ホット スポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応

Summary

ここでは、ドロップオフ ddPCR と加水分解プローブの一意のペアを使用して単一の反作用で対象地域の複数の遺伝子の変異を正確に定量化するためのプロトコルを提案する.

Abstract

液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応 (ddPCR) は、ナノサイズの水-油の個々 の反作用の数千にサンプル分別に基づく高感度の量的なポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 法です。最近では、ddPCR は循環腫瘍 (葉緑体) DNA 検出の最も正確で重要なツールとなっています。標準的な ddPCR 技術の主要な限界の 1 つは、特定加水分解プローブ各対立遺伝子のバージョンを認識し、必要な反応あたり上映することができます変異数の制限です。別の方法、ドロップオフの ddPCR では、プローブで検出し、対象地域における潜在的すべての遺伝的変化を定量化するの 1 つのペアだけが必要なので、スループットが向上します。ドロップオフの ddPCR は、単一の反作用で突然変異の大きい数を検出の利点と従来の ddPCR の試金に匹敵する感度を表示します。コスト効率の高い、貴重な試料を節約、変異をアプリオリに知られていないとき検出ツールとして使用することができます。

Introduction

何千もの癌の開発に関連する体細胞突然変異は報告された¹をされています。これらのうち、いくつかの標的療法^2,3の有効性予測マーカー、遺伝のこれらの突然変異のスクリーニングは今日常診療。液滴デジタル PCR (ddPCR) の技術は高い検出精度と突然変異の有無を監視するため、非侵襲的な液体生検^4、5と高い互換性。ただし、試金 ddPCR 現在主に先天的な知られている突然変異を検出する設計されています。突然変異が知られている場合、これは深刻な検出ツールとして ddPCR の使用が制限されます。確かに、従来の ddPCR デザインの野生型対立遺伝子 (WT プローブ) を認識し加水分解プローブは突然変異体の対立遺伝子 (MUT プローブ) (図 1 a) を認識し、特定のプローブと競合します。高い親和性プローブは、テンプレートに交配し、対応する遺伝子の性質を示す、その蛍光を解放します。各液滴の得られた蛍光データは、別の次元で WT とムトのプローブによって放出される蛍光を表す散布で視覚化できます。従来の ddPCR の試金のための典型的な結果の概略は、図 1 aに提示されます。この例では、青、雲は水滴、MUT の対立遺伝子が増幅され MUT プローブによって識別されるに対応する赤い雲に対し WT プローブによって識別される WT 対立遺伝子を含んでいる小滴に対応します。反応に読み込まれている DNA の量、に応じて WT とムトの産物を含む二重肯定的な液滴は (緑雲) を表示できます。光の灰色の雲は、空の液滴に対応します。

以来、ほとんどのプラットフォームは、フルオロ (通常 2、5 までが) の限られた数の検出を実現、従来の ddPCR のスループットが制限されています。したがって、複数の隣接する遺伝子変異を有する地域をターゲット技術的に困難な多重 ddPCR 試金または並行各突然変異を対象とする複数の反応の使用の設計が必要です。WT 加水分解プローブの一意のペアを使用してターゲット領域内の遺伝的改変を検出できる可能性があるので、ドロップオフ ddPCR 戦略はこの制限を克服します。ターゲット地域と 2 番目のプローブ (プローブ 2) に隣接する非可変シーケンスは突然変異が、対象地域の WT シーケンスに補足最初のプローブ (プローブ 1) のカバーには、(図 1 b) が期待されています。最初のプローブは、反応における無衝突分子の合計量を定量化中、2 番目のプローブは突然変異体シーケンスにサブ最適な交配によって WT とムトの対立遺伝子を識別します。プローブ 2 は、複数のターゲット地域 (単一または複数のヌクレオチドの置換、削除、等)⁶の突然変異の種類を識別できます。従来の ddPCR のように光の灰色の雲は、DNA 分子を含まない水滴に対応します。それはこのタイプの試金、WT とムトの雲の最適な分離は WT だけを含んでいる小滴から WT とムトのターゲット遺伝子を含んでいる小滴を区別できないので、反応に読み込まれている DNA の量に依存していることを思い出すことが重要フォーム。したがって、この試金はほとんど水滴が目標とされた遺伝子の 1 つ以上のコピーを含める必要があります。

Protocol

ここで提示されたプロトコルの Institut キュリーの倫理ガイドラインに従います。人間のすべてのサンプルは、インフォームド コンセント、Institut キュリー制度審査委員会で承認された研究の後、登録された患者から得られました。

1. 血液 DNA 抽出プラズマ ・ コレクション

注: 任意の種類の「組織」から抽出した DNA を使用できます (例えば、新鮮なまたはホルマリン固定パラフィン埋め込まれた (FFPE) 組織、文化や血液の細胞)。ここでは、採血、プラズマ分離とストレージ、および細胞の DNA (cfDNA) の抽出の詳細な手順を提供します。

1. 血のコレクションおよびプラズマのストレージ (図 2 b)
   1. 7 mL EDTA の管に血液サンプルを収集します。2 つの管は、プラズマの約 4 mL を収集するために推奨されます。
   2. 赤い血球 (RBC)、白血球 (WBC) とプラズマ分離する血液の 3 h 以内 820 x gで 10 分間のチューブを遠心します。サンプリングし、遠心分離の間の時間は、高品質の cfDNA (すなわち、 WBC からリリースされた DNA の汚染されていない cfDNA) を取得する重要です。
   3. 慎重にピペット WBC レイヤーに触れることがなく 1 mL ピペットを使用して上清 (プラズマ)プラズマの約 2 mL で通常 EDTA 管ごとリカバリされます。
   4. 2 mL チューブにプラズマを転送し、16,000 x g細胞の残骸を削除する 15 の ° C で 10 分間で試料を遠心分離します。
   5. 慎重にピペット ペレットを乱すことがなく清 (プラズマ)。2 mL の低温管でプラズマを配布し、-80 ° c まで必要な保存します。
2. cfDNA 抽出(図 2 b)
   注: ここでは、手動で抽出キットを使用して手順を紹介します。製造元の指示に従って自動バージョンは、cfDNA の分離も実行できます。
   1. プロティナーゼ K の 400 μ L を 50 mL チューブに入れます。キットからプラズマ (日常的に使用されるボリューム) の 4 mL と 3.2 mL の溶解バッファー (1.0 μ g キャリア RNA を含む) の ACL を追加します。管を閉じるし、30 のボルテックスによってミックス s 均一溶液を取得します。60 の ° c で 30 分間インキュベートします。
   2. (キット) から循環シリカ膜の核酸の結合を最適化し、ミックスを 15-30 s. 加温氷の上 5 分の管のボルテックス ライセートに 7.2 mL のバッファー ACB を追加します。
   3. 真空ポンプに列と 20 mL のエクステンダーを配置します。真空吸引を許可する未使用のポジションをクローズします。
   4. 慎重にチューブ エクステンダー (簡潔に遠心ライセート バッファー ACB 混合物の最大値を収集するためにチューブ) に溶解バッファー ACB の混合物を適用真空ポンプに切り替えでき、ライセートを完全に列を描画します。取り外してチューブ エクステンダーを廃棄します。
   5. バッファー ACW1 の 600 μ L を列に適用します。750 μ L を追加の列をバッファー ACW1 が描画されると、バッファー ACW2 そして最後にエタノール (96 ~ 100%) の 750 μ L を追加。その後、クリーン 2 mL 管とフルスピード (20,000 x g) エタノールを除去するために 3 分間遠心に列を配置します。
   6. 新しい 2 mL のコレクションの管に列を配置します。蓋を開けるし、膜を完全に乾燥する 10 分の 56 ° C で孵化させなさい。
   7. きれいな 1.5 mL DNA 低いバインド チューブに列を配置します。0.04% アジ化ナトリウム (バッファー AVE) と RNase フリー水の 36 μ L を慎重に適用されます。蓋を閉じて 3 分間室温でインキュベートします。
   8. フルスピード (20,000 x g) 核酸を溶出し、-20 ° C 必要になるまで、保管 1 分間遠心します。
3. cfDNA 定量化
   注: cfDNA 定量化、蛍光光度計使用前に抽出または室温 (RT) でサンプルを凍結解除後すぐに製造元のプロトコルを使用して実行されます。複数の凍結/解凍サイクルを避けてください。
   1. 未満 100 ng/mL プラズマは、通常予想される cfDNA の量によると高感度アッセイを使用します。cfDNA 濃度は健常者の 2-10 ng/mL の範囲が、転移性疾患患者の 100 ng/mL 程度にすることができます。
   2. すべての試薬は常温、199 μ L 蛍光光度計希釈バッファーの色素 (200 x) 1 μ L を混ぜて反応 (サンプル + 2 基準、蛍光光度計を校正するための N 数) あたりを確保する実用的なソリューションを取得します。
   3. 渦の均質性を確保し管の下部に内容を収集するために遠心分離機の簡潔に徹底的に cfDNA ソリューション。
   4. 実用的なソリューションの 195 μ L で各 cfDNA サンプルのミックス 5 μ。
   5. ミックス 10 μ L の各標準作業ソリューションの 190 μ L で。
   6. 均質性を確保し、簡単にチューブの下部に内容を収集するために遠心 2-3 s 用渦徹底的にすべてのチューブします。
   7. RT で暗闇の中で 2 分間インキュベートします。
   8. 'Ng/μ L' 出力モードを使用して、蛍光光度計でチューブを読む
   9. プラズマの ng/mL に最終濃度を次のように計算: ng/μ L x 36 (cfDNA 溶出量)/4 (プラズマ抽出量)。

2. ddPCR プローブ ・ プライマー デザイン (図 2 a)

注: ドロップオフ ddPCR 試金の対象となる分子の増幅 qPCR の似たような原則に従います。各プライマーおよびプローブは Primer3⁷ (http://primer3.ut.ee/) 従来の専用ソフトで設計されています。

1. プライマー デザイン
   1. 全般設定のウィンドウで '2価陽イオンの濃度' 'dNTPs の濃度' 3.8 を 0.8 と'mispriming/リピート ライブラリ'正しい生物に変更します。
   2. 事前の設定ウィンドウでサンタ ・ ルチアの 1998 年「熱力学的パラメーターの表」と「塩分濃度式」両方を変更します。
   3. 55 ~ 70 ° C T_mを選択 (塩分濃度と 300 50 ミリメートルとオリゴヌクレオチド濃度の nM)。
   4. PrimerBlast などのツールを使用してプライマーの特異性を確認します。
   5. 二次構造がある地域を避けてください。
   6. 50-60% の GC 含量を持つシーケンスを選択します。
   7. Gs と Cs 3 拠点以上の繰り返しは避けてください。
   8. 可能な場合は 3' 端に Gs と Cs が付いているプライマーを選択します。
   9. 一対のプライマーの 3' 端プライマー二量体を避けるために有意な相補性を持っていないことを確認します。産物を 150 未満にする必要があります cfDNA を効率的に増幅する bp (サイズは 170 の bp⁸を意味する) と頻繁に分解は FFPE から抽出された DNA。
2. プローブ設計
   注: 加水分解プローブは、5' 端に蛍光レポーター/3' 末端をクエンチャーが付いています。彼らは高い特異性を提供する高い信号対雑音比と多重化により必要な場合。2 ch 液滴読者ファム/六角の分析と同様、FAM と HEX またはヴィックの染料と互換性のあるまたはファム/ヴィック結合プローブ。
   1. 加水分解プローブ ターゲット領域と隣接する非可変領域の WT シーケンスに補足をデザインします。
   2. 以前に設計されたプライマーによって定義された私アンプリコン内にある両方のプローブを選択します。プライマー シーケンスは、互いの隣に座ることがありますが、プローブの順序と重複できません。
   3. Gs。 プローブは 30 〜 80% の GC 含量を持つ必要がありますよりもより多くの Cs のあるストランドを選択します。
   4. 13 と 30 ヌクレオチドの長さの間、プローブを選択します。高いバック グラウンド蛍光を表示する傾向がある長いプローブ蛍光レポーターの消光蛍光体と、クェンチャーの距離に影響するため。
   5. T_m 3 ~ 10 ° C プライマーのアニーリングをおよび拡張中に加水分解プローブを確保するプライマーの T_mより高くするプローブを選択します。T ・_m ・増築を短いプローブ差別より効率的に単一のヌクレオチドの亜種として、短いプローブを維持しながら必要な T_mに到達する推奨します。プローブによって、これは加水分解後も蛍光信号をクエンチするために、その 5' 端に G はなりません。
   6. ドロップオフ プローブの設計を次のように: 5'-(VIC)-変異領域の補足の WT シーケンス-(MGB NFQ) 3' とプローブのリファレンス: 5'-(6-FAM)-非可変領域の相補的な塩基配列-(MGB NFQ) 3'。レポーター/クェンチャーの他の組み合わせも可能です。

3. ddPCR (図 2 a) の反応の最適化

注: この手順で使用される野生型と変異型の DNA コントロール得られる細胞、腫瘍サンプルまたは市販の DNA の基準など。

1. 熱勾配機能を使用して設計したプライマーによって増幅される PCR の製品の特異性を検証する熱 cycler で従来の PCR を実行します。
   1. 4.1 ステップ 8 反応温度ごとに少なくとも 1 つの反応をする最低の野生型 DNA コントロール テンプレート (プローブ) なしで下記のとおりユニークな PCR の反作用の組合せを準備します。
   2. 4.3.2 ステップおよびプライマーの理論的アニーリング温度付近のアニーリングの温度の範囲で記述されているプログラムを使用して増幅を実行します。
   3. アニーリング温度が特定の製品を提供することに選択する 3% の agarose のゲルの PCR の製品をロードします。
2. ドロップオフ ddPCRs 上記のパラメーターを使用して、この時間は両方のプローブを含むシリーズを実行します。
   1. 100% WT DNA 100% MUT DNA、WT とムトの DNA の混合物を使用 (例えば50% MUT/50% WT) WT とムトの液滴雲の明確な分離に最適な条件を決定します。
   2. 4.1 のステップで選択した温度以上のアニーリングの温度の範囲を選択します。
   3. アニール温度 100% WT DNA または 100% MUT DNA と WT とムトの液滴雲の最高の分離を使用する場合、WT または MUT の特異的検出の信号を可能にするを選択します。
   4. 雲の分離を改善するために、中間蛍光 (雨効果) を用いた液滴の数を減らすため、アニーリング時間とプライマー ・ プローブの濃度を調整もできます。
3. 背景または空白 (LOB) の制限を評価の試金。
   1. 48 WT コントロール DNA 焼鈍パラメーターおよびプライマー ・ プローブ濃度 3.2 で選択使用して個々 のドロップオフ ddPCR 反応の最小値を実行します。
   2. 各反作用のため突然変異体の対立遺伝子頻度 (MAF) を次のように計算: (塗りつぶされた滴数変異液滴の数) x 100。
      注: LOB は偽陽性 MAF 平均として定義され、関連付けられている SD の 95% 信頼区間 (95 %CI) の計算をします。LOB = (平均偽陽性 maf) + 95% 信頼区間。
4. アッセイの検出 (LOD) の制限を評価します。
   1. MAFs 5% から 0.01% に至るまでに、WT DNA の MUT DNA のシリアル希薄を使用してドロップオフ ddPCR 反応を実行 (1 つの条件は ≥ 8 がレプリケートされます)。3.2 で選ばれたアニーリング パラメーターとプライマー ・ プローブの濃度を使用します。
      注意: LOD は定義 MAF の最小値としての現在の平均値と SD、LOB 上を複製 (Decraeneらを参照してください。⁶詳細については)。

4. ddPCR プロトコル (図 2 b)

います従来のような ddPCR、ドロップオフ ddPCR プロトコルで構成されて 4 つのステップ: (i) PCR ミックス準備、(ii) 液滴生成、pcr (iii) および (iv) データ集録。

1. PCR ミックスの準備
   1. 標準予防策に従い、手袋、きれいな PCR フード、クリーンなピペットおよび RNase、使用など汚染を避けるために水を蒸留 DNase 自由します。
   2. 解凍し、室温反応コンポーネントを平衡
   3. 各 18 μ M でプライマーとプローブ各 5 μ M での蒸留水でプライマー ・ プローブ ミックス x 20 を準備します。
   4. すべての個別 PCR 反応の 2 x ddPCR スーパーミックス (10 μ L)、1 μ L の 20 倍のプライマー ・ プローブ ミックス、10 ng DNA サンプルqsp 20 μ L の蒸留水を組み合わせることによりサンプル ミックスを準備します。
   5. 渦の反応は均質性を確保するため徹底的にミックス、塗布前に、管の下部にコンテンツを収集して簡単に遠心力場します。この手順を使用する前に各反作用の組合せに遠慮なく。
2. 液滴生成
   1. DdPCR カートリッジ ホルダーに挿入し、液滴生成 (緑位置図 2 b) のためのカートリッジの中央の井戸にサンプルを含む反応混合物の 20 μ L をロード 8 ch ピペットを使用します。
   2. 下の井戸 (黄色系) に液滴生成油の 70 μ L を追加します。
   3. 液滴形成配列装置; に、ガスケットで、カートリッジを挿入します。液滴は、カートリッジ (青系) の上の井戸の中に生成されます。
   4. 吸引し、ゆっくりと優しく分配 (剪断を避けるため) に 96 ウェル PCR プレートにカートリッジから液滴の 40 μ L。マルチ チャンネル ピペットを使用して、水滴の転送を最適化します。
3. PCR の拡大
   1. 液滴を転送した後にすぐに蒸発を避けるためにプレートのシーラーを使用してアルミ箔で最終的な PCR プレートをシールします。簡単に井戸の下部にコンテンツを収集してプレートを遠心分離機します。
   2. 次のプログラムを使用して熱 cycler で従来の PCR 増幅を実行: 95 ° C 10 分の 40 のサイクル [94 ° C 30 s、検証アニーリング T ° 60 s]、98 ° C 10 分 (ランプ 2.5 ° C/s)。それぞれの実行で入力の DNA と野生型 DNA (3 レプリケートします) コントロールを含めます。
   3. 実行が完了したら、簡単に井戸の下部にコンテンツを収集してプレートを遠心します。
4. データ集録
   1. PCR 増幅後液滴リーダー数 PCR 陽性と PCR 陰性液滴を製造元の指示に従ってを使用します。
      注: 液滴のリーダーは通常、FAM、VIC または HEX fluorophores が付いている互換性のある 2 色の光学検出システムを提供しています。

5. データ分析 (図 2および図 3)

注意: PCR 陽性と PCR 陰性の液滴、MUT と対象地域で WT 対立遺伝子の絶対定量を提供するためにカウントされます。割り当てられた水滴、各ウェルに MAF の計算に使用されます。液滴の定量化と解析ドロップオフ アッセイは、アタリと同僚の^9,10によって開発された ddPCR R パッケージ (https://github.com/daattali/ddpcr) を使用して実行できます。この R パッケージや現実肯定的な信号 (図 3) でいっぱい (のために非能率的な増幅)、「雨」の空の一部として自動的に液滴を分類します。分析の別の手順を示す次のセクションは (https://github.com/daattali/ddpcr/blob/master/vignettes/ アルゴリズムを参照してくださいその作者によって書かれたアルゴリズムの説明のビネットの簡単なバージョン。詳細については、Rmd)。データがコンマ区切り値ファイル (FileName_Amplitude.csv) にエクスポートし、R に直接または専用の web インターフェイスを介して分析する ddPCR パッケージのアップロードします。

1. パラメーター調整
   注: 各ドロップオフ アッセイ デザイン特定の最終的な液滴分布の結果し、雲の形態、分離または位置の変化が予想されます。自動解析の効率化を確保するため、パラメーターのセットを調整する必要があります。井戸に予期しないプロファイルがある可能性がありますが失敗し、全体の板の解析エラー メッセージが生成します。問題もが識別され、自動化された分析対象から除外。
   1. (REMOVE_FAILURES) を使用して失敗した井戸を識別します。TOTAL_DROPS_T を使用 (デフォルト値は 5,000) 各ウェル中の液滴の最小限の数を調整します。EMPTY_LAMBDA_LOW_T を使用 (デフォルト値は 0.3) と EMPTY_LAMBDA_HIGH_T (既定値は 0.99) 予想される液滴雲 (空、ムト、WT) を評価する指標を調整してその品質。
      注: あまりにも多くの空の滴を持つ反応に十分な無衝突テンプレートもなかったというサインです。
   2. 外れ値の滴 (REMOVE_OUTLIERS) を使用して識別します。TOP_PERCENT を使用 (既定値は p = 1%) プレート全体における液滴から各信号の次元 (ファム、ヴィック/HEX) に最高の信号値を持つ液滴のトップの p % を調整します。CUTOFF_IQR を使用 (デフォルトは 5) 最高信号のトップの p % の外れ値のしきい値を調整します。
   3. (REMOVE_EMPTY) を使用して空の液滴を識別します。CUTOFF_SD を使用 (既定値は 7) プローブ 1 値の低い (空滴) ガウス分布の標準偏差を調整します。
   4. (分類) を使用してゲートの液滴。CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD を使用 (デフォルトは 3) プローブ 1 値の高い (塗りつぶされた水滴) ガウス分布の標準偏差を調整します。ADJUST_BW_MIN を使用 (デフォルトは 4) と ADJUST_BW_MAX (デフォルトは 20) をプローブの 2 値のカーネル密度推定して MUT と液滴の WT 雲を区別する k_min と k_max のパラメーターを調整します。
      1. SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ を使用 (既定値は p = 1%) と SIGNIFICANT_P_VALUE (デフォルトは有意水準 s=0.01%) 変異体と野生型の井戸を分類します。
         メモ: このアルゴリズムの変異体もとして定義されます p % よりも有意に高い、MAF を有するします。
2. 自動解析
   注: ここで説明した各パラメーターの ddPCR R パッケージの著者は、彼らの専門知識とそのデータに基づいて提案既定値を持ちます。ただし、分析 (図 3) の品質を向上させるすべてのパラメーターを変更できます。
   1. 失敗した井戸を識別します。
      1. 4 品質管理指標を使用 (設定: REMOVE_FAILURES); 失敗した井戸を識別するために最初の 1 つは、井戸を含む液滴の最小数です。他の 3 つ空、おそらくファム + および 16 進数の有効な候補者集団を識別するのに焦点を当てる + ヴィック + 水滴。下流の分析からこれらの基準を満たすために失敗した井戸を削除します。
   2. 外れ値の液滴を識別します。
      1. 液滴のゲートの傾斜を避けるためにさらに分析からの外れ値 (すなわち、異常高進/ヴィックまたは FAM の値によって液滴) を上限しきい値を設定することによって削除 (設定: REMOVE_OUTLIERS)。
   3. 空の液滴を識別します。
      1. データの次元を削減する空の液滴を識別 (典型的なよく彼らがのほとんどを占める液滴の) のみテンプレートを含む液滴まま (役に立たない情報の大部分が存在するため統計的なバイアスを排除し、設定: REMOVE_EMPTY)。
   4. 液滴のゲートを実行します。
      1. 突然変異体、野生型雨のいずれかとして残りの滴を分類する (設定: 分類)。
   5. 雨の滴を識別します。
      1. 雨の滴に起因する非効率な増幅、FAM + または 16 進数から対象除外 + ヴィック + 雲。プローブ 1 値を使用して、クラスターの境界を定める (設定: CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD)。
   6. 変異体と野生型液滴を識別します。
      1. 分析のハイライトは、鑑別の変異体と野生型のテンプレートは、1 つまたは他のいずれかは、この段階で全ての残りの滴を識別します。同様のプローブ 1 値、持っている必要があります彼らは彼らのそれぞれの性質を予測する最善プローブ 2 値を使用 (設定: ADJUST_BW_MIN、ADJUST_BW_MAX)。
   7. 野生型と変異体として井戸を分類します。
      1. どの水滴が決まったら MUT と WT、MAF を計算します。突然変異頻度と各ウェルの関連付けられている p 値を使用して、それはそれらを分類することが可能 (設定: SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ、SIGNIFICANT_P_VALUE) WT (大抵 WT 液滴を含む) または (MUT の統計的に有意な数を含む MUT 井戸として液滴)。
3. 探索し、データをエクスポートします。
   1. 探るし、数滴、外れ値、空の液滴、濃度または最適な表現をさらにカスタマイズすることができますグラフとしてデータをエクスポートします。

Representative Results

概念実証研究 FFPE 組織やドロップオフ ddPCR 戦略⁶を使用して癌から血漿検体でKRASエクソン 2 変異 (コドン 12 と 13) とegfr 遺伝子エクソン 19 削除を調べた。

KRASドロップオフ プローブは、複数人間癌¹¹既知のKRAS変異の 95% 以上あるのエクソン 2 のKRAS遺伝子の変異を含む 16 bp の領域を尋問しました。基準プローブは 20 bp の長さと位置 3 bp 下流。2 最も頻繁に変異したKRASのアミノ酸を含む細胞から抽出した DNA を用いて我々 の分析を最適化する: G12V (c.35GT、SW480) と G13D (c.38GA、HCT 116)。

EGFRドロップオフ アッセイは、 egfr 遺伝子エクソン 19 のすべてのライセンス認証を削除をスキャンする設計されました。試金は 21 の基準プローブとともに再発削除された地域に置かれる 25 bp 長ドロップオフ プローブを使用、bp にある 31 bp 下流同じ増幅。EGFRを含む cfDNA 参照の標準的なセットを用いて我々 の分析を最適化、エクソン 19 削除 c.2235_2249del、p.Glu746_Ala750del。

感度、特異性、液滴雲の位置は、KRA のコントロール MUT のサンプルと WT PBMC ゲノム DNA図 4 aのように、定義されています。さらにこのタイプの試金に複数の種類の単一の置換、複数の置換または削除 (図 4 b) などの遺伝子変異に関する様々 なサンプルの種類⁶動作するデモンストレーションを行った。

図 1: ドロップオフ ddPCR ホット スポット領域のすべての変異体をスキャンする加水分解オリゴ プローブの一意のペアが必要です。2次元散布図を示す液滴蛍光表示回路図結果と設計の試金します。(A) 従来 ddPCR (MUT プローブ) 変異体と野生型 (WT プローブ) のプローブが正確な同じ地域を対象とします。ドロップオフ (B) ddPCR は、非可変領域に焼鈍基準プローブ (プローブ 1) とドロップオフ プローブ (プローブ 2) が、WT のシーケンスは、同じ私アンプリコン内に相補的な変異の地域をターゲットに含まれます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: プラズマ DNA の突然変異のプロファイリングのドロップオフ ddPCR ワークフロー 。完全なワークフローは 5 つの主要な手順から成る: プライマーとプローブ、アッセイ、(B) (3) プラズマ分離と cfDNA 抽出、実行 (4) ddPCR (C) (5) データ分析・最適化 (2) (A) (1) デザイン。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: ドロップオフ ddPCR 解析します。ドロップオフ ddPCR 解析ワークフローの重要なパラメーターを強調表示を微調整する必要があります。これにより、外れ値、空の効率的な自動認識、雨または肯定的な液滴;MUT または WT の液滴を割り当てると、各ウェルの MAF を計算します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: 代表的な結果 - KRAとEGFRドロップオフ ddPCR 試金。ドロップオフ ddPCR アッセイの最適化の手順で得られる結果の (A) の例。突然変異や 100% MUT DNA、5% MUT DNA 100% WT DNA を含む反応における野生型遺伝子の検出。(B) 血漿KRAとEGFR解析事例ドロップオフ ddPCR 試金エクソン 2 KRASのegfr 遺伝子エクソン 19 の削除で単一のヌクレオチドと複数の代替の検出を示します。この図は、Decraeneらから適応されています。⁶.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Discussion

効率的なドロップオフ ddPCR アッセイを設計、最適化が重要であり、プロトコルを慎重に従う必要があります。プライマーとプローブの各組み合わせが一意の PCR 反応効率。したがって、個々 のアッセイは、貴重な試料を使用する前にコントロールのサンプルを注意深く検証します。最適化、検証、ピーク信号検出を証明し、特異性と感度を評価する重要です。プロトコルに従って、「プローブ 2」によってカバーされる対象領域にあるすべての変異体潜在的尋問されることができます。「プローブ 2」の 5' または 3' 端に位置する突然変異の確認を推奨するそれにもかかわらずドロップオフの試金の効率に影響を与える可能性がありますこれら以来。

ここで紹介した方法は、FFPE 組織、文化や血液の細胞を含む、「組織」の任意の型から抽出した DNA を実行できます。ただし、核酸抽出の質は劇的に ddPCR の結果に影響を与えます。ヘパリン、蛋白質、ヘム、フェノール、プロテアーゼ、コラーゲン、メラニン、洗剤や塩などの PCR 阻害物質があるサンプリングと精製工程中に可能な限り除去します。DdPCR の PCR 阻害物質の影響を減らすために DNA のサンプルを希釈ことができます、希釈が反応あたりターゲットの少ないコピーがテストされるので、この感度を低下します。これは、コピーの最小値をテストする必要があります、特定のレベルの秘密度が到達することを考慮した取られるべき。

ドロップオフの ddPCR は、多くのタイプの分子変化 (単一および複数のヌクレオチドの置換、削除、等) に適用できます。のみ 2 つのプローブを使用すると、(実用性とアッセイの費用対効果を向上させます) すべての変更を検出、ほかドロップオフ ddPCR は少ないバック グラウンド ノイズ⁶を生成し、マルチプレックス アッセイと比較して感度の向上を示しています。さらに、単一の反作用で実行すると、以来患者サンプルの最小限の量で消費されます。この試金は、葉緑体の量は頻繁にこれらのサンプルの低液生検のコンテキストで特に魅力的です。

確かに、ここで紹介した方法は液生検材料で変異のスクリーニングに適用され、臨床実習 (ESR1変異のスクリーニング PADA 1 臨床試験 - NCT03079011) のためのユーティリティが、すでに。しかし、それは cfDNA⁸の断片化のためこの設定で可能な限り短く amplicons を使用する重要です。

下流の特性は、突然変異体の対立遺伝子によって運ばれる正確な突然変異を識別するために個別に実行する必要があります。ただし、治療方針の決定は主に対象遺伝子 (WT 対変異) のホット スポット領域の突然変異の状態に基づいて、のですぐに突然変異を識別するドロップオフ ddPCR 能力は、強力な診断ツール。また、正確な突然変異は、アプリオリと現在の商用ソリューションの対比でアッセイを設計する知られている必要はありません。また、ドロップオフ ddPCRs 適用可能、さらに特定の従来の ddPCR の試金 (データは示されていない) の上映の突然変異の数。最後に、ドロップオフの ddPCR は、研究の他の分野に適用できます。特に、ゲノム編集の実験に肯定的なコロニーのスクリーニングに有用であると証明するかもしれない。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
K2EDTA tube (color code : lavender)	BD	367863	EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol)	Qiagen	55114	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol)	Qiagen	937556	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony SP system	Qiagen	9001297	fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification
QIAvac 24 Plus	Qiagen	19413	For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously
Qubit fluorometer	Invitrogen	Q33226	The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA
QX100 or QX200 reader	Bio-Rad	186-3003 or186-4003, respectively	The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector
QX100 or QX200 droplet generator	Bio-Rad	186-3002 or 186-4002, respectively	Instrument used for droplet generation
C1000 thermal cycler	Bio-Rad	1851196	Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module
Plate sealer	Bio-Rad	181-4000	PX1™ PCR plate sealer
DG8 cartridge holder	Bio-Rad	186-3051	Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation
Droplet generator cartridges and gaskets	Bio-Rad	186-4007	Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation
PCR supermix	Bio-Rad	186-3010	ddPCR supermix for probes (no dUTP)
96-well PCR plates	Eppendorf	951020362	96-well semi-skirted plates
Foil seal	Bio-Rad	181-4040	Pierceable foil heat seal
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	oil used in the read
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	186-3005	oil for droplet generation
DNA loBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	0030 108.051	Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding
Multiplex I cfDNA Reference Standard Set	HORIZON	HD780	The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations
QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500	Life Technologies	Q32854	The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL
Qubit Assay Tubes	Life Technologies	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer