Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um mehrere genetische Veränderungen der Zielregion in einer einzelnen Reaktion mit Drop-off-DdPCR und ein einzigartiges paar Hydrolyse Sonden genau zu quantifizieren.

Abstract

Droplet digitale Polymerase-Kettenreaktion (DdPCR) ist eine hochempfindliche quantitative Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Methode basiert auf Probe Fraktionierung in Tausende von nanogrösse Wasser-in-Öl-individuelle Reaktionen. Vor kurzem, ist eines der genauesten und sensible Instrumente für zirkulierenden Tumor DNA (CtDNA) Erkennung DdPCR geworden. Die wesentlichen Einschränkungen der standard DdPCR-Technik gehört die begrenzte Anzahl von Mutationen, die pro Reaktion gezeigt werden kann als spezifische Hydrolyse Sonden erkennen jede mögliche Allele Version erforderlich sind. Eine alternative Methode, die Drop-off-DdPCR erhöht den Durchsatz, da es nur ein einzelnes Paar von Sonden erfordert zu erkennen und zu quantifizieren, potenziell alle genetische Veränderungen in der gezielten Region. Drop-off-DdPCR zeigt vergleichbare Sensitivität zu konventionellen DdPCR Assays mit dem Vorteil eine größere Anzahl von Mutationen in einer einzelnen Reaktion zu erkennen. Es ist kostengünstig, schont wertvolle Probenmaterial und kann auch als ein Discovery-Tool verwendet werden, wenn Mutationen kein-prioribekannt sind.

Introduction

Tausende von somatischen Mutationen, die im Zusammenhang mit Krebsentstehung wurden berichtet¹. Unter diesen sind einige prädiktive Marker für die Wirksamkeit der gezielten Therapie ^2,3 und genetisches screening dieser Mutationen ist jetzt klinischen Routine. Tröpfchen-Digitaltechnik-PCR (DdPCR) verwendet werden, um das Vorhandensein oder das Fehlen von Mutationen mit hoher Erkennungsgenauigkeit zu überwachen und ist sehr kompatibel mit nicht-invasiven flüssigen Biopsien^4,5. Aktuelle DdPCR Assays sind jedoch in erster Linie Mutationen bekannt a-priorizu erkennen. Dies schränkt die Verwendung von DdPCR als ein Discovery-Tool die Mutation ist nicht bekannt. In der Tat konkurriert in der konventionellen DdPCR Design, eine Hydrolyse-Sonde erkennt das Wildtyp Allel (WT-Sonde) mit einer speziellen Sonde erkennen die mutierten Allels (MUT-Sonde) (Abbildung 1A). Sonde mit höherer Affinität zur Vorlage hybridisiert und veröffentlicht seine Fluorophor, unter Angabe der Art des entsprechenden Allels. Die Fluoreszenz Daten für jedes Tröpfchen können in einem Streudiagramm repräsentieren die Fluoreszenz emittiert durch den WT und MUT Sonden in verschiedenen Dimensionen visualisiert werden. Eine schematische Darstellung der ein typisches Ergebnis für einen herkömmlichen DdPCR-Assay ist in Figur 1Apräsentiert. In diesem Beispiel entspricht die Blaue Wolke Tröpfchen mit WT Allele identifiziert durch die WT-Sonde, während die rote Wolke Tröpfchen entspricht in der MUT-Allel verstärkt und durch die MUT-Sonde identifiziert. Abhängig von der Menge der DNA in der Reaktion geladen können doppelte positive Tröpfchen mit WT und MUT Amplifikate (grüne Wolke) angezeigt werden. Die helle graue Wolke entspricht leer Tröpfchen.

Da die meisten Plattformen für den Nachweis von einer begrenzten Anzahl von Fluorophore (in der Regel 2, aber bis zu 5) ermöglichen, ist Durchsatz von konventionellen DdPCR begrenzt. Daher erfordert die Ausrichtung auf Regionen mit mehreren angrenzenden Mutationen Design von technisch anspruchsvollen multiplex DdPCR Assays oder die Verwendung von mehreren Reaktionen auf jede Mutation parallel. Die Drop-off-DdPCR-Strategie, überwindet diese Einschränkung, da es möglicherweise genetische Veränderung innerhalb einer Zielregion mit einer einzigartigen WT Hydrolyse Sonden erkennen kann. Die erste Sonde (Sonde 1) Abdeckungen ist eine nicht-Variablen Sequenz, angrenzend an die Zielregion und die zweite Sonde (Sonde 2) Ergänzend zu der WT-Sequenz der Zielregion wo Mutationen sind zu erwarten (Abbildung 1 b). Während die erste Sonde den Gesamtbetrag der amplifiable Moleküle in der Reaktion quantifiziert, diskriminiert die zweite Sonde WT und MUT Allele durch suboptimale Hybridisierung auf mutierte Sequenzen. Fühler 2 kann mehrere Arten von Mutationen in der Ziel-Region (einzelne oder mehrere Nukleotid Substitutionen, löschen, etc.)-⁶identifizieren. Wie bei konventionellen DdPCR entspricht die helle graue Wolke Tröpfchen enthalten keine DNA-Moleküle. Es ist wichtig, daran zu erinnern, dass bei dieser Art des Tests, optimale Trennung von WT und MUT Wolken abhängig von der Menge der DNA geladen in der Reaktion ist, da Tröpfchen mit WT und MUT Ziel Allele von Tröpfchen enthalten nur das WT nicht zu unterscheiden Form. Dieser Test erfordert daher, dass die meisten Tropfen nicht mehr als eine Kopie des Gens gezielte enthalten.

Protocol

Die hier vorgestellten Protokoll folgt den Ethikrichtlinien des Institut Curie. Alle menschlichen Proben stammen von Patienten, nach Einwilligung in Studien von Institutional Review Board am Institut Curie genehmigt.

(1) Blut Sammlung, Plasma Speicherung und zellfreie DNA-Extraktion

Hinweis: Bei jeder Art von "Gewebe" extrahierte DNA verwendet werden (z. B. frisch oder Formaldehyd-feste Paraffin eingebettet (FFPE) Gewebe, Zellen in Kultur oder Blutproben). Hier bieten wir detaillierte Anweisungen für die Blutentnahme, Plasma isoliert und Lagerung und zellfreie DNA (Blut) Extraktion.

1. Blut-Sammlung und Plasma Lagerung (Abb. 2 b( )
   1. Blutproben in 7 mL EDTA Röhrchen zu sammeln. Zwei Röhren sollten etwa 4 mL Plasma zu sammeln.
   2. Zentrifugieren Sie die Rohre für 10 min bei 820 X g innerhalb von 3 h von der Blutentnahme, Erythrozyten (RBC), weißen Blutkörperchen (WBC) und Plasma zu trennen. Die Zeitspanne zwischen der Probenahme und der Zentrifugation ist entscheidend für qualitativ hochwertige Blut (d.h. Blut nicht verunreinigt mit DNA vom WBC) zu erhalten.
   3. Pipettieren Sie sorgfältig den überstand (Plasma) mit einer 1 mL pipettieren ohne Berührung der WBC-Schicht; etwa 2 mL Plasma werden in der Regel pro EDTA-Röhrchen wiederhergestellt.
   4. Übertragen Sie das Plasma auf 2 mL-Tuben und Zentrifugieren Sie der Aliquote bei 16.000 X g für 10 min bei 15 ° C, Zelle Ablagerungen zu entfernen.
   5. Sorgfältig den überstand (Plasma) ohne zu stören das Pellet pipettieren. Das Plasma in 2 mL Kryo Röhrchen zu verteilen und speichern bei-80 ° C bis benötigt.
2. Blut Extraktion (Abb. 2 b)
   Hinweis: Hier präsentieren wir Ihnen das Verfahren mit manuelle Extraktion Kit. Eine automatisierte Version nach den Anweisungen des Herstellers kann auch Blut isoliert durchgeführt werden.
   1. Genommen Sie 400 µL Proteinase K in ein 50 mL-Tube. Fügen Sie 4 mL Plasma (Volumen routinemäßig verwendet) und 3,2 mL Lyse Puffer ACL (mit 1,0 µg Träger RNA hinzu) aus dem Kit. Das Röhrchen verschließen und Mischen von Vortexen für 30 s, eine homogene Lösung zu erhalten. Bei 60 ° C für 30 min inkubieren.
   2. Fügen Sie 7,2 mL Puffer ACB hinzu (aus dem Kit) lysate optimieren die Bindung der zirkulierenden Nukleinsäuren, die Kieselsäure-Membran und Mischen von Vortexen für 15-30 s. Inkubation der Röhre für 5 min auf Eis.
   3. Legen Sie die Spalte und den 20 mL-Extender in die Vakuumpumpe. Schließen Sie die nicht verwendeten Positionen um Vakuum Aspiration zu ermöglichen.
   4. Übernehmen Sie sorgfältig die lysate Puffer ACB Mischung in der Röhre-Extender (kurz Zentrifugieren der Röhre, das Maximum der lysate Puffer ACB Mischung zu sammeln), die Vakuumpumpe einschalten und warten die lysate durch die Spalten komplett gezeichnet werden. Entfernen und entsorgen des Rohr-Extenders.
   5. Die Spalte 600 µL Puffer ACW1 zuweisen. Wenn Puffer ACW1 durch die Spalte gezogen hat, fügen Sie 750 µL Buffer ACW2 und schließlich fügen Sie 750 µL Ethanol (96 – 100 %). Legen Sie dann die Spalte, in einer sauberen 2 mL sammelröhrchen und Zentrifuge mit voller Geschwindigkeit (20.000 X g) für 3 min, Ethanol zu beseitigen.
   6. Legen Sie die Spalte in eine neue 2 mL sammelröhrchen. Öffnen Sie den Deckel und inkubieren Sie bei 56 ° C für 10 min die Membran vollständig trocknen.
   7. Setzen Sie die Säule in eine saubere 1,5 mL DNA niedrige Bindung Rohr. Gelten Sie sorgfältig 36 µL RNase-freies Wasser mit 0,04 % Natriumazid (Puffer AVE). Den Deckel schließen und bei Raumtemperatur 3 min inkubieren.
   8. Zentrifugieren Sie auf Hochtouren (20.000 X g) für 1 min zum eluieren Nukleinsäuren und Lagerung bei-20 ° C bis benötigt.
3. Blut-Quantifizierung
   Hinweis: Blut Quantifizierung erfolgt mit einem Fluorometer mit der Hersteller-Protokoll unmittelbar nach Extraktion oder Auftauen der Proben bei Raumtemperatur (RT), vor dem Gebrauch. Vermeiden Sie mehrere Frost/Tau-Zyklen.
   1. Verwenden des hochempfindlichen Tests nach der erwarteten Blut-Menge, die in der Regel weniger als 100 ng/mL Plasma. Blut-Konzentrationen können reichen von 2 – 10 ng/mL für gesunden Spendern jedoch so hoch wie 100 ng/mL bei Patienten mit metastasierten Erkrankung.
   2. Alle Reagenzien sind bei RT und mischen 199 µL Fluorometer Verdünnungspuffer mit 1 µL Farbstoff (200 X) pro Reaktion (N Anzahl der Proben + 2 Normen der Fluorometer kalibrieren) zu gewährleisten, eine funktionierende Lösung zu erhalten.
   3. Wirbel die Blut-Lösung gründlich auf Homogenität zu gewährleisten und kurz Zentrifugieren, um Inhalte an der Unterseite des Rohres zu sammeln.
   4. Mix 5 µL jeder Blut-Probe mit 195 µL der Arbeitslösung.
   5. Mischung 10 µL jeder Norm mit 190 µL der Arbeitslösung.
   6. Vortex gründlich alle Rohre für 2 – 3 s Homogenität zu gewährleisten und kurz Zentrifugieren, um Inhalte an der Unterseite der Rohre zu sammeln.
   7. 2 min im Dunkeln bei RT inkubieren.
   8. Lesen die Rohre in die Fluorometer, Ausgabemodus mit der ng/µL
   9. Die Endkonzentration in ng/mL Plasma wie folgt zu berechnen: ng/µL X 36 (Volumen von Blut Eluat) / 4 (Volumen von Plasma extrahiert).

2. DdPCR Sonde und besser gekleideteres Design (Abbildung 2A)

Hinweis: Die Verstärkung der gezielten Moleküle in der Drop-off-DdPCR-Assay folgt ähnliche Prinzipien der qPCR. Jedes Primer und Sonde ist mit der herkömmlichen dedizierte Software Primer3⁷ (http://primer3.ut.ee/) entwickelt.

1. Besser gekleideteres design
   1. Im Fenster "Allgemeine Einstellungen" ändern Sie "Konzentration von zweiwertigen kationen" auf 3.8, "Konzentration von dNTPs" 0,8 und "Mispriming/Repeat Bibliothek" für den richtigen Organismus.
   2. Im Fenster Einstellungen voraus ändern Sie die "Tabelle der thermodynamischen Parameter" und "Salzkonzentration Formel" in Santa Lucia 1998.
   3. Wählen Sie eine T_m zwischen 55 und 70 ° C (mit 50 mM für Salzkonzentration und 300 nM für Oligonukleotid-Konzentration).
   4. Überprüfen Sie die Besonderheit der Primer mit Tools wie PrimerBlast.
   5. Vermeiden Sie Regionen, die Sekundärstrukturen haben.
   6. Wählen Sie eine Sequenz, die einen GC-Gehalt von 50 – 60 % hat.
   7. Vermeiden Sie Wiederholungen von Gs und Cs länger als 3 Basen.
   8. Primer mit Gs und Cs an ihrem 3' Ende wenn möglich zu wählen.
   9. Sicherstellen Sie, dass 3' Enden der gekoppelten Zündkapseln keinen signifikanten Komplementarität, Primer-Dimere zu vermeiden. Amplifikate sollte kleiner sein als 150 bp Blut effizient zu verstärken (meine Größe beträgt 170 bp⁸) und DNA extrahiert aus FFPE, die oft fragmentiert ist.
2. Sonde-design
   Hinweis: Hydrolyse-Sonden sind mit einem fluoreszierenden Reporter am 5'-Ende und ein Quencher am 3'-Ende beschriftet. Sie bieten hohen Spezifität, hohes Signal-Rausch-Verhältnis und ermöglichen Multiplexen, wenn nötig. Zweikanal-Droplet-Leser sind kompatibel mit FAM und HEX oder VIC Farbstoffe sowie Analyse der FAM/HEX oder FAM/VIC Sonden gekoppelt.
   1. Gestalten Sie Hydrolyse Sonden komplementär zu der WT-Sequenz von der Zielregion und der angrenzenden Region nicht variabel.
   2. Wählen Sie die Sonden, die beide innerhalb der Amplifikate definiert durch die zuvor entwarf Primerpaar gelegen. Primer-Sequenzen können nicht mit der Sonde Sequenzen überlappen, obwohl sie nebeneinander sitzen können.
   3. Wählen Sie den Strang, der hat mehr Cs als Gs. Sonden einen GC-Gehalt von 30-80 % haben müssen.
   4. Wählen Sie die Sonden, die zwischen 13 und 30 Nukleotide in der Länge sind. Längere Sonden sind in der Regel höhere Hintergrundfluoreszenz angezeigt weil der Abstand zwischen der Fluorophor und der Quencher beeinflusst abschrecken der Fluorophor-Reporter.
   5. Wählen Sie T_m der Sonden zu 3 bis 10 ° C höher als die T-_m der Primer, Sonde Hydrolyse während Grundierung glühen und Erweiterung zu gewährleisten. T_m Enhancer werden empfohlen, um die erforderlichen T-_m zu erreichen, und dabei die Sonde kurz, als kürzere Sonden effizienter Einzel-Nukleotid-Varianten unterscheiden. Sonden sollten keine G am 5'-Ende haben, weil dies das Fluoreszenzsignal auch nach Hydrolyse stillt.
   6. Entwerfen Sie Drop-off-Sonden wie folgt: 5'-(VIC) -komplementäre WT-Sequenz der mutierten Region-(MGB NFQ)-3' und Referenz als probe: 5'-(6-FAM) -komplementäre Sequenz einer Region nicht variabler-(MGB NFQ)-3 ". Andere Kombinationen von Reporter/Durstlöscher sind ebenfalls möglich.

(3) Optimierung der DdPCR Reaktion (Abbildung 2A)

Hinweis: Wildtyp und mutierte DNA-Steuerelemente in diesem Schritt können Zelllinien, tumorproben oder im Handel erhältlichen DNA Referenzstandards, zum Beispiel entnommen werden.

1. Führen Sie eine konventionelle PCR auf einem Thermocycler mit der thermischen Gradienten Funktion um die Spezifität der PCR-Produktes durch die Primer entwickelt, verstärkt zu überprüfen.
   1. Bereiten Sie eine einzigartige Mischung der PCR-Reaktion, wie unten beschrieben in Schritt 4.1 (ohne Sonden) auf einer Steuerelementvorlage Wildtyp DNA für ein Minimum von 8 Reaktionen auf mindestens eine Reaktion pro Temperatur haben.
   2. Führen Sie die Verstärkung mit Hilfe des Programms am Schritt 4.3.2 und eine Reihe von annealing Temperaturen um die theoretische Anlasstemperatur der Primer beschrieben.
   3. Laden Sie PCR-Produkte auf einem 3 % Agarosegel für Glühen Temperaturen, die Bereitstellung von bestimmter Produkten auswählen.
2. Führen Sie eine Reihe von Drop-off-DdPCRs mit den oben beschriebenen Parametern, aber dieses Mal, einschließlich beide Sonden.
   1. Verwenden Sie 100 % WT DNA, DNA-100 % MUT und eine Mischung von WT und MUT DNA (z. B. 50 % MUT/50% WT) die besten Voraussetzungen für klare Trennung von WT und MUT Tröpfchen Wolken bestimmen.
   2. Wählen Sie eine Reihe von annealing Temperaturen oberhalb der Temperatur in Schritt 4.1 ausgewählt.
   3. Wählen Sie die Anlasstemperatur ermöglicht eine spezifische Erkennung des WT oder MUT Signale bei Verwendung von 100 % WT DNA oder 100 % MUT DNA und beste Trennung von WT und MUT Tröpfchen Wolken.
   4. Glühen Zeit und Primer/Sonden-Konzentrationen kann auch Trennung von Wolken zu verbessern und verringern Sie die Anzahl der Tröpfchen mit mittleren Fluoreszenz (Regen-Effekt) eingestellt werden.
3. Bewerten der Hintergrund oder die Begrenzung des Rohlings (LOB) des Tests.
   1. Führen Sie mindestens 48 einzelne Drop-off DdPCR Reaktionen mit einem WT-Steuerelement DNA mit dem glühen Parameter und Primer/Sonden-Konzentrationen in 3.2 gewählt.
   2. Für jede Reaktion, berechnen Sie die Frequenz des mutierten Allels (MAF) wie folgt: (Anzahl der mutierten Tröpfchen/Anzahl der gefüllten Tröpfchen) X 100.
      Hinweis: Das LOB ist definiert als der falsch-positiven MAF Mittelwert und verbundenen SD, aus denen das 95 %-Konfidenzintervall (95 % CI) berechnet. LOB (Mittelwert von falsch-positiven MAF) = + 95 % CI.
4. Bewerten der Nachweisgrenze (LOD) des Tests.
   1. Führen Sie Drop-off DdPCR Reaktionen durch Verdünnungsreihen MUT DNA in WT-DNA mit MAFs von 5 % bis 0,01 % (≥ 8 Wiederholungen pro Zustand). Verwenden Sie glühen Parameter und Primer/Sonden Konzentrationen in 3.2 gewählt.
      Hinweis: Die Detailgenauigkeit ist definiert als die kleinste MAF-Werte für die vorliegende Mittelwerte und SD über das LOB repliziert (siehe Decraene Et Al. ⁶ Weitere Informationen).

4. DdPCR Protokoll (Abb. 2 b)

Hinweis: Ähnlich wie bei konventionellen DdPCR, die Drop-off-DdPCR-Protokoll besteht aus 4 Schritten: (i) PCR zu mischen, Vorbereitung, (Ii) Tröpfchen Erzeugung, (Iii) PCR-Amplifikation und (iv) Datenerfassung.

1. PCR-eismixherstellung
   1. Befolgen Sie die üblichen Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen von Handschuhen, mit einer sauberen PCR-Haube, sauber Pipetten und RNase, DNase-freie destilliertes Wasser um Kontaminationen zu vermeiden.
   2. Auftauen und equilibrate der reaktionskomponenten bei RT
   3. Bereiten Sie 20 x Primer/Sonden-Mix in destilliertem Wasser mit Primer bei 18 µM und Sonden bei 5 µM.
   4. Bereiten Sie für alle einzelnen PCR-Reaktionen eine Probe-Mischung durch die Kombination von 2 X ddPCR Supermix (10 μl) 1 µL 20 x Primer/Sonden Mischung und bis zu 10 ng DNA Probe Qsp 20 µL destilliertes Wasser.
   5. Wirbel die Reaktion gründlich mischen, um Homogenität zu gewährleisten und kurz Zentrifugieren, um Inhalte an der Unterseite des Rohres vor der Abgabe zu sammeln. Zögern Sie nicht, diesen Schritt für jede Reaktion Mischung vor dem Gebrauch zu wiederholen.
2. Tröpfchen-generation
   1. Legen Sie die DdPCR Patrone in die Halterung und Laden 20 μL Reaktion-Mix mit Proben in der mittleren Bohrungen der Patrone für Tröpfchen Generation (grüne Positionen in Abbildung 2 b) mit einer 8-Kanal-Pipette.
   2. Fügen Sie 70 μL Tröpfchen Generator Öl in die unteren Brunnen (gelbe Positionen).
   3. Legen Sie die Patrone mit einer Dichtung in die tropfengenerators; Tropfen werden in den oberen Vertiefungen der Patrone (blaue Positionen) produziert.
   4. Aspirieren und langsam und sanft zu verzichten (zur Vermeidung von Scheren) 40 μL der Tröpfchen von den Patronen in eine 96-Well-PCR-Platte. Verwenden Sie eine Multi-Kanal-Pipette, um die Übertragung der Tröpfchen zu optimieren.
3. PCR-Amplifikation
   1. Versiegeln Sie die endgültige PCR-Platte mit einer Alu-Folie mit einer Platte Versiegelung sofort nach der Übertragung Tröpfchen um Verdunstung zu vermeiden. Zentrifugieren Sie kurz die Platte, um Inhalte an der Unterseite der Brunnen zu sammeln.
   2. Führen Sie eine konventionelle PCR-Amplifikation auf einem Thermocycler mit dem folgenden Programm: 95 ° C 10 min, 40 Zyklen von [94 ° C 30 s, validiert glühen T ° für 60 s], 98 ° C 10 min (Rampe 2,5 ° C/s). Enthalten Sie Steuerelemente ohne Eingabe DNA und Wildtyp-DNA (≥3 Wiederholungen) in jedem Lauf.
   3. Nach Abschluss die Ausführung kurz Zentrifugieren Sie die Platte, um Inhalte an der Unterseite der Brunnen zu sammeln.
4. Die Datenerfassung
   1. Verwenden Sie nach der PCR-Amplifikation den Tröpfchen Reader zu zählen PCR-positiv und PCR-negativ Tröpfchen, nach den Anweisungen des Herstellers.
      Hinweis: Die Tröpfchen-Leser bietet in der Regel eine Zweifarben-optische Detektionssystem mit FAM, VIC oder HEX Fluorophore kompatibel.

(5) Datenanalyse (Abbildung 2 und Abbildung 3)

Hinweis: PCR-positiv und PCR-negativ Tröpfchen gezählt werden, um eine absolute Quantifizierung von dem MUT und der WT-Allele bei der gezielten Region bieten. Die zugewiesenen Tröpfchen werden verwendet, um die MAF in jede Vertiefung zu berechnen. Droplet Quantifizierung und Analyse der Drop-off, die Tests ausgeführt werden können, mit dem DdPCR R-Paket (https://github.com/daattali/ddpcr) von Attali und Kollegen^9,10entwickelt. Diese R-Paket klassifiziert automatisch Tröpfchen als leer, Teil von "Rain" (aufgrund der ineffizienten Verstärkung) oder als gefüllt mit ein wirklich positives Signal (Abbildung 3). Der folgende Abschnitt präsentiert die verschiedenen Schritte der Analyse ist eine kurze Version der beschreibenden Vignette des Algorithmus geschrieben von den Autoren (siehe https://github.com/daattali/ddpcr/blob/master/vignettes/-Algorithmus. RMD für weitere Details). Daten werden in Dateien durch Kommas getrennte Werte (FileName_Amplitude.csv) exportiert und in das DdPCR-Paket direkt in R oder über die dedizierte Web-Schnittstelle analysiert werden hochgeladen.

1. Parametereinstellungen
   Hinweis: Jedes Drop-off-Test-Design führt zu spezifischen letzte Tröpfchen Distributionen und Variationen in der Cloud, Trennungen oder Positionen ist zu rechnen. Um effiziente automatisierte Analyse zu gewährleisten, muss eine Reihe von Parametern angepasst werden. Wenn eine gut eine unerwartete Profil aufweist, könnte es die Analyse der gesamten Platte zum Scheitern verurteilt, verursachen, was zu einer Fehlermeldung. Die Problematik haben gut erkannt und die automatisierte Analyse entnommen werden.
   1. Fehlgeschlagene Brunnen mit (REMOVE_FAILURES) zu identifizieren. Verwenden Sie TOTAL_DROPS_T (Standardwert ist 5.000), die minimale Anzahl von Tropfen in jedes gut anzupassen. Verwenden Sie EMPTY_LAMBDA_LOW_T (Standardwert ist 0,3) und EMPTY_LAMBDA_HIGH_T (Standardwert ist 0,99) die Metriken anpassen, die die erwarteten Tröpfchen Wolken (leer, MUT, WT) zu bewerten und deren Qualität.
      Hinweis: Nachdem zu viele leere Tröpfchen ist ein Zeichen, dass es nicht genug amplifiable Vorlage in der Reaktion.
   2. Ausreißer-Tropfen verwenden (REMOVE_OUTLIERS) zu identifizieren. Verwenden Sie TOP_PERCENT (Standardwert ist p = 1 %), den obersten p Prozent Tröpfchen mit dem höchsten Signalwert in jeder Dimension Signal (FAM, VIC/HEX) aus Tröpfchen in die gesamte Platte anzupassen. Verwenden Sie CUTOFF_IQR (Standard ist 5) die Ausreißer Schwelle den p % der höchsten Signal einstellen.
   3. Leere Tropfen verwenden (REMOVE_EMPTY) zu identifizieren. Verwenden Sie CUTOFF_SD (Standardwert ist 7), die Standardabweichung der untere (leere Tröpfchen) Gauß-Verteilung der Sonde 1 Werte anzupassen.
   4. Tor-Tröpfchen (KLASSIFIZIEREN) verwenden. Verwenden Sie CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD (Standardwert ist 3), die Standardabweichung der höheren (gefüllte Tröpfchen) Gauß-Verteilung der Sonde 1 Werte anzupassen. Verwenden Sie ADJUST_BW_MIN (Standard ist 4) und ADJUST_BW_MAX (Standard ist 20), passen die Parameter K_min und K_max um die Kernel-Dichte der Probe 2 Werte zu schätzen und den MUT und die WT-Wolke Tröpfchen zu diskriminieren.
      1. Verwenden Sie SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ (Standardwert ist p = 1 %) und SIGNIFICANT_P_VALUE (Standard ist Signifikanzniveau s=0.01%) Brunnen als Mutant oder Wildtyp zu klassifizieren.
         Hinweis: In diesem Algorithmus ist eine Mutante gut definiert als ein MAF, die statistisch signifikant höher als p %.
2. Automatisierte Analyse
   Hinweis: Für jeden Parameter in diesem Abschnitt dargestellt, haben die Autoren der DdPCR R-Paket vorgeschlagenen Standardwerte basierend auf ihrem Know-how und ihrer Daten. Alle Parameter können jedoch geändert werden, erhöhen die Qualität der Analyse (Abbildung 3).
   1. Fehlgeschlagene Brunnen zu identifizieren.
      1. Verwenden Sie vier Qualitätskontrolle Metriken (Einstellungen: REMOVE_FAILURES) zu identifizieren, fehlgeschlagene Brunnen; die erste ist die minimale Anzahl von Tropfen, die ein Brunnen enthalten sollte. Die anderen drei im Fokus identifizieren gültiger Kandidat Populationen für leer, möglicherweise FAM + und HEX + / VIC + Tröpfchen. Entfernen Sie Brunnen, die diese Kriterien aus nachgelagerten Analyse nicht einhalten.
   2. Die Tröpfchen Ausreißer zu identifizieren.
      1. Um zu vermeiden, neigen Tröpfchen gating, entfernen Ausreißer (z.B. Tröpfchen mit einem ungewöhnlich hohen HEX/VIC oder FAM-Wert) von der weiteren Analyse durch einen Schwellenwert für die obere Grenze festlegen (Einstellungen: REMOVE_OUTLIERS).
   3. Leere Tröpfchen zu identifizieren.
      1. Identifizieren Sie leere Tropfen um die Dimension der Daten zu reduzieren (in einem typischen gut, sie werden machen den größten Teil der Tröpfchen) und statistische Verzerrung aufgrund der Präsenz eines großen Teils von nutzlosen Informationen zu beseitigen, als Vorlage enthält nur Tröpfchen bleiben () Einstellungen: REMOVE_EMPTY).
   4. Durchführen Sie Droplet Anspritzung.
      1. Die restlichen Tropfen als Mutant, Wildtyp oder Regen zu klassifizieren (Einstellungen: KLASSIFIZIEREN).
   5. Regen-Tropfen zu identifizieren.
      1. Da Regen Tröpfchen durch ineffiziente Verstärkung entstehen, schließen von FAM + oder HEX + / VIC + Wolken. Bestimmen Sie die Grenzen ihrer Cluster mit ihrer Sonde 1-Werten (Einstellung: CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD).
   6. Mutant im Vergleich zu Wildtyp Tröpfchen zu identifizieren.
      1. Das Highlight der Analyse Diskriminierung zwischen Mutanten und Wildtyp Vorlagen ist, welche alle restlichen Tröpfchen zu diesem Zeitpunkt als eine oder die andere. Da sie ähnliche Probe 1 Werte haben sollten, Sonde 2 Werte verwenden, um ihre jeweiligen Natur am besten Vorhersagen (Einstellungen: ADJUST_BW_MIN und ADJUST_BW_MAX).
   7. Brunnen als Mutant im Vergleich zu Wildtyp klassifizieren.
      1. Nach der Bestimmung, welche Tropfen sind berechnen MUT und WT, die MAF. Mit der Mutantenhäufigkeit und zugehörige p-Wert von jedem gut, es ist möglich, sie zu klassifizieren (Einstellungen: SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ, SIGNIFICANT_P_VALUE) als WT (mit meist WT Tröpfchen) oder MUT Brunnen (mit einer statistisch signifikanten Anzahl von MUT Tröpfchen).
3. Erkunden Sie und exportieren Sie die Daten
   1. Erkunden Sie und exportieren Sie die Daten als Anzahl der Tröpfchen, Ausreißer, leere Tropfen, Konzentrationen oder Grafiken, die für optimale Darstellung weiter angepasst werden können.

Representative Results

In einem Proof-of-Concept-Studie wurden KRAS Exon 2 Mutationen (Codon 12 und 13) und EGFR Exon 19 Löschungen in FFPE Gewebe und Plasma-Proben von Krebspatienten mit der Drop-off DdPCR Strategie⁶untersucht.

Die KRAS -Drop-off-Sonde verhört einen 16 bp-Region umfasst mehrere Mutationen im Exon 2 des KRAS -Gens, die mehr als 95 % der bekannten KRAS -Mutationen in menschlichen Krebserkrankungen¹¹beherbergen. Die Referenz-Sonde war 20 bp in der Länge und liegt 3 bp stromabwärts. Zur Optimierung unserer Assay verwendet wir aus Zell-Linien mit 2 der am häufigsten mutierten KRAS Aminosäuren extrahierte DNA: G12V (c.35GT, SW480) und G13D (c.38GA, HCT-116).

Der EGFR -Drop-off-Test wurde entwickelt, um für alle aktivierenden Streichungen von EGFR Exon 19 scannen. Der Assay verwendet eine 25 bp-Long Drop-off-Sonde platziert über die wiederkehrende gelöschten Region zusammen mit einem Referenzfühler 21 bp, befindet sich 31 bp stromabwärts in der gleichen Amplikons. Um unsere Assay zu optimieren, verwendeten wir ein Blut Referenz-standard-Set inklusive der EGFR Exon 19 Löschung c.2235_2249del, p.Glu746_Ala750del.

Sensitivität, Spezifität und Ort der Tröpfchen Wolken wurden mit Kontrollproben MUT und WT PBMC genomischer DNA wie in Abbildung 4A für KRAS definiert. Wir zeigten weiter, dass diese Art des Tests auf mehrere Arten von genetischen Veränderungen wie einzelne Ersetzung, mehrere Ersetzungen oder Löschungen (Abbildung 4 b) sowie auf verschiedene Probe Typen⁶funktioniert.

Abbildung 1: die Drop-off-DdPCR erfordert ein einzigartiges paar von Hydrolyse Oligo-Sonden alle Mutationen einen Hotspot-Bereich Scannen. Assay Designs mit einem schematischen Ergebnis als zweidimensionale Streuung zeigt Tröpfchen Fluoreszenzintensität Grundstücke angezeigt. (A) konventionelle DdPCR mit Mutant (MUT-Sonde) und Wildtyp (WT-Sonde) Sonden die exakt gleichen Region. (B) die Drop-off DdPCR enthält eine Referenz-Sonde (Sonde 1), die zu einer nicht-Variable Region glüht und Drop-off-Sonde (Sonde 2) die mutierten Region aber ergänzend zu der WT-Sequenz innerhalb der gleichen Amplikons. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Drop-off DdPCR Workflow für Plasma DNA-Mutation profiling. Der vollständigen Workflow besteht aus 5 großen Schritten: (A) (1) Design der Primer und Sonden, (2) Optimierung der Assay, (B) (3) Plasma isoliert und Blut Extraktion, (4) DdPCR laufen und (C) (5) Datenanalyse. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: Drop-off-DdPCR Analyse. Drop-off-DdPCR Analyse Workflow Hervorhebung wichtiger Parameter, die optimiert werden müssen. Dies sorgt für effiziente automatisierte Identifikation von Ausreißern, leer, Regen oder positive Tröpfchen; Zuweisen von MUT oder WT Tröpfchen und computing MAF für jedes gut. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse - KRAS und EGFR -Drop-off-DdPCR-Assays. (A) Beispiel für Ergebnisse während Optimierungsschritte des Drop-off DdPCR Assays erhalten. Erkennung von Mutant/Wildtyp DNA in einer Reaktion mit 100 % MUT DNA, 5 % MUT DNA und DNA-100 % WT oder. (B) Beispiele für Plasma-Proben analysiert mit KRAS und die EGFR Drop-off DdPCR Proben zeigen die Erkennung von Einzel-Nukleotid und mehrere Ersetzungen im Exon 2 von KRAS und eine Deletion im EGFR Exon 19. Diese Zahl wurde angepasst von Decraene Et al. ⁶. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Um eine effiziente Drop-off-DdPCR-Assay zu entwerfen, Optimierung ist entscheidend, und das Protokoll muss sorgfältig beachtet werden. Jede Kombination von Primer und Sonden hat eine einzigartige Effizienz der PCR-Reaktion. So hat eine einzelne Probe sorgfältig auf Kontrollproben überprüft werden, bevor Sie auf wertvolle Proben verwendet wird. Optimierung und Validierung sind wichtig zur Zertifizierung Peak Signalerkennung und Spezifität und Sensitivität zu beurteilen. Wie im Protokoll beschrieben, können potenziell alle Mutationen befindet sich in einer Zielregion fallenden "Sonde 2" abgefragt werden. Dennoch empfiehlt sich die Validierung für Mutationen am 5' oder 3'-Enden der "Sonde 2", da diese die Effizienz der Drop-off-Test beeinflussen können.

Die hier vorgestellte Methode kann mit DNA extrahiert aus jeder Art von "Gewebe", einschließlich FFPE Gewebe, Zellen in Kultur oder Blutproben durchgeführt werden. Allerdings kann die Qualität der Nukleinsäure-Extraktion DdPCR Ergebnisse dramatisch auswirken. PCR-Inhibitoren wie z. B. Heparin, Proteine, Häm, Phenol, Proteasen, Kollagen, Melanin, Reinigungsmittel oder Salze müssen während der Probenahme und der Reinigungsschritte so weit wie möglich beseitigt werden. Obwohl DNA-Proben verdünnt werden können, um die Auswirkungen von PCR-Inhibitoren auf die DdPCR zu reduzieren, verringert Verdünnung Empfindlichkeit, weil weniger Exemplare des Ziels pro Reaktion getestet werden. Dies sollte berücksichtigt werden wenn ein gewisses Maß an Sensibilität erreicht werden soll, da ein Minimum von Kopien muss getestet werden.

Drop-off-DdPCR kann auf viele Arten von molekulare Veränderungen (einzelne und mehrere Nukleotid Substitutionen, Löschungen usw.)angewendet werden. Neben der Verwendung von nur zwei Sonden, um alle Änderungen (wodurch Zweckmäßigkeit und Wirtschaftlichkeit des Assays) zu erkennen, Drop-off DdPCR erzeugt weniger Hintergrund Lärm⁶ und zeigt erhöhten Empfindlichkeit gegenüber Multiplex-Assays. Da es in einer einzelnen Reaktion durchgeführt wird, werden darüber hinaus minimale Mengen von Patientenproben verbraucht. Dieser Assay ist besonders reizvoll im Zusammenhang mit der flüssigen Biopsie, weil die Menge an CtDNA in diesen Proben oft ausreicht.

In der Tat, die hier vorgestellte Methode ist anwendbar für Mutation Screening in Flüssigkeit Biopsiematerial und seine Nützlichkeit für die klinische Praxis (ESR1 Mutation Screening in der klinischen Prüfung PADA-1 - NCT03079011) hat sich bereits bewährt. Es ist jedoch entscheidend, Amplifikate so kurz wie möglich in diese Einstellung aufgrund der Zersplitterung des Blut-⁸zu verwenden.

Nachgeschalteten Charakterisierung muss noch separat durchgeführt werden, um die exakte Mutation von mutierten Allelen durchgeführt zu identifizieren. Jedoch da therapeutische Entscheidungen in erster Linie auf die Mutationszucht Status des Hotspot-Regionen der Aktionsleisten Onkogene (WT Vs Mutant) basieren, ist die Fähigkeit der Drop-off DdPCR, Mutationen sofort zu identifizieren es ein leistungsfähiges Diagnose-Tool. Darüber hinaus muss die exakte Mutation nicht a priori eine Probe im Gegensatz zur aktuellen kommerziellen Lösungen entwerfen bekannt sein. Darüber hinaus können Drop-off-DdPCRs mit bestimmten herkömmlichen DdPCR Assays weiter zu steigern die Anzahl der Mutationen geschirmt für (Daten nicht gezeigt) kombiniert werden. Zu guter Letzt kann Drop-off DdPCR auf andere Bereiche der Forschung angewendet werden. Insbesondere könnte es ein nützliches Werkzeug für das screening von positiven Kolonien im Genom Bearbeitung Experimente sein.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
K2EDTA tube (color code : lavender)	BD	367863	EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol)	Qiagen	55114	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol)	Qiagen	937556	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony SP system	Qiagen	9001297	fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification
QIAvac 24 Plus	Qiagen	19413	For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously
Qubit fluorometer	Invitrogen	Q33226	The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA
QX100 or QX200 reader	Bio-Rad	186-3003 or186-4003, respectively	The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector
QX100 or QX200 droplet generator	Bio-Rad	186-3002 or 186-4002, respectively	Instrument used for droplet generation
C1000 thermal cycler	Bio-Rad	1851196	Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module
Plate sealer	Bio-Rad	181-4000	PX1™ PCR plate sealer
DG8 cartridge holder	Bio-Rad	186-3051	Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation
Droplet generator cartridges and gaskets	Bio-Rad	186-4007	Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation
PCR supermix	Bio-Rad	186-3010	ddPCR supermix for probes (no dUTP)
96-well PCR plates	Eppendorf	951020362	96-well semi-skirted plates
Foil seal	Bio-Rad	181-4040	Pierceable foil heat seal
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	oil used in the read
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	186-3005	oil for droplet generation
DNA loBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	0030 108.051	Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding
Multiplex I cfDNA Reference Standard Set	HORIZON	HD780	The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations
QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500	Life Technologies	Q32854	The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL
Qubit Assay Tubes	Life Technologies	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer