قطره واحدة رقمي البلمرة المتسلسل لكشف شامل ومتزامن من الطفرات في المناطق الساخنة

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لدقة تحديد مقدار التعديلات الوراثية متعددة من المنطقة المستهدفة في رد فعل واحد استخدام دبكر الإنزال وزوج فريدة من المسابر التحلل المائي.

Abstract

التجميعية الرقمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (دبكر) أسلوب تفاعل المتسلسل (PCR) بوليميريز كمية حساسة للغاية تستند إلى وجود عينة إلى الآلاف من ردود الفعل الفردية الماء في النفط التي نانو الحجم. في الآونة الأخيرة، أصبح دبكر واحدة من الأدوات الأكثر دقة وحساسية لتعميم الورم كشف الحمض النووي (كتدنا). أحد القيود الرئيسية التي تقنية دبكر القياسي هو تقييد عدد الطفرات التي يمكن أن يكون فحص كل رد فعل، التي تلزم بتحقيقات محددة التحلل الاعتراف بكل إصدار الاليلي ممكن. منهجية بديلة، دبكر الإنزال، يزيد الإنتاجية، نظراً لأنها تتطلب فقط زوج واحد من تحقيقات لكشف وتحديد يحتمل أن تكون كافة التعديلات الوراثية في المنطقة المستهدفة. يعرض دبكر الإنزال حساسية قابلة للمقارنة لفحوصات دبكر التقليدية مع ميزة الكشف عن عدد أكبر من الطفرات في رد فعل واحد. فعالة من حيث التكلفة، ويحافظ على المواد الثمينة عينة، ويمكن أيضا استخدامها كأداة لاكتشاف عند حدوث طفرات غير معروفة مسبقاً.

Introduction

آلاف طفرات الجسدية المتصلة بالتنمية سرطان قد أبلغ عنها¹. بين هؤلاء، هناك عدد قليل من علامات تنبؤية لفعالية العلاج المستهدفة ^2،3 وفحص هذه الطفرات الوراثية الممارسة السريرية الروتينية الآن. الحبرية، التكنولوجيا الرقمية على بكر (دبكر) يمكن استخدامها لرصد للوجود أو عدم وجود الطفرات مع كشف عالية الدقة، وهو متوافق بشكل كبير مع خزعات السائلة غير الغازية^4،5. ومع ذلك، تشنيع الحالية دبكر فحوصات للكشف عن الطفرات معروفة مسبقاً. وهذا يحد بشدة استخدام دبكر كأداة لاكتشاف عند الطفرة غير معروف. في الواقع، في تصميم دبكر التقليدية، مجس التحلل إذ تسلم اليل البرية من نوع (WT مسبار) تتنافس مع تحقيق محددة إذ تسلم اليل المسخ (موت مسبار) (الشكل 1A). التحقيق مع تقارب أعلى هيبريديزيس إلى القالب، والنشرات في فلوروفوري، مما يشير إلى طبيعة اليل المقابلة. يمكن تصور الأسفار البيانات التي تم الحصول عليها لكل قطره في مؤامرة مبعثر يمثلون الأسفار المنبعثة من المسابر WT وموت في أبعاد مختلفة. تمثيل تخطيطي لنتيجة نموذجية مقايسة دبكر تقليدية ترد في الشكل 1A. في هذا المثال، يناظر سحابة زرقاء قطرات تحتوي على الآليلات WT حددها التحقيق WT، بينما سحابة حمراء يطابق قطرات الذي تم تضخيمه اليل موت وحددها التحقيق موت. اعتماداً على كمية الحمض النووي محملة في رد الفعل، يمكن أن تظهر قطرات إيجابية مزدوجة تحتوي على أمبليكونس WT وموت (سحابة الخضراء). سحابة رمادية خفيفة يطابق قطرات فارغة.

حيث تسمح معظم المنصات للكشف عن عدد محدود من فلوروفوريس (عادة ما تكون 2، بل تصل إلى 5)، يقتصر إنتاجية دبكر التقليدية. ولذلك، استهداف المناطق مع الطفرات المتاخمة متعددة يتطلب تصميم تحديا تقنيا فحوصات دبكر متعدد أو استخدام ردود فعل متعددة تستهدف كل طفرة في نفس الوقت. الاستراتيجية دبكر الإنزال، ويتغلب على هذا القيد كما يحتمل أن يمكن الكشف عن أي تغيير الوراثية داخل منطقة مستهدفة استخدام زوج فريدة من المسابر التحلل WT. ومن المتوقع أول مجس (مسبار 1) يغطي تسلسل غير متغيرة، المتاخمة للمنطقة المستهدفة والتحقيق الثاني (المسبار 2) مكمل لتسلسل المنطقة المستهدفة حيث الطفرات WT (الشكل 1B). في حين أن التحقيق الأولى يقد المبلغ الإجمالي لجزيئات أمبليفيابل في رد الفعل، يميز التحقيق الثاني الآليلات WT وموت بالتهجين دون المستوى الأمثل لتسلسل متحولة. المسبار 2 يمكن تحديد أنواع متعددة من الطفرات في المنطقة (نوكليوتيد واحد أو عدة بدائل، الحذف، إلخ) الهدف⁶. كما هو الحال في دبكر التقليدية، سحابة رمادية خفيفة يطابق قطرات تحتوي على لا جزيئات الحمض النووي. من المهم أن نذكر أن الفصل الأمثل الغيوم WT وموت في هذا النوع من التحليل، تعتمد على الكمية من الحمض النووي محملة في رد الفعل، حيث لا يمكن تمييزها قطرات تحتوي على وزن وموت الآليلات الهدف من قطرات تحتوي على فقط وزن النموذج. ولذلك، يتطلب هذا التحليل أن معظم قطرات تحتوي على لا أكثر من نسخة واحدة من الجينات المستهدفة.

Protocol

البروتوكول المعروضة هنا يتبع المبادئ التوجيهية الأخلاقية لكوري معهد. وتم الحصول على جميع العينات البشرية من المرضى المسجلين، بعد الموافقة عن علم، في الدراسات التي وافق عليها "مجلس المراجعة المؤسسية" في معهد كوري.

1-جمع وتخزين البلازما واستخراج الحمض النووي خالية من خلايا الدم

ملاحظة: يمكن استخدام الحمض النووي المستخرج من أي نوع من "النسيج" (البارافينمثلاً، طازجة أو فورمالدهايد--ثابت مضمن (FFPE) الأنسجة والخلايا في عينات الدم أو الثقافة). هنا، نحن نقدم التعليمات المفصلة لجمع الدم وعزل البلازما وتخزين واستخراج الحمض النووي (كفدنا) خالية من الخلية.

1. تخزين مجموعة وبلازما الدم (الشكل 2B)
   1. جمع عينات الدم في أنابيب يدتا مل 7. وينصح اثنان أنابيب لجمع حوالي 4 مل بلازما.
   2. الطرد المركزي هذه الأنابيب لمدة 10 دقيقة في 820 x ز داخل ح 3 سحب الدم لفصل خلايا الدم الحمراء (RBC)، وخلايا الدم البيضاء (WBC) والبلازما. الوقت بين العينات والطرد المركزي أمر حاسم للحصول على جودة عالية كفدنا (أي، كفدنا غير ملوثة بالحمض النووي من مكافحة حرائق آبار النفط).
   3. عناية بيبيت المادة طافية (البلازما) استخدام بيبيت 1 مل دون لمس الطبقة مكافحة حرائق آبار النفط؛ عادة ما يتم استرداد حوالي 2 مل بلازما في أنبوب يدتا.
   4. نقل البلازما لأنابيب 2 مل والطرد المركزي مختبرين في س 16,000 ز لمدة 10 دقيقة في 15 درجة مئوية لإزالة الحطام خلية.
   5. عناية بيبيت المادة طافية (البلازما) دون الإخلال بيليه. توزيع البلازما في الأنابيب المبردة 2 مل وتخزينها في-80 درجة مئوية إلى حين الحاجة.
2. كفدنا الاستخراج (الشكل 2)
   ملاحظة: هنا، نقدم هذه العملية باستخدام أدوات الاستخراج اليدوي. يمكن أيضا إجراء لإصدار تلقائي اتباع إرشادات الشركة المصنعة لعزل كفدنا.
   1. وضع 400 ميليلتر كالبروتيناز في أنبوب 50 مل. إضافة 4 مل بلازما (وحدة تخزين تستخدم بشكل روتيني)، ومل 3.2 من المخزن المؤقت لتحلل ACL (تحتوي على 1.0 ميكروغرام الناقل الرنا) من الطقم. إغلاق الأنبوب ومزيج من فورتيكسينج لمدة 30 ثانية للحصول على حل متجانسة. احتضان عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   2. إضافة مل 7.2 من المخزن المؤقت ACB (من kit) إلى تحسين ربط الأحماض النووية المتداولة للغشاء والسليكا ومزيج من فورتيكسينج عن 15 – 30 س. إينكوباتي الأنبوبة لمدة 5 دقائق على الجليد.
   3. مكان العمود والموسع 20 مل في مضخة فراغ. إغلاق المواقع غير المستخدمة للسماح بالشفط بالتخلية.
   4. تطبيق الخليط ACB ليستي المخزن المؤقت بعناية في أنبوب الموسع (بإيجاز الطرد أنبوب لجمع الحد أقصى خليط ACB ليستي العازلة)، التبديل على مضخة فراغ وتسمح التي يمكن استخلاصها من خلال الأعمدة تماما. إزالة وتجاهل الموسع الأنبوبة.
   5. تطبيق 600 ميليلتر من المخزن المؤقت ACW1 للعمود. عندما وضعت المخزن المؤقت ACW1 من خلال العمود، إضافة ميليلتر 750 ACW2 المخزن المؤقت، وأخيراً إضافة 750 ميليلتر من الإيثانول (96-100%). ثم، ضع العمود في أنبوب جمع نظيفة 2 مل وأجهزة الطرد المركزي بالسرعة الكاملة (20,000 س ز) لمدة 3 دقائق للقضاء على الإيثانول.
   6. مكان العمود إلى أنبوب جمع 2 مل جديدة. فتح الغطاء واحتضان في 56 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة يجف الغشاء تماما.
   7. مكان العمود في أنبوب ملزمة منخفضا الحمض النووي نظيفة 1.5 مل. تطبيق بعناية ميليلتر 36 المياه خالية من رناسي مع أزيد الصوديوم 0.04% (أفي المخزن المؤقت). إغلاق الغطاء واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
   8. الطرد المركزي بالسرعة الكاملة (20,000 س ز) لمدة 1 دقيقة الوت الأحماض النووية وتخزينها في-20 درجة مئوية إلى حين الحاجة.
3. كفدنا الكمي
   ملاحظة: يتم التقدير الكمي كفدنا مع فلوروميتير استخدام البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة مباشرة بعد استخراج أو ذوبان هذه العينات في درجة حرارة الغرفة (RT)، قبل الاستخدام. تجنب عدة دورات تجميد/ذوبان الجليد.
   1. استخدام تحليل حساسية عالية وفقا لكمية كفدنا المتوقعة، التي عادة ما تكون أقل من 100 نانوغرام/مل بلازما. كفدنا تركيزات تتراوح بين 2-10 نانوغرام/مل للمانحين صحي لكن يمكن أن يصل إلى 100 نانوغرام/مل في المرضى الذين يعانون من المرض المنتشر.
   2. ضمان جميع الكواشف RT ومزيج ميليلتر 199 من المخزن المؤقت لتمييع fluorometer مع 1 ميليلتر من صبغة (200 x) كل فعل (N عدد العينات + 2 معايير لمعايرة فلوروميتير) للحصول على إيجاد حل عملي.
   3. دوامة الحل كفدنا جيدا ضمان تجانس والطرد المركزي بإيجاز لجمع محتويات في الجزء السفلي من الأنبوب.
   4. مزيج 5 ميليلتر من كل عينة كفدنا مع ميليلتر 195 الحل العامل.
   5. ميكس 10 ميليلتر لكل معيار مع ميليلتر 190 من الحل العامل.
   6. دوامة كل دقة أنابيب ل s 2 – 3 ضمان التجانس والطرد المركزي بإيجاز لجمع محتويات في الجزء السفلي من الأنابيب.
   7. تبني على RT لمدة 2 دقيقة في الظلام.
   8. قراءة هذه الأنابيب في فلوروميتير، باستخدام طريقة الإخراج 'نانوغرام/ميليلتر'
   9. حساب تركيز النهائي في نانوغرام/مل بلازما كما يلي: نانوغرام/ميليلتر x 36 (حجم كفدنا النذرة)/4 (حجم استخراج البلازما).

2-دبكر المسبار و "التصميم التمهيدي" (الشكل 2A)

ملاحظة: تضخيم الجزيئات المستهدفة في مقايسة دبكر الإنزال يتبع مبادئ مماثلة من قبكر. تم تصميم كل التمهيدي والتحقيق مع البرمجيات التقليدية مخصصة Primer3⁷ (http://primer3.ut.ee/).

1. التصميم التمهيدي
   1. في الإطار "إعدادات عامة"، قم بتغيير 'تركيز الكاتيونات divalent' إلى 3.8، 'تركيز دنتبس' إلى 0.8، 'ميسبريمينج/تكرار مكتبة' للكائن الصحيح.
   2. في نافذة إعدادات مسبقة، تغيير كل 'الجدول معلمات دينامي حراري' و 'تركيز الملح الصيغة' إلى سانتا لوسيا عام 1998.
   3. اختر تي_م بين 55 و 70 درجة مئوية (مع 50 ملم لتركيز الملح و 300 نانومتر لتركيز اليغنوكليوتيد).
   4. التحقق من الطابع الخاص للإشعال باستخدام أدوات مثل بريميربلاست.
   5. تجنب المناطق التي لديها هياكل الثانوي.
   6. اختر تسلسل يحتوي على محتوى GC من 50 – 60%.
   7. تجنب تكرار من فئة الخدمات العامة وخدمات العملاء أطول من 3 قواعد.
   8. اختر الإشعال بفئة الخدمات العامة، وخدمات العملاء نهاية 3 ' عندما يكون ذلك ممكناً.
   9. ضمان 3 ' ينتهي الإشعال إقران عدم التكامل هامة لتجنب مبلمر. أمبليكونس ينبغي أن يكون أقل من 150 bp لتضخيم كفاءة كفدنا (يعني حجم هو 170 شركة بريتيش بتروليوم⁸) والحمض النووي المستخرج من فب، التي كثيرا ما مجزأة.
2. تصميم مسبار
   ملاحظة: تتم تسمية المسابير التحلل المائي مع مراسل فلورسنت في نهاية 5 'وتقضي في نهاية 3'. أنها توفر خصوصية عالية، نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية والسماح الإرسال المتعدد إذا لزم الأمر. القراء الحبرية القناة الثانية متوافقة مع الأصباغ الاتحاد الماليزي وست عشري أو مركز فيينا الدولي، فضلا عن تحليل للاتحاد الماليزي/ست عشري أو الاتحاد الماليزي/مركز فيينا الدولي إلى جانب تحقيقات.
   1. تصميم التحلل تحقيقات تكميلية لتسلسل WT المنطقة المستهدفة والمنطقة المجاورة لها غير متغيرة.
   2. اختر المسابير كلاهما تقع داخل amplicon يحددها زوج التمهيدي المصممة مسبقاً. تسلسلات التمهيدي لا يمكن أن تتداخل مع تسلسل التحقيق، على الرغم من أنها قد الجلوس بجانب بعضها البعض.
   3. اختر حبلا يحتوي على خدمات العملاء أكثر من المسابر ع. يجب أن يكون محتوى GC من 30-80%.
   4. حدد المسابير التي بين 13 و 30 النيوكليوتيدات في الطول. تحقيقات طويلة تميل إلى عرض أعلى الخلفية الفلورية لأنه يؤثر المسافة بين فلوروفوري ويحتوي على تبريد لمراسل فلوروفوري.
   5. حدد T_m من تحقيقات لتكون 3 إلى 10 درجات مئوية أعلى من ت_م كبسولة تفجير لضمان التحقيق التحلل المائي أثناء الصلب التمهيدي وملحق. ينصح تي_م القدرة على التوصل إلى تي المطلوب_م مع إبقاء التحقيق قصيرة، كما المسابير أقصر تميز متغيرات النوكليوتيدات واحدة أكثر كفاءة. لا يجب المسابير ز في نهاية 5 ' لأن هذا يروي إشارة الأسفار حتى بعد التحلل المائي.
   6. تصميم المجسات الإنزال كما يلي: 5'-(VIC)-تسلسل WT مكملة لمنطقة تحور-(MGB NFQ)-3 'والتحقيق كمرجع: 5'-(6-FAM)-تسلسل مكملة لمنطقة غير متغيرة-(MGB NFQ)-3'. تركيبات أخرى لمراسل/تقضي أيضا ممكنة.

3-الاستفادة المثلى دبكر رد فعل (الشكل 2A)

ملاحظة: عناصر تحكم الحمض النووي البرية من نوع ومتحولة المستخدمة في هذه الخطوة يمكن الحصول من خطوط الخلايا، وعينات الورم أو المعايير المرجعية المتاحة تجارياً في الحمض النووي، على سبيل المثال.

1. أداء بكر تقليدية على cycler حرارية استخدام ميزة التدرج الحراري للتحقق من صحة خصوصية المنتج بكر تضخيمه بكبسولة تفجير تصميم.
   1. إعداد مزيج تفاعل PCR فريدة من نوعها كما هو موضح أدناه في الخطوة 4.1 (دون تحقيقات) على قالب تحكم البرية من نوع الحمض النووي للحد أدنى من 8 ردود الفعل أن يكون رد فعل واحد على الأقل في درجة الحرارة.
   2. تشغيل التضخيم استخدام البرنامج الموضحة في الخطوة 4.3.2 ومجموعة من درجات الحرارة انلينغ حول درجة حرارة انلينغ النظرية كبسولة تفجير.
   3. تحميل منتجات بكر على 3% [اغروس] هلام لتحديد للصلب في درجات الحرارة توفير منتجات محددة.
2. تنفيذ سلسلة من دبكرس الإنزال باستخدام المعلمات المذكورة أعلاه ولكن هذه المرة بما في ذلك تحقيقات على حد سواء.
   1. استخدام 100% WT الحمض النووي والحمض النووي موت 100% وخليط من وزن وموت الحمض النووي (مثلاً 50% MUT/50% WT) لتحديد أفضل الظروف للفصل الواضح بين الغيوم الحبرية WT وموت.
   2. اختر مجموعة من درجات الحرارة انلينغ أعلاه درجة الحرارة اخترته في الخطوة رقم 4، 1.
   3. حدد درجة الحرارة انلينغ الذي يسمح بكشف محددة WT أو موت إشارات عند استخدام الحمض النووي وزن 100% أو 100% "موت الحمض النووي" والانفصال أفضل من الغيوم الحبرية WT وموت.
   4. الصلب تركيزات وقت، والتمهيدي/المسبار يمكن أيضا تعديلها لتحسين الفصل بين الغيوم وتقليل عدد قطرات مع الأسفار المتوسطة (تأثير الأمطار).
3. تقييم الخلفية أو الحد من فارغة (LOB) من المقايسة.
   1. القيام بالحد أدنى من 48 ردود دبكر الإنزال الفردية مع عنصر تحكم WT الحمض النووي باستخدام معلمات انلينغ وتركيزات الإشعال/المجسات المختارة في 3.2.
   2. لكل رد فعل، حساب تردد متحولة اليل (ماف) على النحو التالي: (عدد قطرات متحولة/عدد قطرات شغلها) x 100.
      ملاحظة: يعرف بأنه يعني ماف إيجابية كاذبة لوب والمرتبطة SD الذي يحسب 95% فاصل الثقة (CI 95%). لوب = (يعني ماف إيجابية كاذبة) + CI 95%.
4. تقييم الحد الأقصى للكشف عن (اللد) التحليل.
   1. القيام بردود فعل دبكر الإنزال باستخدام تخفيف المسلسل موت الحمض النووي في "وزن الحمض النووي"، مع مافس تتراوح من 5% إلى 0.01 ٪ (≥ 8 يتطابق كل حالة). استخدام تركيزات المعلمات والإشعال/تحقيقات انلينغ المختارة في 3.2.
      ملاحظة: اللد يعرف قيم ماف أصغر التي يتطابق هذا متوسط القيم و SD أعلاه لوب (انظر ديكران et al. ⁶ لمزيد من التفاصيل).

4-دبكر البروتوكول (الشكل 2)

ملاحظة: دبكر مماثلة إلى التقليدية، البروتوكول دبكر الإنزال تتكون من 4 خطوات: مزيج PCR (ط) إعداد وتوليد الحبرية (ثانيا)، (ثالثا) [بكر] تضخيم والحصول على البيانات (رابعا).

1. إعداد مزيج PCR
   1. اتباع الاحتياطات القياسية، مثل ارتداء القفازات، باستخدام غطاء بكر نظيفة وتنظيف الممصات رناسي، خالية من الدناز المقطر المياه لتجنب التلوث.
   2. ذوبان الجليد وحجته مكونات رد فعل في الرايت
   3. إعداد 20 x ميكس الإشعال/تحقيقات في الماء المقطر، مع الإشعال في كل 18 ميكرون وتحقيقات في كل 5 ميكرومتر.
   4. لجميع ردود الفعل الفردية بكر، إعداد مزيج عينة من خلال الجمع بين 2 x ddPCR سوبيرميكس (10 ميكروليتر)، 1 ميليلتر من 20 x ميكس الإشعال/تحقيقات وما يصل إلى 10 نانوغرام الحمض النووي عينة برنامج البداية السريعة 20 ميليلتر من الماء المقطر.
   5. دوامة ردود فعل مزيج دقيق لضمان التجانس والطرد المركزي بإيجاز لجمع محتويات في الجزء السفلي من الأنبوب قبل صرفها. لا تتردد في تكرار هذه الخطوة لكل رد فعل المزيج قبل الاستخدام.
2. جيل الحبرية
   1. إدراج خرطوشة دبكر الحامل وتحميل 20 ميكروليتر من رد فعل مزيج يحتوي على عينات في الآبار الأوسط خرطوشة لتوليد الحبرية (الوظائف الخضراء في الشكل 2) استخدام ماصة 8-قناة.
   2. إضافة ميكروليتر 70 الحبرية مولد النفط في الآبار السفلي (وظائف الصفراء).
   3. إدراج الخرطوشة، مع طوقا، في مولد الحبرية؛ سيتم إنتاج قطرات في آبار أعلى الخرطوشة (مواقف الأزرق).
   4. نضح والاستغناء ببطء ولطف (لتجنب إمالة) 40 ميكروليتر من القطرات من الخراطيش في لوحة بكر 96-جيدا. استخدام ماصة متعدد القنوات لتحسين نقل القطرات.
3. [بكر] تضخيم
   1. إغلاق لوحة بكر النهائي مع رقائق ألومنيوم استخدام السدادة لوحة مباشرة بعد نقل قطرات لتجنب التبخر. الطرد المركزي باختصار لوحة لجمع محتويات في الجزء السفلي من الآبار.
   2. تشغيل تضخيم PCR تقليدية على cycler حرارية استخدام البرنامج التالي: 95 درجة مئوية 10 دقيقة، دورات 40 [94 درجة مئوية 30 ثانية، التحقق من صحة انلينغ تي ° 60 s], 98 ° ج 10 دقيقة (منحنى 2.5 درجة مئوية/s). وتشمل الضوابط مع لا إدخال الحمض النووي والبرية نوع الحمض النووي (إيه ثري replicates) في كل تشغيل.
   3. عندما يتم الانتهاء من التشغيل، الطرد المركزي باختصار لوحة لجمع محتويات في الجزء السفلي من الآبار.
4. الحصول على البيانات
   1. بعد التضخيم بكر، استخدام قارئ الحبرية لعد PCR إيجابيا وقطرات PCR سالب، واتباع إرشادات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: قارئ الحبرية عادة ما يقدم نظام كشف بصري اللونين متوافق مع فلوروفوريس الاتحاد الماليزي، ومركز فيينا الدولي أو ست عشري.

5-بيانات تحليل (الشكل 2 و الشكل 3)

ملاحظة: يتم عد قطرات PCR-الإيجابية والسلبية PCR تقديم القياس الكمي مطلق موت والاليلات WT في المنطقة المستهدفة. وتستخدم قطرات المعينة لحساب ماف في كل بئر. الحبرية القياس الكمي وتحليل للانزال يمكن إجراء فحوصات باستخدام حزمة دبكر R (https://github.com/daattali/ddpcr) وضعتها أتالي والزملاء^9،10. ويصنف هذه الحزمة R تلقائياً قطرات كجزء فارغ، "المطر" (بسبب عدم كفاءة التضخيم)، أو مليئة بإشارة إيجابية حقيقية (الشكل 3). المقطع التالي عرض الخطوات المختلفة للتحليل هو نسخة مختصرة من المصغر وصفية خوارزمية كتبها مؤلفيه (انظر خوارزمية https://github.com/daattali/ddpcr/blob/master/vignettes/. رمد لمزيد من التفاصيل). تصدير إلى ملفات قيم مفصولة بفاصلة (FileName_Amplitude.csv) البيانات وتحميلها في حزمة دبكر يتم تحليلها مباشرة في البحث والتطوير، أو من خلال واجهة ويب مخصصة.

1. معلمة إدخال تعديلات
   ملاحظة: كل تصميم المقايسة الإنزال ينتج توزيعات الحبرية نهائية محددة والاختلافات في شكل سحابة أو نسخ فصل الألوان أو مواقف ما يمكن توقعه. لضمان كفاءة التحليل الآلي، مجموعة من المعلمات يحتاج إلى تعديل. إذا كان جيدا بصورة غير متوقعة، فإنه قد يسبب تحليل اللوحة كلها بالفشل، أسفر عن رسالة خطأ. إشكالية جيدا سوف يتعين تحديدها وإزالته من التحليل الآلي.
   1. تحديد الآبار الفاشلة باستخدام (REMOVE_FAILURES). استخدام TOTAL_DROPS_T (القيمة الافتراضية هو 5000) تعديل الحد الأدنى لعدد قطرات في كل بئر. استخدام EMPTY_LAMBDA_LOW_T (القيمة الافتراضية هي 0.3) و EMPTY_LAMBDA_HIGH_T (القيمة الافتراضية هي 0، 99) لضبط المقاييس التي تقيم الغيوم الحبرية المتوقعة (فارغ، موت، WT) ونوعيتها.
      ملاحظة: وجود عدد كبير جداً من قطرات فارغة علامة على أنه لا يوجد قالب أمبليفيابل ما يكفي في رد الفعل.
   2. تحديد قطرات الخارجة باستخدام (REMOVE_OUTLIERS). استخدام TOP_PERCENT (الافتراضي هو p = 1%) لضبط ف أعلى بالمائة من قطرات بعد إشارة أعلى قيمة في كل بعد من أبعاد إشارة (الاتحاد الماليزي، مركز فيينا الدولي/ست عشري) من قطرات في لوحة كاملة. استخدام CUTOFF_IQR (الافتراضي هو 5) لضبط العتبة الخارجة من أعلى ف بالمائة من أعلى إشارة.
   3. تحديد قطرات فارغ باستخدام (REMOVE_EMPTY). استخدام CUTOFF_SD (الافتراضي هو 7) لضبط الانحراف المعياري لتوزيع الضبابي (قطرات فارغة) أقل من القيم 1 التحقيق.
   4. قطرات البوابة باستخدام (CLASSIFY). استخدام CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD (الافتراضي هو 3) لضبط الانحراف المعياري لتوزيع غاوسي (قطرات شغلها) أعلى قيم 1 التحقيق. استخدام ADJUST_BW_MIN (الافتراضي هو 4) و ADJUST_BW_MAX (الافتراضي هو 20) لضبط المعلمات k_min و k_max لتقدير كثافة نواة القيم 2 التحقيق وتميز موت وسحابة WT قطرات.
      1. استخدام SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ (الافتراضي هو p = 1%) و SIGNIFICANT_P_VALUE (الافتراضي هو s=0.01% مستوى الأهمية) لتصنيف الآبار كالمسخ أو wildtype.
         ملاحظة: في هذه الخوارزمية، متحولة جيدا يعرف أنه بعد ماف أعلى شكل يعتد به إحصائيا من p %.
2. التحليل الآلي
   ملاحظة: لكل معلمة المعروضة في هذا القسم، المؤلف مجموعة دبكر R يكون القيم الافتراضية المقترحة على أساس خبرتهم والبيانات الخاصة بهم. ومع ذلك، يمكن تعديل كافة المعلمات لزيادة جودة التحليل (الشكل 3).
   1. تحديد الآبار الفاشلة.
      1. استخدام أربعة مقاييس مراقبة الجودة (إعدادات: REMOVE_FAILURES) لتحديد الآبار الفاشلة؛ الأول هو الحد الأدنى لعدد قطرات ينبغي أن تحتوي على بئر. الثلاثة الأخرى التي تركز على تحديد المرشح صالح السكان فارغة، ربما الاتحاد الماليزي + وست عشري + فيك + قطرات. إزالة الآبار التي لا تستوفي هذه المعايير من تحليل المتلقين للمعلومات.
   2. تحديد قطرات الخارجة.
      1. لتفادي انحراف النابضة الحبرية، إزالة القيم المتطرفة (أي قطرات مع قيمة HEX/مركز فيينا الدولي أو الاتحاد الماليزي طبيعي عالية) من مزيد من التحليل بتعيين حد حدود العليا (إعدادات: REMOVE_OUTLIERS).
   3. تحديد قطرات فارغة.
      1. تحديد قطرات فارغة لتقليل البعد للبيانات (في بئر نموذجي، أنها سوف تمثل معظم القطرات) والقضاء على التحيز الإحصائية نظراً لوجود جزء كبير من المعلومات عديمة الفائدة كما تبقى قطرات فقط التي تحتوي على قالب ( إعدادات: REMOVE_EMPTY).
   4. أداء النابضة الحبرية.
      1. تصنيف قطرات المتبقية كالمسخ، wildtype أو المطر (إعدادات: تصنيف).
   5. تحديد قطرات المطر.
      1. كما قطرات المطر نتيجة لعدم كفاءة التضخيم، تستبعد من الاتحاد الماليزي + أو الهيكس + فيك + السحب. تحديد حدود مجموعاتهم استخدام قيمها التحقيق 1 (الإعداد: CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD).
   6. تحديد المسخ مقابل قطرات البرية من نوع.
      1. كما أبرز التحليل هو التمييز بين قوالب متحولة و wildtype، تحديد جميع القطرات المتبقية في هذه المرحلة أما واحدة أو الأخرى. نظراً لأن لديهم مشابهة 1 التحقيق القيم، استخدم القيم Probe 2 أفضل التكهن طبيعة كل منهما (إعدادات: ADJUST_BW_MIN و ADJUST_BW_MAX).
   7. تصنيف الآبار كالمسخ مقابل البرية من نوع.
      1. بعد تحديد أي قطرات حساب موت ووزن، وزارة الزراعة والحراجة. باستخدام التردد متحولة وقيمة p المرتبطة لكل بئر، من الممكن أن يصنف لهم (إعدادات: SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ، SIGNIFICANT_P_VALUE) ك WT (تحتوي على الأغلب WT قطرات) أو موت الآبار (التي تحتوي على عدد يعتد به إحصائيا من موت قطرات).
3. استكشاف وتصدير البيانات
   1. استكشاف وتصدير البيانات كعدد قطرات أو القيم المتطرفة، قطرات فارغة، وتركيزات أو الرسوم البيانية التي يمكن تخصيصها المزيد للتمثيل الأمثل.

Representative Results

في دراسة لمفهوم الإثبات، تم التحقيق في كراس إكسون 2 الطفرات (codons 12 و 13) والحذف 19 إكسون EGFR في عينات البلازما من مرضى السرطان باستخدام استراتيجية دبكر الإنزال⁶والأنسجة FFPE.

التحقيق الإنزال كراس استجواب 16 منطقة bp يشمل عدة طفرات في إكسون 2 من الجينات كراس ، التي تأوي أكثر من 95% الطفرات كراس المعروفة في السرطانات البشرية¹¹. التحقيق الإشارة كانت 20 شركة بريتيش بتروليوم في الطول و 3 يقع bp المصب. لتحسين جهودنا المقايسة، قمنا باستخدام الحمض النووي المستخرج من خطوط الخلايا التي تحتوي على 2 الأحماض الأمينية كراس تحور الأكثر شيوعاً: G12V (c.35GT، SW480) و G13D (c.38GA، HCT 116).

والرزن الإنزال EGFR صمم للمسح الضوئي للحذف تفعيل كل من إكسون EGFR 19. المقايسة تستخدم مجس 25 bp طوله الإنزال توضع فوق المنطقة المحذوفة المتكررة إلى جانب تحقيق مرجع من 21 شركة بريتيش بتروليوم، يقع 31 bp المصب في أمبليكون نفسه. لتحسين جهودنا المقايسة، استخدمنا كفدنا مرجع مجموعة موحدة بما في ذلك EGFR إكسون 19 الحذف c.2235_2249del، p.Glu746_Ala750del.

تم تعريفها مع عينات مراقبة موت والحمض النووي WT ببمك كما هو مبين في الشكل 4A حساسية وخصوصية وموقع الغيوم الحبرية كراس. كذلك أثبتنا أن هذا النوع من التحليل يعمل على أنواع متعددة من التعديلات الوراثية مثل استبدال واحد أو عدة استبدالات أو الحذف (الشكل 4) فضلا عن مختلف أنواع العينة⁶.

رقم 1: دبكر الإنزال يتطلب زوج فريدة من نوعها للتحلل اليغو-تحقيقات لفحص جميع الطفرات من منطقة الساخنة. الاعتداء التصاميم مع نتيجة تخطيطي عرض الشكل ثنائي الأبعاد مبعثر مؤامرات تبين كثافة fluorescence الحبرية. (أ) دبكر التقليدية مع المسخ (موت مسبار) والمسابير البرية من نوع (WT مسبار) تستهدف الضبط نفس المنطقة. دبكر (ب) الإنزال يحتوي على مرجع مجس (مسبار 1) التي أنيالس إلى منطقة غير متغيرة والانزال مجس (مسبار 2) استهداف منطقة تحور لكن مكملة لتسلسل WT، داخل amplicon نفس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: الإنزال سير دبكر البلازما الحمض النووي طفرة التنميط. سير العمل كاملة تتكون من 5 خطوات رئيسية: (أ) (1) تصميم أجهزة الإشعال وتحقيقات، (2) تحسين التحليل واستخراج العزلة وكفدنا البلازما (3) (ب)، (4) دبكر تشغيل وتحليل البيانات (5) (ج). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 3: تحليل دبكر الإنزال. الإنزال دبكر تحليل سير العمل تسليط الضوء على المعالم الهامة التي تحتاج إلى صقل. وهذا ما يضمن كفاءة التعرف الآلي القيم المتطرفة، فارغة أو المطر أو قطرات الإيجابية؛ تعيين قطرات موت أو وزن والحوسبة في وزارة الزراعة والحراجة لكل بئر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4: نتائج الممثل- كراس وفحوصات دبكر الإنزال EGFR . مثال (A) من النتائج التي حصل عليها خلال الخطوات الأمثل للمقايسة دبكر الإنزال. كشف المسخ و/أو البرية من نوع الحمض النووي في رد فعل التي تحتوي على الحمض النووي موت 100%، 5% موت الحمض النووي والحمض النووي وزن 100%. (ب) أمثلة على البلازما العينات التي تم تحليلها مع كراس و EGFR دبكر الإنزال فحوصات عرض كشف النوكليوتيدات واحدة وبدائل متعددة في إكسون 2 كراس وحذف في إكسون EGFR 19. وهذا الرقم قد تم تكييفه من ديكران et al. ⁶- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

تصميم مقايسة دبكر الإنزال كفاءة والأمثل الحاسم، والبروتوكول يجب أن تتبع بدقة. وقد كل تركيبة الإشعال والمسابير من كفاءة تفاعل PCR فريدة من نوعها. وهكذا، قد مقايسة فردية سيتم التحقق من عينات مراقبة بعناية قبل استخدامها في عينات اختبار قيمة. الأمثل والتحقق من الصحة مهمة التصديق على الكشف عن إشارة ذروة وتقييم خصوصية وحساسية. كما ورد في البروتوكول، يمكن أن يحتمل أن استجواب جميع الطفرات التي تقع في منطقة هدف تغطيها "المسبار 2". ومع ذلك، يوصي بالتحقق من صحة للطفرات الموجودة في أما 5 '3' غايات أو "المسبار 2"، حيث قد يؤثر ذلك على كفاءة الإنزيم الإنزال.

يمكن تنفيذ الطريقة المعروضة هنا مع الحمض النووي المستخرج من أي نوع من "نسيج"، بما في ذلك فب الأنسجة والخلايا في عينات الدم أو الثقافة. ومع ذلك، نوعية استخراج الحمض النووي يمكن أن تؤثر جذريا نتائج دبكر. وقد بكر مثبطات مثل الهيبارين أو البروتينات، الهيم، الفينول، البروتياز، الكولاجين، الميلانين، والمنظفات أو الأملاح يجب القضاء قدر الإمكان أثناء أخذ العينات وخطوات تنقية. على الرغم من أن يمكن أن تضعف عينات من الحمض النووي الحد من تأثير مثبطات بكر على دبكر، يقلل إضعاف حساسية لأنه سيتم اختبار نسخ أقل من المستهدف في رد فعل. ينبغي أن تؤخذ هذه في الاعتبار عند مستوى معين من الحساسية يمكن التوصل إليه، كما يجب أن يتم اختبار الحد ني نسخ.

يمكن تطبيق دبكر الإنزال إلى عدة أنواع من التعديلات الجزيئية (استبدال النوكليوتيدات واحدة ومتعددة، الحذف، إلخ). وإلى جانب استخدام اثنين فقط من تحقيقات للكشف عن جميع التعديلات (مما يزيد من الطابع العملي والفعالية من حيث التكلفة للفحص)، دبكر الإنزال يولد أقل ضوضاء الخلفية⁶ ويبين زيادة الحساسية مقارنة بفحوصات متعدد. بالإضافة إلى ذلك، نظراً لأنها تتم في رد فعل وحيد، تستهلك كميات ضئيلة من عينات المرضى. جذاباً بشكل خاص في سياق خزعة سائلة هذا التحليل أنه غالباً ما مقدار كتدنا منخفضة في هذه العينات.

والواقع أن الطريقة المعروضة هنا قابلاً للفحص طفرة في المواد السائلة-خزعة وقد أثبتت فائدتها للممارسة السريرية (ESR1 الطفرة الفرز في التجارب السريرية على-1-NCT03079011). ومع ذلك، من الأهمية بمكان استخدام أمبليكونس قصيرة قدر الإمكان في هذا الإعداد بسبب تجزئة كفدنا⁸.

لا يزال يحتاج توصيف المتلقين للمعلومات التي يتعين القيام بها بشكل منفصل لتحديد الطفرة الدقيق بها الآليلات المسخ. ومع ذلك، نظراً لأن القرارات العلاجية تستند أساسا حيث وضع المناطق الساخنة من استهدافها المسرطنة (WT مقابل المسخ)، قدرة دبكر الإنزال على الفور تحديد الطفرات يجعل أداة تشخيصية قوية. وعلاوة على ذلك، لا يلزم الطفرة الدقيق تكون معروفة مسبقاً لتصميم مقايسة تمييزاً للحلول التجارية الحالية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن ضم دبكرس الإنزال مع فحوصات دبكر التقليدية المحددة لزيادة عدد الطفرات فرزهم (البيانات لا تظهر). وأخيراً، يمكن تطبيق دبكر الإنزال إلى مجالات أخرى للبحث. على وجه الخصوص، فإنه يمكن أن تكون أداة مفيدة لفحص المستعمرات الإيجابية في تجارب التحرير الجينوم.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
K2EDTA tube (color code : lavender)	BD	367863	EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol)	Qiagen	55114	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol)	Qiagen	937556	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony SP system	Qiagen	9001297	fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification
QIAvac 24 Plus	Qiagen	19413	For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously
Qubit fluorometer	Invitrogen	Q33226	The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA
QX100 or QX200 reader	Bio-Rad	186-3003 or186-4003, respectively	The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector
QX100 or QX200 droplet generator	Bio-Rad	186-3002 or 186-4002, respectively	Instrument used for droplet generation
C1000 thermal cycler	Bio-Rad	1851196	Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module
Plate sealer	Bio-Rad	181-4000	PX1™ PCR plate sealer
DG8 cartridge holder	Bio-Rad	186-3051	Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation
Droplet generator cartridges and gaskets	Bio-Rad	186-4007	Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation
PCR supermix	Bio-Rad	186-3010	ddPCR supermix for probes (no dUTP)
96-well PCR plates	Eppendorf	951020362	96-well semi-skirted plates
Foil seal	Bio-Rad	181-4040	Pierceable foil heat seal
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	oil used in the read
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	186-3005	oil for droplet generation
DNA loBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	0030 108.051	Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding
Multiplex I cfDNA Reference Standard Set	HORIZON	HD780	The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations
QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500	Life Technologies	Q32854	The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL
Qubit Assay Tubes	Life Technologies	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer