロウェル培養プレート26とスピナー フラスコ バイオリアクター45,46の同時使用は生産だけでなく、試験と神経回路網の解析を効率化し、再現性を確保します。細胞培養の試金の様々 な。スピナー フラスコまたは同等のバイオリアクターの使用はオプションですが、密接な接触の球の静止した文化があります、融合、従って制限の栄養素および酸素拡散で中心の限界を超えて、それを強調する必要があります。球47。特に、大規模なバイオリアクター46と比較して高いスループット アプローチとして 3 D プリント ミニ バイオリアクターの使用が報告されています。

シナプス形成を測定する従来のツールなどの生理学的手法など全細胞パッチク MEAs36,48,49, カルシウム イメージング50。ここでは、我々 は MEAs の使用については、短い時間スケールで球の電気的活動のシンプルかつ高スループット試験を提供するように選択します。ただし、他の技術も利用されるかもしれない。

このプロトコルでマイクロウェル プレートの使用の制限は (~ 300) の球と球ごとのセルの最大数 (2 ~ 10 x4) 各ウェルで許可され。増加; の代替球形成ツールが使えますしかし、細胞数の増加は開始の時点で必要があります。24 ウェル フォーマットは、球の中心の内で細胞死を軽減しつつ、目での解析の処理と表示をすることができます大きな球体を生成する能力のためここで選ばれました。全体的にみて、プロトコルにこの手順の追加制服 3 D 球の堅牢でスケーラブルな運用が保証されます。

我々 のプロトコルは、数と各セル型の比だけでなく、3 D の球体に制御の定義された方法で他の細胞型を導入する可能性を調整する柔軟性を誇っています。地域固有のニューロンとアストロ サイトのサブタイプの使用は、中枢神経系のさまざまな地域のシナプス回路の研究を許可します。球することができますこれらの共は、細胞運動と長距離シグナル伝達研究に51を融合しました。オリゴデンドロ サイト、血管内皮細胞、ミクログリアの添加は、これらの 3 D 球のこのメソッドのための有望な将来の方向性として、複雑さを増して有益な脳モデルであることを証明できます。最後に、病気や怪我のモデリング、に加えてこのシステムは携帯電話補充療法や新薬開発、再生に関するを強化するなどの治療法の研究を許可します。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

博士マイケル区 (NIH) iNeuron 分化に関する技術的な助言のため、予備的な画像解析のサバ Barlas これらのプロシージャの設計上の知的入力を博士エリック Ullian (UCSF) に感謝したいと思います。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 well plate Fisher Scientific 08-772-1B
15 mL conical tubes Olympus Plastics 28-101
Accutase Sigma A6964-100ML Detachment solution
AggreWell plate Stemcell Technologies 34850
Anti-Adherence Rinsing Solution Stemcell Technologies 7010 Prevent cell adhesion to microwell plates
Anti/anti Thermofisher 15240062
B27 Thermofisher 17504044 Media Supplement
BrainPhys neuronal medium Stemcell Technologies 5790 Neurophysiological basal medium alternative
Circular glass coverslips Neuvitro GG-12-oz
Cryostor CS10 Stemcell Technologies 7930 Cryopreservation medium with 10% DMSO
DMEM/F12 Thermofisher 10565-042 With GlutaMAX supplement
DMH-1 Stemcell Technologies 73634 HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 μM
Donkey serum Lampire Biological Laboratories 7332100 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Doxycycline Hydrochloride (Dox) Sigma D3072-1ml HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 μg/mL
Epidermal growth factor (EGF) Peprotech AF-100-15 Working concentration: 10 ng/mL
Fibroblast growth factor-2 (FGF) Peprotech 100-18B Working concentration: 10 ng/mL
Fluoromount-G mounting solution Southern Biotech 0100-01
Glass slides Fisherbrand 22-037-246
Goat serum Lampire Biological Laboratories 7332500 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Hemacytometer or automatic cell counter Life Technologies AMQAX1000
Heparin Sigma H3149-50KU Working concentration: 2 mg/mL
Magnetic plate DLAB 8030170200
Matrigel membrane matrix Corning 354230 ECM coating solution. Working concentration: 80 μg/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.
MEA 2100 System Multichannel Systems MEA2100
Mounting solution
N2 Thermofisher 17502048 Media Supplement
OCT Tissue-Tek 4583 Tissue embedding solution for cryosectioning
Pap Pen (Aqua Hold) Scientific Device Laboratory 9804-02
Paraformaldehyde (PFA) Acros Organics 169650025 HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS
Phosphate buffered saline (PBS) Stemcell Technologies CA008-300
Poly-l-ornithine (PLO) Sigma P3655-100MG Working concentration: 0.5 mg/mL
Rectangular glass cover slips Fisherfinest Premium Superslip 12-545-88
ReLeSR Stemcell Technologies 5872 Detachment and passaging reagent
Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y) Tocris 1254 Working concentration: 10 uM
SB431542 Stemcell Technologies 72234 Working concentration: 2 μM
Spinner flasks Fisher Scientific 4500-125
Sucrose Fisher Chemical S5-3 Working concentration: 20% or 30% in PBS
T25 Culture Flask Olympus Plastics 25-207 Vented caps
T75 Culture Flask Olympus Plastics 25-209 Vented caps
Terg-A-zyme Sigma Z273287-1EA Detergent. Working concentration: 1%
TeSR-E8 basal medium Stemcell Technologies 5940 Human pluripotent stem cell (hPSC) medium
TeSR-E8 supplements Stemcell Technologies 5940 Supplements for human pluripotent stem cell medium
TritonX-100 Sigma X100-500ML Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer
Trypan blue Invitrogen T10282
Antibodies
AlexaFluor 488 Thermofisher A-11029 Secondary antibody
AlexaFluor 594 Thermofisher A-11037 Secondary antibody
Ezrin Thermofisher MA5-13862 Primary antibody; astrocytes perisynaptic
GFAP Chemicon MAB360 Primary antibody; astrocytes
GFP Aves GFP-1020 Primary antibody; astrocytes
Glt1 Gift from Dr. Jeffrey Rothstein n/a Primary antibody; astrocytes
Homer Synaptic Systems 160 011 Primary antibody; neurons, post-synaptic
MAP2 Synaptic Systems 188 004 Primary antibody; neurons
PSD95 Abcam ab2723 Primary antibody; neurons, post-synaptic
S100 Abcam ab868 Primary antibody; astrocytes
Synapsin 1 Synaptic Systems 106 103 Primary antibody; neurons, pre-synaptic
TuJ1/β3-tubulin (TUBB3) Covance MMS-435P Primary antibody; neurons

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ひと多能性幹細胞からのニューロンとアストロ サイトの三次元共培養系によるシナプス局所回路におけるモデリング
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