Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Synaptic dataloger modellering med 3D Cocultures astrocytter og neuroner fra humane pluripotente stamceller

Published: August 16, 2018 doi: 10.3791/58034
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Neuroregeneration, Department of Neurosurgery, Houston Methodist Research Institute

Summary

I denne protokol, vi har til formål at beskrive en reproducerbar metode til at kombinere dissocieres humane pluripotente stamceller afledt neuroner og astrocytter sammen i 3D sfære cocultures, vedligeholdelse af disse områder i frie flydende betingelser, og efterfølgende måle synaptic kredsløb aktivitet af kugler med immunoanalysis og multielectrode array optagelser.

Abstract

En hindring for vores forståelse af, hvordan forskellige celletyper og signaler bidrage til synaptic kredsløb funktion er manglen på relevante modeller for at studere den menneskelige hjerne. En ny teknologi til at løse dette problem er brugen af tre-dimensionelle (3D) neurale cellekulturer, kaldes 'organoids' eller 'spheroids', for langsigtet præservering af intercellulære interaktioner herunder ekstracellulære adhæsionsmolekyler. Men systemerne kultur er tidskrævende og ikke systematisk genereret. Her, vi beskriver en metode til hurtigt og konsekvent producere 3D cocultures af neuroner og astrocytter fra humane pluripotente stamceller. Første, forhånd differentieret astrocytter og neuronal ophav er adskilt og tælles. Næste, celler i kugle-dannende kombineret retter med en Rho-Kinase inhibitor og på specifikke nøgletal til at producere kugler af reproducerbare størrelse. Efter flere ugers kultur som flydende kugler, er cocultures ('asteroider') Endelig sectioned for immunfarvning eller forgyldt ved multielectrode arrays til at måle synaptic tæthed og styrke. Generelt forventes det, at denne protokol vil give 3D neurale kugler, der vise modne celletype begrænset markører, danne funktionelle synapser og udstille spontan synaptic netværk burst aktivitet. Sammen, tillader dette system stof screening og undersøgelser mekanismer af sygdom i en mere velegnet model i forhold til éncellelag kulturer.

Introduction

Astrocytter er en meget rigelige glial celletype inden for det centrale nervesystem (CNS) med en lang række funktionelle ansvar uden for strukturstøtte. Gennem udskillelsen af opløselige synaptogenic faktorer og ekstracellulære matrix (ECM) komponenter, astrocytter støtte i etableringen og klynger af modne synapser under udvikling1. De også spiller en afgørende rolle i at bevare sundhed og plasticitet i synapserne gennem ekstracellulære signaling2,3,4,5, og bidrage til stabilitet på lang sigt af homeostatiske miljøer ved at regulere ekstracellulære kalium samt glutamat og udskillelsen af energi substrater og ATP6,7,8. Endelig, de kan bidrage til neurotransmission ved at påvirke extrasynaptic strømninger9, og kan indirekte påvirke aktivitet gennem andre celletyper såsom fremme af myelination10. Vigtigere, fordi abnormitet eller dysfunktion af astrocytter kan føre til mange udviklingsforstyrrelser syndromer og voksen neuropatologiske, er der et indlysende behov for at medtage astrocytter sammen med neuroner i manipuleret neurale netværk i rækkefølge for en forbedret model af den endogene hjernen miljø. En integreret kendetegner astrocytter er deres evne til formen dynamisk samspil med neuronal synapser1,11,12. I mangel af glia danner neuroner et begrænset antal synapser, der generelt mangler også funktionelle modenhed13.

Menneskelige astrocytter vise morfologiske, transcriptional og funktionelle egenskaber — såsom øget størrelsen og kompleksiteten af forgrenede, samt artsspecifikke gener – der ikke er sammenfattet i gnavere12,14, 15. Som et resultat, studerer udnytte menneskelige pluripotente stamceller (hPSC)-afledte neurale celler har blive bredt accepteret som en mulighed for at undersøge CNS-relaterede sygdomme i vitro samtidig udvikle nye behandlingsformer, skade modeller og kultur paradigmer16 ,17. Derudover tillader hPSCs undersøgelse af menneskelige synapse dannelsen og funktionen uden behov for primære væv18,19.

En hindring for vores forståelse af, hvordan forskellige celletyper og signaler bidrage til synaptic kredsløb funktion er manglen på relevante modeller af den menneskelige hjerne. Der er behov for en passende platform til at sammenfatte sine synaptic netværk med high fidelity og reproducerbarhed. For nylig har interesse er opstået i produktion af 3D kultur systemer (bredt kendt som 'organoids,' 'spheroids' eller 'mini hjerner')20 model komplekse tredimensionale (3D) strukturer på cellulære og makro niveau. 3D kultur systemer bevarer ECM og celle-celle interaktioner, der er normalt fraværende eller begrænset under typiske 2D coculture paradigmer21,22. En overflod af teknikker findes for dyrkning 3D neurale spheroids23,24,25; men mange kræver langvarige kultur perioder (måneder til år) til spontan udvikling og lag bevarelse, med brugeren udviser meget lidt kontrol over output.

Her viser vi en systematisk metode til hurtigt og konsekvent bioengineer neurale interaktioner blandt flere celletyper (pre differentieret neuroner og astrocytter) afledt af hPSCs ved at samle celler i område cocultures ('asteroider')26 at sammenfatte menneske-specifikke morfologiske kompleksiteter i 3D. Denne high-density neurale systemet genererer jævnt spredt neurale undertyper, der tager på ældre ejendomme over tid og kan screenet eller analyseres i en høj overførselshastighed måde. Vi demonstrere for første gang at menneskelige astrocytter fremkalde synaptic netværksaktivitet brast i disse 3D cocultures. Derudover er denne protokol let at tilpasse til at generere områder af forskellige størrelser, til at udnytte cellerne angivet til forskellige regionale identiteter i CNS, og til at studere samspillet mellem flere andre celletyper som ønsket.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. celle kultur og reagens

Bemærk: Protokoller i dette afsnit er skrevet i den rækkefølge som de vises i differentiering protokol (afsnit 2). Se Tabel af materialer til materialer og katalog numre.

  1. Forberede overtrukne plader til cellekultur.
    1. Fortynd ekstracellulære matrix (ECM) belægning løsning med DMEM/F12 medier til at forberede en 1 mg/mL stamopløsning. Alikvot fortyndet ECM lagerfører løsning til 30 koniske rør af 3 mL og umiddelbart gemme i-20 ° C. For en brugsopløsning resuspend 3 mL af ECM materiel til 33 mL pre kølet DMEM/F12 medier, at bringe den samlede mængde til 36 mL til en koncentration på 80 µg/mL.
    2. Frakke 1 mL pr. brønd af et 6-godt celle kultur plade med ECM brugsopløsning. Tilføje en yderligere 1 mL DMEM/F12 pr. brønd (hvis nødvendigt) for at sikre, at overfladen af brønden er fuldt dækket. Tillad cellen belagt 6-og kultur plader til at sidde ved stuetemperatur i mindst 1 time før brug.
      Bemærk: Overtrukne plader kan blive gemt i inkubator eller ved 4 ° C i op til 2 uger.
  2. Forberede medier formuleringer, vækstfaktorer og små molekyler.
    1. For at forberede 500 mL af humane pluripotente stamceller (hPSC) medium27, tilsættes 20 x og 500 x kosttilskud efter fabrikantens anvisninger.
    2. For at forberede 500 mL af neurale medium (NM), tilføje heparin til en slutkoncentration på 2 mg/mL, 1 x antibiotikum/antimykotikum løsning, 1 x B27 tillæg eller 1 x N2 supplement til en 500 mL flaske DMEM/F12 med L-Glutamin supplement som tidligere detaljerede28.
    3. At forberede en 10 mM (1, 000 x) bestand løsning af Rho-Kinase Inhibitor Y27632 (Y), tilføje 10 mg pulver til 3 mL fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Filter sterilisere, alikvot, og opbevares ved-20 ° C. Brug i en 10 µM arbejder koncentration i medierne.
    4. At forberede en 20 mM (10, 000 x) bestand løsning af SB431542, tilføje 10 mg pulver til 1,3 mL dimethylsulfoxid (DMSO). At forberede en 2 mM (1, 000 x) bestand løsning af DMH1, tilføje 10 mg pulver til 13,1 mL DMSO. Filter sterilisere, alikvot, og gemme hver løsning på-20 ° C. Bruge hver i en 2 µM arbejder koncentration i medierne (NM + SB431542 + DMH1).
      Bemærk: Denne protokol anbefaler 2 µM arbejder koncentrationer af både SB431542 og DMH1 baseret på vores observationer og rapporter fra andre29 om, at denne koncentration effektivt fremmer neurale induktion fra hPSCs. Højere koncentrationer har også været rapporteret30. Derudover med alternative medier, har det også vist at små molekyler ikke er nødvendige for høj neurale konvertering31. Således arbejder koncentrationer vil variere afhængigt af alternative celle kultur miljøer, og optimal koncentrationer bør testes af individuelle forskere.
    5. At udarbejde individuelle 100 µg/mL (10, 000 x) stamopløsninger af epidermal vækstfaktor (EGF) og fibroblast vækstfaktor-2 (FGF2), tilføje 1 mg af hver i 10 mL PBS + 0,1% BSA. Alikvot EGF og FGF2 lager løsninger til 50 µL delprøver opbevares ved-80 ° C. Brug i en 10 ng/mL arbejder koncentration i medierne; f.eks.tilsæt 5 µL EGF og 5 µL FGF2 50 ml af NM (NM + EGF + FGF2).
    6. For at forberede en stamopløsning af doxycyclin hydrochlorid (Dox), først opløse pulveret i DMSO på 100 mg/mL og opbevares ved-20 ° C. Yderligere fortyndes for at gøre en 2 mg/mL (1, 000 x) bestand løsning i PBS og opbevares ved-20 ° C. Bruge i 2 µg/mL arbejder koncentration i medierne; f.eks.Tilsæt 50 µL Dox til 50 mL af NM (NM + Dox).
      Bemærk: Ikke re fryse løsninger efter optøning.

2. generation af neurale undertyper fra menneskelige induceret pluripotente celler (hPSCs)

Bemærk: Alle cellekulturer bør holdes i en inkubator med 5% CO2 ved 37 ° C. Disse kulturer fastholdes på værelse ilt niveauer, selv om lavere niveauer kan udnyttes.

  1. Generere og opretholde astrocyte ophav (hAstros) fra hPSCs.
    Bemærk: Dette afsnit giver en kort og forenklet differentiering protokol. For en detaljeret beskrivelse (med embryoid krop dannelse, roset udvalg og regionale mønstre trin) henviser til de tidligere beskrevne protokol28 (figur 1A, stiplede grønne boks).
    1. Frø klynger af hPSCs (figur 1B) på ECM-belagt 6-godt plader (Se trin 1.1) med 2 mL af hPSC medium + Y pr. brønd. Feed stamcellerne hver dag, indtil de er omkring 50% sammenflydende og opdelt efter behov.
      1. Du kan opdele hPSCs, tilsættes 1 mL passaging reagens til brønde og Opsug efter 1 min. Incubate cellerne ved stuetemperatur i 5 min, tilsættes 1 mL hPSC medium, og opdele aggregater 1:10 på ny ECM-coatede brønde i 2 mL af hPSC medium + Y pr. brønd.
    2. Opretholde stamcellerne, indtil de er omkring 50% sammenflydende, så Skift medier til NM + SB431542 + DMH1 til at fremkalde neurale differentiering (dag 0). Når celler er omkring 95% sammenflydende, opdelt nye ECM-coatede brønde i samme medium 1:6.
    3. Dag 14, adskille celler med udstationering løsning og overføres til en ikke-belagt kolbe med Y til at fremme dannelsen af aggregater.
      Bemærk: Tilsætning af Y er udnyttet til at fremme celle overlevelse og kugle dannelse men er ikke inkluderet i hver foder.
    4. I generation af neuronal ophav og neuroner (hNeurons), bruge disse dag-14 celler som beskrevet nedenfor. Alternativt kan du udnytte disse celler på senere tidspunkter fra éncellelag eller sfære kulturer før neuronal modning opstår eller gliogenesis påbegyndelse.
      Bemærk: Som standard, denne protokol producerer dorsal-kortikale astrocytter. Dog kan astrocyte undertyper angives regionalt ved tilsætning af mønster morphogens, hvis det ønskes28,32,33. Retinsyre (RA) kan tilføjes for at caudalize celler i rygmarven fænotyper, mens sonic hedgehog (SHH), filtset agonist (SAG), eller purmorphamine vil producere ventrale fænotyper.
    5. For generation af astrocyte ophav og astrocytter i spontant dannet 3D aggregater (hAstrospheres), skifte til NM + EGF + FGF2 og feed ugentlige (eller som er nødvendig for at sikre stabil pH) som tidligere detaljerede34.
      1. Forsigtigt adskille hAstro aggregater med udstationering løsning når mørke Centre vises og fjerne kugler, der spontant vedhæfte. Bryde kugler forsigtigt en gang om ugen, at opretholde sfære sundhed og undgå nekrotisk kerner.
        Bemærk: Må ikke overstige 5 min af behandling med udstationering løsning.
      2. Efter 4-6 måneder af ekspansion, bekræfte celle identitet og enten fryse i kryopræservering medium (ifølge fabrikantens anvisninger) eller alternative opbevaring betingelserne for langsigtet bevaring i flydende nitrogen, eller brug straks for eksperimenter.
    6. For at tø en frossen bestand af hAstrospheres, hurtigt optø et hætteglas ved stuetemperatur, overføre indholdet til en tom 15 mL konisk tube, og der centrifugeres ved 300 x g i 1 min. omhyggeligt Aspirér supernatanten, vask med DMEM/F12, og Gentag i alt to wash trin. Tilføje til en T25 kolbe med en samlet maengde paa 6 mL af NM + EGF + FGF2 + Y (eller skalere efter behov).
  2. Generere og opretholde inducerbar neuroner (iNeurons) fra hPSCs.
    1. Frø transgene hPSCs (med en stabil doxycyclin-inducerbar neurogenin 2 transgen35) på ECM-belagt 6-godt plader med 2 mL af hPSC medium + Y pr. brønd (som beskrevet ovenfor for ikke-transgene linjer). Feed hver dag med 2 mL af medier pr. brønd, indtil de er klar til at løfte på 70% confluency. Opdel celler, som beskrevet i trin 2.1.2.
    2. Når celler er ca. 35% sammenflydende, tilføje NM + Dox for at inducere differentiering i iNeurons. Bevare som en éncellelag kultur med NM + Dox for 2 dage, før du fortsætter til trin 3.2.
      Bemærk: Celler vil overgang til neuronal progenitorceller, men vil ikke endnu udvide neurites (figur 1 c).

3. forberedelse og vedligeholdelse af 3D kugle Cocultures

  1. Adskille hAstros fra 3D aggregater i suspension (som beskrevet i trin 2.1.5.1).
  2. Adskille hNeurons eller iNeurons fra en 2D éncellelag.
    1. Fjerne medier fra 6-godt plade og tilføje 500 µL af detachment løsning til hver godt indeholder éncellelag kulturer. Der inkuberes ved 37 ° C i 5 min. forsigtigt tilføje 2-3 mL DMEM/F12 til at fjerne tilknyttede celler.
    2. Indsamle celler og medier i en 15 mL konisk rør og centrifugeres ved 300 x g i 1 min. aspirat supernatanten, tilsættes 1 mL af friske medier, og pipetteres op og ned forsigtigt med en 1.000 µL mikropipette til at opnå en enkelt cellesuspension.
  3. Form 3D kugler ved hjælp af microwell kultur plader.
    1. Forbered pladen ved at tilføje 0,5 mL af anti-tilslutning føres løsning til hvert hul i microwell pladen. Centrifugeres plade på 2.000 x g i 5 min. aspirat føres løsning, tilsættes 1 mL DMEM/F12 til hver brønd at vaske, og Opsug igen.
      Bemærk: Sørg altid for, at centrifugen er afbalanceret under brug.
    2. Tæl hver celletype ved hjælp af en hemocytometer eller automatiseret celle counter. Tilføje ønskede forholdet mellem dissocierede hAstros og hNeurons eller iNeurons til hver brønd i en samlet maengde paa 2 mL af NM + Y (omfatter Dox, hvis iNeurons udnyttes). Centrifugeres plade på 100 x g i 3 min og vende tilbage til rugemaskine.
      Bemærk: 24-godt microwell plader (Se Tabel af materialer) indeholder 300 microwells pr. brønd. Tilføje et minimum af 6 x 105 celler (for kugler af 2 x 103 celler hver) og et maksimum på 6 x 106 celler (for kugler af 2 x 104 celler hver) i 2 mL af medier pr. brønd. For levedygtige kugler af en bestemt tæthed inden for dette interval, bruge en defineret mængde af celler og dividere med 300 til at beregne antallet af celler pr. kugle. Alternative område danner metoder og værktøjer kan også udnyttes, hvis det ønskes. Følg producentens anvisninger for acceptable intervaller af celle tætheder.
    3. Tillad cellerne at selv samle i tætpakkede områder inden for microwell plader over de næste 2 dage (figur 2A). Erstatte 50% medier, hvis kultur gulning.
      Bemærk: Udveksle kun halv medier og afpipetteres forsigtigt ved at fjerne og tilføje medier for ikke at forstyrre kugler. Kugler kan løfte fra microwells og smelter sammen med højere kraft.
    4. Efter 2 dage, forsigtigt fjerne kugler fra microwells med en 1.000 µL mikropipette (fig. 1 d). Let anvende kraft til bunden af microwells med medierne for at fjerne eventuelle yderligere overholdt kugler. Lad kugler bosætte sig i en 15 mL konisk slange, Opsug den gamle medier og tilføje frisk medier.
  4. Oprette spinner kolbe bioreaktor system for at danne 3D kugler.
    1. Rengør overfladen af en magnetisk røre pladen med 70% ethanol, læg det i en celle kultur inkubator. Autoklave individuelle spinner kolber til at sterilisere.
    2. Tilføje områder med et minimum af 50-60 mL medier til hver spinner kolbe (figur 1 d, inset). Kolben anbringes på den magnetiske rør plade på 60 rpm. Kultur kugler i spinner kolber indtil de er klar til dataindsamling.
      Bemærk: Mindst 3 uger i kultur er nødvendig for synapse dannelse. Hvis spinner kolbe bioreaktor system der ikke ønskes, kan kugler kulturperler under stationære forhold i celle kultur kolber eller retter. Områder kan også være integreret i ECM eller hydrogel.

4. måling af levende Synaptic fysiologi med Multielectrode Arrays (MMA)

  1. Forberede cellekultur multilaterale miljøaftaler.
    1. Ren overflade af hver MEA med 1 mL af vaskemiddel til 1 h. skylles med sterilt deioniseret vand (DI) vand, skyl med 70% ethanol til at sterilisere og derefter lufttørre i biosikkerhed kabinet i UV-lys.
      Bemærk: Multilaterale miljøaftaler kan gemmes i DI vand ved 4 ° C under sterile forhold indtil brug.
    2. Der fremstilles en 0,5 mg/mL opløsning af poly-ornithin (PLO) ved at opløse 50 mg af PLO i 100 mL af borsyre buffer. Coat overfladen af hver MEA med 1 mL af PLO at gøre overfladen hydrofile og inkuberes ved 37 ° C i mindst 4 h. Fjern PLO, vask overfladen med Deioniseret vand, tilsættes 1 mL af ECM (Se trin 1.1.1), og der inkuberes ved 37 ° C i mindst 4 h.
    3. Fjerne ECM og placerer kugler i 1,5 mL af medier på en MEA overflade, at sikre, at områderne er placeret ovenpå elektrode-array (tal 3A, 3A'). Gør det muligt at holde sig i 2 dage. Ændre halvdelen af medierne hver 2-3 dage (eller mere ofte hvis det er nødvendigt), at sikre, at områderne ikke forstyrres.
      Bemærk: Tilsætning af vækstfaktorer kan forbedre kultur overlevelse og modning.
  2. Måle elektriske aktivitet af neurale kugler.
    1. Oprette en multielectrode array (MEA) system med en temperatur-kontrolleret headstage. Opret et softwareprogram med en 5 Hz high-pass filter, og en 200 Hz lavpas-filter og en spike tærskel på 5 x standardafvigelse (SD).
    2. Placer MEA på headstage og optage spontane elektriske aktivitet (figur 3BB'). Gemme raw data herunder spike frekvens og amplitude til statistiske analyser.
      Bemærk: En perfusion system kan blive udnyttet med MEA at tilføje farmakologiske stoffer eller at øge strømmen af frisk medier for langsigtet optagelse. Yderligere efterbehandling af pigge kan udføres som ønskede36,37.

5. måling af Synaptic tæthed med immuncytokemi

  1. Forberede reagenserne.
    1. For at gøre en 500 mL stamopløsning af 4% PARAFORMALDEHYD (PFA), 400 mL 1 x PBS tilsættes til et glas bægerglas eller en røre plade i en ventileret hætte. Tilsæt stir bar og varme til 60 ° C under omrøring; ikke koge. Tilsættes 20 g PFA pulver til den opvarmede PBS løsning og hæve pH til 6,9 af langsomt tilføje 1 N NaOH dråbevis.
      Bemærk: 4% PFA løsning kan være aliquoted og opbevares ved 4 ° C i op til en måned.
    2. Tilsættes 20 g eller 30 g saccharose 100 mL PBS at gøre 20% og 30% løsninger af saccharose, henholdsvis.
    3. Der tilsættes 1 mL af vaskemiddel til 10 mL PBS til at forberede en 10% stamopløsning. Invertere flere gange for at homogenisere.
    4. Tilføje 250 µL af 10% vaskemiddel stamopløsning (endelig koncentration på 0,25%) og 500 µL af ged og æsel sera (endelig koncentration på 5% hver) til 10 mL PBS til at forberede den primære blokerende buffer.
    5. Tilsættes 100 µL af ged og æsel sera (endelig koncentration på 1% hver) til 10 mL PBS til at forberede den sekundære blokerende buffer.
  2. Forberede prøverne.
    1. Overføre kugler i en 15 mL konisk slange, tillade dem at slå sig ned i bunden af røret og Opsug den gamle medier. Skyl kugler med 500 µL af PBS, lad bosætte sig og Opsug PBS. Tilsættes 500 µL af 4% PFA (eller nok til at dække områder) og inkuberes ved 4 ° C i 30 min.
    2. Opsug PFA og forsigtigt vaskes to gange med PBS. Tilføj 20% rørsukkeropløsning og inkuberes ved 4 ° C for flere timer eller natten over. Omhyggeligt Aspirér, tilføje 30% rørsukkeropløsning, og der inkuberes ved 4 ° C i flere timer eller natten over.
      Bemærk: Prøver kan opbevares ved 4 ° C i enten PBS eller saccharose i op til 1 uge før du fortsætter til næste trin. Hvis ikke udskæring, opretholde som 3D kugler (figur 4A-C) i 1,5 mL rør og Fortsæt til trin 5.3.
    3. Hvis udskæring kugler, omhyggeligt overføre kugler til en indlejring kryogene mug på toppen af tøris. Opsug 30% rørsukkeropløsning og langsomt hæld væv indlejring løsning i formen, indtil den fuldt ud dækker den prøve, at undgå luftbobler. Vent, indtil løsningen fryser og opbevares ved-80 ° C indtil kryostaten udskæring.
    4. Ved hjælp af en kryostaten på-20 ° C, Skive de indlejrede blokke i 30 µm sektioner (eller efter ønske) og overførsel på glas dias. Opbevares ved-80 ° C indtil klar til pletten.
  3. Immunostain kugler.
    1. Skitsere kanterne af dias med en hydrofobe PAP pen til at forhindre spildes væske. Forberede primære og sekundære blokerende løsninger med antistoffer (Se Tabel af materialer). Tilføje 500 µL af primære blokerende buffer til hver dias eller tube og inkuberes ved stuetemperatur i 30 min.
    2. Fjern væsken, tilføje 500 µL af frisk primære blokerende buffer med fortyndet primære antistoffer til hver dias eller rør, og der inkuberes natten over ved 4 ° C. Fjerne primære antistof løsning og vask 3 x med PBS i 10 min.
    3. Tilføje 500 µL af sekundære blokerende buffer med fortyndet sekundære antistoffer til hver dias eller tube og inkuberes ved 4 ° C for 1 h. fjerne sekundær antistof løsning og vask 3 x med PBS i 10 min.
      Bemærk: En liste over anbefalede antistoffer er fastsat i Tabel af materialer. Andre antistoffer eller farvestoffer kan bruges som ønsket. Udsæt ikke fluorescerende prøver for lys (trin 5.3.3 fremefter).
    4. Tilsæt 50 µL af montering løsning dråbevis at dække overfladen og omhyggeligt placere en coverslip over dias, undgå boblerne. Tillad dias til tørt ved stuetemperatur i 24 timer og opbevares ved 4 ° C.
  4. Billede af dias.
    1. Bruge en Konfokal eller to-photon fluorescerende mikroskop med en 63 X oliebestandighedsobjektet til billede før og efter synaptic protein overflod og colocalization inden for kugle skiver (figur 4D). Bruge en 20 X eller 40 X mål for at visualisere morfologiske træk af hAstros.
    2. Åben fluorescens billedfiler med ImageJ software. Tæller pre og post synaptic puncta manuelt ved hjælp af celle Counter plug-in, ved hjælp af en uvildig tælle metode, som tidligere detaljerede38eller med alternative metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når udført korrekt, vil denne protokol producere definerede populationer af funktionelle cocultures astrocytter28,33,34 og neuroner35 genereret fra hPSCs (figur 1A-1C), som detaljerede tidligere26 og beskrevet her i trin 2.1-2.2. Denne trinvis procedure, med brug af microwell plader, forventes at give 3D neurale kugler af ensartet størrelse og form (trin 3.3; Figur 1 d) med jævnt spredt celler og uden betydelige tegn på celledød. En vifte af start celle tætheder, med en ønskede forholdet mellem celletyper, vil producere kugler i varierende størrelser. I mangel af microwell plader, celler vil kombinere til form betydeligt større og uensartet aggregater hvis diametre (> 2 mm) overgå grænsen for diffusion (figur 2A-2B). Det forventes, at brugen af en spinner kolbe eller tilsvarende bioreaktor vil bevare ensartethed blandt kugler og reducere fusion (trin 3,4; Figur 2 c). Men mens spinner kolber tillader kultur af kugler i uger, deres anvendelse er ikke nødvendige.

For at stabilisere cocultures til elektrofysiologiske analyse, ECM-efterligne substrater tillader kugler til let overholde samtidig bevare deres 3D struktur (figur 3A, 3A'). Under optagelser, vil sund kugler af iNeurons placeret på MEAs spontant fremkalde spændingsstigninger større end ± 40 µV med konsekvent fyring frekvenser (trin 4.1-4.2; Figur 3B -C, 3F). Coculture kugler forventes at vise større netværksforbindelse med tilstedeværelsen af hAstros, som medfører en forøgelse af synkron netværk byger af pigge (figur 3B-3 C). Anvendelsen af CNQX35,39,40, en postsynaptiske AMPA receptor antagonist, reducerer netværk burst synchrony i coculture områder (figur 3D'-3E').

Neurale celletype begrænset protein markører vise visuelt jævnt spredt arrangement og astrocytter og neuroner i 3D kugler modenhed. En maksimal projektion af astrocyte morfologi og forgrening er vist i figur 4A i en repræsentativ 3D kugle med hAstros tyndt mærket med membran-bundet normal god landbrugspraksis. Modne hAstros express markører herunder GFAP (figur 4B), S100B og Glt134, mens hNeurons og iNeurons express mikrotubulus-forbundet protein 2 (MAP2; Figur 4 c) og tubulin beta 3 (Tuj1/TUBB3). Selvom iNeurons express pre og post synaptic proteiner herunder Synapsin 1 (Syn1) og Homer eller PSD95, henholdsvis, forstærkes synaptic tæthed endelig væsentligt af tilstedeværelsen af hAstros i coculture (figur 4D)26. Hvis det er tilgængeligt, vil alternativ anvendelse af hjernen clearing-teknikker og lys ark mikroskopi aktiverer hurtig billedbehandling af intakt kugler.

Tilsammen, udtryk for modne neurale markører sammen med spontane elektriske aktivitet bekræfte succes af den protokol, der er beskrevet ovenfor i produktion af 3D cocultures af funktionelle synaptic mikrokredsløb.

Figure 1
Figur 1: trinvis skildring af differentiering og dannelsen af 3D neurale kugler afledt af hPSCs. (A) tidslinje over vigtige trin i protokollen. (B) rene bestande af neurale celler kan genereres fra menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hPSCs). For generation af astrocyte ophav (stiplede grønne boks), se trin 2.1 samt Ref28. (C) inducerbar neuroner (iNeurons; Se afsnit 2.2) genereret fra transgene hPSCs via induceret overekspression af neurogenin 2 demonstrere neuronal morfologi på 2D ECM (dag 7) og er positive for MAP2 (indsat). (D) kugler fjernet fra microwell plader (Se trin 3.1-3.3) viser ensartet størrelse for high throughput screening. Kugler kan være kulturperler i en spinner kolbe bioreaktor (inset; se trin 3,4) hvis det ønskes at forhindre fusion. Skalalinjen = 50 µm (C, indsat). Skalere barer = 200 µm (A, D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: systematisk og reproducerbare generation af bioengineered 3D neurale kugler. (A) Microwell (µ-godt) kultur plader anvendes til at danne 3D neurale kugler ønskede tæthed og neuron til astrocyte nøgletal på en systematisk og bruger-specificeret måde, fremstilling af ensartet størrelse og form. Billeder vises 1 dag efter sfære dannelse. Skalere barer = 200 µm. (B) en række starter celle tætheder (fra 4 x 103 til 2 x 104 celler pr. microwell) producerer kugler i varierende størrelser. I mangel af microwell plader, hPSCs kombinere at form betydeligt større og uensartet aggregater hvis diametre overgå grænsen for diffusion efter en uge (n = 6-14 kugler pr. gruppe og tid). (C) iNeuron kugler kulturperler i en spinner kolbe på 80 rpm udstillet mindre fusion og således var væsentligt mindre, mere ensartede, og udstillede større cirkularitet i forhold til dem i stillestående kultur over en periode på tre uger (n = 6-51 kugler pr. gruppe og tid). Parceller repræsenterer gennemsnit ± SD; * Angiver betydning (p < 0,05) mellem grupper, bestemmes ved hjælp af to-sidede t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: repræsentant live synaptic fysiologi af neurale kugler på multielectrode arrays (MMA). (A, A') MMA er udnyttet til at måle live synaptic fysiologi af neurale kugler. Kugler af iNeurons (A) eller cocultures af iNeurons og hAstros (A') kan være kulturperler på MEA overflader med ECM-efterligne substrater (Se trin 4.1). (B, B') Raster parceller af repræsentative spontane elektriske aktivitet måles på tværs af alle elektroder (lodret akse) under en optagelse vindue (vandrette akse). Efter 4 uger af kultur i neurofysiologiske basal medium41, iNeuron kugler (B) vises spontan pigge, mens coculture sfærer (B') viste øget netværk byger af synkron affyring mønstre (orange pil). (C, C') Histogram af pigge målt under MEA optagelse vinduer fra repræsentative elektroder. (D, D') Raster parceller af spontane elektriske aktivitet måles på tværs af alle elektroder efter anvendelsen af 50 µM CNQX, en AMPA receptor antagonist (samme tidshorisont som B, B'). CNQX elimineret tilstedeværelsen af synkron byger af pigge observeret i cocultures (D').  (E, E') Histogram af pigge målt under MEA optagelse vinduer fra repræsentative elektroder efter 50 µM CNQX ansøgning (samme tid skala som C, C'). (F) kort over spike tracings af iNeuron kugler fra alle elektroder over tid (til venstre). Demonstrativ enkelt elektrode vise flere klynger spor over tid (midten); enkelte spike spor kan sorteres og analyseres individuelt (til højre). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: karakteristiske Immunhistokemi af synaptic mikrokredsløb. (A) en membran-bundet normal god landbrugspraksis (mGFP) reporter er nyttige til at undersøge arrangement og morfologi af hAstros i 3D neurale kugler. (B) hAstros differentieres fra hPSCs er GFAP-positive. (C) kugler indeholdende hAstros og iNeurons kan visualiseres og analyseres ved hjælp af celle type-begrænset protein markører som GFAP og MAP2. Skalere barer = 50 µm. (D) repræsentative billeder af præ- og post synaptic tætheder (Syn1 og PSD95, henholdsvis) i kugler af iNeurons uden (venstre) og med (højre) cocultured hAstros. En væsentligt øget tæthed af colocalized Syn1 og PSD95 blev observeret i coculture områder i forhold til iNeuron kugler i dag 35, demonstrerer hAstros evne til at fremkalde synapse dannelse (n = 3 uafhængige gentagelser hver; data Genoptrykt fra Ref 26 med tilladelse). Skalere barer = 10 µm. Plot repræsenterer gennemsnit ± SEM; betydelige forskelle (* angiver p < 0,05; ** angiver p < 0,01) mellem grupper blev bestemt ved hjælp af to-sidede t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokol beskriver vi en systematisk metode til fremstilling af 3D kugler af neurale cocultures. Områderne består af astrocytter og neuroner, som er afledt uafhængigt af hPSCs. Dog ikke i fokus i denne protokol, generation af ren populationer af astrocytter fra hPSCs28 er et kritisk skridt og kan være en teknisk udfordring, hvis udføres uden forudgående erfaring. Dette første skridt i generation af disse synaptic mikrokredsløb bør udføres med minutiøse tidtagning og sans for detaljer. En begrænsning af brugen af hPSC-afledte astrocytter er den langvarige differentiering proces; men produktion af store mængder af celler, der kan fryses for fremtiden brug og optøet på tidspunktet for eksperimenter (Se trin 2.1.5) eliminerer behovet for at begynde processen fra den oprindelige hPSC fase. Selv om en iNeurons, genereret fra transgene hPSCs er synaptogenic og har mulighed for at udstille spontan postsynaptiske elektriske strømme, begge egenskaber især er forbedret ved tilstedeværelsen af glia12,35— herunder hAstros detaljeret i denne protokol. Således skal det bemærkes, at valget af celletype, nummer, og udviklingsstadiet eller modenhed er et afgørende element i denne protokol, og tilpasninger kan resultere i variationer i elektriske aktivitet eller synapse visualisering. Denne protokol tillader dog også manipulation af celle tæthed eller nøgletal på en måde, der afspejler fleksibiliteten mulige betingelser eller resultater fra den enkelte forsker.

Som beskrevet ovenfor, tager vi fordel af bioteknologiske værktøjer til at producere et alternativ neurale organoid metoder42,43, med det forbehold, at dette system ikke sammenfatte selvorganisering og lagdeling fænotyper af organoids, der kan være ønsket20,44. Den samtidige anvendelse af microwell kultur plader26 og en spinner kolbe bioreaktor45,46 sikrer reproducerbarhed, dermed strømline ikke blot produktion, men også undersøgelsen og analyse af neurale mikrokredsløb med en bred vifte af celle kultur assays. Det skal understreges, at selv om brugen af en spinner kolbe eller tilsvarende bioreaktor er valgfri, en stationær kultur af kugler i tæt kontakt kan resultere i deres fusing sammen, således begrænsende næringsstoffer og ilt ud over grænsen for diffusion i centrum af kugler47. Især, brugen af 3D trykte mini-bioreaktorer er blevet rapporteret som en højere overførselshastighed tilgang i forhold til store bioreaktorer46.

Traditionelle værktøjer til at måle synaptic dannelse omfatter fysiologiske metoder sådan hele-celle patch fastspænding, MEAs36,48,49, og calcium imaging50. Her vælger vi at beskrive brugen af multilaterale miljøaftaler, da de giver en enkel og høj overførselshastighed undersøgelse af elektriske aktivitet i område på en kort tidshorisont. Andre teknikker kan dog også udnyttes.

En begrænsning af brugen af microwell plader i denne protokol er det maksimale antal kugler (~ 300) og celler pr. kugle (~ 2 x 104) der er tilladt i hver brønd. Alternative område dannelse værktøjer kan anvendes til et øget antal; imidlertid vil et højere antal celler kraeves ved udgangspunktet. 24-godt format blev valgt her for sin evne til at generere større kugler, der kan være håndteret for analyse og synlige med det blotte øje, samtidig begrænse celledød i midten af kugler. Samlet set vil tilføjelsen af dette trin til protokollen sikre en robust og skalerbar produktion af ensartede 3D kugler.

Vores protokol kan også prale af fleksibilitet for justering af antallet og forholdet mellem hver celletype og muligheden for at indføre andre celletyper i 3D kugler i et kontrolleret, definerede måde. Brugen af regionsspecifikke neuronale og astrocyte undertyper tillader undersøgelse af synaptisk mikrokredsløb af forskellige regioner i det centrale nervesystem. Disse coculture områder kan også være smeltet sammen51 for at studere cellulær migration og lang rækkevidde signalerer. Tilsætning af oligodendrocytes, endotelceller eller mikroglia kunne bevise disse 3D kugler til at være en informativ hjerne model med øget kompleksitet, som en lovende fremtidige retning for denne metode. Endelig, ud over sygdom og skade modeling, dette system tillader undersøgelse af terapeutiske tilgange, såsom cellulære substitutionsterapi eller udvikling af lægemidler til at forbedre neuroregeneration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Dr. Erik Ullian (UCSF) for intellektuelle bidrag til udformningen af disse procedurer, Dr. Michael Ward (NIH) for teknisk rådgivning om iNeuron differentiering, og Saba Barlas for foreløbige billedanalyse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 well plate Fisher Scientific 08-772-1B
15 mL conical tubes Olympus Plastics 28-101
Accutase Sigma A6964-100ML Detachment solution
AggreWell plate Stemcell Technologies 34850
Anti-Adherence Rinsing Solution Stemcell Technologies 7010 Prevent cell adhesion to microwell plates
Anti/anti Thermofisher 15240062
B27 Thermofisher 17504044 Media Supplement
BrainPhys neuronal medium Stemcell Technologies 5790 Neurophysiological basal medium alternative
Circular glass coverslips Neuvitro GG-12-oz
Cryostor CS10 Stemcell Technologies 7930 Cryopreservation medium with 10% DMSO
DMEM/F12 Thermofisher 10565-042 With GlutaMAX supplement
DMH-1 Stemcell Technologies 73634 HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 μM
Donkey serum Lampire Biological Laboratories 7332100 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Doxycycline Hydrochloride (Dox) Sigma D3072-1ml HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 μg/mL
Epidermal growth factor (EGF) Peprotech AF-100-15 Working concentration: 10 ng/mL
Fibroblast growth factor-2 (FGF) Peprotech 100-18B Working concentration: 10 ng/mL
Fluoromount-G mounting solution Southern Biotech 0100-01
Glass slides Fisherbrand 22-037-246
Goat serum Lampire Biological Laboratories 7332500 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Hemacytometer or automatic cell counter Life Technologies AMQAX1000
Heparin Sigma H3149-50KU Working concentration: 2 mg/mL
Magnetic plate DLAB 8030170200
Matrigel membrane matrix Corning 354230 ECM coating solution. Working concentration: 80 μg/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.
MEA 2100 System Multichannel Systems MEA2100
Mounting solution
N2 Thermofisher 17502048 Media Supplement
OCT Tissue-Tek 4583 Tissue embedding solution for cryosectioning
Pap Pen (Aqua Hold) Scientific Device Laboratory 9804-02
Paraformaldehyde (PFA) Acros Organics 169650025 HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS
Phosphate buffered saline (PBS) Stemcell Technologies CA008-300
Poly-l-ornithine (PLO) Sigma P3655-100MG Working concentration: 0.5 mg/mL
Rectangular glass cover slips Fisherfinest Premium Superslip 12-545-88
ReLeSR Stemcell Technologies 5872 Detachment and passaging reagent
Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y) Tocris 1254 Working concentration: 10 uM
SB431542 Stemcell Technologies 72234 Working concentration: 2 μM
Spinner flasks Fisher Scientific 4500-125
Sucrose Fisher Chemical S5-3 Working concentration: 20% or 30% in PBS
T25 Culture Flask Olympus Plastics 25-207 Vented caps
T75 Culture Flask Olympus Plastics 25-209 Vented caps
Terg-A-zyme Sigma Z273287-1EA Detergent. Working concentration: 1%
TeSR-E8 basal medium Stemcell Technologies 5940 Human pluripotent stem cell (hPSC) medium
TeSR-E8 supplements Stemcell Technologies 5940 Supplements for human pluripotent stem cell medium
TritonX-100 Sigma X100-500ML Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer
Trypan blue Invitrogen T10282
Antibodies
AlexaFluor 488 Thermofisher A-11029 Secondary antibody
AlexaFluor 594 Thermofisher A-11037 Secondary antibody
Ezrin Thermofisher MA5-13862 Primary antibody; astrocytes perisynaptic
GFAP Chemicon MAB360 Primary antibody; astrocytes
GFP Aves GFP-1020 Primary antibody; astrocytes
Glt1 Gift from Dr. Jeffrey Rothstein n/a Primary antibody; astrocytes
Homer Synaptic Systems 160 011 Primary antibody; neurons, post-synaptic
MAP2 Synaptic Systems 188 004 Primary antibody; neurons
PSD95 Abcam ab2723 Primary antibody; neurons, post-synaptic
S100 Abcam ab868 Primary antibody; astrocytes
Synapsin 1 Synaptic Systems 106 103 Primary antibody; neurons, pre-synaptic
TuJ1/β3-tubulin (TUBB3) Covance MMS-435P Primary antibody; neurons

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ullian, E. M., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Role for Glia in Synaptogenesis. Glia. 47, 209-216 (2004).
  2. Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
  3. Molofsky, A. V., et al. Astrocyte-encoded positional cues maintain sensorimotor circuit integrity. Nature. 509 (7499), 189-194 (2014).
  4. Sultan, S., et al. Synaptic Integration of Adult-Born Hippocampal Neurons Is Locally Controlled by Astrocytes. Neuron. 88, 957-972 (2015).
  5. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
  6. Cheung, G., Sibille, J., Zapata, J., Rouach, N. Activity-Dependent Plasticity of Astroglial Potassium and Glutamate Clearance. Neural Plasticity. , 109106 (2015).
  7. Ghezali, G., Dallerac, G., Rouach, N. Perisynaptic astroglial processes dynamic processors of neuronal information. Brain Struct Funct. 221, 2427-2442 (2016).
  8. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of Astrocytes and their Potential As Therapeutic Targets. Neurotherapeutics. 7, 338-353 (2010).
  9. Pál, B. Astrocytic Actions on Extrasynaptic Neuronal Currents. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 474 (2015).
  10. Kiray, H., Lindsay, S. L., Hosseinzadeh, S., Barnett, S. C. The multifaceted role of astrocytes in regulating myelination. Experimental Neurology. 283, 541-549 (2016).
  11. Allen, N. J., Eroglu, C. Cell Biology of Astrocyte-Synapse Interactions. Neuron. 96 (3), 697-708 (2017).
  12. Krencik, R., van Asperen, J. V., Ullian, E. M. Human astrocytes are distinct contributors to the complexity of synaptic function. Brain Research Bulletin. 129, 66-73 (2017).
  13. Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of Synapse Number by Glia. Science. 291, 657-662 (2001).
  14. Oberheim Bush, N. A., Nedergaard, M. Do Evolutionary Changes in Astrocytes Contribute to the Computational Power of the Hominid Brain? Neurochemical Research. 42 (9), 2577-2587 (2017).
  15. Han, X., et al. Forebrain Engraftment by Human Glial Progenitor Cells Enhances Synaptic Plasticity and Learning in Adult Mice. Cell Stem Cell. 12 (3), 342-353 (2013).
  16. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. The EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
  17. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  18. Dodla, M. C., Mumaw, J., Stice, S. L. Role of astrocytes, soluble factors, cells adhesion molecules and neurotrophins in functional synapse formation: implications for human embryonic stem cell derived neurons. Stem Cell Res Ther. , 251-260 (2010).
  19. Krencik, R., Ullian, E. M. A cellular star atlas: using astrocytes from human pluripotent stem cells for disease studies. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 1-10 (2013).
  20. Pasca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  21. Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144, 938-941 (2017).
  22. Mason, J. O., Price, D. J. Building Brains in a Dish: Prospects for Growing Cerebral Organoids from Stem Cells. Neuroscience. 334, 105-118 (2016).
  23. Kelava, I., Lancaster, M. A. Dishing out mini-brains: Current progress and future prospects in brain organoid research. Developmental Biology. 420 (2), 199-209 (2016).
  24. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  25. Sloan, S. A., et al. Human Astrocyte Maturation Captured in 3D Cerebral Cortical Spheroids Derived from Pluripotent Stem Cells. Neuron. , 779-790 (2017).
  26. Krencik, R., et al. Systematic three-dimensional coculture rapidly recapitulates interactions between human neurons and astrocytes. Stem Cell Reports. 9 (6), 1745-1753 (2017).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Krencik, R., Zhang, S. -C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 6 (11), 1710-1717 (2011).
  29. Du, Z. -W., et al. Generation and expansion of highly pure motor neuron progenitors from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 6, 6626 (2015).
  30. Neely, M. D., et al. DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: Comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction. ACS Chemical Neuroscience. 3 (6), 482-491 (2012).
  31. Lippmann, E. S., Estevez-Silva, M. C., Ashton, R. S. Defined Human Pluripotent Stem Cell Culture Enables Highly Efficient Neuroepithelium Derivation Without Small Molecule Inhibitors. Stem Cells. 32, 1032-1042 (2014).
  32. Eggan, K., Kawada, J., Kaneda, S., Kirihara, T., Maroof, A. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9, 1441-1449 (2017).
  33. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -J., Zhang, S. -C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  34. Krencik, R., et al. Dysregulation of astrocyte extracellular signaling in Costello syndrome. Science Translational Medicine. 7 (286), 286 (2015).
  35. Wang, C., et al. Scalable Production of iPSC-Derived Human Neurons to Identify Tau- Lowering Compounds by High-Content Screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  36. Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays. Frontiers in Neuroscience. 10, (2016).
  37. Kapucu, F. E., Mäkinen, M. E., Tanskanen, J. M. A., Ylä-Outinen, L., Narkilahti, S., Hyttinen, J. A. K. Joint analysis of extracellular spike waveforms and neuronal network bursts. Journal of Neuroscience Methods. 259, 143-155 (2016).
  38. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number. Journal of Visualized Experiments. 45, 2-9 (2010).
  39. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  40. Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture. Scientific reports. 6, 26181 (2016).
  41. Bardy, C., Hurk,, et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. PNAS. 112 (25), E2725-E2734 (2015).
  42. Monzel, A. S., et al. Derivation of Human Midbrain-Specific Organoids from Neuroepithelial Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1144-1154 (2017).
  43. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  44. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2018).
  45. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7647), 373-379 (2013).
  46. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  47. Yan, Y., et al. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. , 1-46 (2016).
  48. Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 9 (JAN), 423 (2015).
  49. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), 1-7 (2010).
  50. Shigetomi, E., Patel, S., Khakh, B. S. Probing the Complexities of Astrocyte Calcium Signaling. Trends in Cell Biology. 26 (4), 300-312 (2016).
  51. Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Lévi-strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nat Methods. 14 (7), (2017).

Tags

Udviklingsmæssige biologi spørgsmålet 138 stamceller neuroner astrocytter synapser Organoid Coculture bioreaktor Multielectrode array
Synaptic dataloger modellering med 3D Cocultures astrocytter og neuroner fra humane pluripotente stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cvetkovic, C., Basu, N., Krencik, R. … More

Cvetkovic, C., Basu, N., Krencik, R. Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (138), e58034, doi:10.3791/58034 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter