Enkelt dråbe Digital Polymerase Chain Reaction for omfattende og samtidige påvisning af mutationer i Hotspot regioner

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at nøjagtigt kvantificere flere genetiske ændringer af et målområde i en enkelt reaktion ved hjælp af drop-off ddPCR og et unikt par hydrolyse sonder.

Abstract

Droplet digital polymerase kædereaktion (ddPCR) er en meget følsomme kvantitative polymerase kædereaktion (PCR) metoden baseret på prøve fraktionering i tusindvis af nano-størrelse vand-i-olie individuelle reaktioner. For nylig, er ddPCR blevet et af de mest nøjagtige og følsomme værktøjer for cirkulerende tumor DNA (ctDNA) registrering. En af de store begrænsninger i standard ddPCR teknik er det begrænsede antal mutationer, der kan blive screenet pr. reaktion, som specifikke hydrolyse sonder anerkende hver muligt allel version er påkrævet. En alternativ metode, drop-off ddPCR, øger overførselshastighed, da det kræver kun et enkelt par sonder til at detektere og kvantificere potentielt alle genetiske ændringer i den målrettede region. Drop-off ddPCR viser sammenlignelige følsomhed for konventionelle ddPCR assays med fordelen ved påvisning af et større antal mutationer i en enkelt reaktion. Det er omkostningseffektiv, sparer dyrebare prøvemateriale og kan også bruges som en opdagelse værktøj, når mutationer ikke er kendt på forhånd.

Introduction

Tusindvis af somatiske mutationer relateret til udviklingen af kræft har været rapporteret¹. Blandt disse, nogle få er forprogrammeret markører for effekten af målrettede terapi ^2,3 og genetisk screening af disse mutationer er nu rutinemæssig klinisk praksis. Droplet digital PCR (ddPCR) teknologi kan bruges til at overvåge tilstedeværelsen eller fraværet af mutationer med lang opdagelse nøjagtighed og er yderst kompatibel med non-invasiv likvide biopsier^4,5. Nuværende ddPCR assays er dog primært beregnet til at påvise mutationer kendt på forhånd. Dette begrænser i høj grad brug af ddPCR som en opdagelse værktøj når mutationen er ukendt. Faktisk, i konventionelle ddPCR design, en hydrolyse sonde anerkende vildtypeallelen (WT sonde) konkurrerer med en bestemt probe anerkende den mutante allel (MUT sonde) (figur 1A). Sonden med højere affinitet hybridiserer til skabelonen og frigiver sin fluorophore, med angivelse af arten af den tilsvarende allel. Fluorescens oplysningerne for hver dråbe kan visualiseres i en scatter plot der repræsenterer fluorescens udledes af WT og MUT sonderne i forskellige dimensioner. En skematisk fremstilling af en typisk resultat for en konventionel ddPCR assay er præsenteret i figur 1A. I dette eksempel svarer blue sky til dråber indeholdende WT alleler identificeret ved WT sonden, mens den røde Sky svarer til dråber som MUT allel er blevet forstærket og identificeret af MUT sonden. Afhængigt af mængden af DNA indlæst i reaktionen, kan dobbelt positive dråber indeholdende både WT og MUT amplikoner vises (grøn Sky). Lys grå Sky svarer til tomme dråber.

Da de fleste platforme giver mulighed for påvisning af et begrænset antal fluorophores (normalt 2, men op til 5), er overførsel af konventionelle ddPCR begrænset. Derfor kræver rette sig mod regioner med flere tilstødende mutationer design af teknisk udfordrende multiplex ddPCR assays eller brug af flere reaktioner rettet mod hver enkelt mutation i parallel. Drop-off ddPCR strategi, overvinder denne begrænsning, som det kan potentielt afsløre genetiske ændring inden for et målområde ved hjælp af en unik WT hydrolyse sonder. De første sonde (sonde 1) dækker en ikke-variable sekvens, støder op til regionen mål og den anden sonde (sonde 2) er et supplement til WT sekvens af regionen mål hvor mutationer er forventet (figur 1B). Mens den første sonde kvantificerer det samlede beløb for amplifiable molekyler i reaktionen, diskriminerer den anden sonde WT og MUT alleler af sub-optimale hybridisering til mutant sekvenser. Sonden 2 kan identificere flere typer af mutationer i target region (enkelt eller flere nukleotid erstatninger, sletning, etc.)⁶. Som i konventionelle ddPCR svarer lys grå sky til dråber indeholder ingen DNA molekyler. Det er vigtigt at erindre, at i denne type analyse, optimal adskillelse af WT og MUT skyer er afhængig af mængden af DNA indlæst i reaktionen, da dråber indeholdende både WT og MUT target alleler ikke kan skelnes fra dråber indeholder kun WT form. Denne analyse kræver derfor, at de fleste dråber indeholder mere end én kopi af målrettede genet.

Protocol

Protokollen præsenteres her følger de etiske retningslinjer for Institut Curie. Alle menneskelige prøver blev indhentet fra patienter tilmeldt, efter informeret samtykke, i undersøgelser, der er godkendt af den institutionelle Review Board på Institut Curie.

1. blod samling, Plasma opbevaring og celle-gratis DNA-ekstraktion

Bemærk: DNA ekstraheret fra enhver form for "væv" kan bruges (fx friske eller formaldehyd-fast paraffin indlejret (FFPE) væv, celler i kultur eller blod prøver). Her, leverer vi detaljerede instruktioner for blod indsamling, plasma isolation og opbevaring og celle-gratis DNA (cfDNA) udvinding.

1. Blod samling og plasma opbevaring (figur 2B)
   1. Indsamle blodprøver i 7 mL EDTA rør. To rør anbefales at indsamle omkring 4 mL af plasma.
   2. Der centrifugeres rør til 10 min på 820 x g inden for 3 h for blod lodtrækningen til at adskille røde blodlegemer (RBC), hvide blodlegemer (WBC) og plasma. Tidsintervallet mellem prøveudtagning og centrifugeringen er afgørende for at opnå høj kvalitet cfDNA (dvs. cfDNA ikke er forurenet med DNA frigivet fra WBC).
   3. Omhyggeligt afpipetteres supernatant (plasma), som bruger en 1 mL pipette uden at røre WBC lag; omkring 2 mL af plasma er normalt inddrives pr. EDTA tube.
   4. Overføre plasmaet til 2 mL rør og centrifugeres delprøver på 16.000 x g i 10 min. ved 15 ° C til at fjerne celle debris.
   5. Omhyggeligt afpipetteres supernatanten (plasma) uden at forstyrre pelleten. Distribuere plasma i 2 mL kryogene rør og opbevares ved-80 ° C indtil det skal bruges.
2. cfDNA udsugning (Figur 2B)
   Bemærk: Vi præsenterer her, proceduren ved hjælp af manuelle udvinding kit. En automatiseret version efter fabrikantens anvisninger kan også udføres for cfDNA isolation.
   1. Sat 400 µL af Proteinase K i en 50 mL tube. Tilsættes 4 mL af plasma (volumen rutinemæssigt anvendes) og 3,2 mL lysisbuffer ACL (indeholdende 1,0 µg carrier RNA) fra sættet. Luk røret og mix af vortexing for 30 s til at opnå en homogen opløsning. Inkuber ved 60 ° C i 30 min.
   2. Tilføje 7,2 mL buffer ACB (fra kit) til den lysate at optimere bindingen af de cirkulerende nukleinsyrer til silica membran og mix af vortexing for 15 – 30 s. Incubate røret i 5 min på is.
   3. Placere kolonnen og 20 mL extender i vakuum-pumpe. Luk ubenyttede positioner for at tillade vakuum aspiration.
   4. Omhyggeligt gælder lysate-buffer ACB blandingen i røret extender (kortvarigt centrifuge rør til at indsamle maksimalt antal lysate-buffer ACB blanding), Tænd vakuumpumpen og tillade lysate at blive trukket gennem kolonnerne helt. Fjern og kassér tube extender.
   5. Anvende 600 µL af buffer ACW1 til kolonnen. Når buffer ACW1 har trukket gennem kolonnen, tilføje 750 µL Buffer ACW2 og endelig tilføje 750 µL af ethanol (96-100%). Anbring kolonnen i en ren 2 mL indsamling rør og centrifugeres ved fuld hastighed (20.000 x g) i 3 min. at fjerne ethanol.
   6. Placere kolonnen i et nyt 2 mL collection tube. Åbn låget og inkuberes ved 56 ° C i 10 min tørre fuldstændigt, membranen.
   7. Sæt kolonnen i en ren 1,5 mL DNA lave bindende tube. Omhyggeligt gælde 36 µL af RNase-fri vand med 0,04% natriumazid (buffer AVE). Luk låget og inkuberes ved stuetemperatur i 3 min.
   8. Der centrifugeres ved fuld hastighed (20.000 x g) for 1 min til elueres af nukleinsyrer og opbevares ved-20 ° C indtil det skal bruges.
3. cfDNA kvantificering
   Bemærk: cfDNA kvantificering er udført med en fluorometer ved hjælp af producentens protokollen umiddelbart efter udvinding eller optøning prøverne ved stuetemperatur (RT), før brug. Undgå flere fryse/tø cykler.
   1. Bruge Højfølsom analysen efter den forventede cfDNA mængde, hvilket er normalt mindre end 100 ng/mL plasma. cfDNA koncentrationer spænder fra 2-10 ng/mL for raske donorer men kan være så højt som 100 ng/mL hos patienter med metastatisk sygdom.
   2. Sikre alle reagenser er på RT og bland 199 µL af fluorometer fortynding buffer med 1 µL af farvestof (200 x) pr. reaktion (N antallet af prøver + 2 standarder til at kalibrere fluorometer) at opnå en arbejdsgruppe løsning.
   3. Vortex cfDNA løsning grundigt for at sikre ensartethed og kortvarigt centrifugeres til at indsamle indholdet i bunden af røret.
   4. Mix 5 µL af hver prøve, cfDNA med 195 µL af brugsopløsning.
   5. Mix 10 µL af hver standard med 190 µL af brugsopløsning.
   6. Vortex grundigt alle rør for 2-3 s til at sikre ensartethed og kortvarigt centrifugeres til at indsamle indholdet i bunden af rørene.
   7. Der inkuberes ved RT i 2 min. i mørke.
   8. Læs rør i fluorometer, ved hjælp af ' ng/µL' output mode
   9. Beregne den endelige koncentration i ng/mL af plasma som følger: ng/µL x 36 (volumen af cfDNA eluatet) / 4 (volumen af plasma udvundet).

2. ddPCR sonde og Primer Design (figur 2A)

Bemærk: Forstærkning af de målrettede molekyler i drop-off ddPCR analyse følger samme principper af qPCR. Hver primer og sonde er designet med den konventionelle dedikeret software Primer3⁷ (http://primer3.ut.ee/).

1. Primer design
   1. I vinduet generelle indstillinger skal du ændre koncentration af divalent kationer til 3.8, "koncentration af dNTP'er" til 0,8, og ' mispriming/repeat bibliotek ' til den korrekte organisme.
   2. I vinduet advance indstillinger ændre både 'Tabel af termodynamiske parametre' og 'saltkoncentration formel' til Santa Lucia 1998.
   3. Vælg en T_m mellem 55-70 ° C (med 50 mM til saltkoncentration og 300 nM for oligonukleotid koncentration).
   4. Kontrollere specificiteten af primere ved hjælp af værktøjer som PrimerBlast.
   5. Undgå regioner, der har sekundære strukturer.
   6. Vælg en sekvens, der har en GC indhold på 50-60%.
   7. Undgå gentagelser af Gs og Cs længere end 3 baser.
   8. Vælg primere med Gs og Cs i deres 3' ende når det er muligt.
   9. Sikre, at 3' ender af parret primere ikke har betydelig komplementaritet at undgå primer-dimerer. Amplikoner bør være mindre end 150 bp til effektivt forstærker cfDNA (mener størrelse er 170 bp⁸) og DNA ekstraheret fra FFPE, som er ofte fragmenteret.
2. Sonden design
   Bemærk: Hydrolyse sonder er mærket med en fluorescerende reporter på 5'-enden og en quencher på 3'-enden. De giver høj specificitet, høj signal-støj-forholdet og tillade multiplexing hvis nødvendigt. To-kanals droplet læsere er kompatibel med FAM og HEX eller VIC farvestoffer samt analyse af FAM/HEX eller FAM/VIC kombineret sonder.
   1. Design hydrolyse sonder supplement til WT sekvens af target-regionen og de tilstødende ikke-variable region.
   2. Vælg sonder begge ligger inden for amplikon defineret af primer parret tidligere designet. Primer sekvenser kan ikke overlappe med sonden sekvenser, selv om de kan sidde ved siden af hinanden.
   3. Vælg den strand, der har flere Cs end Gs. sonder skal have en GC indhold af 30-80%.
   4. Vælg sonder, der er mellem 13 og 30 nukleotider i længde. Længere sonder har tendens til at vise højere baggrund fluorescens fordi afstanden mellem fluorophore og quencher påvirker quenching af fluorophore reporter.
   5. Vælg T_m af sonder at være 3-10 ° C højere end T_m primere at sikre sonde hydrolyse under primer udglødning og udvidelse. T_m smagsforstærkere anbefales til at nå den krævede T_m samtidig holde sonden kort, som kortere sonder diskriminere enkelt nucleotid varianter mere effektivt. Sonder bør ikke have en G på 5'-enden fordi det slukker fluorescens signal selv efter hydrolyse.
   6. Designe drop-off sonder som følger: 5'-(VIC) -supplerende WT sekvens af regionen muterede-(MGB NFQ)-3' og reference sonde som: 5'-(6-FAM) -supplerende sekvens af en ikke-variable region-(MGB NFQ)-3'. Andre kombinationer af reporter/quencher er også muligt.

3. optimering af ddPCR reaktion (figur 2A)

Bemærk: Wild-type og mutant DNA kontrolelementer bruges i dette trin kan fås fra cellelinjer, tumor prøver eller kommercielt tilgængelige DNA referencestandarder, f.eks.

1. Udføre en konventionel PCR på en termisk cycler ved hjælp af den termiske gradient funktion for at validere specificiteten af PCR produktet forstærkes af primere designet.
   1. Forberede en unik PCR-mastermix, som beskrevet nedenfor i trin 4.1 (uden sonder) om en wild-type DNA kontrol skabelon til et minimum af 8 reaktioner at have mindst én reaktion pr. temperatur.
   2. Køre forstærkning ved hjælp af programmet beskrives på trin 4.3.2 og en række udgloedning temperaturer omkring den teoretiske udgloedning temperatur af primere.
   3. Indlæse PCR produkter på et 3% agarosegel vælge for udglødning temperaturer giver specifikke produkter.
2. Udføre en række drop-off ddPCRs ved hjælp af de parametre, der er beskrevet ovenfor, men denne gang, herunder begge sonder.
   1. Brug 100% WT DNA, 100% MUT DNA og en blanding af WT og MUT DNA (fx 50% MUT/50% WT) til at bestemme de bedste betingelser for klar adskillelse af WT og MUT droplet skyer.
   2. Vælg en række udgloedning temperaturer over den temperatur, der er valgt i trin 4.1.
   3. Vælg den udgloedning temperatur, som giver mulighed for specifikke påvisning af WT eller MUT signaler, når du bruger 100% WT DNA eller 100% MUT DNA og bedste adskillelse af WT og MUT droplet skyer.
   4. Udglødning tid og primer/sonden koncentrationer kan også justeres, forbedre adskillelse af skyer og mindske antallet af dråber med mellemliggende fluorescens (regn effekt).
3. Vurdere baggrunden eller begrænsning af blank (LOB) i analysen.
   1. Udføre et minimum af 48 individuelle drop-off ddPCR reaktioner med en WT kontrol DNA ved hjælp af optimerende parametre og primere/sonder koncentrationer valgt i punkt 3.2.
   2. For hver reaktion, beregne den mutante allel frekvens (MAF) som følger: (antallet af mutant dråber/antal fyldt dråber) x 100.
      Bemærk: LOB er defineret som falsk-positive MAF middelværdi og tilhørende SD hvorfra et 95% konfidensinterval (95% CI) beregnes. LOB = (gennemsnittet af falsk-positive MAF) + 95% CI.
4. Evaluere detektionsgrænsen (LOD) af analysen.
   1. Udføre drop-off ddPCR reaktioner ved hjælp af serielle fortyndinger af MUT DNA i WT DNA, med MAFs lige fra 5% til 0,01% (≥ 8 gentagelser pr. betingelse). Bruge udgloedning parametre og primere/sonder koncentrationer valgt i punkt 3.2.
      Bemærk: LOD er defineret som de mindste MAF værdier som replikerer nuværende middelværdier og SD ovenfor LOB (Se Decraene et al. ⁶ for flere detaljer).

4. ddPCR protokol (figur 2B)

Bemærk: Svarende til konventionelle ddPCR, bagageaflevering ddPCR protokol består af 4 trin: (i) PCR Bland forberedelse, (ii) droplet generation, (iii) PCR-amplifikation og (iv) dataopsamling.

1. PCR mix forberedelse
   1. Følg standard forholdsregler, såsom iført handsker, ved hjælp af en ren PCR hætte, ren pipetter og RNase, DNase-frit destilleret vand for at undgå kontaminering.
   2. Tø og reagensglasset reaktion komponenter på RT.
   3. Forberede 20 x primere/sonder mix i destilleret vand, med primere på 18 µM og sonder på 5 µM.
   4. For alle individuelle PCR reaktioner, forberede en prøve mix ved at kombinere 2 x ddPCR supermix (10 μL), 1 µL af 20 x primere/sonder mix og op til 10 ng DNA prøve qsp 20 µL destilleret vand.
   5. Vortex reaktionen blandes grundigt for at sikre ensartethed og kortvarigt centrifugeres til at indsamle indholdet i bunden af røret inden udlevering. Tøv ikke med at gentage dette trin for hver mastermix før brug.
2. Droplet generation
   1. Indsæt ddPCR patron i holderen og indlæse 20 μL mastermix indeholdende proever i de midterste wells af patronen for slipværktøj generation (grønne holdninger i figur 2B) ved hjælp af en 8-kanal pipette.
   2. Tilsæt 70 μL af droplet generator olie i bunden brønd (gul stillinger).
   3. Indsæt patron med en pakning i droplet generator; dråber vil blive produceret i de øverste wells af patronen (blå stillinger).
   4. Opsug og undvære langsomt og forsigtigt (for at undgå klipning) 40 μL af dråber fra patroner til en 96-brønd PCR plade. Brug en multikanal-pipette til at optimere overførsel af dråber.
3. PCR-amplifikation
   1. Forsegle den endelige PCR-plade med en aluminiumsfolie, ved hjælp af en plade sealer umiddelbart efter overførsel af droplets til at undgå fordampning. Kort centrifugeres plade til at indsamle indholdet i bunden af brøndene.
   2. Køre en konventionel PCR-amplifikation på en termisk cycler bruger følgende program: 95 ° C 10 min, 40 cyklusser af [94 ° C 30 s, valideret udgloedning T ° til 60 s], 98 ° C 10 min (rampe 2,5 ° C/s). Omfatte kontrol med ingen input DNA og vildtype DNA (≥3 replikater) i hver analyseserie.
   3. Når kørslen er afsluttet, kort centrifugeres plade til at indsamle indholdet i bunden af brøndene.
4. Dataopsamling
   1. Efter PCR-amplifikation, bruge droplet læseren til at tælle PCR-positive og PCR-negative dråber, efter fabrikantens anvisninger.
      Bemærk: Droplet læseren normalt tilbyder en to-farvet optisk registrering-kompatibelt med FAM, VIC eller HEX fluorophores.

5. dataanalyse (figur 2 c og figur 3)

Bemærk: PCR-positive og PCR-negative dråber tælles for at give en absolut kvantificering af MUT og WT alleler i den målrettede region. De tildelte dråber bruges til at beregne MAF i hver brønd. Droplet kvantificering og analyse af drop-off assays kan udføres ved hjælp af pakken ddPCR Rasmussen (https://github.com/daattali/ddpcr) udviklet af Attali og kolleger^9,10. Denne R pakke klassificerer automatisk dråber som tom, en del af "regn" (på grund af ineffektive forstærkning) eller som fyldt med en rigtig positivt signal (figur 3). I det følgende afsnit præsentere de forskellige trin af analysen er en kort version af den beskrivende vignet af algoritmen skrevet af ophavsmændene (Se https://github.com/daattali/ddpcr/blob/master/vignettes/ algoritme. RMD for flere detaljer). Data er eksporteret til kommasepareret filer (FileName_Amplitude.csv) og uploades i pakken ddPCR skal analyseres direkte i R eller via dedikeret web-interface.

1. Parameter justeringer
   Bemærk: Hver drop-off assay design resultater i bestemte endelige dråbe distributioner og variationer i skyen form, separationer eller positioner kan forventes. For at sikre effektiv automatiseret analyse, skal et sæt af parametre, der justeres. Hvis et godt har en uventet profil, kan det forårsage analyse af hele pladen til at mislykkes, hvilket resulterer i en fejlmeddelelse. Den problematiske skal godt være identificeret og fjernet fra den automatiserede analyse.
   1. Identificere mislykkede brønde ved hjælp af (REMOVE_FAILURES). Bruge TOTAL_DROPS_T (standardværdi er 5.000) til at justere den minimale antal dråber i hver brønd. Bruge EMPTY_LAMBDA_LOW_T (standardværdi er 0,3) og EMPTY_LAMBDA_HIGH_T (standardværdien er 0,99) til at justere de målinger, der evaluerer de forventede droplet skyer (tom, MUT, WT) og deres kvalitet.
      Bemærk: At have for mange tomme dråber er et tegn på at der ikke var nok amplifiable skabelon i reaktionen.
   2. Identificere outlier droplets bruger (REMOVE_OUTLIERS). Brug TOP_PERCENT (standard er p = 1%) til at justere den øverste p procent af dråber at have den højeste signalværdi i hvert signal dimension (FAM, VIC/HEX) ud af dråber i hele pladen. Brug CUTOFF_IQR (standard er 5) til at justere outlier tærsklen til den øverste p procent af højeste signal.
   3. Identificere Tom droplets bruger (REMOVE_EMPTY). Brug CUTOFF_SD (standard er 7) til at justere standardafvigelsen af de lavere (Tom dråber) Gauss-fordeling af sonde 1 værdier.
   4. Gate droplets bruger (KLASSIFICERE). Brug CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD (standard er 3) til at justere standardafvigelsen af højere (fyldt dråber) Gaussisk distribution af sonde 1 værdier. Brug ADJUST_BW_MIN (standard er 4) og ADJUST_BW_MAX (standard er 20) til at justere parametrene k_min og k_max for at vurdere kerne tætheden af sonde 2-værdier og diskriminere MUT og WT sky af små dråber.
      1. Brug SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ (standard er p = 1%) og SIGNIFICANT_P_VALUE (standard er signifikansniveauet s=0.01%) til at klassificere brønde som enten mutant eller vildtype.
         Bemærk: I denne algoritme, en mutant godt er defineret som havende en MAF, der er statistisk signifikant højere end p %.
2. Automatiseret analyse
   Bemærk: For hver parameter, der præsenteres i dette afsnit, forfatterne af pakken ddPCR Rasmussen har foreslået standardværdier baseret på deres ekspertise og deres data. Men alle parametre kan ændres for at øge kvaliteten af analyse (figur 3).
   1. Identificere mislykkede brønde.
      1. Bruge fire kvalitetskontrol målinger (indstillinger: REMOVE_FAILURES) at identificere mislykkede brønde; den første er den mindste antal dråber, der en brønd bør indeholde. De andre tre fokusere på at identificere gyldig kandidat befolkningsgrupper til tom, eventuelt FAM + og HEX +/ VIC + dråber. Fjerne brønde, der ikke opfylder disse kriterier fra downstream analyse.
   2. Identificere outlier dråber.
      1. For at undgå skævvridning droplet gating, fjerne outliers (dvs. dråber med en unormalt høj HEX/VIC eller FAM værdi) fra yderligere analyse ved at fastsætte en øvre grænse tærskel (indstillinger: REMOVE_OUTLIERS).
   3. Identificere Tom dråber.
      1. Identificere Tom droplets til at reducere dimension af data (i en typisk godt, de vil tegne sig for de fleste af dråberne) og fjerne statistiske bias på grund af tilstedeværelsen af en stor del af ubrugelige oplysninger, som kun skabelon-holdige dråber forblive () indstillinger: REMOVE_EMPTY).
   4. Udføre droplet gating.
      1. Klassificere de resterende dråber som enten mutant, vildtype eller regn (indstillinger: KLASSIFICERE).
   5. Identificere regn dråber.
      1. Som regn dråber skyldes ineffektiv forstærkning, udelukke fra FAM + eller HEX +/ VIC + skyer. Fastlægge grænserne af deres klynger ved hjælp af deres sonde 1 værdier (indstilling: CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD).
   6. Identificere mutant versus vildtype dråber.
      1. Højdepunktet i analysen er forskelsbehandling mellem mutant og vildtype skabeloner, identificere alle resterende dråber på dette tidspunkt som enten den ene eller den anden. Da de bør have lignende sonde 1 værdier, bruge sonde 2 værdier til bedste forudsige deres respektive karakter (indstillinger: ADJUST_BW_MIN og ADJUST_BW_MAX).
   7. Klassificere brønde som mutant versus vildtype.
      1. Efter bestemmelse af, hvilke dråber er beregne MUT og WT, MAF. Ved hjælp af mutant frekvens og tilhørende p-værdi af hver brønd, er det muligt at klassificere dem (indstillinger: SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ, SIGNIFICANT_P_VALUE) som WT (der indeholder for det meste WT dråber) eller MUT brønde (indeholdende et statistisk signifikant antal MUT dråber).
3. Udforske og eksportere data
   1. Udforske og eksportere data som antal dråber, outliers, Tom dråber, fusioner eller grafer, der kan tilpasses yderligere til optimal repræsentation.

Representative Results

I en proof of concept undersøgelse undersøgte Kommissionen KRAS exon 2 mutationer (kodon 12 og 13) og EGFR exon 19 sletninger i FFPE væv og plasmaprøver fra patienter bruger drop-off ddPCR strategi⁶.

KRAS drop-off sonden afhørt en 16 bp regionen omfatter flere mutationer i exon 2 af KRAS -genet, som havnen mere end 95% af de kendte KRAS mutationer i menneskelige kræftformer¹¹. Reference sonden var 20 bp i længden og placeret 3 bp nedstrøms. For at optimere vores assay, vi brugte DNA ekstraheret fra cellelinjer indeholdende 2 af de hyppigst muterede KRAS aminosyrer: G12V (c.35GT, SW480) og G13D (c.38GA, HCT 116).

EGFR drop-off assay var designet til at scanne for alle aktiverende sletninger af EGFR exon 19. Analysen anvendes en 25 bp-lange drop-off sonde placeret over den tilbagevendende slettede region samt en henvisning sonde af 21 bp, ligger 31 bp nedstrøms i den samme amplikon. For at optimere vores assay, vi brugte en cfDNA reference standard sæt herunder EGFR exon 19 sletning c.2235_2249del, p.Glu746_Ala750del.

Følsomhed, specificitet og placering af droplet skyer er blevet defineret med kontrolprøver MUT og WT PBMC genomisk DNA som vist i figur 4A for KRAS. Vi viste yderligere, at denne type af assay virker på flere typer af genetiske ændringer som enkelt substitution, flere udskiftninger eller sletninger (figur 4B) samt på forskellige prøve typer⁶.

Figur 1: drop-off ddPCR kræver en unik par af hydrolyse oligo-sonder til at scanne alle mutationer af en hotspot region. Analysen designs med en skematisk resultatet vises som to-dimensionelle scatter observationsområder viser droplet fluorescens intensitet. (A) konventionelle ddPCR med mutant (MUT sonde) og wild-type (WT sonde) sonder rettet mod den nøjagtige samme region. (B) drop-off ddPCR indeholder en reference sonde (sonde 1), der anneals til en ikke-variable region og en drop-off sonde (sonde 2) rettet mod den muterede region men komplementære til WT sekvens, inden for den samme amplikon. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Drop-off ddPCR arbejdsgangen til plasma DNA mutation profilering. Fuld arbejdsprocessen er sammensat af 5 hovedtrin: (A) (1) udformningen af primere og sonder, (2) optimering af assay, (B) (3) plasma isolation og cfDNA udvinding, (4) ddPCR køre og (C) (5) data analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Drop-off ddPCR analyse. Drop-off ddPCR analyse arbejdsproces fremhæve vigtige parametre, der skal finjusteres. Dette sikrer effektiv automatiseret identifikation af outliers, tom, regn eller positive dråber; tildele MUT eller WT dråber og computing MAF til hver brønd. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Repræsentative resultater - KRAS og EGFR drop-off ddPCR assays. (A) eksempel af resultater opnået under optimering trin af drop-off ddPCR assay. Påvisning af mutant og/eller vildtype DNA i en reaktion, der indeholder 100% MUT DNA, 5% MUT DNA og 100% WT DNA. (B) eksempler på plasmaprøver analyseres med KRAS og EGFR drop-off ddPCR undersøgelser, som viser påvisning af enkelt nucleotid og flere udskiftninger i exon 2 af KRAS og en sletning i EGFR exon 19. Dette tal er blevet tilpasset fra Decraene et al. ⁶. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

For at designe en effektiv drop-off ddPCR analyse, optimering er afgørende, og protokollen skal følges nøje. Hver kombination af primere og sonder har en unik PCR reaktion effektivitet. Således har en individuel analyse skal valideres omhyggeligt på kontrolprøver inden det anvendes på værdifulde prøveemner. Optimering og validering er vigtigt at certificere peak signal detection og vurdere specificiteten og følsomheden. Som beskrevet i protokollen, kan alle mutationer i et målområde, er omfattet af "sonde 2" potentielt blive afhørt. Ikke desto mindre validering anbefales til mutationer beliggende enten 5' eller 3' enden af "sonde 2", da disse kan påvirke effektiviteten af drop-off assay.

Metoden præsenteres her kan udføres med DNA ekstraheret fra enhver form for "væv", herunder FFPE væv, celler i kultur eller blod prøver. Kvaliteten af nukleinsyre udvinding kan drastisk påvirker ddPCR resultater. PCR hæmmere såsom heparin, proteiner, hæm, phenol, proteaser, kollagen, melanin, rengøringsmidler eller salte skal fjernes så vidt muligt under prøvetagningen og rensning trin. Selv om DNA-prøver kan fortyndes for at reducere virkningen af PCR hæmmere på ddPCR, falder fortynding følsomhed, fordi færre eksemplarer af målet vil blive testet pr. reaktion. Dette bør tages i betragtning når en vis grad af følsomhed er at være nået, som et minimum af kopier skal afprøves.

Drop-off ddPCR kan anvendes til mange typer af molekylære ændringer (enkelt- og flersidede nukleotid erstatninger, sletninger, osv.). Udover at bruge kun to sonder til at registrere alle ændringer (derved øge praktiske gennemførlighed og omkostningseffektiviteten af analysen), drop-off ddPCR genererer mindre baggrund støj⁶ og viser øget følsomhed i forhold til multiplex assays. Derudover, da det er udført i et enkelt reaktion, der minimale mængder af patientprøver forbruges. Denne analyse er særligt tiltrækkende i forbindelse med flydende biopsi, fordi mængden af ctDNA er ofte lave i disse prøver.

Ja, metoden præsenteres her er gældende for mutation screening i væske-biopsi materiale og har allerede bevist sin nytte for klinisk praksis (ESR1 mutation screening i PADA-1 klinisk forsøg - NCT03079011). Det er imidlertid afgørende at bruge amplikoner så kort som muligt i denne indstilling på grund af opsplitningen af cfDNA⁸.

Downstream karakterisering stadig skal udføres separat for at identificere den nøjagtige mutation af muterede alleler. Fordi terapeutiske beslutninger er primært baseret på mutationsmønstre status for hotspot regioner af markedssegment onkogener (WT vs mutant), gør drop-off ddPCR evne til at umiddelbart identificere mutationer det imidlertid en kraftfulde diagnostiske værktøj. Desuden, den eksakte mutation ikke behøver at være kendt på forhånd til at designe en assay i Herodots til nuværende kommercielle løsninger. Derudover kan drop-off ddPCRs kombineres med specifikke konventionelle ddPCR assays til øges antallet af mutationer screenet for (data ikke vist). Endelig kan drop-off ddPCR anvendes på andre områder inden for forskning. Især kan det vise sig for at være et nyttigt redskab for screening positive kolonier i genom redigering eksperimenter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
K2EDTA tube (color code : lavender)	BD	367863	EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol)	Qiagen	55114	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol)	Qiagen	937556	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony SP system	Qiagen	9001297	fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification
QIAvac 24 Plus	Qiagen	19413	For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously
Qubit fluorometer	Invitrogen	Q33226	The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA
QX100 or QX200 reader	Bio-Rad	186-3003 or186-4003, respectively	The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector
QX100 or QX200 droplet generator	Bio-Rad	186-3002 or 186-4002, respectively	Instrument used for droplet generation
C1000 thermal cycler	Bio-Rad	1851196	Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module
Plate sealer	Bio-Rad	181-4000	PX1™ PCR plate sealer
DG8 cartridge holder	Bio-Rad	186-3051	Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation
Droplet generator cartridges and gaskets	Bio-Rad	186-4007	Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation
PCR supermix	Bio-Rad	186-3010	ddPCR supermix for probes (no dUTP)
96-well PCR plates	Eppendorf	951020362	96-well semi-skirted plates
Foil seal	Bio-Rad	181-4040	Pierceable foil heat seal
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	oil used in the read
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	186-3005	oil for droplet generation
DNA loBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	0030 108.051	Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding
Multiplex I cfDNA Reference Standard Set	HORIZON	HD780	The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations
QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500	Life Technologies	Q32854	The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL
Qubit Assay Tubes	Life Technologies	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer