Одной капли цифровой полимеразной цепной реакции для комплексного и одновременного обнаружения мутаций в регионах Hotspot

Summary

Здесь мы представляем протокол точно определить несколько генетические изменения целевого региона в одном реакции с использованием высадки ddPCR и уникальный Пара зондов гидролиза.

Abstract

Капелька цифровой полимеразной цепной реакции (ddPCR) является высокочувствительным количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР) метод, основанный на фракционирование образца в тысячи индивидуальных реакций воды в нефти, нано размера. Недавно ddPCR стал одним из наиболее точных и чувствительных инструментов для циркулирующих опухолевые выявления ДНК (ctDNA). Одним из основных ограничений стандартного ddPCR техники является ограниченное количество мутаций, которые могут проверяться на реакции, которые требуются конкретные гидролиза зонды, признавая каждой возможной аллельные версии. Альтернативная методология, высадки ddPCR, повышает пропускную способность, так как он требует только одна пара зондов для выявления и количественной оценки потенциально все генетические изменения в целевом регионе. Высадки ddPCR отображает сопоставимых чувствительности обычных ddPCR анализов с преимуществом обнаружения большее количество мутаций в одной реакции. Он является экономически эффективным, экономит драгоценное образец материала и может также использоваться как инструмент для обнаружения при мутации не известны заранее.

Introduction

Были сообщения о¹тысячи соматических мутаций, связанных с развитием рака. Среди них некоторые являются прогнозирования маркеры эффективности таргетная терапия ^2,3 и генетический скрининг этих мутаций теперь обычной клинической практике. Капелька цифровая технология ПЦР (ddPCR) может использоваться для наблюдения за наличие или отсутствие мутации с высоким Определение точности и высоко совместим с неинвазивные жидкого биопсий^4,5. Однако текущий ddPCR анализы предназначены прежде всего для выявления мутаций известный априори. Это серьезно ограничивает использование ddPCR как инструмент обнаружения, когда мутация неизвестен. Действительно в обычных ddPCR дизайн, гидролиз зонд, признавая аллеля дикого типа (WT зонд) конкурирует с конкретного ПЭП, признавая Мутантный аллель (MUT зонд) (рис. 1A). Зонд с более высокой аффинностью скрестил на шаблон и освобождает его Флюорофор, указывая на характер соответствующего аллеля. Флуоресценции данных, полученных для каждой капли могут быть визуализированы в точечной, представляющие испускаемых WT и MUT зондов в разных измерениях флуоресценции. Схематическое представление типичный результат для обычных ddPCR assay представлена на рисунке 1A. В этом примере синий облако соответствует капли, содержащие WT аллели, выявленные WT зонда, в то время как красные облака соответствует капель, в которых был усиленный и определены зонд MUT MUT аллеля. В зависимости от количества ДНК, загруженных в реакции двойной положительный капли, содержащие WT и MUT ампликонов может появиться (зеленый облако). Светло серый облако соответствует пустой капельки.

Поскольку большинство платформы позволяют для обнаружения ограниченное количество флуорофоров (обычно 2, но до 5), пропускная способность обычных ddPCR ограничен. Таким образом ориентация регионов с несколькими соседними мутации требует дизайн технически сложных мультиплекс ddPCR анализов или использование нескольких реакций, ориентации каждого мутация параллельно. Высадки ddPCR стратегии, преодолевает это ограничение, как он потенциально может обнаружить генетические изменения в пределах целевого региона, используя уникальную пару WT гидролиза зондов. Первый зонд (зонд 1) переплетами-переменной последовательности, прилегающих к целевого региона и второй зонд (зонд 2) дополняет WT последовательность целевого региона, где мутации являются ожидается (рис. 1B). В то время как первый зонд измеряет общее количество мы молекул в реакции, второй зонд дискриминирует WT и MUT аллели, субоптимальных гибридизации мутант последовательностей. Зонд 2 можно определить несколько типов мутаций в целевом регионе (один или несколько нуклеотидов замены, удаления и т.д.)⁶. Как и в обычных ddPCR светло серые облака соответствует капель, содержащих не молекул ДНК. Важно напомнить, что в этом типе пробирного, оптимальное разделение WT и MUT облака зависит количество ДНК, загруженных в реакции, так как капли, содержащие WT и MUT целевой аллели нельзя отличить от капель, содержащих только WT формы. Таким образом этот assay требует, что большинство капель содержат не более одной копии целевого гена.

Protocol

Протокола, представленные здесь руководящими принципами этики Institut Кюри. Все человеческие образцы были получены от пациентов, зачисленных, после обоснованного согласия, в исследованиях, утвержденных Советом по рассмотрению институциональных на Institut Curie.

1. кровь сбора, хранения плазмы и экстракции ДНК клеток бесплатно

Примечание: ДНК, извлеченные из любого типа «ткани» может использоваться (например, свежие или формальдегида Исправлена парафин-врезанных тканей (FFPE), клетки в культуре или крови образцов). Здесь мы предоставляем подробные инструкции для сбора крови, плазмы изоляции и хранения и свободных клеток экстракции ДНК (cfDNA).

1. Для хранения коллекции и плазмы крови (Рисунок 2B)
   1. Сбор образцов крови в пробирках, ЭДТА 7 мл. Две трубы рекомендуется собрать около 4 мл плазмы.
   2. Центрифуга Трубы крови обратить отдельных эритроцитов (РБК), белые клетки крови (WBC) и плазмы в 10 минут в 820 x g в течение 3 ч. Время между выборкой и центрифугирования имеет решающее значение для получения высокого качества cfDNA (то есть, cfDNA, не загрязнены ДНК освобожден от ТПН).
   3. Тщательно накапайте супернатант (плазмы) с помощью пипетки 1 мл без касатьться WBC слой; около 2 мл плазмы, обычно возмещаются за ЭДТА трубы.
   4. Передать трубы 2 мл плазмы и центрифуги аликвоты на g 16000 x 10 мин при 15 ° C для удаления мусора ячейки.
   5. Тщательно накапайте супернатант (плазмы), не нарушая гранулы. Распространять плазмы в 2 мл криогенных трубы и хранить при температуре-80 ° C до тех пор, пока требуется.
2. cfDNA добыча (Рис. 2B)
   Примечание: Здесь мы представляем процедура, с помощью ручного извлечения kit. Автоматизированной версии после инструкции производителя также может выполняться для cfDNA изоляции.
   1. Положите 400 мкл протеиназы K в 50 мл трубки. Добавьте 4 мл плазмы (объем регулярно используется) и 3,2 мл буфера lysis ACL (содержащие 1,0 мкг перевозчик РНК) из комплекта. Закройте трубку и смешать с vortexing для 30 s, чтобы получить однородный раствор. Инкубируйте на 60 ° C за 30 мин.
   2. Добавьте 7.2 мл буфера ACB (из комплекта) в lysate оптимизировать привязки циркулирующего нуклеиновых кислот кремнезема мембраны и смешать с vortexing за 15 – 30 s. инкубировать трубки для 5 минут на льду.
   3. Поместите столбец и расширитель 20 мл в вакуумный насос. Закройте неиспользуемые позиции разрешить вакуум-аспирации.
   4. Осторожно применять смесь ACB lysate буфера в расширитель труб (кратко центрифуги трубки собрать максимум lysate буферов ВАВ смеси), включите вакуумный насос и позволяют lysate быть выписанным полностью через столбцы. Снимите и выбросьте удлинитель трубки.
   5. Примените к столбцу 600 мкл буфера ACW1. Когда буфер ACW1 привлекла через колонку, 750 мкл буфера ACW2 и наконец 750 мкл этанола (96-100%). Затем место столбца в коллекции чистый 2-мл пробирку и центрифуги на полной скорости (20000 x g) 3 мин для ликвидации этанола.
   6. Поместите столбец в новой коллекции 2-мл пробирку. Откройте крышку и Инкубируйте на 56 ° C за 10 мин до полного высыхания мембраны.
   7. Место столбца в чистой 1,5 мл трубку ДНК низкой привязки. Осторожно примените 36 мкл РНКазы свободной воды с азидом натрия 0,04% (буфер AVE). Закройте крышку и инкубации при комнатной температуре в течение 3 мин.
   8. Центрифуга на полной скорости (20000 x g) за 1 мин элюировать нуклеиновые кислоты и хранить при-20 ° C до тех пор, пока требуется.
3. количественная оценка cfDNA
   Примечание: cfDNA количественная оценка производится с флюорометр с использованием протокола производителя сразу после извлечения или оттаивания образцов при комнатной температуре (RT), перед использованием. Избегайте несколько циклов замораживания/оттаивания.
   1. Используйте высок чувствительности анализа по количеству ожидаемого cfDNA, который, как правило, меньше, чем 100 нг/мл плазмы. cfDNA концентрации в диапазоне от 2-10 нг/мл для здоровых доноров, но может быть выше, чем 100 нг/мл у пациентов с метастатической болезнью.
   2. Обеспечить все реагенты в RT и смешайте 199 мкл буфера для разведения флюорометр с 1 мкл концентрированного красителя (200 x) в реакции (N количество образцов + 2 стандартов для калибровки флуориметр) для получения рабочего решения.
   3. Вихревой cfDNA раствор тщательно, чтобы обеспечить однородность и кратко центрифуги для сбора содержимого в нижней части трубки.
   4. Смешайте 5 мкл каждого образца cfDNA с 195 мкл рабочего раствора.
   5. Смесь 10 мкл каждого стандарта с 190 мкл рабочего раствора.
   6. Вихревой тщательно все трубки для 2-3 s для обеспечения однородности и кратко центрифуги для сбора содержимого в нижней части трубы.
   7. Инкубируйте на RT на 2 мин в темноте.
   8. Читайте труб в флуориметр, используя режим вывода «нг/мкл»
   9. Рассчитать конечная концентрация в нг/мл плазмы следующим: нг/мкл x 36 (объем cfDNA элюата) / 4 (объем плазмы извлечены).

2. ddPCR зонд и конструкции праймера (рисунок 2A)

Примечание: Усиление целевой молекул в assay ddPCR высадки следует аналогичные принципы ПЦР. Каждый грунт и зонд разработан с обычными специализированное программное обеспечение Primer3⁷ (http://primer3.ut.ee/).

1. Конструкция праймера
   1. В окне Общие настройки измените «концентрации катионов двухвалентной» 3.8, «концентрация дНТФ» до 0,8, а «mispriming/повтор библиотека» организму правильно.
   2. В окне настройки заранее измените «Таблицы термодинамических параметров» и «концентрация соли формулы» на Санта Люсия 1998.
   3. Выберите T_m от 55 до 70 ° C (с 50 мм для концентрации соли и 300 Нм для олигонуклеотида концентрации).
   4. Проверка специфичности грунтовки с помощью таких инструментов, как PrimerBlast.
   5. Избегайте регионах, которые имеют вторичных структур.
   6. Выберите последовательность, которая имеет содержание GC 50 – 60%.
   7. Избегайте повторов ГЦБ и НЦБ, дольше, чем 3 базы.
   8. Выберите грунты с НЦБ и ГЦБ в конце их 3' когда это возможно.
   9. Обеспечьте 3' концы парных праймеры не значительную взаимодополняемость избежать Димеры праймера. Ампликонов должно быть меньше, чем 150 bp для эффективного усиления cfDNA (средний размер составляет 170 ВР⁸) и ДНК, извлеченные из FFPE, который часто фрагментирована.
2. Конструкция зонда
   Примечание: Гидролиз зонды помечены с репортером флуоресцентные в конце 5' и утоления в конце 3'. Они обеспечивают высокую специфичность, высокое соотношение сигнал шум и позволяют мультиплексирования при необходимости. 2 канальный капелька читателей совместимы с красителей FAM и HEX или Вика, а также анализ FAM/HEX или FAM/Вик сочетании зонды.
   1. Дизайн гидролиза зонды дополняет WT последовательность целевого региона и прилегающих региона-переменной.
   2. Выберите зондов, который оба расположены в пределах ампликонами, определяется пара грунтовка ранее разработан. Грунтовка последовательности не совпадают с зонд последовательности, хотя они могут сидеть рядом друг с другом.
   3. Выберите прядь, которая имеет больше Cs чем Gs. датчики должны иметь GC содержание 30-80%.
   4. Выбор датчиков, которые находятся между 13 и 30 нуклеотидов в длину. Больше датчиков, как правило, для отображения выше фона флуоресценции потому, что расстояние между Флюорофор и утоления влияет на тушение Флюорофор репортер.
   5. Выберите T_m зондов на 3-10 ° C выше, чем T_m праймеров для обеспечения зонд гидролиз во время отжига праймера и расширение. Усилителей T_m рекомендуется для достижения требуемых T_m сохраняя зонд короткие, как короче зонды дискриминацию единичных нуклеотидных варианты более эффективно. Зонды не должны G в конце 5', потому что это утоляет флуоресценции сигнал даже после гидролиза.
   6. Дизайн высадки зонды следующим: 5'-(VIC) -взаимодополняющие WT последовательность мутировавших региона-(MGB NFQ)-3' и зонда как ссылка: 5'-(6-FAM) -Дополнительные последовательности - переменная региона-(MGB NFQ)-3'. Также возможны другие комбинации репортер/утоления.

3. Оптимизация ddPCR реакции (рисунок 2A)

Примечание: Одичал типа и мутантов ДНК элементы управления, используемые на этом шаге можно получить из клеточных линий, образцы опухоли или коммерчески доступных ДНК эталонных стандартов, например.

1. Выполнение обычных ПЦР на тепловая велосипедист, используя функцию теплового градиента для проверки специфики продукта PCR, усиливается праймеры дизайн.
   1. Подготовьте уникальный микс реакции PCR, как описано ниже в шаге 4.1 (без датчиков) на шаблон элемента управления ДНК одичал типа как минимум 8 реакций иметь по крайней мере одна реакция на температуру.
   2. Запустите амплификации, с помощью программы, описанные на шаге 4.3.2 и широкий спектр температуры нагрева при отжиге вокруг теоретических отжига температура праймеров.
   3. Загрузка продуктов ПЦР на 3% агарозном геле выбрать для отжига температур, предоставление конкретных продуктов.
2. Выполните серию высадки ddPCRs с помощью параметров, описанных выше, но на этот раз, включая обоих зондов.
   1. Использование ДНК WT 100%, 100% MUT ДНК и смесь WT и MUT ДНК (например, 50% MUT/50% WT) для определения лучших условий для четкого разделения WT и MUT капельки облаков.
   2. Выберите диапазон отжига температура выше температуры, выбранного на шаге 4.1.
   3. Выберите отжига температура, которая позволяет для обнаружения конкретных WT или Мут сигналов при использовании ДНК WT 100% или 100% MUT ДНК и лучшее разделение WT и MUT капельки облаков.
   4. Отжиг концентрации время и праймер/зонд также может регулироваться чтобы улучшить разделение облаков и уменьшить количество капель с промежуточным флуоресценции (эффект дождя).
3. Оценка фон или предел заготовки (LOB) анализа.
   1. Выполните минимум 48 реакций отдельных высадки ddPCR с элементом управления WT ДНК, используя параметры отжига и грунты/датчики концентрации в 3.2.
   2. Для каждой реакции, рассчитать частоту аллеля мутанта (ТБР) следующим образом: (число мутантных капель/количество заполненных капель) x 100.
      Примечание: LOB определяется как среднее ТБР ложно положительных и связанные SD, из которого вычисляется 95% доверительный интервал (ДИ 95%). LOB = (средний ТБР ложно положительных) + 95% CI.
4. Оцените предел обнаружения (LOD) assay.
   1. Выполнять высадки ddPCR реакции с помощью серийных разведений MUT ДНК в WT ДНК, с ТБР, начиная от 5% до 0,01% (≥ 8 реплицирует за состояние). Используйте отжига параметры и грунты/датчики концентрации, выбранный в 3.2.
      Примечание: Лод определяется как наименьших значений ТБР для которого реплицирует настоящий средние значения и SD выше LOB (см. Decraene и др. ⁶ для получения более подробной информации).

4. ddPCR протокол (рис. 2B)

Примечание: Похож на обычных ddPCR, высадки ddPCR протокол состоит из 4 этапов: (i) ПЦР смесь подготовки, (ii) капли поколения, амплификации PCR (iii) и (iv) данных.

1. Подготовка смеси ПЦР
   1. Выполните стандартные меры предосторожности, например носить перчатки, используя чистый ПЦР капот, чистый пипетки и РНКазы, DNase бесплатно дистиллированной воды, чтобы избежать загрязнения.
   2. Размораживание и сбалансировать компоненты реакции на RT.
   3. Подготовка 20 x грунты/зонды микс в дистиллированной воде, с грунтовки на 18 мкм и зонды на 5 мкм.
   4. Для всех индивидуальных реакций ПЦР Подготовьте образец микс, объединяя 2 x ddPCR Супермикс (10 мкл), 1 мкл 20 x грунты/зонды микс и до 10 нг ДНК образца qsp 20 мкл дистиллированной воды.
   5. Вихревой реакции тщательно перемешать для обеспечения однородности и кратко центрифуги для сбора содержимого в нижней части трубки перед подачей. Не стесняйтесь повторить этот шаг для каждой реакции перемешайте перед использованием.
2. Создание дроплета
   1. Вставьте ddPCR картридж в держатель и загрузить 20 мкл реакция смеси, содержащие образцы в середине скважины картриджа капли поколения (зеленый позиции в Рисунок 2B) с помощью 8-канальный дозатор.
   2. Добавьте 70 мкл генератор капля масла в нижней скважины (желтый позиции).
   3. Вставьте картридж, с прокладкой, в генераторе капли; капельки будут выпускаться в Топ колодцы картридж (голубой позиции).
   4. Аспирационная и медленно и осторожно (чтобы избежать сдвига) 40 мкл капель от картриджи в 96-луночных ПЦР-планшете. Использование многоканальных дозаторов для оптимизации передачи капель.
3. Амплификации PCR
   1. Уплотнение пластину окончательный ПЦР с алюминиевой фольгой, с помощью пластины герметик сразу после передачи капельки во избежание испарения. Кратко центрифуга пластину для сбора содержимого в нижней части скважины.
   2. Запустить обычных амплификации PCR на тепловая велосипедист, используя следующую программу: 95 ° C 10 мин, 40 циклов [94 ° C 30 s, проверяются отжига T ° для 60 s], 98 ° C 10 мин (рампа 2,5 ° C/s). Включить элементы управления без ввода ДНК и ДНК (≥3 реплицирует) дикого типа при каждом запуске.
   3. После завершения теста, кратко центрифуга пластину для сбора содержимого в нижней части скважины.
4. Сбор данных
   1. После амплификации PCR используйте капли читателю граф ПЦР позитивных и ПЦР отрицательных капельки, следуя инструкциям производителя.
      Примечание: Капелька читателя обычно предлагает два цвета оптического обнаружения системы, совместимой с FAM, Вик или HEX флуорофоров.

5. анализ данных (рис. 2 c и 3 на рисунке)

Примечание: ПЦР позитивных и негативных ПЦР капельки, учитываются для обеспечения абсолютной количественной оценке Мут и WT аллелей в целевом регионе. Назначенные капли используются для вычисления ТБР в каждой скважине. Капелька количественная оценка и анализ сдачи анализов можно выполнить с помощью пакета ddPCR R (https://github.com/daattali/ddpcr), разработанный Аттали и коллеги^9,10. Этот пакет R автоматически классифицирует капель, как пустой, частью «дождь» (из-за неэффективного амплификации), или как наполнены реальным позитивным сигналом (рис. 3). Следующий раздел, представляя различные этапы анализа является Краткая версия описательный виньетка алгоритма, написанные авторами (см. алгоритм https://github.com/daattali/ddpcr/blob/master/vignettes/. RMD для получения более подробной информации). Данные экспортируются в файлы с разделителями-запятыми (FileName_Amplitude.csv) и загружены в ddPCR пакет, чтобы быть проанализированы непосредственно в R или через выделенный веб-интерфейс.

1. Регулировка параметров
   Примечание: Каждый дизайн пробирного высадки приводит конкретные окончательные капелька дистрибутивов и ожидается вариации в форме облака, увольнений или позиции. Чтобы обеспечить эффективный автоматизированный анализ, набор параметров необходимо скорректировать. Если хорошо неожиданные профиля, это может привести к анализ целую тарелку на неудачу, что приводит к сообщению об ошибке. Проблематичным также придется быть обнаружены и удалены из автоматического анализа.
   1. Определите не удалось скважин с использованием (REMOVE_FAILURES). Используйте TOTAL_DROPS_T (значение по умолчанию — 5000) чтобы настроить минимальное количество капель в каждую лунку. Используйте EMPTY_LAMBDA_LOW_T (значение по умолчанию — 0,3) и EMPTY_LAMBDA_HIGH_T (значение по умолчанию — 0,99) для регулировки метрик, что оценить ожидаемый капельки облаков (пусто, Мут, WT) и их качество.
      Примечание: Имея слишком много пустых капельки является признаком, что было не достаточно мы шаблон в реакции.
   2. Идентифицировать останец капельки, используя (REMOVE_OUTLIERS). Используйте TOP_PERCENT (значение по умолчанию — p = 1%) для регулировки верхней % p капель, имеющих наибольшее значение сигнала в каждом измерении сигнала (FAM, Вик/HEX) из капель на всей пластине. Используйте CUTOFF_IQR (значение по умолчанию — 5) для регулировки останец порог верхние p % высокий сигнал.
   3. Определение пустых капельки, используя (REMOVE_EMPTY). Используйте CUTOFF_SD (значение по умолчанию — 7) чтобы настроить стандартное отклонение ниже (пустой капельки) гауссовское распределение значений зонда 1.
   4. Ворота капли с помощью (классификации). Используйте CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD (значение по умолчанию — 3) чтобы настроить стандартное отклонение выше (заполненные капельки) гауссовское распределение значений датчика 1. Используйте ADJUST_BW_MIN (значение по умолчанию — 4) и ADJUST_BW_MAX (значение по умолчанию — 20) для настройки параметров k_min и k_max оценить плотность ядра зонд 2 значений и дискриминацию Мут и WT облачных капель.
      1. Используйте SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ (значение по умолчанию — p = 1%) и SIGNIFICANT_P_VALUE (по умолчанию используется значение уровня s=0.01%) для классификации скважин как мутант или wildtype.
         Примечание: В этом алгоритме, мутант хорошо определяется как имеющий ТБР, что статистически значительно выше, чем p %.
2. Автоматизированный анализ
   Примечание: Для каждого параметра, представленные в этом разделе, авторы пакета ddPCR R имеют значения предлагаемого по умолчанию, на основе их опыта и их данных. Однако все параметры могут быть изменены для повышения качества анализа (рис. 3).
   1. Выявления неудачных колодцев.
      1. Использовать четыре метрики качества управления (параметры: REMOVE_FAILURES) для выявления неудачных колодцев; Первый из них является минимальное количество капель, которые должны содержать хорошо. Три другие сосредоточиться на выявлении популяций действительный кандидата для пустой, возможно FAM + и HEX +/ Вик + капли. Удаление скважин, которые не отвечают этим критериям от течению анализа.
   2. Идентифицировать останец капельки.
      1. Во избежание перекоса капелька стробирования, удалить промахов (то есть капельки с аномально высокое значение HEX/Вик или FAM) из дальнейшего анализа, установив порог верхняя граница (параметры: REMOVE_OUTLIERS).
   3. Определите пустой капельки.
      1. Определить пустой капельки уменьшить размер данных (в типичном хорошо, они будут составляют большую часть капельки) и ликвидации статистической погрешности из-за присутствия большую часть бесполезной информации, как только шаблон содержащих капельки остаются () параметры: REMOVE_EMPTY).
   4. Выполните капелька стробирования.
      1. Классифицировать оставшиеся капли как мутант, wildtype или дождь (параметры: классификации).
   5. Идентифицировать капельки дождя.
      1. Как капли дождя в результате неэффективного амплификации, исключить из FAM + или HEX +/ Вик + облака. Определить границы их кластеров с помощью их значений зонда 1 (установка: CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD).
   6. Идентифицировать мутант против капель одичал типа.
      1. Как выделить анализа дискриминации между мутант и wildtype шаблоны, определите все оставшиеся капли на данном этапе как один или другой. Так как они должны иметь одинаковые значения датчика 1, зонд 2 значения использовать для лучше прогнозировать их соответствующих природы (параметры: ADJUST_BW_MIN и ADJUST_BW_MAX).
   7. Классифицировать скважин как мутант против одичал тип.
      1. После определения, какие капли Мут и WT, вычислить ТБР. Использование частоты мутантных и связанные p значение каждой скважины, это позволяет классифицировать их (параметры: SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ, SIGNIFICANT_P_VALUE) как WT (содержащие главным образом WT капельки) или Мут скважин (содержащие статистически значительное количество MUT капельки).
3. Исследовать и экспорта данных
   1. Исследуйте и экспортировать данные как количество капель, останцы, пустой капельки, концентрации или графиков, которые далее могут быть настроены для оптимального представления.

Representative Results

В исследовании, доказательство концепции крас 2 экзона мутации (кодоны 12 и 13) и EGFR экзона 19 изъятия были исследованы в образцах плазмы от больных раком с использованием стратегии сдачи в ddPCR⁶и FFPE тканей.

Зонд высадки крас допрашивали 16 bp регион, охватывающий несколько мутации экзона 2 крас гена, которые гавань более чем 95% известных крас мутаций в человеческих раков¹¹. Ссылка зонд был 20 bp в длину и 3 расположен bp вниз по течению. Для оптимизации нашего анализа, мы использовали ДНК, извлеченные из клеточных линий, содержащих 2 наиболее часто мутировавших крас аминокислот: G12V (c.35GT, SW480) и G13D (c.38GA, HCT 116).

EGFR сдачи анализа был разработан для проверки всех активации удаления EGFR экзона 19. Assay используется зонд 25 bp Лонг высадки помещен над районом периодических удаленные вместе с зондом ссылка 21 bp, расположен 31 bp по течению в том же ампликонами. Для оптимизации нашего анализа, мы использовали cfDNA ссылка стандартный набор, включая EGFR экзона 19 исключение c.2235_2249del, p.Glu746_Ala750del.

Чувствительность, специфичность и расположение капельки облаков были определены с управления MUT образцов и WT КСДОР геномной ДНК как показано на рисунке 4A для крас. Далее мы продемонстрировали, что этот тип анализа работает на нескольких типов генетические изменения, такие как одной замены, несколько замен или удаления (Рисунок 4B), а также на различные типы образец⁶.

Рисунок 1: высадки ddPCR требует уникальный пара гидролиза oligo зонды для проверки всех мутации области hotspot. Пробирного конструкции схемы результат отображается как двумерный точечные интенсивности флуоресценции показаны капелька. (A) обычных ddPCR с мутанта (MUT зонд) и одичал тип (WT зонд) датчики ориентации точное же региона. (B) высадки ddPCR содержит ссылку зонд (зонд 1), который anneals для не переменная региона и сдачи зонда (зонд 2), ориентация мутировавших региона но дополняет WT последовательности, внутри же ампликон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: высадки ddPCR процесс мутации ДНК плазмы. Полный рабочий процесс состоит из 5 основных шагов: (A) (1) дизайн праймеров и зонды, (2) оптимизация пробирного, (B) (3) плазмы изоляции и cfDNA добычи, (4) ddPCR запуска и анализа (C) (5) данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: анализ сдачи ddPCR. Высадки ddPCR анализа рабочего процесса, подчеркивая важные параметры, которые должны быть доработаны. Это гарантирует эффективной автоматизированной идентификации останцы, пустой, дождь или положительных капель; Присвоение MUT или WT капли и вычисления ТБР для каждой скважины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: Представитель результаты - крас и EGFR высадки ddPCR анализов. (A) пример результатов, полученных в ходе оптимизации шаги высадки ddPCR assay. Обнаружение мутант и/или одичал тип ДНК в реакции, содержащий 100% MUT ДНК, ДНК MUT 5% и 100% WT ДНК. (B) примеры образцов плазмы, проанализированы с EGFR и КАРСТЕ высадки ddPCR assays показаны обнаружение единичных нуклеотидных и несколько замен в экзона 2 Удаление в EGFR экзона 19 и КАРСТЕ . Эта цифра была адаптирована из Decraene и др. ⁶. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Для разработки эффективной высадки ddPCR assay, оптимизация имеет решающее значение, и протокол должен быть тщательно следили за. Каждая комбинация грунты и зонды имеет уникальную эффективность реакции PCR. Таким образом отдельные assay должно тщательно проверяться на контрольных образцах перед использованием на ценные образцы. Оптимизация и проверки имеют важное значение для сертификации пика сигнала и оценить специфичность и чувствительность. Как описано в протоколе, потенциально можно опросить все мутации, расположенных в целевом регионе, охватываемом «зонд-2». Тем не менее, проверка рекомендуется для мутации, расположенный на 5' или 3' концах «зонд 2», так как они могут повлиять на эффективность сдачи анализа.

Метод, представленный здесь могут быть выполнены с ДНК, извлеченные из любого типа «ткани», включая FFPE ткани, клетки в культуре или крови образцов. Однако качество отжима нуклеиновыми кислоты резко может повлиять на результаты ddPCR. ПЦР ингибиторы, такие как гепарин, белки, гема, фенола, протеаз, коллаген, меланина, моющие средства или солей должны быть устранены как можно больше во время выборки и очистки шагов. Хотя образцы ДНК может быть разбавлен по уменьшению воздействия ингибиторов ПЦР на ddPCR, разрежения уменьшается чувствительность, потому что меньше копии целевого объекта будет испытываться в реакции. Это следует учитывать при определенный уровень чувствительности, чтобы быть достигнуто, как минимум копий должны испытываться.

Высадки ddPCR может применяться для различных типов молекулярных изменений (одно- и нескольких нуклеотидов замены, удаления и т.д.). Наряду с использованием только двух зондов для обнаружить все изменения (тем самым увеличивая практичности и эффективности анализа), высадки ddPCR генерирует меньше шума фона⁶ и показывает повышенная чувствительность, по сравнению с мультиплексной анализов. Кроме того поскольку он выполняется в одном реакция, потребляются минимальное количество пациентов образцов. Этот assay особенно привлекательным в контексте жидких биопсии, потому что количество ctDNA часто является низким в этих образцах.

Действительно метод, представленные здесь применима для скрининга мутации в жидкость биопсийного материала и уже доказали свою полезность для клинической практики (ESR1 мутации скрининг в клинических испытаниях ПАДА-1 - NCT03079011). Однако важно использовать ампликонов максимально в этом месте из-за фрагментации cfDNA⁸.

Вниз по течению характеристика по-прежнему необходимо выполнить отдельно определить точный мутации, перевозимых мутантные аллели. Однако поскольку терапевтического решения главным образом основаны на мутационного статуса hotspot регионов ориентации онкогенов (WT против мутантов), высадки ddPCR возможность сразу же выявить мутации делает его мощный диагностический инструмент. Кроме того точное мутации не должны быть известны заранее разработать assay в отличие от текущих коммерческих решений. Кроме того высадки ddPCRs может сочетаться с конкретными обычных ddPCR анализов для дальнейшего увеличения количество мутаций, экранированные (данные не показаны). Наконец высадки ddPCR может применяться в других областях исследований. В частности это может оказаться полезным инструментом для скрининга положительных колоний в геноме редактирования экспериментов.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
K2EDTA tube (color code : lavender)	BD	367863	EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol)	Qiagen	55114	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol)	Qiagen	937556	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony SP system	Qiagen	9001297	fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification
QIAvac 24 Plus	Qiagen	19413	For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously
Qubit fluorometer	Invitrogen	Q33226	The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA
QX100 or QX200 reader	Bio-Rad	186-3003 or186-4003, respectively	The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector
QX100 or QX200 droplet generator	Bio-Rad	186-3002 or 186-4002, respectively	Instrument used for droplet generation
C1000 thermal cycler	Bio-Rad	1851196	Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module
Plate sealer	Bio-Rad	181-4000	PX1™ PCR plate sealer
DG8 cartridge holder	Bio-Rad	186-3051	Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation
Droplet generator cartridges and gaskets	Bio-Rad	186-4007	Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation
PCR supermix	Bio-Rad	186-3010	ddPCR supermix for probes (no dUTP)
96-well PCR plates	Eppendorf	951020362	96-well semi-skirted plates
Foil seal	Bio-Rad	181-4040	Pierceable foil heat seal
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	oil used in the read
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	186-3005	oil for droplet generation
DNA loBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	0030 108.051	Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding
Multiplex I cfDNA Reference Standard Set	HORIZON	HD780	The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations
QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500	Life Technologies	Q32854	The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL
Qubit Assay Tubes	Life Technologies	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer