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Developmental Biology

Microcircuito sináptica modelado con 3D Cocultures de astrocitos y neuronas de células madre pluripotentes humanas

Published: August 16, 2018 doi: 10.3791/58034
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Neuroregeneration, Department of Neurosurgery, Houston Methodist Research Institute

Summary

En este protocolo, nuestro objetivo es describir un método reproducible para combinar disociado humanas pluripotentes células madre derivadas neuronas y astrocitos juntos en 3D esfera cocultures, mantener estas esferas en condiciones flotantes libres y posteriormente medición de la actividad de circuito sináptico de las esferas con inmunoanálisis y matriz micropozo-microcanal grabaciones.

Abstract

Una barrera para nuestra comprensión de cómo varios tipos de células y señales contribuyen a la función sináptica del circuito es la falta de modelos relevantes para el estudio del cerebro humano. Una tecnología emergente para abordar este tema es el uso de tres dimensiones (3D) nervios cultivos de células, denominado 'organoides' o esferoides, para la preservación a largo plazo de las interacciones intercelulares como moléculas de adhesión extracelular. Sin embargo, estos sistemas de cultivo son mucho tiempo y no sistemáticamente generado. Aquí detallamos un método rápidamente y consistentemente producir cocultures 3D de neuronas y astrocitos de humanas pluripotentes células madre. Astrocitos en primer lugar, el distinguido y trasplante de precursores neuronales es disociados y contado. A continuación, las células se combinan en forma de esfera platos con un inhibidor de la Rho-quinasa y en proporciones específicas para producir esferas de tamaño reproducible. Después de varias semanas de la cultura como esferas flotantes, cocultures ('asteroides') finalmente se secciona para la inmunotinción o plateados sobre matrices micropozo-microcanal para medir la fuerza y la densidad sináptica. En general, se espera que este protocolo dará 3D esferas neurales que mostrar marcadores del tipo de célula madura restringido, forman sinapsis funcionales y exhiben red sináptica espontánea explosión actividad. Juntos, este sistema permite detección de drogas y las investigaciones sobre los mecanismos de la enfermedad en un modelo más conveniente en comparación con cultivos de monocapa.

Introduction

Los astrocitos son un tipo de célula glial muy abundante dentro de sistema nervioso central (SNC) con una variedad de responsabilidades funcionales más allá de la ayuda estructural. A través de la secreción de factores solubles sinaptogénica y componentes de la matriz extracelular (ECM), astrocitos ayudan en el establecimiento y agrupación de sinapsis Maduritas durante desarrollo1. También juegan un papel crítico en el mantenimiento de la salud y plasticidad de las sinapsis a través de señalización extracelular2,3,4,5y contribuir a la estabilidad a largo plazo de homeostático ambientes mediante la regulación de potasio extracelular y glutamato, así como la secreción de sustratos de energía y ATP6,7,8. Finalmente, puede contribuir a la neurotransmisión por influir en las corrientes extrasinápticos9e indirectamente puede influir en la actividad a través de otros tipos celulares como la promoción de myelination10. Importante, debido a anomalía o disfunción de los astrocitos puede conducir a muchos síndromes del desarrollo neurológico y neuropatología adulto, es evidente la necesidad de incluir astrocitos junto a las neuronas en redes neuronales Ingeniería en orden para un mejor modelo del ambiente endógeno del cerebro. Una característica integral de astrocitos es su capacidad de interacciones dinámicas forma sinapsis neuronal1,11,12. En la ausencia de glia, las neuronas forman un número limitado de las sinapsis, que en general carecen de madurez funcional13.

Los astrocitos humanos Mostrar características morfológicas, transcripcionales y funcionales — tales como aumento en el tamaño y la complejidad de la ramificación, así como sobre los genes — que no son recapitulados en roedores12,14, 15. Como resultado, los estudios utilizando la célula de vástago de pluripotent humanas (hPSC)-células neuronales derivadas han aceptado ampliamente como un medio de examinar enfermedades relacionadas con el CNS en vitro en el desarrollo de nuevas terapias, lesiones modelos y paradigmas de la cultura16 ,17. Además, hPSCs permiten el estudio de la formación de la sinapsis humana y función sin necesidad de tejido primario18,19.

Una barrera para nuestra comprensión de cómo varios tipos de células y señales contribuyen a la función sináptica del circuito es la falta de modelos relevantes del cerebro humano. Hay una necesidad de una plataforma adecuada recapitular sus redes sinápticas con alta fidelidad y reproducibilidad. Recientemente, ha surgido interés en la producción de sistemas de cultivo 3D (ampliamente conocido como 'organoides,' 'esferoides', o 'mini cerebros')20 de modelo complejo tridimensional (3D) las estructuras a nivel celular y macro. Sistemas de cultivo 3D mantienen interacciones célula-célula y ECM que son normalmente ausente o limitada en cocultivo 2D típico paradigmas21,22. Existen una gran cantidad de técnicas para el cultivo de esferoides nervios 3D23,24,25; sin embargo, muchos requieren períodos de cultivo prolongado (meses a años) de desarrollo espontáneo y preservación de la capa, con el usuario exhibiendo muy poco control sobre la salida.

Aquí, nos ilustran un método sistemático para rápidamente y constantemente bioingeniero interacciones neuronales entre múltiples tipos de células (previamente diferenciadas neuronas y astrocitos) derivan de hPSCs por Unión de células en cocultures de la esfera (asteroides)26 que recapitulan las complejidades morfológicas específicas de humanos en 3D. Este sistema neuronal alta densidad genera subtipos neuronales dispersos uniformemente que tomar propiedades madura con el tiempo y pueden ser proyectados o analizados de un modo de alto rendimiento. Demostramos por primera vez que los astrocitos humanos inducen la actividad de explosión sináptica red en estos cocultures 3D. Además, este protocolo es fácilmente adaptable para generar esferas de diferentes tamaños, para utilizar células especificadas para diferentes identidades regionales de la CNS y estudiar las interacciones de varios otros tipos celulares como se desee.

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Protocol

1. cultura y preparación de los reactivos de la célula

Nota: Los protocolos en esta sección se escriben en el orden en que aparecen en el protocolo de diferenciación (sección 2). Vea la Tabla de materiales para materiales y números de catálogo.

  1. Preparar placas cubiertas para el cultivo celular.
    1. Solución de capa de matriz extracelular (ECM) con medio DMEM/F12 prepare un 1 mg/mL solución diluida. Alícuota ECM diluido solución de stock en 30 tubos cónicos de 3 mL y almacenar inmediatamente a-20 ° C. Para una solución de trabajo, suspender 3 mL de caldo de ECM en 33 mL de pre enfriados medios DMEM/F12, que el volumen total de 36 mL a una concentración de 80 μg/mL.
    2. Aplique 1 mL por pocillo de una placa de cultivo celular 6-pozo con solución de trabajo de ECM. Añadir un adicional 1 mL de DMEM/F12 por pozo (si es necesario) para asegurar la cobertura completa de la superficie del pozo. Permiten que la célula 6-pozo revestida placas a reposar a temperatura ambiente al menos 1 h antes de su uso.
      Nota: Placas cubiertas se pueden almacenar en la incubadora o a 4 ° C hasta por 2 semanas.
  2. Preparar formulaciones de medios de comunicación, factores de crecimiento y moléculas pequeñas.
    1. Para preparar 500 mL de humanas pluripotentes células madre (hPSC) medio27, añadir 20 x y 500 x suplementos según las instrucciones del fabricante.
    2. Para preparar 500 mL de medio de nervios (NM), añadir heparina a una concentración final de 2 mg/mL, 1 x de solución de antibiótico/antimicótico, 1 suplemento de x B27 o 1 x N2 suplemento a una botella de 500 mL de DMEM/F12 con suplemento de L-glutamina como anteriormente detallada28.
    3. Para preparar un 10 mM (1, 000 x) común solución de Rho-kinasa inhibidor Y27632 (Y), añadir 10 mg de polvo en 3 mL de tampón fosfato salino (PBS). Filtro de esterilizar, alícuota y almacenar a-20 ° C. Utiliza a una concentración de trabajo μm 10 en los medios de comunicación.
    4. Para preparar un 20 mM (10, 000 x) solución de SB431542 de archivo, añadir 10 mg de polvo en 1,3 mL de dimetilsulfóxido (DMSO). Para preparar una de 2 mM (1, 000 x) común solución de DMH1, añadir 10 mg de polvo a 13,1 mL de DMSO. Filtro de esterilizar, alícuota y cada solución a-20 ° C. Usar cada uno en una concentración de trabajo 2 μm en los medios de comunicación (NM + SB431542 + DMH1).
      Nota: Este protocolo recomienda concentraciones de trabajo de 2 μm de ambos SB431542 y DMH1 basado en nuestras observaciones e informes de otros29 que indica que esta concentración promueve efectivamente la inducción neural de hPSCs. Concentraciones más altas también han sido reportados30. Además, con medios alternativos, se ha también demostrado que moléculas pequeñas no son necesarias para la alta conversión neural31. Así, las concentraciones de trabajo variará dependiendo de ambientes de cultivo celular alternativo y concentraciones óptimas deben analizarse por los investigadores individuales.
    5. Para preparar los 100 μg/mL (10, 000 x) las soluciones madre de factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de fibroblastos-2 (FGF2), añadir 1 mg de cada uno en 10 mL de PBS + 0.1% de BSA. EGF alícuota FGF2 soluciones de stock en 50 alícuotas de μl y almacenar a-80 ° C. Usar cada uno en una concentración de trabajo 10 ng/mL en los medios de comunicación; por ejemplo, añadir 5 μl EGF y 5 μl FGF2 a 50 mL de NM (NM + EGF FGF2).
    6. Para preparar una solución de clorhidrato de doxiciclina (Dox), primero disuelva el polvo en DMSO a 100 mg/mL y almacenar a-20 ° C. Además diluir para hacer una 2 mg/mL (1, 000 x) stock solución de PBS y conservar a-20 ° C. Utilizar 2 concentración de trabajo μg/mL en los medios de comunicación; por ejemplo, añada 50 μl Dox a 50 mL de NM (NM + Dox).
      Nota: No volver a congelar las soluciones después de descongelar.

2. generación de subtipos neuronales de las células humanas inducidas pluripotentes (hPSCs)

Nota: Todas las culturas de célula debe mantener una incubadora con 5% CO2 a 37 ° C. Estas culturas se mantienen en los niveles de oxígeno del ambiente, aunque pueden utilizar niveles más bajos.

  1. Generar y mantener los progenitores astrositos (hAstros) de hPSCs.
    Nota: Esta sección proporciona un protocolo breve y simplificado de la diferenciación. Para una descripción detallada (con formación de embryoid cuerpo, selección de roseta y pasos de patrones regionales) consulte el protocolo anteriormente descrito28 (figura 1A, caja verde de puntos).
    1. Racimos de semillas de hPSCs (figura 1B) sobre placas de 6 pozos revestido de ECM (vea el paso 1.1) con 2 mL de medio de hPSC + Y por pozo. Las células se alimentan todos los días hasta que son cerca de 50% confluente y dividido según sea necesario.
      1. Para dividir hPSCs, añadir 1 mL de reactivo de pases a los pocillos y aspirar después de células de incubar 1 minuto a temperatura ambiente durante 5 minutos, agregar 1 mL de medio de hPSC y split de agregados 1:10 en nuevos pozos recubiertos de ECM en 2 mL de medio de hPSC + Y por pozo.
    2. Mantener las células madre hasta que tienen alrededor de 50% confluente, luego cambio medios NM + SB431542 + DMH1 para inducir la diferenciación neural (día 0). Cuando las células están cerca de 95% confluente, dividir 1:6 en nuevos pozos recubiertos de ECM en el mismo medio.
    3. El día 14, disociar las células con solución de separación y transferencia a un matraz sin revestimiento con Y para promover la formación de agregados.
      Nota: La adición de Y se utiliza para promover la formación de la célula de supervivencia y de la esfera, pero no está incluida durante cada alimentación.
    4. Para la generación de progenitores neuronales y de neuronas (hNeurons), utiliza estas células día 14 como se describe a continuación. Como alternativa, utilizar estas células en más puntos del tiempo de cultivos monocapa o esfera antes de maduración neuronal se produce o gliogenesis comienza.
      Nota: Por defecto, este protocolo produce astrocitos dorsal cortical. Sin embargo, los subtipos de astrositos pueden especificarse regionalmente por la adición de patrones morfógenos si desea28,32,33. Ácido retinoico (ar) puede añadirse para caudalize las células en la médula espinal, mientras que de sonic hedgehog (SHH), los fenotipos alisado a agonista (SAG), o purmorphamine se producen fenotipos ventrales.
    5. Para la generación de progenitores de astrositos y astrocitos en formado espontáneamente 3D agregados (hAstrospheres), cambie a NM + EGF FGF2 y alimentar semanalmente (o cuando sea necesario para asegurar el pH estable) como anteriormente detallada34.
      1. Suavemente disociar hAstro agregados con solución de separación cuando centros oscuros aparecen y eliminar las esferas que se adhieren espontáneamente. Romper las esferas suavemente una vez por semana para mantener la salud de la esfera y evitar núcleos necróticos.
        Nota: No exceda los 5 minutos de tratamiento con la solución de la separación.
      2. Después de 4 a 6 meses de expansión, confirmar identidad celular y o congelar en medio de la crioconservación (según las instrucciones del fabricante) o almacenamiento alternativo condiciones para la preservación a largo plazo en nitrógeno líquido, o en uso inmediatamente para experimentación.
    6. Para descongelar un stock congelado de hAstrospheres, rápidamente descongelar un vial a temperatura ambiente, transferencia de contenido a un tubo cónico de vacío de 15 mL y centrifugar a 300 x g durante 1 minuto cuidadosamente aspirar el sobrenadante, lave con DMEM/F12 y repita para un total de lavado de dos a unos pasos. Agregar a un matraz de T25 con un volumen total de 6 mL de EGF, NM + Y + FGF2 o ampliar según sea necesario.
  2. Generar y mantener las neuronas inducibles (iNeurons) de hPSCs.
    1. Semillas transgénicas hPSCs (con un transgén estable neurogenin inducible por doxiciclina 235) en ECM cubierto bien 6 placas con 2 mL de medio de hPSC + Y por bien (como se describió anteriormente para las líneas no transgénicas). Alimentación diaria con 2 mL de medio por pozo hasta que estén listos para levantarlas en confluencia de 70%. Dividir celdas como se describe en el paso 2.1.2.
    2. Cuando las células están alrededor del 35% confluente, añadir NM + Dox para inducir diferenciación en iNeurons. Mantener una cultura de monocapa con NM + Dox por 2 días antes de proceder al paso 3.2.
      Nota: Las células se transición a trasplante de precursores neuronales pero no aún extender neuritas (figura 1).

3. preparación y mantenimiento de Cocultures de esfera 3D

  1. Disociar el hAstros de 3D agregados en suspensión (como se describe en el paso 2.1.5.1).
  2. Disociar a hNeurons o iNeurons de una monocapa 2D.
    1. Retire los medios de comunicación de placa de 6 pozos y agregar 500 μl de solución de separación para cada bien que contenga cultivos de monocapa. Incubar a 37 ° C por 5 minutos suavemente añadir 2-3 mL DMEM/F12 para eliminar las células adjuntas.
    2. Recoger las células y los medios de comunicación en un tubo cónico de 15 mL y centrifugar a 300 x g durante 1 min aspirar el sobrenadante, agregar 1 mL de medio fresco y pipeta hacia arriba y hacia abajo suavemente con una micropipeta de 1000 μL para lograr una suspensión unicelular.
  3. Forma esferas 3D utilizando placas pocillos.
    1. Preparar placa agregando 0,5 mL de solución de enjuague anti-adherencia a cada pocillo de la placa de micropocillos. Centrifugar la placa a 2.000 x g por 5 min solución lavado aspirado, añadir 1 mL de DMEM/F12 cada pozo para lavar y aspirar nuevamente.
      Nota: Asegúrese siempre de que la centrífuga esté equilibrada durante el uso.
    2. Cuenta cada tipo de célula usando un hemocitómetro o un contador de células automatizado. Agregar relación deseada de hAstros disociado y hNeurons o iNeurons para cada pozo en un volumen total de 2 mL de NM + Y (incluye Dox si se utilizan iNeurons). Centrifugar la placa a 100 x g durante 3 minutos y vuelva a la incubadora.
      Nota: las placas de 24 pocillos micropocillos (véase la Tabla de materiales) contienen 300 micropocillos por pozo. Añadir un mínimo de 6 x 105 células (para esferas de 2 x 103 células cada uno) y un máximo de 6 x 106 células (para esferas de 2 x 104 células cada uno) en 2 mL de medio por pozo. Para esferas viables de una densidad específica dentro de esta gama, utilice una cantidad definida de células y dividir por 300 para calcular el número de células por esfera. Alternativa ámbito formación de métodos y herramientas también puede ser utilizado si se desea. Siga las instrucciones del fabricante para los rangos aceptables de densidades celulares.
    3. Permitir que las células de uno mismo-montar en esferas densamente dentro de pocillos de placas durante los próximos 2 días (figura 2A). Reemplazar el 50% media si la cultura es amarillamiento.
      Nota: Sólo la mitad de los medios de intercambio y pipetee suavemente al retirar y agregar medios para no disturbar las esferas. Esferas pueden levantar de micropocillos y fusible con mayor fuerza.
    4. Después de 2 días, quite con cuidado las esferas de los micropocillos con una micropipeta de 1000 μl (figura 1). Suavemente aplique fuerza en el fondo de los micropocillos con los medios de comunicación para eliminar cualquier adicionales esferas adheridas. Que las esferas se instalan en un tubo cónico de 15 mL, aspirar viejos media y añadir medio fresco.
  4. Establecer el sistema de biorreactor de spinner frasco para formar esferas 3D.
    1. Limpie la superficie de una placa de agitación magnética con etanol al 70%, coloque en una incubadora de cultivo celular. Frascos individuales spinner de autoclave para esterilizar.
    2. Añadir esferas con un mínimo de media de 50 – 60 mL en cada matraz de spinner (figura 1, recuadro). Coloque el matraz en la placa de agitación magnética de 60 rpm. Esferas de la cultura en frascos de spinner hasta que están listos para la recolección de datos.
      Nota: Se necesita un mínimo de 3 semanas en cultura para la formación de sinapsis. Si no se desea el sistema de biorreactor de frasco de spinner, esferas pueden cultivarse en condiciones estacionarias en frascos de cultivo celular o platos. Esferas también pueden ser incrustadas en ECM o hidrogel.

4. medición de la Fisiología sináptica vivo con matrices micropozo-microcanal (MEAs)

  1. Preparar de MEAs para el cultivo celular.
    1. Limpie la superficie de cada MEA con 1 mL de detergente por 1 h. Enjuague con agua desionizada estéril de (DI), enjuagar con etanol al 70% para esterilizar y luego déjelo secar al aire en bioseguridad gabinete bajo luz UV.
      Nota: MEAs pueden almacenarse en DI agua a 4 ° C en condiciones estériles hasta su uso.
    2. Preparar una solución de 0,5 mg/mL de poly-ornitina (OLP) disolviendo 50 mg de OLP en 100 mL de tampón ácido bórico. Capa de la superficie de cada MEA con 1 mL de PLO a renderizar la superficie hidrofílica e incubar a 37 ° C durante un mínimo de 4 h. quitar el PLO, lave la superficie con agua desionizada, agregue 1 mL de ECM (vea el paso 1.1.1) e incubar a 37 ° C durante un mínimo de 4 h.
    3. ECM de retirar y colocar las esferas en 1,5 mL de medio en una superficie MEA, asegurando que las esferas se colocan en la parte superior del conjunto de electrodo (figuras 3A, 3A'). Permiten adherirse durante 2 días. Cambiar la mitad de los medios de comunicación cada 2 – 3 días (o más a menudo si es necesario), asegurando que las esferas no son perturbadas.
      Nota: La adición de factores de crecimiento puede mejorar la maduración y supervivencia de la cultura.
  2. Medir la actividad eléctrica de nervios esferas.
    1. Establecer un sistema de matriz micropozo-microcanal (MEA) con un headstage de temperatura controlada. Crear un programa de software con un filtro de paso alto de 5 Hz y un filtro de paso bajo de 200 Hz y un umbral de espiga de 5 x desviación de estándar (SD).
    2. Coloque el MEA en la actividad eléctrica espontánea headstage y registro (figura 3BB'). Guardar los datos raws incluyendo aumento de frecuencia y amplitud para el análisis estadístico.
      Nota: Puede utilizarse un sistema de perfusión con el MEA para agregar a agentes farmacológicos o para aumentar el flujo de medios frescos para la grabación de largo plazo. Más post-proceso de picos puede realizarse como deseado36,37.

5. medición de la densidad sináptica con inmunocitoquímica

  1. Preparar los reactivos.
    1. Para hacer una solución de paraformaldehído al 4% (PFA) 500 mL, añadir 400 mL de 1 x PBS a un vaso de precipitado de vidrio o una placa de agitación en una campana de ventilación. Añadir barra de agitación y el calor a 60 ° C mientras revuelve; no hierva. Añadir 20 g de polvo de la PFA a la solución de PBS climatizada y aumentar el pH a 6,9 añadiendo lentamente 1 N NaOH gota a gota.
      Nota: solución PFA 4% puede ser alícuotas y almacenado a 4 ° C hasta por un mes.
    2. Añadir 20 g o 30 g de sacarosa en 100 mL de PBS para hacer soluciones 20% y 30% de sacarosa, respectivamente.
    3. Añadir 1 mL de detergente por 10 mL de PBS para preparar una solución stock al 10%. Invertir varias veces para homogeneizar.
    4. Añadir 250 μl de solución detergente 10% (concentración final de 0.25%) y 500 μl de suero de cabra y burro (concentración final de 5% cada uno) a 10 mL de PBS para preparar la solución amortiguadora de bloqueo primaria.
    5. Añadir 100 μl del suero de cabra y burro (concentración final de 1% cada uno) a 10 mL de PBS para preparar la solución amortiguadora de bloqueo secundario.
  2. Preparar las muestras.
    1. Transferencia de las esferas en un tubo cónico de 15 mL, que puedan instalarse en la parte inferior del tubo y aspirar viejos media. Enjuagar las esferas con 500 μl de PBS, que asiente y aspirar el PBS. Agregar 500 μl de 4% PFA (o suficiente para cubrir las esferas) e incubar a 4 ° C por 30 minutos.
    2. Aspire la PFA y lave suavemente dos veces con PBS. Añadir solución de sacarosa al 20% e incube a 4 ° C durante varias horas o toda la noche. Cuidadosamente aspirar, Añadir 30% solución de sucrosa e incube a 4 ° C durante varias horas o durante la noche.
      Nota: Las muestras pueden ser almacenadas a 4 ° C en PBS o sacarosa hasta 1 semana antes de proceder al siguiente paso. Si no, mantener como esferas 3D (Figura 4A-C) en un tubo de 1,5 mL y proceda al paso 5.3.
    3. Si las esferas de la corte, cuidadosamente transferir esferas a un molde criogénico empotrar sobre hielo seco. Aspirar la solución de sacarosa de 30% y volcar lentamente el tejido incorporación de solución en el molde hasta que cubra completamente la muestra, evitando burbujas de aire. Espere hasta que la solución se congela y almacenar a-80 ° C hasta cortar criostato.
    4. Usando un criostato a-20 ° C, sector los bloques integrados en 30 secciones μm (o como se desee) y traslado a portaobjetos de vidrio. Almacenar a-80 ° C hasta que esté listo para teñir.
  3. Immunostain las esferas.
    1. Delinear los bordes de los portaobjetos con un lápiz hidrofóbico del PAP para evitar derrame de líquidos. Preparar soluciones de bloqueo primarias y secundarias con los anticuerpos (véase la Tabla de materiales). Añadir 500 μl de solución amortiguadora de bloqueo primaria a cada diapositiva o tubo e incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
    2. Extraer el líquido, Añadir 500 μl de solución amortiguadora de bloqueo primaria fresco con anticuerpos primarios diluidos a cada tubo o portaobjetos e incubar durante una noche a 4 ° C. Solución de anticuerpo primario de quitar y lavar 3 veces con PBS durante 10 minutos.
    3. Añadir 500 μl de solución amortiguadora de bloqueo secundario con anticuerpos secundarios diluidos a cada tubo o portaobjetos e incubar a 4 ° C por 1 h. solución de anticuerpo secundario de quitar y lavar 3 veces con PBS durante 10 minutos.
      Nota: Se proporciona una lista de anticuerpos recomendadas en la Tabla de materiales. Otros anticuerpos o tintes pueden ser utilizados como deseado. No exponga las muestras fluorescentes a la luz (adelante paso 5.3.3).
    4. Añadir 50 μl de la solución gota a gota para cubrir la superficie y coloque cuidadosamente un cubreobjetos sobre el portaobjetos, evitando burbujas de montaje. Deje que los portaobjetos se seque a temperatura ambiente durante 24 h y almacenar a 4 ° C.
  4. Imágenes de las diapositivas.
    1. Usar un microscopio de fluorescencia confocal o dos fotones con un 63 X objetivo de inmersión de aceite a la imagen y abundancia de proteína postsináptica y colocalización en rebanadas de la esfera (figura 4). Use un 20 X o 40 X objetivo visualizar las características morfológicas de la hAstros.
    2. Archivos de imagen abiertos fluorescencia con el software ImageJ. Cuenta pre y post sináptica puncta manualmente utilizando el contador celular plug-in, utilizando un método de conteo imparcial como anteriormente detallado38, o con métodos alternativos.

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Representative Results

Cuando se realiza correctamente, este protocolo produce poblaciones definidas de cocultures funcionales de astrocitos28,33,34 y neuronas35 generados a partir de hPSCs (figura 1A-1C), como detallado anteriormente26 y aquí descritos en los pasos 2.1, 2.2. Este procedimiento paso a paso, con la utilización de placas de pocillos, se espera que esferas nervios 3D de tamaño constante y forma (paso 3.3; Figura 1) con células uniformemente dispersadas y sin señales significativas de muerte celular. Una gama de densidades de célula, a partir de una proporción deseada de tipos celulares, producen esferas de diferentes tamaños. En la ausencia de placas de pocillos, las células se combinan para formar agregados de significativamente más grandes y no uniforme cuyo diámetro (> 2 mm) supera el límite de difusión (figura 2A-2B). Se prevé que el uso de un biorreactor de frasco o equivalente de spinner mantendrá uniformidad entre esferas y reducir la fusión (paso 3.4; Figura 2). Sin embargo, mientras que los frascos de spinner permiten para la cultura de las esferas durante semanas, no es necesaria su utilización.

Para estabilizar el cocultures para el análisis electrofisiológico, imitan a las ECM sustratos permiten esferas adherirse fácilmente manteniendo su estructura 3D (Figura 3A, 3A'). Durante las grabaciones, sana las esferas de la iNeurons a MEAs espontáneamente elicite picos de voltaje superior a ± 40 μV con frecuencias de disparo constante (pasos 4.1 – 4.2; Figura 3B -C, 3F). Esferas de cocultivo se espera que muestre una mayor conectividad de red con la presencia de hAstros, resultando en un incremento de explosiones red síncrona de espigas (figura 3B' C -3 '). La aplicación de CNQX35,39,40, un antagonista de receptores postsináptico AMPA, reduce red burst sincronía en esferas de cocultivo (figura 3D'-3E').

Marcadores neuronales-tipo de la célula limitada visualmente demuestran el arreglo uniformemente disperso y la madurez de astrocitos y neuronas en 3D esferas. Una proyección máxima de morfología astrositos y ramificación se muestra en la Figura 4A en una esfera 3D representante con hAstros escasamente marcados con GFP unida a la membrana. HAstros maduras expresan marcadores incluyendo GFAP (Figura 4B), S100B y Glt134, mientras que hNeurons y iNeurons expresan proteína asociada a microtúbulos 2 (MAP2; Figura 4) y tubulina beta 3 (Tuj1/TUBB3). Por último, aunque iNeurons expresar proteínas pre- y postsinápticos, incluyendo 1 sinapsina (Syn1) y Homero o PSD95, respectivamente, la densidad sináptica es mejorada significativamente por la presencia de hAstros en cocultivo (figura 4)26. Si está disponible, el uso alternativo de cerebro claro hoja luz microscopia y técnicas permitirá la proyección de imagen rápida de esferas intactas.

Tomados en conjunto, la expresión de marcadores neuronales maduros junto con la actividad eléctrica espontánea confirman el éxito del protocolo detallado anteriormente en la producción de cocultures 3D de microcircuitos sinápticas funcionales.

Figure 1
Figura 1: representación paso a paso de la diferenciación y formación de 3D esferas neuronales derivan de hPSCs. (A) línea de tiempo de los pasos claves en el protocolo. Pueden generar poblaciones puras (B) de las células neuronales de las células madre pluripotentes inducidas humanas (hPSCs). Para la generación de progenitores de astrositos (caja verde punteada), vea paso 2.1 así como Ref28. (C) inducible por las neuronas (iNeurons; vea la sección 2.2) generadas a partir de transgénicos hPSCs a través de la sobreexpresión inducida de neurogenin 2 demostrar morfología neuronal en 2D ECM (día 7) y son positivas para MAP2 (inserción). (D) esferas de placas de pocillos (ver pasos 3.1-3.3) demuestran tamaño constante para el cribado de alto rendimiento. Esferas pueden ser cultivadas en un biorreactor de matraz spinner (recuadro; vea paso 3.4) si lo desea para evitar la fusión. Barra de escala = 50 μm (C, de la inserción). Barras de escala = 200 μm (A, D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: generación sistemática y reproducible de Bioingeniería 3D esferas neural. (A) placas pocillos (μ-bien) se utilizan para formar esferas 3D neurales de densidad deseada y proporciones de neurona a astrositos de manera sistemática y especificada por el usuario, dando forma y tamaño constante. Imágenes aparecen un día después de la formación de la esfera. Barras de escala = 200 μm. (B) una amplia gama de a partir de las densidades de célula (de 4 x 103 a 2 x 104 células por pocillo) produce esferas de diferentes tamaños. En la ausencia de placas de pocillos, hPSCs se combinan para formar agregados de significativamente más grandes y no uniforme cuyo diámetro sobrepasa el límite de difusión después de una semana (n = 6-14 esferas por grupo y tiempo). (C) iNeuron esferas cultivadas en un matraz de spinner a 80 rpm exhibieron menos fusión y así fueron significativamente más pequeños, más uniforme y expuesta circularidad mayor en comparación con aquellos en la cultura inmóvil durante un período de tres semanas (n = 6-51 esferas por grupo y tiempo). Parcelas representan la media ± SD; * indica significancia (p < 0.05) entre grupos, determinada dos colas t-pruebas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Fisiología sináptica vivo representante de esferas neurales en arreglos de discos micropozo-microcanal (MEAs). (A, A') MEAs se utilizan para medir la Fisiología sináptica vivo de esferas neurales. Esferas de iNeurons (A) o cocultures de iNeurons y hAstros (A') pueden ser cultivados en las superficies de la MEA con sustratos imitan a las ECM (ver paso 4.1). (B, B') Trama de parcelas de la actividad eléctrica espontánea representante medida a través de todos los electrodos (eje vertical) durante un período de grabación (eje horizontal). Después de 4 semanas de cultivo en medio basal neurofisiológicos41, esferas iNeuron (B) muestran picos espontáneos, mientras que esferas de cocultivo (B) revelaron mayor red ráfagas de disparo sincrónico patrones (flechas naranjas). (C, C') Histograma de picos medidos durante windows grabación de MEA de electrodos representante. (D, D') Diagramas de la trama de la actividad eléctrica espontánea medición a través de todos los electrodos después de la aplicación de 50 μm CNQX, un antagonista del receptor AMPA (misma escala de tiempo como B, B'). CNQX eliminó la presencia sincrónica ráfagas de puntas en cocultures (D').  (E, E') histograma de picos medidos durante windows grabación de MEA de electrodos representante después de la aplicación de CNQX de 50 μm (misma escala de tiempo como C, C'). (F) mapa de trazados de spike de esferas iNeuron de todos los electrodos con el tiempo (izquierda). Electrodo único demostrativo mostrando múltiples rastros agrupados en el tiempo (medio); rastros de espiga individual pueden ser clasificados y analizados individualmente (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: característica inmunohistoquímica de microcircuitos sinápticas. Reportero (A) un GFP unida a la membrana (mGFP) es útil para examinar la disposición y morfología de hAstros en 3D esferas neurales. (B) hAstros diferenciadas de hPSCs es positiva GFAP. (C) las esferas que contienen hAstros y iNeurons pueden ser visualizadas y analizan usando celular restringida por el tipo de marcadores como GFAP y MAP2. Barras de escala = 50 μm. (D) imágenes representativas de densidades previas y postsinápticos (Syn1 y PSD95, respectivamente) en las esferas de iNeurons sin (izquierda) y con (derecha) morfología hAstros. Una significativamente mayor densidad de colocalized Syn1 y PSD95 observó en cocultivo esferas en comparación con esferas de iNeuron en el día 35, demostrando la capacidad de hAstros para inducir la formación de sinapsis (n = 3 réplicas independientes cada; datos reimpresos de Ref 26 con permiso). Barras de la escala = 10 μm. parcela representa media ± SEM; diferencias significativas (* indica p < 0.05; ** indica p < 0.01) entre los grupos se determinaron utilizando dos colas t-pruebas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este protocolo, se describe un método sistemático para la producción de esferas 3D de nervios cocultures. Las esferas están compuestos por astrocitos y neuronas, que se derivan independientemente de hPSCs. Aunque no es el objetivo de este protocolo, la generación de poblaciones puras de astrocitos del hPSCs28 es un paso crítico y puede ser técnicamente difícil si se realiza sin experiencia previa. Este primer paso en la generación de estos microcircuitos sinápticas debe realizarse con tiempo meticuloso y atención al detalle. Una limitación del uso de derivados de hPSC astrocitos es el proceso de diferenciación muy largo; sin embargo, la producción de grandes cantidades de células que pueden ser congeladas para su futuro uso y descongelar en el momento de la experimentación (ver paso 2.1.5) elimina la necesidad de comenzar el proceso desde la etapa inicial hPSC. Aunque las iNeurons generados a partir de transgénicos hPSCs sinaptogénica y tienes la capacidad de exhibir espontáneas postsynaptic corrientes eléctricas, ambas características son notablemente realzados por la presencia de glia12,35, incluyendo la hAstros detallada en el presente Protocolo. Así, cabe señalar que la elección del tipo de células, número y etapa de desarrollo o madurez es un componente fundamental de este protocolo, y ajustes pueden resultar en variaciones en la actividad eléctrica o visualización de la sinapsis. Sin embargo, este protocolo también permite la manipulación de densidad celular o relaciones de una manera que refleja la flexibilidad de las condiciones o los resultados del investigador individual.

Como se describió anteriormente, aprovechamos herramientas de bioingeniería para producir una alternativa a los nervios organoide métodos42,43, con la salvedad de que este sistema no recapitular los fenotipos de uno mismo-organización y estratificación de organoides que pueden ser había deseado20,44. El uso simultáneo de pocillos de placas de cultura26 y un hilandero frasco biorreactor45,46 asegurar la reproducibilidad, por lo tanto agilizar no sólo la producción sino también el examen y análisis de Microcircuitos neuronales con una variedad de ensayos de cultura de célula. Cabe destacar que aunque el uso de un biorreactor de frasco o equivalente de spinner es opcional, una cultura inmóvil de las esferas en contacto puede resultar en su fusión, así limitando nutrientes y oxígeno más allá del límite de difusión en el centro de esferas47. En particular, el uso de 3D mini-Biorreactores impresos se han divulgado como un enfoque de rendimiento superior en comparación con grandes Biorreactores46.

Las herramientas tradicionales para medir la formación sináptica incluyen métodos fisiológicos tal parche de células completas de sujeción, MEAs36,48,49y50la proyección de imagen del calcio. Aquí, elegimos describir el uso de MEAs ya que proporcionan un examen simple y alto rendimiento de la actividad eléctrica en las esferas en una escala de tiempo breve. Sin embargo, otras técnicas también pueden ser utilizadas.

Una limitación de la utilización de placas de pocillos en este protocolo es el número máximo de células por esfera y esferas (300 ~) (~ 2 x 104) que se permiten en cada pozo. Pueden utilizarse herramientas de formación de esfera alternativo para un número creciente; sin embargo, un mayor número de células será requerido en el punto de partida. El formato de 24 pocillos fue elegido aquí por su capacidad para generar esferas más grandes que pueden ser manipulado para su análisis y visible por el ojo, limitando la muerte celular en el centro de las esferas. En general, la adición de este paso del protocolo garantizará una producción robusta y escalable de esferas uniformes de 3D.

Nuestro protocolo también cuenta con la flexibilidad de ajustar el número y proporción de cada tipo de célula, así como la posibilidad de introducir a otros tipos de células en las esferas 3D de una manera controlada y definida. El uso de cada región neuronal y astrositos subtipos permite el estudio de microcircuitos sinápticas de diferentes regiones del sistema nervioso central. Estas esferas también pueden ser de cocultivo fusionado51 para estudiar la migración celular y señalización de largo alcance. La adición de microglía, oligodendrocitos y células endoteliales podrían estas esferas 3D para un modelo de cerebro informativo con mayor complejidad, como una dirección futuro prometedor para este método. Por último, además de enfermedades y lesiones de modelado, este sistema permite el estudio de enfoques terapéuticos, como terapia de reemplazo celular o desarrollo de fármacos, para mejorar la Neurorregeneración.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer a Dr. Erik Ullian (UCSF) por entrada intelectual sobre el diseño de estos procedimientos, el Dr. Michael Ward (NIH) para asesoramiento técnico en la diferenciación iNeuron y Barlas de Saba para el análisis preliminar de la imagen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 well plate Fisher Scientific 08-772-1B
15 mL conical tubes Olympus Plastics 28-101
Accutase Sigma A6964-100ML Detachment solution
AggreWell plate Stemcell Technologies 34850
Anti-Adherence Rinsing Solution Stemcell Technologies 7010 Prevent cell adhesion to microwell plates
Anti/anti Thermofisher 15240062
B27 Thermofisher 17504044 Media Supplement
BrainPhys neuronal medium Stemcell Technologies 5790 Neurophysiological basal medium alternative
Circular glass coverslips Neuvitro GG-12-oz
Cryostor CS10 Stemcell Technologies 7930 Cryopreservation medium with 10% DMSO
DMEM/F12 Thermofisher 10565-042 With GlutaMAX supplement
DMH-1 Stemcell Technologies 73634 HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 μM
Donkey serum Lampire Biological Laboratories 7332100 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Doxycycline Hydrochloride (Dox) Sigma D3072-1ml HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 μg/mL
Epidermal growth factor (EGF) Peprotech AF-100-15 Working concentration: 10 ng/mL
Fibroblast growth factor-2 (FGF) Peprotech 100-18B Working concentration: 10 ng/mL
Fluoromount-G mounting solution Southern Biotech 0100-01
Glass slides Fisherbrand 22-037-246
Goat serum Lampire Biological Laboratories 7332500 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Hemacytometer or automatic cell counter Life Technologies AMQAX1000
Heparin Sigma H3149-50KU Working concentration: 2 mg/mL
Magnetic plate DLAB 8030170200
Matrigel membrane matrix Corning 354230 ECM coating solution. Working concentration: 80 μg/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.
MEA 2100 System Multichannel Systems MEA2100
Mounting solution
N2 Thermofisher 17502048 Media Supplement
OCT Tissue-Tek 4583 Tissue embedding solution for cryosectioning
Pap Pen (Aqua Hold) Scientific Device Laboratory 9804-02
Paraformaldehyde (PFA) Acros Organics 169650025 HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS
Phosphate buffered saline (PBS) Stemcell Technologies CA008-300
Poly-l-ornithine (PLO) Sigma P3655-100MG Working concentration: 0.5 mg/mL
Rectangular glass cover slips Fisherfinest Premium Superslip 12-545-88
ReLeSR Stemcell Technologies 5872 Detachment and passaging reagent
Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y) Tocris 1254 Working concentration: 10 uM
SB431542 Stemcell Technologies 72234 Working concentration: 2 μM
Spinner flasks Fisher Scientific 4500-125
Sucrose Fisher Chemical S5-3 Working concentration: 20% or 30% in PBS
T25 Culture Flask Olympus Plastics 25-207 Vented caps
T75 Culture Flask Olympus Plastics 25-209 Vented caps
Terg-A-zyme Sigma Z273287-1EA Detergent. Working concentration: 1%
TeSR-E8 basal medium Stemcell Technologies 5940 Human pluripotent stem cell (hPSC) medium
TeSR-E8 supplements Stemcell Technologies 5940 Supplements for human pluripotent stem cell medium
TritonX-100 Sigma X100-500ML Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer
Trypan blue Invitrogen T10282
Antibodies
AlexaFluor 488 Thermofisher A-11029 Secondary antibody
AlexaFluor 594 Thermofisher A-11037 Secondary antibody
Ezrin Thermofisher MA5-13862 Primary antibody; astrocytes perisynaptic
GFAP Chemicon MAB360 Primary antibody; astrocytes
GFP Aves GFP-1020 Primary antibody; astrocytes
Glt1 Gift from Dr. Jeffrey Rothstein n/a Primary antibody; astrocytes
Homer Synaptic Systems 160 011 Primary antibody; neurons, post-synaptic
MAP2 Synaptic Systems 188 004 Primary antibody; neurons
PSD95 Abcam ab2723 Primary antibody; neurons, post-synaptic
S100 Abcam ab868 Primary antibody; astrocytes
Synapsin 1 Synaptic Systems 106 103 Primary antibody; neurons, pre-synaptic
TuJ1/β3-tubulin (TUBB3) Covance MMS-435P Primary antibody; neurons

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Biología del desarrollo número 138 células madre neuronas astrocitos sinapsis organoide cocultivo biorreactor matriz micropozo-microcanal
Microcircuito sináptica modelado con 3D Cocultures de astrocitos y neuronas de células madre pluripotentes humanas
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