Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Synaptic resonanskrets modellering med 3D Cocultures av astrocyter och nervceller från mänskliga pluripotenta stamceller

Published: August 16, 2018 doi: 10.3791/58034
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Neuroregeneration, Department of Neurosurgery, Houston Methodist Research Institute

Summary

I detta protokoll, vi strävar efter att beskriva en reproducerbar metod för att kombinera dissocierade mänskliga pluripotenta stamceller som härrör nervceller och astrocyter tillsammans i 3D sfär cocultures, bibehålla dessa sfärer i fri svävande villkor, och därefter mäta synaptic krets aktiviteten av sfärer med immunoanalysis och multielectrode array inspelningar.

Abstract

Ett hinder för vår förståelse av hur olika celltyper och signaler bidrar till synaptic krets funktion är bristen på relevanta modeller för att studera den mänskliga hjärnan. En ny teknik som löser problemet är användningen av tre dimensionell (3D) neurala cellkulturer, kallas 'organoids' eller 'spheroids', för långsiktigt bevarande av intercellulära interaktioner inklusive extracellulära adhesionsmolekyler. Dessa kultur-system är dock tidskrävande och inte systematiskt genererade. Här vi detalj en metod för att snabbt och konsekvent producera 3D cocultures nervceller och astrocyter från mänskliga pluripotenta stamceller. Första, före differentierade astrocyter och neuronala stamfäder är separerade och räknade. Nästa, celler kombineras i sfär-bilda rätter med en Rho-tyrosinkinashämmare och specifika nyckeltal att producera sfärer av reproducerbara storlek. Efter flera veckor av kultur som flytande klot, är cocultures ('asteroider') Slutligen sektioneras för immunfärgning eller förkromad vid multielectrode matriser för att mäta synaptisk densitet och styrka. Det förväntas allmänt att detta protokoll kommer att ge 3D neurala sfärer som Visa mogen cell-typ begränsad markörer, bilda funktionella synapser och uppvisar spontana synaptic nätverksaktivitet burst. Tillsammans, tillåter detta system drogkontroll och utredningar av mekanismer av sjukdom i en mer lämplig modell jämfört med enskiktslager kulturer.

Introduction

Astrocyter är en mycket riklig glial celltyp inom det centrala nervsystemet (CNS) med en mängd funktionella ansvar bortom strukturellt stöd. Genom utsöndring av lösliga synaptogenic faktorer och extracellulär matrix (ECM) komponenter, astrocyter stöd i upprättandet och klustring av mogen synapser under utveckling1. De också spelar en avgörande roll i att upprätthålla hälsa och plasticitet i synapser till extracellulära signalering2,3,4,5, och bidrar till långsiktiga stabilitet homeostatiska miljöer genom att reglera extracellulära kalium och glutamat, samt utsöndringen av energisubstrat och ATP6,7,8. Slutligen, de kan bidra till neurotransmission genom att påverka extrasynaptic strömmar9och kan indirekt påverka verksamhet genom andra celltyper som främjande myelinisering10. Ännu viktigare, eftersom abnormitet eller dysfunktion av astrocyter kan leda till många neurologiska syndrom och vuxen neuropatologi, finns det ett uppenbart behov av att inkludera astrocyter tillsammans med nervceller inom bakåtkompilerade neurala nätverk för en förbättrad modell av endogena hjärnan miljön. En integrerad kännetecken av astrocyter är deras förmåga att bilda dynamisk interaktion med nervcellernas synapser1,11,12. I avsaknad av glia bildar nervceller ett begränsat antal synapser, som i allmänhet också saknar funktionell mognad13.

Mänskliga astrocyter uppvisar morfologiska, transkriptionell och funktionella egenskaper — såsom ökad storlek och komplexitet av förgrenade, liksom artspecifika gener — som är inte återgetts i gnagare12,14, 15. Som ett resultat, studier utnyttja mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC)-härledda neurala celler har blivit allmänt accepterat som ett medel för att undersöka CNS-relaterade sjukdomar i vitro samtidigt utveckla nya terapier, skada modeller och kultur paradigm16 ,17. Dessutom tillåter hPSCs studiet av mänskliga synaps bildning och funktion utan behov av primära vävnad18,19.

Ett hinder för vår förståelse av hur olika celltyper och signaler bidrar till synaptic krets funktion är bristen på relevanta modeller av den mänskliga hjärnan. Det finns ett behov av en lämplig plattform för att sammanfatta dess synaptic nätverk med HiFi och reproducerbarhet. Nyligen, intresse vuxit fram i produktionen av 3D kultur system (allmänt känt som 'organoids,' 'spheroids' eller 'mini hjärnor')20 att modellera komplexa tredimensionella (3D) strukturer på cellulär och makro. 3D kultur system behåller ECM och cell-cell interaktioner som är normalt frånvarande eller begränsad under typiska 2D coculture paradigm21,22. Ett överflöd av tekniker finns för odling 3D neurala spheroids23,24,25; men många kräver långa kultur perioder (månader till år) för spontan utveckling och lager bevarande, med användaren uppvisar mycket liten kontroll över produktionen.

Här vi illustrera en systematisk metod för att snabbt och konsekvent bioengineer neurala interaktioner bland flera celltyper (pre differentierade nervceller och astrocyter) härstammar från hPSCs genom montering celler i området cocultures ('asteroider')26 som recapitulate mänskliga-specifika morfologiska komplexiteten i 3D. Detta högdensitets neurala system genererar jämnt spridda neurala undertyper som ta på mogen egenskaper över tiden och kan screening eller analyserats på ett sätt som hög genomströmning. Vi visar för första gången att mänskliga astrocyter inducerar synaptic burst nätverksaktivitet i dessa 3D cocultures. Detta protokoll är dessutom lätt att anpassa till generera sfärer av olika storlekar, att utnyttja celler som anges till olika regionala identiteter i CNS, och att studera interaktioner mellan flera andra celltyper som önskas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. cell kultur och REAGENSBEREDNING

Obs: Protokollen i detta avsnitt är skrivna i den ordning som de visas i protokollet differentiering (avsnitt 2). Se Tabell för material för material och katalognummer.

  1. Förbereda plattorna för cellodling.
    1. Späd extracellulär matrix (ECM) beläggning lösningen med DMEM/F12 media att förbereda en 1 mg/mL stamlösning. Alikvotens utspädda ECM stamlösning till 30 koniska rör 3 mL varje och omedelbart förvaras i-20 ° C. För en fungerande lösning, att resuspendera 3 mL ECM lager i 33 mL före kylda DMEM/F12 media, föra den totala volymen till 36 mL till en koncentration på 80 µg/mL.
    2. Coat 1 mL per brunn 6-väl cell kultur platta med ECM fungerande lösning. Lägg till ytterligare 1 mL DMEM/F12 per brunn (om nödvändigt) för att säkerställa att ytan av brunnen är helt täckt. Tillåta cellen 6-väl belagda kultur plattor att sitta vid rumstemperatur i minst 1 tim före användning.
      Obs: Plattorna kan lagras i inkubatorn eller vid 4 ° C i upp till 2 veckor.
  2. Förbereda media formuleringar, tillväxtfaktorer och små molekyler.
    1. För att förbereda mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC) medium27500 mL, tillsätt 20 x och 500 x kosttillskott enligt tillverkarens instruktioner.
    2. För att förbereda 500 mL neurala medium (NM), lägga till heparin till en slutkoncentration av 2 mg/mL, 1 x antibiotikum/antimycotic lösning, 1 x B27 tillägg eller 1 x N2 tillägg till en 500 mL flaska DMEM/F12 med L-glutamin tillskott som tidigare detaljerade28.
    3. Att förbereda en 10 mM (1, 000 x) stamlösning av Rho-Kinase Inhibitor Y27632 (Y), lägga till 10 mg pulver till 3 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Filter sterilisera, delprov, och förvaras vid-20 ° C. Använd en 10 µM arbetande koncentration i media.
    4. Att förbereda en 20 mM (10, 000 x) stamlösning av SB431542, lägga till 10 mg pulver till 1,3 mL av dimetyl sulfoxid (DMSO). Att förbereda en 2 mM (1, 000 x) stamlösning av DMH1, lägga till 10 mg pulver till 13,1 mL av DMSO. Filter sterilisera, delprov, och varje förvaras vid-20 ° C. Använd varje på en 2 µM arbetande koncentration i media (NM + SB431542 + DMH1).
      Obs: Detta protokoll rekommenderar 2 µM arbetande koncentrationer av både SB431542 och DMH1 utifrån våra observationer och rapporter från andra29 anger att denna koncentration effektivt främjar neurala induktion från hPSCs. Högre koncentrationer har också rapporterade30. Dessutom med alternativa media, har det också visat att små molekyler inte är nödvändiga för hög neurala konvertering31. Således arbetar koncentrationer varierar beroende på alternativa cell kultur miljöer och optimala koncentrationer bör testas av enskilda forskare.
    5. Att förbereda enskilda 100 µg/mL (10, 000 x) stamlösningar av epidermal tillväxtfaktor (EGF) och fibroblast tillväxtfaktor-2 (FGF2), Lägg till 1 mg av varje i 10 mL PBS + 0,1% BSA. Alikvotens EGF och FGF2 lagerför lösningar till 50 µL portioner och lagra vid-80 ° C. Använd varje i en 10 ng/mL arbetande koncentration i media; t.ex., tillsätt 5 µL EGF och 5 µL FGF2 till 50 mL NM (NM + EGF + FGF2).
    6. För att förbereda en stamlösning av doxycyklin hydroklorid (Dox), först Lös upp pulvret i DMSO till 100 mg/mL och förvaras vid-20 ° C. Späd ytterligare för att göra en 2 mg/mL (1, 000 x) stamlösning i PBS och förvaras vid-20 ° C. Använda vid 2 µg/mL arbetande koncentration i media; t.ex., tillsätt 50 µL Dox till 50 mL NM (NM + Dox).
      Obs: Får inte frysas på nytt lösningar efter upptining.

2. generation av neurala undertyper från mänskliga inducerade pluripotenta celler (hPSCs)

Obs: Alla cellkulturer bör bibehållas i en inkubator med 5% CO2 vid 37 ° C. Dessa kulturer bibehålls på rummet syrenivåer, även om lägre nivåer kan utnyttjas.

  1. Generera och underhåll Astrocyten stamfäder (hAstros) från hPSCs.
    Obs: Detta avsnitt ger en kort och förenklat differentiering-protokollet. För en detaljerad beskrivning (med embryoid kropp bildandet, rosett urval och regionala mönster steg) hänvisa till de tidigare beskrivna protokollet28 (figur 1A, prickade gröna rutan).
    1. Utsäde kluster av hPSCs (figur 1B) på ECM-belagd 6 brunnar (se steg 1.1) med 2 mL hPSC medium + Y per brunn. Foder stamcellerna varje dag tills de är ca 50% konfluenta och split som behövs.
      1. Dela upp hPSCs, tillsätt 1 mL passaging reagens till brunnar och aspirera efter 1 min. Inkubera cellerna i rumstemperatur i 5 min, tillsätt 1 mL av hPSC medium, och split aggregat 1:10 på nya ECM-belagd brunnar i 2 mL hPSC medium + Y per brunn.
    2. Upprätthålla stamcellerna tills de är ca 50% konfluenta, sedan ändra media till NM + SB431542 + DMH1 för att inducera neurala differentiering (dag 0). När cellerna är ca 95% konfluenta, split 1:6 i nya ECM-belagd brunnar i samma medium.
    3. Dag 14, dissociera cellerna med avlossning lösning och överför till en icke-belagda kolv med Y att främja bildandet av aggregat.
      Obs: Tillägg av Y utnyttjas för att främja överlevnad och sfär-cellbildande men ingår inte under varje matning.
    4. För generationen av neuronala stamfäder och nervceller (hNeurons), Använd dessa dag-14 celler som beskrivs nedan. Alternativt, använda dessa celler vid senare tidpunkter från enskiktslager eller sfär kulturer innan nervcellernas mognad inträffar eller gliogenesis inleds.
      Obs: Som standard detta protokoll producerar dorsal-kortikala astrocyter. Astrocyten undertyper kan dock anges regionalt genom tillsats av mönstring morphogens om så önskas28,32,33. Retinoinsyra (RA) kan läggas till för att caudalize celler i ryggmärgen fenotyper, medan sonic hedgehog (SHH), glättas agonist (SAG), eller purmorphamine kommer att producera ventrala fenotyper.
    5. För generationen Astrocyten stamfäder och astrocyter i spontant bildade 3D aggregat (hAstrospheres), växla till NM + EGF + FGF2 och foder varje vecka (eller som behövs för att säkerställa stabila pH) som tidigare detaljerade34.
      1. Försiktigt separera hAstro aggregat med avlossning lösning när mörka centra visas och ta bort sfärer som spontant bifogar. Bryta sfärer försiktigt en gång i veckan att upprätthålla sphere hälsa och undvika nekrotisk kärnor.
        Obs: Inte överstiger 5 min behandling med avlossning lösning.
      2. Efter 4-6 månader av expansion, bekräfta frysa cellidentiteten och antingen i frysförvaring medium (enligt tillverkarens instruktioner) eller alternativa lagring villkor för långtidslagring i flytande kväve, eller Använd omedelbart för experimenterande.
    6. För att tina upp en frusen lager av hAstrospheres, snabbt Tina en injektionsflaska i rumstemperatur, överföra innehållet till en tom 15 mL koniska rör och centrifugera vid 300 x g för 1 min. Aspirera supernatanten, tvätta omsorgsfullt med DMEM/F12 och upprepa för sammanlagt två wash steg. Lägg till en T25 kolv med en total volym på 6 mL NM + EGF + FGF2 + Y (eller skala vid behov).
  2. Generera och underhåll inducerbara nervceller (iNeurons) från hPSCs.
    1. Utsäde transgena hPSCs (med en stabil doxycyklin-inducerbara neurogenin 2 transgenens35) på ECM-belagd 6-väl plattor med 2 mL hPSC medium + Y per brunn (som beskrivs ovan för icke-transgena linjerna). Foder varje dag med 2 mL media per brunn tills de är redo att lyfta på 70% konfluens. Dela celler som beskrivs i steg 2.1.2.
    2. När cellerna är ca 35% konfluenta, Lägg till NM + Dox inducera differentiering in iNeurons. Underhåll som en enskiktslager kultur med NM + Dox för 2 dagar innan du fortsätter till steg 3,2.
      Obs: Celler kommer övergången till neuronala stamfäder men kommer inte ännu förlänga neuriter (figur 1 c).

3. upprättande och underhåll av 3D-sfär Cocultures

  1. Separera hAstros från 3D aggregat i suspension (enligt beskrivningen i steg 2.1.5.1).
  2. Separera hNeurons eller iNeurons från en 2D enskiktslager.
    1. Ta bort medier från 6-väl plattan och tillsätt 500 µL av avlossning lösning till varje brunn innehållande enskiktslager kulturer. Inkubera vid 37 ° C för 5 min. Tillsätt försiktigt 2-3 mL DMEM/F12 om du vill ta bort bifogade celler.
    2. Samla in celler och media i en 15 mL koniska rör och centrifugera vid 300 x g i 1 min. Aspirera supernatanten, tillsätt 1 mL färsk media och Pipettera upp och ner försiktigt med en 1000 µL mikropipett att uppnå en enda cellsuspension.
  3. Form 3D sfärer med mikrobrunn kultur plattor.
    1. Förbereda plattan genom att tillsätta 0,5 mL anti följsamhet skölja lösning till varje brunn av mikrobrunn plattan. Centrifugera plattan vid 2000 x g i 5 min. Aspirera spolningslösning, tillsätt 1 mL DMEM/F12 till varje brunn för att tvätta och sug upp igen.
      Notera: Se alltid till att centrifugen är balanserad under användning.
    2. Räkna varje celltyp som använder en hemocytometer eller automatiserade cell räknare. Tillsätt önskad förhållandet mellan dissocierade hAstros och hNeurons eller iNeurons till varje brunn i en total volym på 2 mL NM + Y (inkludera Dox om iNeurons utnyttjas). Centrifugera plattan vid 100 x g i 3 min och återgå till inkubatorn.
      Obs: 24-väl mikrobrunn plattor (se Tabell för material) innehåller 300 mikrobrunnar per brunn. Lägga till ett minimum av 6 x 105 celler (för sfärer av 2 x 103 celler varje) och högst 6 x 106 celler (för sfärer av 2 x 104 celler varje) i 2 mL media per brunn. För livskraftiga områden av en specifik täthet inom detta spänner, använda en definierad mängd celler och dividera med 300 att beräkna antalet celler per sfär. Alternativa sfären bildar metoder och verktyg kan också användas om så önskas. Följ tillverkarens instruktioner för acceptabla intervall av cell tätheter.
    3. Tillåta celler att själv montera in i tätt packade sfärer inom mikrobrunn plattor under de kommande 2 dagarna (figur 2A). Byt ut 50% media om kulturen gulfärgning.
      Obs: Byter bara halva media och Pipettera försiktigt när du tar bort och lägger till media för att inte störa sfärer. Kulorna kan lyfta från mikrobrunnar och säkring tillsammans med högre kraft.
    4. Efter 2 dagar, ta försiktigt bort kulorna från mikrobrunnar med en 1000 µL mikropipett (figur 1 d). Lätt applicera kraft till botten av mikrobrunnarna med media för att ta bort eventuella ytterligare klibbade sfärer. Låt kulorna bosätta sig i en 15 mL koniska rör, aspirera gamla media och lägga till färska media.
  4. Ställa in spinner kolv bioreaktor systemet för att bilda 3D sfärer.
    1. Rengör ytan av en magnetisk uppståndelse plattan med 70% etanol, placera det i en cell kultur inkubator. Autoklav enskilda spinner kolvar att sterilisera.
    2. Lägga till områden med ett minimum av 50 – 60 mL media i varje spinner kolv (figur 1 d, infälld). Placera kolven på den magnetiska rör värmeplattan inställd på 60 rpm. Kultur sfärer i spinner kolvar tills de är redo för datainsamling.
      Obs: Minst 3 veckor i kultur behövs för synaps bildas. Om det spinner kolv bioreaktor systemet inte är önskvärd, kan sfärer vara odlade i stationära förhållanden i cell kultur kolvar eller rätter. Områden kan också vara inbäddade i ECM eller hydrogel.

4. mätning av levande Synaptic fysiologi med Multielectrode matriser (åtgärder)

  1. Förbereda åtgärder för cellodling.
    1. Ren yta av varje MEA med 1 mL av tvättmedel för 1 h. Skölj med sterilt avjoniserat vatten (DI) vatten, skölj med 70% etanol att sterilisera och sedan lufttorka i biosäkerhet skåp under UV-ljus.
      Obs: MEAs kan lagras i DI vatten vid 4 ° C under sterila förhållanden fram till användning.
    2. Förbereda en 0,5 mg/mL lösning av poly-ornithine (PLO) genom upplösning PLO 50 mg i 100 mL borsyra buffert. Täck ytan av varje MEA med 1 mL av PLO att göra ytan hydrofil och inkubera vid 37 ° C i minst 4 h. ta bort PLO, tvätta ytan med DI vatten, tillsätt 1 mL av ECM (se steg 1.1.1), och inkubera vid 37 ° C i minst 4 h.
    3. Ta bort ECM och placera sfärer i 1,5 mL media på en MEA yta, säkerställa att kulorna är placerade ovanpå den elektrod arrayen (siffror 3A, 3A'). Tillåta för att följa för 2 dagar. Ändra hälften av media varje 2 – 3 dagar (eller oftare vid behov), se till att kulorna inte störs.
      Obs: Tillägg av tillväxtfaktorer kan förbättra kultur överlevnad och mognad.
  2. Mäter elektrisk aktivitet av neurala områden.
    1. Konfigurera en multielectrode matris (MEA) system med en temperatur-kontrollerad headstage. Skapa ett program med ett 5 Hz högpass filter, ett 200 Hz lågpass filter och en spike tröskel på 5 x standardavvikelsen (SD).
    2. Placera MEA på headstage och spela in spontana elektriska aktivitet (figur 3BB'). Spara raw-data inklusive spike frekvens och amplitud för statistisk analys.
      Obs: Ett perfusion system kan utnyttjas MEA att lägga till farmakologiska agenter eller öka flödet av färska media för långsiktiga inspelning. Ytterligare efterbearbetning av spikar kan utföras som önskad36,37.

5. mätning av synaptisk densitet med immuncytokemi

  1. Förbereda reagenserna.
    1. För att en 500 mL stamlösning av 4% PARAFORMALDEHYD (PFA), lägga 400 mL 1 x PBS i en glasbägare eller en uppståndelse tallrik i en ventilerad huv. Lägga rör bar och värme till 60 ° C under omrörning; koka inte. Tillsätt 20 g PFA pulver till uppvärmd PBS lösningen och höja pH till 6,9 av långsamt NaOH 1 N droppvis.
      Obs: 4% PFA lösning kan vara aliquoted och lagras vid 4 ° C i upp till en månad.
    2. Tillsätt 20 g eller 30 g sackaros till 100 mL PBS att göra 20% och 30% lösningar av sackaros, respektive.
    3. Tillsätt 1 mL av tvättmedel till 10 mL PBS att förbereda en 10%-stamlösningen. Vänd flera gånger för att homogenisera.
    4. Lägga till 250 µL 10% tvättmedel stamlösning (slutlig koncentration på 0,25%) och 500 µL varje get och åsna serum (slutliga koncentration av 5% vardera) till 10 mL PBS att förbereda det primära blockerande buffert.
    5. Tillsätt 100 µL varje get och åsna serum (slutliga koncentration av 1% vardera) till 10 mL PBS att förbereda det sekundära blockerande buffert.
  2. Bereda proverna.
    1. Överföra kulorna i en 15 mL koniska rör, tillåta dem att bosätta sig på botten av röret och aspirera gamla media. Skölj sfärer med 500 µL av PBS, låt kvitta och aspirera PBS. Tillsätt 500 µL av 4% PFA (eller tillräckligt för att täcka områden) och inkubera vid 4 ° C i 30 min.
    2. Uppsugning av PFA och försiktigt tvätta två gånger med PBS. Lägg till 20% sackaroslösning och inkubera vid 4 ° C under flera timmar eller över natten. Noggrant aspirera, lägga till 30% sackaroslösning, och inkubera vid 4 ° C under flera timmar eller över natten.
      Obs: Prover kan lagras vid 4 ° C i PBS eller sackaros i upp till 1 vecka innan du fortsätter till nästa steg. Om inte skivning, upprätthålla som 3D sfärer (figur 4A-C) i en 1,5 mL tub och fortsätt till steg 5.3.
    3. Om skivning sfärernas, noggrant överföra sfärer till en inbäddning kryogen mögel ovanpå torris. Sug ut 30% sackaros lösningen och Häll långsamt vävnad inbäddning lösning i formen tills den täcker helt provet, att undvika luftbubblor. Vänta tills lösningen fryser och förvaras vid-80 ° C tills kryostaten skivning.
    4. Använda en kryostat vid-20 ° C, skiva de inbäddade block till 30 µm sektioner (eller som önskas) och överföring till objektglas. Förvaras vid-80 ° C tills det att färga.
  3. Immunostain kulorna.
    1. Skissera kanterna på bilderna med en hydrofob PAP pen att förhindra utspilld. Förbereda primära och sekundära blockerande lösningar med antikroppar (se Tabell för material). Tillsätt 500 µL av primära blockerande buffert till varje bild eller tube och odla i rumstemperatur i 30 min.
    2. Bort vätskan, tillsätt 500 µL färska primära blockerande buffert med utspädda primära antikroppar till varje bild eller tube och inkubera över natten vid 4 ° C. Avlägsna primär antikropp lösningen och tvätta 3 x med PBS för 10 min varje.
    3. Tillsätt 500 µL av sekundära blockerande buffert med utspädda sekundära antikroppar till varje bild eller tube och inkubera vid 4 ° C för 1 h. ta bort sekundär antikropp lösningen och tvätta 3 x med PBS för 10 min varje.
      Observera: En lista över rekommenderade antikroppar finns i Tabell för material. Andra antikroppar eller färgämnen får användas som önskat. Utsätt inte fluorescerande prover för ljus (framåt steg 5.3.3).
    4. Tillsätt 50 µL monteringslösning droppvis att täcka ytan och noggrant placera ett täckglas över bilden, att undvika bubblor. Låt bilderna ska torka i rumstemperatur i 24 timmar och förvaras vid 4 ° C.
  4. Bild bilder.
    1. Använda en confocal eller två-photon fluorescerande Mikroskop med en 63 X oljeimmersionsobjektivet bild före och efter synaptic protein överflöd och colocalization inom området skivor (figur 4 d). Använda en 20 X eller 40 X-objektiv för att visualisera morfologiska egenskaper av hAstros.
    2. Öppna fluorescens bildfiler med ImageJ programvara. Räkna före och efter synaptic puncta manuellt med hjälp av Cell räknaren plug-in, med en opartisk räknande metod som tidigare detaljerade38, eller med alternativa metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

När de utförs korrekt, kommer att detta protokoll producera definierade populationer av funktionella cocultures astrocyter28,33,34 och nervceller35 genereras från hPSCs (figur 1A-1C), som detaljerade tidigare26 och beskrivs här i steg 2.1-2.2. Detta stegvis förfarande, med användning av mikrobrunn plattor, förväntas ge 3D neurala områden med enhetlig storlek och form (steg 3.3; Figur 1 d) med jämnt spridda celler och utan betydande tecken på celldöd. En rad börjar cellen tätheter, med förhållandet önskade celltyper, kommer att producera sfärer av olika storlekar. I avsaknad av mikrobrunn plattor, celler kommer att kombinera form betydligt större och nonuniform aggregat vars diameter (> 2 mm) överträffa gränsen för diffusion (figur 2A-2B). Det förväntas att användningen av ett spinner kolv eller motsvarande bioreaktor kommer att upprätthålla enhetlighet bland kulorna och minska fusion (steg 3,4; Figur 2 c). Deras användning är dock inte nödvändigt medan spinner kolvar tillåter kultur av sfärer för veckor.

För att stabilisera cocultures för elektrofysiologiska analys, ECM-härma substrat tillåta sfärer lätt följa bibehållen sin 3D-strukturen (figur 3A, 3A'). Under inspelningar, kommer friska spheres av iNeurons placeras på MEAs spontant framkalla spänningstoppar som är större än ± 40 µV med konsekvent bränning frekvenser (steg 4.1 – 4.2; Figur 3B ” -C, 3F). Coculture sfärer förväntas visa större nätverksanslutning med förekomsten av hAstros, vilket resulterar i en ökning av synkron nätverk skurar av spikar (figur 3B' -3 C'). Tillämpningen av CNQX35,39,40, en postsynaptiska AMPA receptorantagonist, minskar nätverk burst synchrony i coculture områden (figur 3D'-3E').

Neurala cell-typ begränsad protein markörer visar visuellt jämnt utspridda arrangemanget och mognad av astrocyter och nervceller inom 3D sfärer. En maximal projektion av Astrocyten morfologi och förgrening visas i figur 4A i en representativ 3D-sfär med hAstros glest märkt med membran-bundna GFP. Mogen hAstros express markörer inklusive Fredsgenomförande (figur 4B), S100B och Glt134, medan hNeurons och iNeurons express mikrotubulära-associerade protein 2 (MAP2; Figur 4 c) och tubulin beta 3 (Tuj1/TUBB3). Slutligen, även om iNeurons express pre- och post synaptic proteiner inklusive Synapsin 1 (Syn1) och Homer eller PSD95, respektive, synaptisk densitet markant förbättrade av närvaron av hAstros i coculture (figur 4 d)26. Om tillgängligt, aktiverar alternativa användning av hjärnan clearing tekniker och lätta blad mikroskopi snabb avbildning av intakt sfärer.

Uttrycket av mogen neurala markörer tillsammans med spontana elektriska aktivitet tillsammans och bekräfta framgången för det protokoll som beskrivs ovan i producerar 3D cocultures av funktionella synaptic mikrokretsar.

Figure 1
Figur 1: stegvis skildring av differentiering och bildandet av 3D neurala områden som härrör från hPSCs. (A) tidslinje av viktiga steg i protokollet. (B) rena bestånd av neurala celler kan genereras från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hPSCs). För generering av Astrocyten stamfäder (prickade gröna rutan), se steg 2.1 samt Ref28. (C) inducerbara nervceller (iNeurons; se avsnitt 2.2) genereras från transgena hPSCs via inducerad överuttryck av neurogenin 2 visar neuronala morfologi på 2D ECM (dag 7) och är positiva för MAP2 (infälld). (D) sfärer bort från mikrobrunn plattor (se steg 3.1 – 3.3) visar konsekvent storlek för high-throughput screening. Områden kan vara odlade i en spinner kolv bioreaktor (infälld; se steg 3,4) om så önskas att förhindra fusion. Skalstapeln = 50 µm (C, infälld). Skala barer = 200 µm (A, D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: systematisk och reproducerbara generation bioengineered 3D neurala sfärer. (A) mikrobrunn (µ-brunn) kultur plattor används att bilda 3D neurala områden av önskad täthet och neuron-till-Astrocyten nyckeltal på ett systematiskt och användardefinierade sätt, ger enhetlig storlek och form. Bilder visas 1 dag efter sfär bildandet. Skala barer = 200 µm. (B) en rad börjar cellen tätheter (från 4 x 103 till 2 x 104 celler per mikrobrunn) producerar sfärer av olika storlekar. I avsaknad av mikrobrunn tallrikar, hPSCs kombinera form betydligt större och nonuniform aggregat vars diametrar överträffa gränsen för diffusion efter en vecka (n = 6-14 sfärer per grupp och tid punkt). (C) iNeuron sfärer odlade i en spinner kolv på 80 rpm uppvisade mindre fusion och således var betydligt mindre, mer enhetlig och utställda större loopkontroll jämfört med dem i stillastående kultur under en period av tre veckor (n = 6-51 sfärer per grupp och tid punkt). Tomter representerar medelvärde ± SD; * indikerar signifikans (p < 0,05) mellan grupper, fastställs med hjälp av tvåsidiga t-tester. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: representativa levande synaptic fysiologi av neurala områden på multielectrode matriser (MEAs). (En, A') MEAs används för att mäta levande synaptic fysiologi av neurala områden. Sfärer av iNeurons (A) eller cocultures av iNeurons och hAstros (A') kan vara odlade på MEA ytor med ECM-härma substrat (se steg 4.1). (B, B') Raster tomter av representativa spontana elektriska aktiviteten mäts över alla elektroder (vertikal axel) under en inspelning (horisontell axel). Efter 4 veckor av kultur i neurofysiologiska basala medium41, iNeuron sfärer (B) visas spontan spikar, medan coculture sfärer (B') visade ökad nätverk skurar av synkron bränning mönster (orange pilar). (C, C') Histogram över spikar mätt under MEA inspelning i windows från representativa elektroder. (D, D') Raster tomter av spontana elektriska aktiviteten mäts över alla elektroder efter tillämpning av 50 µM CNQX, en AMPA receptorantagonist (samma tidsskala som B, B'). CNQX eliminerat förekomsten av synkron skurar av spikar som observerats i cocultures (D').  (E, E') Histogram över spikar mätt under MEA inspelning i windows från representativa elektroder efter 50 µM CNQX ansökan (samma tid skala som C, C'). (F) karta över spike tracings iNeuron sfärer från alla elektroder över tid (vänster). Demonstrativ enda elektrod visar flera klustrade spår över tid (mitten); enskilda spike spår kan sorteras och analyseras individuellt (höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: karakteristiska immunohistokemi av synaptic mikrokretsar. (A) en membran-bundna GFP (mGFP) reporter är användbar för att undersöka arrangemang och morfologi av hAstros i 3D neurala områden. (B) hAstros göras åtskillnad mellan från hPSCs är Fredsgenomförande-positiva. (C) sfärer som innehåller hAstros och iNeurons kan visualiseras och analyseras med hjälp av cell typ eget protein markörer såsom Fredsgenomförande och MAP2. Skala barer = 50 µm. (D) representativa bilder av pre- och post synaptic tätheter (Syn1 och PSD95, respektive) i sfärer av iNeurons utan (vänster) och med (höger) cocultured hAstros. En avsevärt ökad täthet av colocalized Syn1 och PSD95 observerades i coculture områden jämfört med iNeuron sfärer på dag 35, visar hAstros förmåga att framkalla synaps bildas (n = 3 oberoende replikat varje; data omtryckt från Ref 26 med tillåtelse). Skala barer = 10 µm. tomt representerar medelvärde ± SEM; signifikanta skillnader (* indikerar p < 0,05; ** anger p < 0,01) mellan grupperna bestämdes med hjälp av tvåsidiga t-tester. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta protokoll beskriver vi en systematisk metod för produktion av 3D sfärer av neurala cocultures. Sfärernas består av astrocyter och nervceller, som självständigt härledas från hPSCs. Men inte i fokus för detta protokoll, generering av ren populationer av astrocyter från hPSCs28 är ett viktigt steg och det kan vara tekniskt svårt om det görs utan tidigare erfarenhet. Detta första steg i generationen av dessa synaptic mikrokretsar bör utföras med noggrann timing och uppmärksamhet på Detaljer. En begränsning av användningen av hPSC-derived astrocyter är långa differentiering processen; produktion av stora mängder av celler som kan frysas för framtiden använder dock och tinade på tiden av experiment (se steg 2.1.5) eliminerar behovet av att påbörja processen från inledande hPSC scenen. Även de iNeurons som genereras från transgena hPSCs är synaptogenic och har förmågan att ställa ut spontan postsynaptiska elektriska strömmar, båda egenskaper är särskilt förbättras av närvaron av glia12,35— inklusive hAstros närmare i detta protokoll. Det bör alltså noteras att valet av celltyp, nummer, och utvecklingsstadier eller förfall är en kritisk komponent i detta protokoll, och justeringar kan leda till variationer i elektriska aktivitet eller synapsen visualisering. Detta protokoll tillåter dock även manipulation av cell densiteten eller nyckeltal på ett sätt som återspeglar flexibiliteten i möjliga förhållanden eller resultat från den enskilda forskaren.

Som beskrivits ovan, utnyttja vi bioengineering verktygen för att producera ett alternativ till neurala organoid metoder42,43, med förbehållet att detta system inte sammanfatta de självorganisering och skiktning fenotyperna av organoids som kan vara önskad20,44. Samtidig användning av mikrobrunn kultur plattor26 och en spinner kolv bioreaktor45,46 säkerställa reproducerbarhet, således effektivisering inte bara produktionen utan också granskning och analys av neurala mikrokretsar med en mängd cell kultur analyser. Det bör betonas att även om det är valfritt att använda av en spinner kolv eller motsvarande bioreaktor, en stillastående kultur av sfärer i nära kontakt kan resultera i deras fusing tillsammans, således begränsande näringsämnen och syre bortom gränsen för diffusion i centrum sfärer47. Särskilt användningen av 3D tryckta mini-bioreaktorer har rapporterats som en högre genomströmning strategi jämfört med stora bioreaktorer46.

Traditionella verktyg för att mäta synaptic bildandet inkluderar fysiologiska metoder sådana hela-cell patch fastspänning, MEAs36,48,49och kalcium imaging50. Här väljer vi att beskriva användningen av multilaterala miljöavtal som de ger en enkel och hög genomströmning undersökning av elektrisk aktivitet i kulorna på en kort tidsskala. Andra tekniker kan emellertid också användas.

En begränsning av användningen av mikrobrunn plattor i detta protokoll är det maximala antalet sfärer (~ 300) och celler per sfär (~ 2 x 104) som tillåts i varje brunn. Alternativa sfären bildandet verktyg kan användas för ett ökat antal; ett högre antal celler kommer dock att krävas vid startpunkten. Formatet 24-väl valdes här för dess förmåga att generera större sfärer som kan hanteras för analys och synliga för ögat, samtidigt begränsa celldöd i center av sfärer. Övergripande, tillägg av detta steg till protokollet kommer att säkerställa en robust och skalbar produktionen av enhetlig 3D sfärer.

Våra protokoll kan också skryta med flexibilitet att justera antal och förhållandet mellan varje celltyp samt möjligheten att införa andra celltyper i sfärernas 3D i en kontrollerad, definierade sätt. Användning av region-specifika neuronala och Astrocyten undertyper tillåter studiet av synaptic mikrokretsar av olika områden i det centrala nervsystemet. Dessa coculture sfärer kan också vara sammansvetsade51 för att studera cellulära migration och lång räckvidd signalering. Tillägg av oligodendrocyter, endotelceller eller mikroglia kunde bevisa dessa 3D sfärer vara en informativ hjärnan modell med ökad komplexitet, som en lovande framtida riktning för denna metod. Slutligen, förutom sjukdom och skada modellering, detta system tillåter studiet av behandlingsmetoder, såsom cellulära substitutionsbehandling eller läkemedelsutveckling, att förbättra neuroregeneration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka Dr Erik Ullian (UCSF) för intellektuell ingång på utformningen av dessa förfaranden, Dr Michael Ward (NIH) för teknisk rådgivning om iNeuron differentiering och Saba Barlas för preliminära bildanalys.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 well plate Fisher Scientific 08-772-1B
15 mL conical tubes Olympus Plastics 28-101
Accutase Sigma A6964-100ML Detachment solution
AggreWell plate Stemcell Technologies 34850
Anti-Adherence Rinsing Solution Stemcell Technologies 7010 Prevent cell adhesion to microwell plates
Anti/anti Thermofisher 15240062
B27 Thermofisher 17504044 Media Supplement
BrainPhys neuronal medium Stemcell Technologies 5790 Neurophysiological basal medium alternative
Circular glass coverslips Neuvitro GG-12-oz
Cryostor CS10 Stemcell Technologies 7930 Cryopreservation medium with 10% DMSO
DMEM/F12 Thermofisher 10565-042 With GlutaMAX supplement
DMH-1 Stemcell Technologies 73634 HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 μM
Donkey serum Lampire Biological Laboratories 7332100 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Doxycycline Hydrochloride (Dox) Sigma D3072-1ml HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 μg/mL
Epidermal growth factor (EGF) Peprotech AF-100-15 Working concentration: 10 ng/mL
Fibroblast growth factor-2 (FGF) Peprotech 100-18B Working concentration: 10 ng/mL
Fluoromount-G mounting solution Southern Biotech 0100-01
Glass slides Fisherbrand 22-037-246
Goat serum Lampire Biological Laboratories 7332500 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Hemacytometer or automatic cell counter Life Technologies AMQAX1000
Heparin Sigma H3149-50KU Working concentration: 2 mg/mL
Magnetic plate DLAB 8030170200
Matrigel membrane matrix Corning 354230 ECM coating solution. Working concentration: 80 μg/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.
MEA 2100 System Multichannel Systems MEA2100
Mounting solution
N2 Thermofisher 17502048 Media Supplement
OCT Tissue-Tek 4583 Tissue embedding solution for cryosectioning
Pap Pen (Aqua Hold) Scientific Device Laboratory 9804-02
Paraformaldehyde (PFA) Acros Organics 169650025 HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS
Phosphate buffered saline (PBS) Stemcell Technologies CA008-300
Poly-l-ornithine (PLO) Sigma P3655-100MG Working concentration: 0.5 mg/mL
Rectangular glass cover slips Fisherfinest Premium Superslip 12-545-88
ReLeSR Stemcell Technologies 5872 Detachment and passaging reagent
Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y) Tocris 1254 Working concentration: 10 uM
SB431542 Stemcell Technologies 72234 Working concentration: 2 μM
Spinner flasks Fisher Scientific 4500-125
Sucrose Fisher Chemical S5-3 Working concentration: 20% or 30% in PBS
T25 Culture Flask Olympus Plastics 25-207 Vented caps
T75 Culture Flask Olympus Plastics 25-209 Vented caps
Terg-A-zyme Sigma Z273287-1EA Detergent. Working concentration: 1%
TeSR-E8 basal medium Stemcell Technologies 5940 Human pluripotent stem cell (hPSC) medium
TeSR-E8 supplements Stemcell Technologies 5940 Supplements for human pluripotent stem cell medium
TritonX-100 Sigma X100-500ML Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer
Trypan blue Invitrogen T10282
Antibodies
AlexaFluor 488 Thermofisher A-11029 Secondary antibody
AlexaFluor 594 Thermofisher A-11037 Secondary antibody
Ezrin Thermofisher MA5-13862 Primary antibody; astrocytes perisynaptic
GFAP Chemicon MAB360 Primary antibody; astrocytes
GFP Aves GFP-1020 Primary antibody; astrocytes
Glt1 Gift from Dr. Jeffrey Rothstein n/a Primary antibody; astrocytes
Homer Synaptic Systems 160 011 Primary antibody; neurons, post-synaptic
MAP2 Synaptic Systems 188 004 Primary antibody; neurons
PSD95 Abcam ab2723 Primary antibody; neurons, post-synaptic
S100 Abcam ab868 Primary antibody; astrocytes
Synapsin 1 Synaptic Systems 106 103 Primary antibody; neurons, pre-synaptic
TuJ1/β3-tubulin (TUBB3) Covance MMS-435P Primary antibody; neurons

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ullian, E. M., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Role for Glia in Synaptogenesis. Glia. 47, 209-216 (2004).
  2. Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
  3. Molofsky, A. V., et al. Astrocyte-encoded positional cues maintain sensorimotor circuit integrity. Nature. 509 (7499), 189-194 (2014).
  4. Sultan, S., et al. Synaptic Integration of Adult-Born Hippocampal Neurons Is Locally Controlled by Astrocytes. Neuron. 88, 957-972 (2015).
  5. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
  6. Cheung, G., Sibille, J., Zapata, J., Rouach, N. Activity-Dependent Plasticity of Astroglial Potassium and Glutamate Clearance. Neural Plasticity. , 109106 (2015).
  7. Ghezali, G., Dallerac, G., Rouach, N. Perisynaptic astroglial processes dynamic processors of neuronal information. Brain Struct Funct. 221, 2427-2442 (2016).
  8. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of Astrocytes and their Potential As Therapeutic Targets. Neurotherapeutics. 7, 338-353 (2010).
  9. Pál, B. Astrocytic Actions on Extrasynaptic Neuronal Currents. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 474 (2015).
  10. Kiray, H., Lindsay, S. L., Hosseinzadeh, S., Barnett, S. C. The multifaceted role of astrocytes in regulating myelination. Experimental Neurology. 283, 541-549 (2016).
  11. Allen, N. J., Eroglu, C. Cell Biology of Astrocyte-Synapse Interactions. Neuron. 96 (3), 697-708 (2017).
  12. Krencik, R., van Asperen, J. V., Ullian, E. M. Human astrocytes are distinct contributors to the complexity of synaptic function. Brain Research Bulletin. 129, 66-73 (2017).
  13. Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of Synapse Number by Glia. Science. 291, 657-662 (2001).
  14. Oberheim Bush, N. A., Nedergaard, M. Do Evolutionary Changes in Astrocytes Contribute to the Computational Power of the Hominid Brain? Neurochemical Research. 42 (9), 2577-2587 (2017).
  15. Han, X., et al. Forebrain Engraftment by Human Glial Progenitor Cells Enhances Synaptic Plasticity and Learning in Adult Mice. Cell Stem Cell. 12 (3), 342-353 (2013).
  16. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. The EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
  17. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  18. Dodla, M. C., Mumaw, J., Stice, S. L. Role of astrocytes, soluble factors, cells adhesion molecules and neurotrophins in functional synapse formation: implications for human embryonic stem cell derived neurons. Stem Cell Res Ther. , 251-260 (2010).
  19. Krencik, R., Ullian, E. M. A cellular star atlas: using astrocytes from human pluripotent stem cells for disease studies. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 1-10 (2013).
  20. Pasca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  21. Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144, 938-941 (2017).
  22. Mason, J. O., Price, D. J. Building Brains in a Dish: Prospects for Growing Cerebral Organoids from Stem Cells. Neuroscience. 334, 105-118 (2016).
  23. Kelava, I., Lancaster, M. A. Dishing out mini-brains: Current progress and future prospects in brain organoid research. Developmental Biology. 420 (2), 199-209 (2016).
  24. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  25. Sloan, S. A., et al. Human Astrocyte Maturation Captured in 3D Cerebral Cortical Spheroids Derived from Pluripotent Stem Cells. Neuron. , 779-790 (2017).
  26. Krencik, R., et al. Systematic three-dimensional coculture rapidly recapitulates interactions between human neurons and astrocytes. Stem Cell Reports. 9 (6), 1745-1753 (2017).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Krencik, R., Zhang, S. -C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 6 (11), 1710-1717 (2011).
  29. Du, Z. -W., et al. Generation and expansion of highly pure motor neuron progenitors from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 6, 6626 (2015).
  30. Neely, M. D., et al. DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: Comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction. ACS Chemical Neuroscience. 3 (6), 482-491 (2012).
  31. Lippmann, E. S., Estevez-Silva, M. C., Ashton, R. S. Defined Human Pluripotent Stem Cell Culture Enables Highly Efficient Neuroepithelium Derivation Without Small Molecule Inhibitors. Stem Cells. 32, 1032-1042 (2014).
  32. Eggan, K., Kawada, J., Kaneda, S., Kirihara, T., Maroof, A. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9, 1441-1449 (2017).
  33. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -J., Zhang, S. -C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  34. Krencik, R., et al. Dysregulation of astrocyte extracellular signaling in Costello syndrome. Science Translational Medicine. 7 (286), 286 (2015).
  35. Wang, C., et al. Scalable Production of iPSC-Derived Human Neurons to Identify Tau- Lowering Compounds by High-Content Screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  36. Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays. Frontiers in Neuroscience. 10, (2016).
  37. Kapucu, F. E., Mäkinen, M. E., Tanskanen, J. M. A., Ylä-Outinen, L., Narkilahti, S., Hyttinen, J. A. K. Joint analysis of extracellular spike waveforms and neuronal network bursts. Journal of Neuroscience Methods. 259, 143-155 (2016).
  38. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number. Journal of Visualized Experiments. 45, 2-9 (2010).
  39. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  40. Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture. Scientific reports. 6, 26181 (2016).
  41. Bardy, C., Hurk,, et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. PNAS. 112 (25), E2725-E2734 (2015).
  42. Monzel, A. S., et al. Derivation of Human Midbrain-Specific Organoids from Neuroepithelial Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1144-1154 (2017).
  43. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  44. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2018).
  45. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7647), 373-379 (2013).
  46. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  47. Yan, Y., et al. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. , 1-46 (2016).
  48. Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 9 (JAN), 423 (2015).
  49. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), 1-7 (2010).
  50. Shigetomi, E., Patel, S., Khakh, B. S. Probing the Complexities of Astrocyte Calcium Signaling. Trends in Cell Biology. 26 (4), 300-312 (2016).
  51. Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Lévi-strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nat Methods. 14 (7), (2017).

Tags

Utvecklingsbiologi fråga 138 stamceller nervceller astrocyter synapser Organoid Coculture bioreaktor Multielectrode array
Synaptic resonanskrets modellering med 3D Cocultures av astrocyter och nervceller från mänskliga pluripotenta stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cvetkovic, C., Basu, N., Krencik, R. … More

Cvetkovic, C., Basu, N., Krencik, R. Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (138), e58034, doi:10.3791/58034 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter