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Developmental Biology

3D Cocultures 星形胶质细胞与人多潜能干细胞神经元的突触电路建模

Published: August 16, 2018 doi: 10.3791/58034
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Neuroregeneration, Department of Neurosurgery, Houston Methodist Research Institute

Summary

在本协议中, 我们的目的是描述一种可重现的方法, 将分离的人类多能干细胞衍生神经元和星形胶质细胞组合成3D 球体 cocultures, 在自由漂浮条件下维持这些球体, 随后用 immunoanalysis 和多电极阵列记录测量球体的突触电路活动。

Abstract

我们理解各种细胞类型和信号对突触电路功能的作用的障碍是缺乏研究人脑的相关模型。解决这个问题的一项新兴技术是使用三维 (3D) 神经细胞培养, 称为 ' organoids ' 或 ' 球体 ', 长期保存细胞间相互作用, 包括细胞外黏附分子。然而, 这些文化系统是费时的, 没有系统地产生。在这里, 我们详细的方法, 以迅速和一贯地产生 3D cocultures 神经元和星形胶质细胞从人类多潜能干细胞。首先, 对预分化的星形胶质细胞和神经元祖先进行离解和计数。接下来, 细胞被结合在球形形成的菜肴与一个蛋白激酶抑制剂, 并在特定的比率, 以产生可再生的大小球体。经过几个星期的文化作为漂浮球体, cocultures (' 小行星 ') 最终被切片的染色或电镀后, 多电极阵列, 以测量突触密度和强度。一般情况下, 该协议将产生3D 神经球体, 显示成熟的细胞类型限制标记, 形成功能性突触, 并表现自发突触网络突发活动。与单层培养相比, 该系统允许对疾病机制进行药物筛选和调查。

Introduction

星形胶质细胞是中枢神经系统 (CNS) 内一种高度丰富的神经细胞类型, 其功能职责超出结构支持范围。通过可溶性 synaptogenic 因子和细胞外基质 (ECM) 组分的分泌, 星形胶质细胞在发育过程中帮助成熟突触的建立和聚集1。通过胞外信号2、3、4、5, 它们在保持突触的健康和可塑性方面发挥着关键作用, 并有助于维持稳定的长期稳定性。环境通过调节胞外钾和谷氨酸, 以及能量基质的分泌和 ATP6,7,8。最后, 它们可以通过影响 extrasynaptic 电流9来促进神经传递, 并且可以通过其他细胞类型 (如促进髓鞘形成10) 间接地影响活动。重要的是, 由于星形胶质细胞的异常或功能障碍会导致许多神经发育综合征和成人神经病理学, 显然需要将星形胶质细胞与神经网络中的神经元包括在一起, 以改善内源性脑环境模型。星形胶质细胞的一个整体特征是它们能够形成与神经元突触1,11,12的动态相互作用。在没有胶质细胞的情况下, 神经元形成数量有限的突触, 一般也缺乏功能成熟度13。

人星形胶质细胞显示形态学, 转录和功能特征-如增加的大小和复杂性的分支, 以及物种特异基因-不概括在啮齿目动物12,14, 15。因此, 利用人类多潜能干细胞 (hPSC) 衍生的神经细胞的研究已被广泛接受为一种检测中枢神经系统相关疾病的方法, 同时开发新的疗法, 伤害模型和文化范例16 ,17。此外, hPSCs 允许研究人类突触的形成和功能, 而不需要初级组织18,19。

我们理解各种细胞类型和信号对突触电路功能的贡献的障碍是缺乏相关的人脑模型。需要一个适当的平台来重述其突触网络的高保真度和重现性。最近, 3D 文化系统 (广为人知的 "organoids"、"球体" 或 "迷你大脑") 的生产中出现了兴趣,在细胞和宏观层面上对复杂的三维 (3D) 结构建模。3D. 在典型的2D 共培养范式21、22中, 文化系统保留 ECM 和细胞间的相互作用, 通常不存在或受到限制。为培养3D 神经球体23、24、25, 存在大量的技术;然而, 许多人需要长时间的文化周期 (几个月到几年) 来进行自发的开发和层的保存, 用户对输出的控制很少。

在这里, 我们说明了一个系统的方法, 迅速和一贯生物工程的神经相互作用之间的多种细胞类型 (预分化神经元和星形胶质细胞) 从 hPSCs 的组装细胞成球形 cocultures (' 小行星 ')26在3D 中概括了人类特有的形态学复杂性。这种高密度的神经系统产生均匀分散的神经亚型, 随着时间的推移而逐渐成熟, 可以用高通量的方式进行筛选或测定。我们首次证明, 人类星形胶质细胞诱发突触网络爆裂活动在这些 3D cocultures。此外, 该协议很容易适应产生不同大小的球体, 利用指定给中枢神经系统不同区域特性的细胞, 并根据需要研究多种其他细胞类型的相互作用。

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Protocol

1. 细胞培养和试剂制备

注: 本节中的协议按照它们在差异化协议中的显示顺序编写 (第2节)。请参阅材料和目录编号的材料表。

  1. 为细胞培养制备涂层板材。
    1. 稀释细胞外基质 (ECM) 涂层溶液与 DMEM/F12 介质, 以准备1毫克/毫升的库存解决方案。整除稀释的 ECM 库存溶液成30个3毫升的锥形管, 并立即存储在-20 °c。对于一个工作的解决方案, 并用重悬3毫升的 ECM 储存成33毫升的预冷 DMEM/F12 介质, 使总体积为36毫升的浓度为80µg/毫升。
    2. 涂层1毫升每井的6井细胞培养板与 ECM 工作解决方案。增加一个额外的1毫升 DMEM/F12 每井 (如有必要), 以确保充分覆盖油井的表面。在使用前, 允许涂敷的6井细胞培养板在室温下坐至少1小时。
      注: 镀膜板可贮存在孵化箱内, 或在4摄氏度内存放2周。
  2. 准备培养基配方, 生长因子和小分子。
    1. 要准备500毫升的人类多潜能干细胞 (hPSC) 中27, 根据制造商的指示添加20x 和500x 补充剂。
    2. 要准备500毫升的神经培养基 (NM), 添加肝素到最终浓度为2毫克/毫升, 1x 抗生素/防霉溶液, 1x B27 补充或 1x N2 补充, 500 毫升瓶 DMEM/F12 与 l-谷氨酰胺补充作为以前详细28。
    3. 要准备一个10毫米 (1,000x) 溶液的 Y27632 激酶抑制剂 (Y), 添加10毫克的粉末到3毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。过滤消毒, 整除, 并存储在-20 摄氏度。在10µM 工作浓度的介质中使用。
    4. 要准备一个20毫米 (10,000x) 的 SB431542 溶液, 添加10毫克的粉末到1.3 毫升的二甲基亚砜 (亚砜)。要准备一个2毫米 (1,000x) 的 DMH1 溶液, 添加10毫克的粉末到13.1 毫升的亚砜。过滤消毒, 整除, 并存储每个解决方案在-20 摄氏度。在介质中使用2µM 工作浓度 (NM + SB431542 + DMH1)。
      注: 本议定书建议在 SB431542 和 DMH1 的2µM 工作浓度的基础上, 根据我们的观察和报告, 从其他29指出, 这种浓度有效地促进神经诱导从 hPSCs。更高浓度也报告了30。另外, 有了替代介质, 也证明了小分子不需要高神经转换31。因此, 工作浓度将因不同的细胞培养环境而异, 而最佳浓度应由个体研究人员来检验。
    5. 为了准备单独的100µg/毫升 (10,000x) 的表皮生长因子 (EGF) 和成纤维细胞生长 factor-2 (FGF2) 的解决方案, 每增加1毫克10毫升的 PBS + 0.1% BSA。整除 EGF 和 FGF2 库存解决方案成50µL 整除数和存储在-80 摄氏度。在介质中使用每一个10毫升的工作浓度;例如, 添加5µL EGF 和5µL FGF2 到50毫升的 nm (nm + EGF + FGF2)。
    6. 为制备盐酸强力霉素 (Dox) 的库存溶液, 首先将亚砜中的粉末溶解至100毫克/毫升, 贮存在-20 摄氏度。进一步稀释它使2毫克/毫升 (1,000x) 股票解决方案在 PBS 和存储在-20 °c。在介质中使用2µg/毫升工作浓度;例如, 添加50µL Dox 到50毫升的 nm (nm + Dox)。
      注: 解冻后不要再冻结溶液。

2. 人诱导多潜能细胞神经亚型的生成 (hPSCs)

注: 所有细胞培养应保持在一个孵化器与 5% CO2在37摄氏度。这些文化保持在房间的氧气水平, 虽然较低的水平可能被利用。

  1. 从 hPSCs 中生成和维持星形胶质细胞祖细胞 (hAstros)。
    注: 本节提供了一种简单、简化的差异化协议。有关详细说明 (具有胚体形成、莲座丛选择和区域图案步骤), 请参阅前面描述的协议28 (图 1A, 虚线绿色框)。
    1. 种子簇的 hPSCs (图 1B) 到 ECM 涂层6井板 (见步骤 1.1) 与2毫升的 hPSC 中 + Y 每井。每天给干细胞喂食, 直到它们有50% 的汇合, 并根据需要进行分裂。
      1. 要分裂 hPSCs, 添加1毫升的传代试剂到水井和吸入1分钟后, 室温孵化细胞5分钟, 增加1毫升的 hPSC 培养基, 并分裂合计1:10 到新的 ECM 涂层的油井2毫升的 hPSC 中 + Y 每井。
    2. 保持干细胞, 直到它们约50% 汇合, 然后改变培养基到 NM + SB431542 + DMH1 诱导神经分化 (0 天)。当细胞约为95% 汇合时, 将1:6 分裂成新的 ECM 涂层的井在同一培养基中。
    3. 在14天, 分离的细胞与脱离溶液和转移到一个无涂层的瓶子与 Y, 以促进形成的骨料。
      注: Y 的增加用于促进细胞存活和球体形成, 但不包括在每一个饲料。
    4. 对于神经元祖细胞和神经元 (hNeurons) 的生成, 请按照下面的描述使用这些 day-14。或者, 在神经元成熟发生或 gliogenesis 开始之前, 利用这些细胞在以后的时间点从单层或球形的培养。
      注意: 默认情况下, 此协议产生背皮层星形胶质细胞。然而, 星形胶质细胞子类型可以是区域指定的加法模式格局来说如果需要28,32,33。维甲酸 (RA) 可以添加到 caudalize 细胞成脊髓表型, 而声波刺猬 (嘘), smoothened 激动剂 (凹陷), 或 purmorphamine 将产生腹型。
    5. 对于在自发形成的3D 聚合体 (hAstrospheres) 中的星形胶质细胞祖和星状胶质, 切换到 NM + EGF + FGF2 和饲料每周 (或根据需要, 以确保稳定的 pH 值) 作为以前的详细34。
      1. 当暗中心出现并去除自发附着的球体时, 轻轻地将 hAstro 骨料与脱离溶液分开。每周轻轻地折断球体以保持球体的健康, 避免坏死的核心。
        注: 不超过5分钟的治疗与脱离解决方案。
      2. 经过4-6 月的扩张, 确认细胞的身份和冷冻保存培养基 (根据制造商的指示) 或替代贮存条件, 长期保存液氮, 或立即使用实验。
    6. 解冻 hAstrospheres 的冷冻库存, 在室温下迅速解冻一小瓶, 将其内容转移到空的15毫升锥形管中, 离心机在 300 x g处为1分钟. 小心地吸入上清, 用 DMEM/F12 冲洗, 并重复两次洗涤步骤。添加到一个 T25 瓶, 总体积为6毫升的 NM + EGF + FGF2 + Y (或扩大根据需要)。
  2. 从 hPSCs 中生成和维持诱导神经元 (iNeurons)。
    1. 种子转基因 hPSCs (以稳定的强力霉素诱导 neurogenin 2 转基因35) 在 ECM 涂覆6井板与2毫升的 hPSC 中 + Y 每井 (如上文所述非转基因线)。每天用2毫升的介质喂养, 直到它们准备在70% 融合。按步骤2.1.2 中所述拆分单元格。
    2. 当细胞约35% 汇合, 添加 NM + Dox 诱导分化为 iNeurons。在继续步骤3.2 之前, 用 NM + Dox 维持2天的单层培养。
      注意: 细胞将转变为神经元祖, 但仍不能扩展突起 (图 1C)。

3. 3D 球形 Cocultures 的制备和维护

  1. 在悬浮液中从3D 聚合体中分离 hAstros (如步骤2.1.5.1 中所述)。
  2. 从2D 单层分离 hNeurons 或 iNeurons。
    1. 将介质从6井板中取出, 并将分离液的500µL 添加到每个含单层培养的井中。孵育37°c 5 分钟, 轻轻地添加2-3 毫升 DMEM/F12, 以去除附着的细胞。
    2. 收集细胞和介质在一个15毫升圆锥管和离心机在 300 x g 1 分钟, 吸入上清, 添加1毫升的新鲜培养基, 和吸管上下轻轻与1000µL 微, 以实现一个单一的细胞悬浮。
  3. 使用 microwell 培养板形成3D 球体。
    1. 在 microwell 板的每个井中加入0.5 毫升的防粘漂洗液, 准备板材。离心板在 2000 x g的5分钟吸入冲洗液, 添加1毫升的 DMEM/F12 到每个井洗, 并再次吸入。
      注: 始终确保离心机在使用过程中平衡。
    2. 使用 hemocytometer 或自动单元格计数器对每个单元格类型进行计数。将所需的分离 hAstros 和 hNeurons 或 iNeurons 的比例添加到每个井中, 总体积为2毫升的 NM (包括 Dox, 如果使用 iNeurons)。离心板在 100 x g 3 分钟, 并返回到孵化器。
      注:24-井 microwell 板 (见材料表) 包含 300 microwells 每井。增加至少 6 x 105单元格 (对于每一个 2 x 10 3个单元格的球体) 和最大 6 x 106个单元格 (对于 2 x 10 4 个单元格的球体), 每井都有2毫升的介质。对于此范围内特定密度的可行球体, 请使用已定义的单元格数量并除以300以计算每个球体的单元格数。如果需要, 还可以使用其他球形成形方法和工具。按照制造商的指示, 可接受的细胞密度范围。
    3. 允许细胞在未来2天内在 microwell 板块内自组装成密集的球体 (图 2A)。如果文化变黄, 请更换50% 媒体。
      注: 在移除和添加介质时, 仅交换半介质和吸管, 以免干扰球体。球体可以从 microwells 中抬起, 并与更高的力量融合在一起。
    4. 2天后, 用1000µL 微轻轻地从 microwells 中移除球体 (图 1D)。用介质轻轻地向 microwells 底部施加力, 以除去任何附加的附着球体。让球体在15毫升锥形管中沉淀, 吸入旧介质, 加入新鲜的介质。
  4. 建立了3D 球体的微调瓶生物反应器系统。
    1. 用70% 乙醇清洁磁性搅拌板表面, 将其放入细胞培养孵化器中。高压釜单独的微调瓶消毒。
    2. 向每个微调瓶添加最小 50–60 mL 介质的球体 (图 1D, 嵌入)。将烧瓶放在 60 rpm 的磁力搅拌板上。在微调烧瓶中培养球体, 直到它们准备好进行数据收集。
      注: 突触形成需要至少3周的培养。如果不需要微调瓶生物反应器系统, 可以在细胞培养瓶或菜肴的固定条件下培养球体。球体也可以嵌入到 ECM 或水凝胶中。

4. 用多电极阵列测量活突触生理学 (多边环境协定)

  1. 为细胞培养准备多边环境协定。
    1. 清洁表面的每一个多边环境协定与1毫升洗涤剂为1小时冲洗与无菌去离子 (DI) 水, 冲洗与70% 乙醇消毒, 然后空气干燥的生物安全柜在紫外线下。
      注: 可在无菌条件下贮存在4摄氏度的 DI 水中, 直至使用。
    2. 将50毫克的巴解组织溶入100毫升硼酸缓冲液中, 制备0.5 毫克/毫升的聚鸟氨酸溶液。将每个多边环境协定的表面涂上1毫升的巴解组织, 使表面亲水性, 并在37摄氏度孵育至少4小时. 去除巴解组织, 用 DI 水洗涤表面, 加入1毫升 ECM (见步骤 1.1.1), 并在37摄氏度孵化至少4小时。
    3. 移除 ECM 并将球体置于多边环境协定表面的1.5 毫升介质中, 确保球体位于电极阵列的顶端 (图3A、3A)。允许坚持2天。每2–3天更改一半的媒体 (或者更经常需要), 以确保这些球体不会受到干扰。
      注: 增加生长因子可改善文化生存和成熟。
  2. 测量神经球体的电活动。
    1. 设置具有温度控制 headstage 的多电极阵列 (多边环境协定) 系统。创建一个具有5赫兹高通滤波器和 200 hz 低通滤波器的软件程序, 以及5x 标准偏差 (SD) 的峰值阈值。
    2. 将多边环境协定放在 headstage 上, 记录自发电活动 (图 3B, B)。保存原始数据, 包括穗频和振幅进行统计分析。
      注: 可与多边环境协定一起使用灌注系统添加药理剂或增加新鲜培养基的长期记录。额外的峰值后处理可以按需要执行36,37。

5. 免疫细胞化学检测突触密度

  1. 准备试剂。
    1. 要制造500毫升的4% 多聚甲醛 (粉煤灰) 的溶液, 在玻璃烧杯或通风罩中加入400毫升 1x PBS。搅拌时加入搅拌棒和加热至60摄氏度;不要煮沸。将20克粉煤灰粉加入加热 PBS 溶液中, 通过缓慢添加 1 N 氢氧化钠, 将 pH 值提高到6.9。
      注: 4% 粉煤灰溶液可 aliquoted, 储存在4摄氏度, 长达一个月。
    2. 添加20克或30克蔗糖到100毫升 PBS, 分别制作20% 和30% 溶液的蔗糖。
    3. 添加1毫升洗涤剂到10毫升 PBS, 以准备10% 库存解决方案。反转几次到融汇。
    4. 添加250µL 10% 洗涤剂库存解决方案 (最终浓度 0.25%) 和500µL 每个山羊和驴血清 (最终浓度5% 每) 到10毫升 PBS 准备主阻塞缓冲区。
    5. 添加100µL 山羊和驴血清 (最终浓度为 1%) 到10毫升 PBS, 以准备二级阻塞缓冲器。
  2. 准备样品。
    1. 将球体转换成15毫升锥形管, 让它们在管子的底部沉淀, 并吸入旧的介质。冲洗球体与500µL pbs, 让解决, 并吸入 pbs。添加500µL 4% 粉煤灰 (或足够覆盖球体) 和孵化4°c 30 分钟。
    2. 吸入粉煤灰, 并轻轻地洗两次 PBS。加入20% 蔗糖溶液, 在4摄氏度孵育几个小时或一夜。小心吸入, 加入30% 蔗糖溶液, 并在4摄氏度孵育几个小时或一夜。
      注: 在进行下一步之前, 样品可在 PBS 或蔗糖中储存4摄氏度至1周。如果不切片, 保持为3D 球体 (图 4A-C) 在1.5 毫升管, 并进行步骤5.3。
    3. 如果切片球体, 小心地转移球体到一个嵌入的低温模子在干冰之上。吸入30% 蔗糖溶液, 慢慢将组织嵌入溶液倒入模具中, 直到完全覆盖样品, 避免气泡。等到解决方案冻结并存储在-80 °c, 直到恒温器切片。
    4. 使用恒温器-20 摄氏度, 将嵌入块切片成30个µm 部分 (或根据需要) 并转移到玻璃幻灯片。储存在-80 摄氏度, 直到准备着色。
  3. Immunostain 的球体。
    1. 用疏水性的 PAP 笔勾勒出幻灯片的边缘, 以防止液体溢出。用抗体制备主、二次阻断溶液 (见材料表)。在每张幻灯片或管中添加500µL 的主阻塞缓冲器, 室温孵育30分钟。
    2. 取出液体, 添加500µL 的新鲜主阻断缓冲液稀释的主要抗体, 每一个幻灯片或管, 并孵化过夜在4摄氏度。去除主抗体溶液, 用 PBS 洗涤 3x, 每10分钟。
    3. 添加500µL 的二级阻断缓冲器, 稀释二次抗体的每一个幻灯片或管和孵化在4°c 1 小时. 去除二次抗体解决方案和洗涤3x 与 PBS 为10分钟每。
      注: 推荐的抗体列表在材料表中提供。其他抗体或染料可按需要使用。不要将荧光样品暴露在光线下 (步5.3.3 向前)。
    4. 添加50µL 的安装溶液滴状, 以覆盖表面, 并小心地放置在幻灯片上的盖玻片, 避免气泡。允许幻灯片在室温下干燥24小时, 并存储在4摄氏度。
  4. 图像的幻灯片。
    1. 使用共焦或双光子荧光显微镜与63X 油浸泡目的是图像前和后突触蛋白丰度和定位在球形切片 (图 4D)。使用20X 或40X 目标来可视化 hAstros 的形态学特征。
    2. 使用 ImageJ 软件打开荧光图像文件。使用单元格计数器插件手动计数前突触后 puncta, 并采用前述38或其他方法的无偏计数方法。

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Representative Results

当正确执行时, 此协议将产生由 hPSCs (图 1A-1C) 生成的星形胶质细胞28、33、34和神经元35的功能 cocultures 的定义种群, 如详细的前26和这里描述的步骤2.1–2.2。这个逐步的过程, 使用 microwell 板, 预计产生3D 的神经球体的大小和形状一致 (步骤 3.3;图 1D)细胞分布均匀, 无明显的细胞死亡迹象。一系列的起始细胞密度, 具有理想的细胞类型比例, 将产生不同大小的球体。在没有 microwell 板的情况下, 细胞将结合形成显着较大和不均匀的骨料, 其直径 (> 2 毫米) 超过扩散限制 (图 2A-2B)。预计使用微调瓶或等效生物反应器将保持球体之间的均匀性和减少融合 (步骤 3.4;图 2C)。然而, 虽然微调瓶允许在几个星期的球体的文化, 他们的使用是不必要的。

为了稳定 cocultures 的电生理分析, ECM 模拟基板允许球体在保持其3D 结构 (图 3A, 3A ') 时容易地坚持。在录音中, 放置在多边环境协定上的 iNeurons 的健康球体将自发地引出大于40µV 的电压峰值, 并具有一致的发射频率 (步骤 4.1–4.2;图 3B-c, 3F)。共培养球体预计将显示更大的网络连接性与 hAstros 的存在, 从而增加了同步网络爆发的峰值 (图 3B'-3C ')。应用 CNQX35,39,40, 突触后 AMPA 受体拮抗剂, 减少网络爆裂同步在共培养领域 (图 3D'-3E ')。

神经细胞类型限制蛋白标记视觉上显示了在3D 球体内的星形胶质细胞和神经元的均匀分散排列和成熟度。星形胶质细胞形态学和分支的最大投影显示在图 4A中的代表3D 球体中, hAstros 稀疏标记有膜结合的 GFP。成熟的 hAstros 快速标记包括 GFAP (图 4B), S100B 和 Glt134, 而 hNeurons 和 iNeurons 表达微管相关蛋白 2 (MAP2;图 4C)和蛋白 beta 3 (Tuj1/TUBB3)。最后, 虽然 iNeurons 表达的前后突触蛋白, 包括突触素 1 (Syn1) 和荷马或 PSD95 分别, 突触密度显著增强, hAstros 存在共培养 (图 4D)26。如果可用, 大脑清除技术和光片显微镜的交替使用将使完整球体的快速成像。

同时, 成熟的神经标记和自发电活动的表达证实了上述协议在产生功能突触集成电路 3D cocultures 的成功。

Figure 1
图 1: 从 hPSCs 中提取的3D 神经球体的分化和形成的逐步描述.(A) 《议定书》关键步骤的时间表。(B) 人类诱导的多潜能干细胞 (hPSCs) 可以产生纯的神经细胞群。为星形胶质细胞祖细胞 (点缀绿色盒) 的世代, 看见步2.1 并且 Ref28。(C) 诱导神经元 (iNeurons; 参见第2.2 节) hPSCs 通过诱导过度表达 neurogenin 2 在 2D ECM (7 天) 中产生神经元形态学, 并对 MAP2 (嵌入) 呈阳性。(D) 从 microwell 板上移除的球体 (见步骤 3.1–3.3) 证明了高吞吐量筛选的一致大小。球体可以培养在一个微调瓶生物反应器 (嵌入; 如果需要, 请参见步骤 3.4) 以防止融合。刻度条 = 50 µm (C, 嵌入)。刻度条 = 200 µm (A, D)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 系统和可重现的生物工程3D 神经球体的生成.(a) Microwell (µ) 培养板用于在系统和用户指定的方式下形成理想密度和神经元对星形胶质细胞比值的3D 神经球体, 产生一致的大小和形状。图像显示在球体形成后1天。刻度条 = 200 µm (B) 一系列的起始细胞密度 (从 4 x 103到 2 x 104细胞每 microwell) 产生不同大小的球体。在没有 microwell 板的情况下, hPSCs 组合形成显著较大的非均匀骨料, 其直径在一周后超过扩散极限 (每组和时间点n = 6-14 个球体)。(C) 在 80 rpm 的旋转瓶中培养的 iNeuron 球体的融合较少, 因而明显较小, 更均匀, 并且与固定文化相比, 在三周的时间内表现出更大的圆形 (n = 6-51每组和时间点的球体)。地块表示平均值。* 表示各组之间的意义 (p < 0.05), 使用双尾t检验确定。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 多电极阵列 (多边环境协定) 神经球体的典型活突触生理学.(a、a)利用多边环境协定测量神经球体的活突触生理学。iNeurons (a) 或 cocultures 的 iNeurons 和 hAstros (a) 的球体可以用 ECM 仿基底物在多边环境协定表面进行培养 (见步骤 4.1)。(b、b)在记录窗口 (水平轴) 期间, 在所有电极 (垂直轴) 上测量的具有代表性自发电活动的光栅地块。经过4周的文化在神经基础中等41, iNeuron 球体 (b) 显示自发峰值, 而共培养球体 (b ') 揭示了增加的网络爆发同步射击模式 (橙色箭头)。(c、c)从代表性电极记录窗口时测量的峰值直方图。(d、d)在50µM CNQX, AMPA 受体拮抗剂 (与 b、b ' 相同的时间尺度) 应用后, 在所有电极上测量出自发电活动的光栅地块。CNQX 消除了在 cocultures (D ') 中观察到的峰值同步爆发的存在。  (e ') 在50µM CNQX 应用程序 (与 c、c ' 相同的时间范围内), 在多边环境协定中记录窗口时测量的峰值直方图。(F) 随着时间的推移, 从所有电极上 iNeuron 球体的穗追查的地图 (左)。指示单电极显示多个聚集痕迹随着时间 (中间);单独的钉痕痕迹可以分别进行分类和分析 (右)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 突触集成电路的特征免疫组化.(a) 膜约束 GFP (mGFP) 报告器对于检查3D 神经球体中 hAstros 的排列和形态是有用的。(B) hAstros 区别于 hPSCs 的是胶质阳性。(C) 可通过细胞类型限制蛋白标记 (如 GFAP 和 MAP2) 对含有 hAstros 和 iNeurons 的球体进行可视化和分析。刻度条 = 50 µm (D) 在 iNeurons (左) 和 (右) 共培养 hAstros 的球体中, 分别有代表性的前后突触密度 (Syn1 和 PSD95) 图像。与35天 iNeuron 球相比, 共培养球体中 colocalized Syn1 和 PSD95 的密度显著增高, 表明 hAstros 诱导突触形成的能力 (n = 3 独立复制每个; 从 Ref 转载的数据26以允许)。刻度条 = 10 µm. 图表示平均值。显著差异 (* 表示p < 0.05; ** 表示p < 0.01) 两组之间使用双尾t检验确定。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

在本协议中, 我们描述了一个系统的方法来生产3D 球体的神经 cocultures。球体由星形胶质细胞和神经元组成, 独立于 hPSCs。虽然不是本协议的重点, 但从 hPSCs28中生成的纯星形胶质细胞是一个关键步骤, 如果没有事先的经验, 它在技术上可能具有挑战性。这些突触集成电路的第一步应该是细致的定时和注意细节。hPSC 星形胶质细胞的使用限制是长的分化过程;然而, 生产大量的细胞, 可以冻结, 以供将来使用和解冻时的试验 (见步骤 2.1.5) 消除了需要从最初的 hPSC 阶段开始的过程。虽然从转基因 hPSCs 产生的 iNeurons 是 synaptogenic 的, 并有能力展示自发突触的电流, 这两种特征明显增强的存在胶质细胞12,35-包括本议定书中详细介绍的 hAstros。因此, 应该指出, 细胞类型、数量和发育阶段或成熟度的选择是本议定书的一个关键组成部分, 调整可能导致电活动或突触可视化的变化。然而, 该议定书还允许操纵细胞密度或比率的方式, 反映了可能的条件或结果的灵活性, 个别研究员。

如上所述, 我们利用生物工程工具来产生一种替代神经 organoid 方法42,43, 并告诫说, 这个系统不重述自组织和分层表型的organoids, 可能需要20,44。同时使用 microwell 培养板26和一个微调瓶生物反应器45,46确保重现性, 从而简化了生产, 并检查和分析的神经集成电路用各种细胞培养的化验。应该强调的是, 虽然使用微调瓶或等效生物反应器是可选的, 但在紧密接触中, 球形的固定培养可能会导致它们融合在一起, 从而限制了中心内扩散范围以外的养分和氧气。球体47。值得注意的是, 与大型生物反应器46相比, 使用3D 印制的微型生物反应器是一种更高的吞吐量方法。

用于测量突触形成的传统工具包括生理方法, 如全细胞贴片钳夹、36、48、49和钙成像50。在这里, 我们选择描述多边环境协定的使用, 因为它们提供了一个简单和高通量的测试, 在球体上的电子活动在一个简短的时间尺度。但是, 还可以使用其他技术。

在本协议中使用 microwell 板的限制是每个井中允许的最大球体数 (~ 300) 和每个球体 (~ 2 x 104) 的单元格。可用于增加数量的替代球体形成工具;但是, 在起始点需要更多的单元格。在这里选择了24井格式, 因为它能够产生更大的球体, 可以用来分析和肉眼可见, 同时限制细胞在球体中心的死亡。总的来说, 将这一步骤添加到该议定书将确保一个强健和可伸缩的统一3D 球体的生产。

我们的协议还拥有调整每个细胞类型的数量和比率的灵活性, 以及以受控的、定义的方式将其他细胞类型引入到3D 球体中的可能性。使用区域特定的神经元和星形胶质细胞亚型允许研究中枢神经系统不同区域的突触集成电路。这些共培养球体也可以融合在一起51研究细胞迁移和远距离信号。添加少突胶质, 内皮细胞, 或小胶质可以证明这些3D 球体是一个信息丰富的大脑模型, 增加复杂性, 作为一个有前途的未来方向, 这个方法。最后, 除了疾病和损伤模型, 这个系统允许研究治疗方法, 如细胞置换治疗或药物开发, 以提高 neuroregeneration。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们要感谢埃里克 Ullian 博士 (UCSF) 在设计这些程序方面的知识投入, 迈克尔. 沃德博士 (NIH) 就 iNeuron 分化和 Barlas 进行初步图像分析提供技术咨询。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 well plate Fisher Scientific 08-772-1B
15 mL conical tubes Olympus Plastics 28-101
Accutase Sigma A6964-100ML Detachment solution
AggreWell plate Stemcell Technologies 34850
Anti-Adherence Rinsing Solution Stemcell Technologies 7010 Prevent cell adhesion to microwell plates
Anti/anti Thermofisher 15240062
B27 Thermofisher 17504044 Media Supplement
BrainPhys neuronal medium Stemcell Technologies 5790 Neurophysiological basal medium alternative
Circular glass coverslips Neuvitro GG-12-oz
Cryostor CS10 Stemcell Technologies 7930 Cryopreservation medium with 10% DMSO
DMEM/F12 Thermofisher 10565-042 With GlutaMAX supplement
DMH-1 Stemcell Technologies 73634 HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 μM
Donkey serum Lampire Biological Laboratories 7332100 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Doxycycline Hydrochloride (Dox) Sigma D3072-1ml HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 μg/mL
Epidermal growth factor (EGF) Peprotech AF-100-15 Working concentration: 10 ng/mL
Fibroblast growth factor-2 (FGF) Peprotech 100-18B Working concentration: 10 ng/mL
Fluoromount-G mounting solution Southern Biotech 0100-01
Glass slides Fisherbrand 22-037-246
Goat serum Lampire Biological Laboratories 7332500 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Hemacytometer or automatic cell counter Life Technologies AMQAX1000
Heparin Sigma H3149-50KU Working concentration: 2 mg/mL
Magnetic plate DLAB 8030170200
Matrigel membrane matrix Corning 354230 ECM coating solution. Working concentration: 80 μg/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.
MEA 2100 System Multichannel Systems MEA2100
Mounting solution
N2 Thermofisher 17502048 Media Supplement
OCT Tissue-Tek 4583 Tissue embedding solution for cryosectioning
Pap Pen (Aqua Hold) Scientific Device Laboratory 9804-02
Paraformaldehyde (PFA) Acros Organics 169650025 HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS
Phosphate buffered saline (PBS) Stemcell Technologies CA008-300
Poly-l-ornithine (PLO) Sigma P3655-100MG Working concentration: 0.5 mg/mL
Rectangular glass cover slips Fisherfinest Premium Superslip 12-545-88
ReLeSR Stemcell Technologies 5872 Detachment and passaging reagent
Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y) Tocris 1254 Working concentration: 10 uM
SB431542 Stemcell Technologies 72234 Working concentration: 2 μM
Spinner flasks Fisher Scientific 4500-125
Sucrose Fisher Chemical S5-3 Working concentration: 20% or 30% in PBS
T25 Culture Flask Olympus Plastics 25-207 Vented caps
T75 Culture Flask Olympus Plastics 25-209 Vented caps
Terg-A-zyme Sigma Z273287-1EA Detergent. Working concentration: 1%
TeSR-E8 basal medium Stemcell Technologies 5940 Human pluripotent stem cell (hPSC) medium
TeSR-E8 supplements Stemcell Technologies 5940 Supplements for human pluripotent stem cell medium
TritonX-100 Sigma X100-500ML Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer
Trypan blue Invitrogen T10282
Antibodies
AlexaFluor 488 Thermofisher A-11029 Secondary antibody
AlexaFluor 594 Thermofisher A-11037 Secondary antibody
Ezrin Thermofisher MA5-13862 Primary antibody; astrocytes perisynaptic
GFAP Chemicon MAB360 Primary antibody; astrocytes
GFP Aves GFP-1020 Primary antibody; astrocytes
Glt1 Gift from Dr. Jeffrey Rothstein n/a Primary antibody; astrocytes
Homer Synaptic Systems 160 011 Primary antibody; neurons, post-synaptic
MAP2 Synaptic Systems 188 004 Primary antibody; neurons
PSD95 Abcam ab2723 Primary antibody; neurons, post-synaptic
S100 Abcam ab868 Primary antibody; astrocytes
Synapsin 1 Synaptic Systems 106 103 Primary antibody; neurons, pre-synaptic
TuJ1/β3-tubulin (TUBB3) Covance MMS-435P Primary antibody; neurons

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发育生物学 问题 138 干细胞 神经元 星形胶质细胞 突触 Organoid 共培养 生物反应器 多电极阵列
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Cvetkovic, C., Basu, N., Krencik, R. Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (138), e58034, doi:10.3791/58034 (2018).

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