Enda Droplet Digital polymeraskedjereaktion för omfattande och samtidiga detektion av mutationer i Hotspot områden

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att exakt kvantifiera flera genetiska förändringar av en målregionen i en enda reaktion som använder drop-off ddPCR och ett unikt par hydrolys sonder.

Abstract

Droplet digital polymeraskedjereaktion (ddPCR) är en mycket känsliga kvantitativa polymeras-kedjereaktion (PCR) metod baserad på prov fraktionering in tusentals av nano-storlek vatten-i-olja individuella reaktioner. Tid har blivit ddPCR en av de mest exakta och känsliga verktyg för cirkulerande tumör DNA (ctDNA) upptäckt. En av de stora begränsningarna av standard ddPCR tekniken är det begränsa antalet mutationer som kan kontrolleras per reaktion, som särskilda hydrolys sonder erkänner varje möjligt alleliska version krävs. En alternativ metod, den drop-off ddPCR, ökar genomströmningen, eftersom det kräver bara ett enda par sonder för att påvisa och kvantifiera potentiellt alla genetiska förändringar i den berörda regionen. Drop-off ddPCR visar jämförbara känslighet till konventionella ddPCR analyser med fördelen av att upptäcka ett större antal mutationer i en enda reaktion. Den är kostnadseffektiv, sparar dyrbar provmaterial och kan också användas som ett upptäckt verktyg när mutationer inte är kända förhand.

Introduction

Tusentals somatiska mutationer relaterade till cancerutveckling har varit rapporterade¹. Bland dessa, några är prediktiva markörer av effekten av riktad terapi ^2,3 och genetisk screening av dessa mutationer är nu rutinmässig klinisk praxis. Droplet digital PCR (ddPCR) teknik kan användas för att övervaka förekomsten eller avsaknaden av mutationer med hög upptäckten exakthet och är kompatibel med icke-invasiv flytande biopsier^4,5. Nuvarande ddPCR analyser är dock primärt utformade för att upptäcka mutationer kända förhand. Detta begränsar allvarligt användningen av ddPCR som ett upptäckt verktyg när mutationen är okänd. Faktiskt, i de konventionella ddPCR designen, en hydrolys sond erkänner den vildtyps-allelen (WT Probe) konkurrerar med en specifik sond som erkänner den muterade allelen (MUT Probe) (figur 1A). Sonden med högre affinitet hybridizes till mallen och frigör dess fluorophore, som anger arten av den motsvarande allelen. Fluorescens uppgifterna om varje droppe kan visualiseras i ett spridningsdiagram representerar fluorescensen som avges av de WT och MUT sonderna i olika dimensioner. En schematisk representation av ett typiskt resultat för en konventionell ddPCR analys presenteras i figur 1A. I det här exemplet motsvarar blå molnet droppar som innehåller WT alleler identifieras av WT sonden, medan röda molnet motsvarar droppar där den MUT-allelen har förstärkt och identifierats av MUT sonden. Beroende på mängden DNA laddad i reaktionen, kan dubbel positiv droppar som innehåller både WT och MUT amplikoner visas (gröna moln). Ljus grå molnet motsvarar tom droppar.

Eftersom de flesta plattformar möjliggör upptäckt av ett begränsat antal fluorophores (vanligtvis 2, men upp till 5), är genomströmning av konventionella ddPCR begränsad. Inriktning regioner med flera intilliggande mutationer kräver därför utformningen av tekniskt utmanande multiplex ddPCR analyser eller användning av flera reaktioner inriktning varje mutation parallellt. Drop-off ddPCR strategin, övervinner denna begränsning som det potentiellt kan upptäcka någon genetisk förändring inom ett mål med hjälp av ett unikt par WT hydrolys sonder. Den första sond (Probe 1) omfattar en icke-variabel sekvens, intill målregionen och andra sonden (sond 2) är ett komplement till WT sekvensen av målregionen där mutationer är förväntat (figur 1B). Medan den första sonden kvantifierar den totala mängden amplifiable molekyler i reaktionen, diskriminerar andra sonden WT och MUT alleler av suboptimal hybridisering till mutant sekvenser. Sond 2 kan identifiera flera typer av mutationer i mål regionen (enstaka eller flera nukleotid substitutioner, radering, etc.)⁶. Som i konventionella ddPCR motsvarar ljus grå molnet droppar som innehåller inget DNA-molekyler. Det är viktigt att komma ihåg att i denna typ av analys, optimal separation av WT och MUT moln är beroende av mängden DNA laddas i reaktionen, eftersom droppar som innehåller både WT och MUT mål alleler inte kan särskiljas från droppar som innehåller endast WT formuläret. Denna analys kräver därför att de flesta droppar innehåller inte mer än en kopia av genen riktade.

Protocol

Det protokoll som presenteras här följer etiska riktlinjer Institut Curie. Alla mänskliga prover erhölls från patienter inskrivna, efter informerat samtycke, i studier som godkänts av den institutionella Review Board vid Institut Curie.

1. blod insamling, Plasma lagring och Cell-free DNA-extraktion

Obs: DNA extraheras från någon typ av ”vävnad” kan användas (t.ex. färska eller formaldehyd-fast paraffin embedded (FFPE) vävnader, celler i kultur eller blod prover). Här, tillhandahåller vi detaljerade instruktioner för blodinsamling, plasma isolering och lagring och cellfria DNA (cfDNA)-extraktion.

1. Blod insamling och plasma lagring (figur 2B)
   1. Samla in blodprover i 7 mL EDTA-rör. Två rör rekommenderas att samla omkring 4 mL plasma.
   2. Centrifugera rören i 10 min vid 820 x g inom 3 h för det blodprov att separera röda blodkroppar (RBC), vita blodkroppar (WBC) och plasma. Tiden mellan provtagning och centrifugeringen är avgörande för att få hög kvalitet cfDNA (dvs. cfDNA inte förorenade med DNA som släppt från WBC).
   3. Pipettera omsorgsfullt supernatanten (plasma) använder en 1 mL Pipettera utan att vidröra det WBC lagret; ca 2 mL plasma återvinns vanligtvis per EDTA-rör.
   4. Överför plasman till 2 mL rör och centrifugera alikvoter vid 16 000 x g under 10 minuter vid 15 ° C ta bort cellfragment.
   5. Pipettera omsorgsfullt supernatanten (plasma) utan att störa pelleten. Distribuera plasma i 2 mL kryogen rör och förvaras vid-80 ° C tills den behövs.
2. cfDNA utvinning (Figur 2B)
   Obs: Här presenterar vi proceduren med manuell utvinning kit. En automatisk version efter tillverkarens instruktioner kan också utföras för cfDNA isolering.
   1. Lägg 400 µL av proteinas K i en 50 mL tub. Lägga till 4 mL plasma (volym rutinmässigt används) och 3,2 mL lyseringsbuffert ACL (innehållande 1,0 µg carrier RNA) från kit. Nära röret och blanda genom vortexa för 30 s för att erhålla en homogen lösning. Inkubera vid 60 ° C i 30 min.
   2. Tillsätt 7,2 mL buffert ACB (från kit) till den lysate att optimera bindningen av cirkulerande nukleinsyror till kiseldioxid membranet och blanda genom vortexa för 15 – 30 s. Inkubera röret för 5 min på is.
   3. Placera kolumnen och 20 mL extender i vakuumpumpen. Stänga de oanvända positionerna för att tillåta vakuum aspiration.
   4. Applicera noggrant lysate-buffert ACB blandningen i tube förlängaren (kort Centrifugera röret för att samla in maximalt lysate-buffert ACB blandning), slå på vakuumpumpen och tillåta den lysate dras igenom kolumnerna helt. Avlägsna och kassera tube förlängaren.
   5. Gäller 600 µL buffert ACW1 för kolumnen. När buffert ACW1 har utnyttjats genom kolonnen, tillsätt 750 µL buffert ACW2 och slutligen lägga till 750 µL etanol (96 – 100%). Sedan placera kolumnen i en ren 2 mL samling rör och centrifugera vid full fart (20 000 x g) för 3 min till eliminera etanol.
   6. Placera kolumnen i en ny 2 mL samling tub. Öppna locket och inkubera vid 56 ° C i 10 min torka membranet.
   7. Placera kolumnen i en ren 1,5 mL DNA låg bindande tub. Noggrant tillämpa 36 µL RNase-gratis vatten med 0,04% natriumazid (buffert AVE). Stäng locket och odla i rumstemperatur i 3 min.
   8. Centrifugera vid full fart (20 000 x g) för 1 min till eluera nukleinsyror och förvaras vid-20 ° C tills den behövs.
3. cfDNA kvantifiering
   Obs: cfDNA kvantifiering utförs med en fluorometer med tillverkarens protokollet omedelbart efter extraktion eller upptining proverna vid rumstemperatur (RT), före användning. Undvik flera frysas och tinas cykler.
   1. Använd hög känslighet analysen enligt den förvänta cfDNA kvantitet, som vanligtvis är mindre än 100 ng/mL plasma. cfDNA koncentrationer varierar från 2 – 10 ng/mL för friska donatorer men kan vara så hög som 100 ng/mL hos patienter med metastaserad sjukdom.
   2. Säkerställa alla reagens på RT och blanda 199 µL förtunningsbuffert fluorometer med 1 µL av färgämne (200 x) per reaktion (N antal prov + 2 standarder att kalibrera fluorometer) att få en fungerande lösning.
   3. Vortex cfDNA lösningen noga för att säkerställa homogenitet och centrifugera kort för att samla in innehållet på botten av röret.
   4. Blanda 5 µL av varje cfDNA prov med 195 µL arbetslösning.
   5. Blanda 10 µL av varje standard med 190 µL arbetslösning.
   6. Vortex noggrant alla rör för 2 – 3 s att säkerställa homogenitet och centrifugera kort för att samla in innehåll längst ned i rören.
   7. Inkubera vid RT i 2 min i mörker.
   8. Läs rören i den fluorometer, använder ' ng/µL' produktionen läge
   9. Beräkna slutliga koncentration i ng/mL plasma som följer: ng/µL x 36 (volym av cfDNA eluatet) / 4 (volym plasma som utvunnits).

2. ddPCR sond och Primer Design (figur 2A)

Obs: Förstärkning av riktade molekylerna i drop-off ddPCR analysen följer liknande principer för qPCR. Varje primer och sonden är utformad med konventionella dedikerade programvara Primer3⁷ (http://primer3.ut.ee/).

1. Primer design
   1. I fönstret allmänna inställningar ändra 'koncentration av divalenta katjoner' till 3,8, 'koncentration av dNTP' till 0,8, och ' mispriming och upprepade bibliotek ' till rätt organismen.
   2. I fönstret avancerade inställningar, ändra både 'Bord av termodynamiska parametrar' och 'Saltkoncentrationen formel' till Santa Lucia 1998.
   3. Välja en T_m mellan 55 och 70 ° C (med 50 mM för salt koncentration och 300 nM för oligonukleotiden koncentration).
   4. Kontrollera specificiteten av grundfärger med verktyg som PrimerBlast.
   5. Undvik att regioner som har sekundära strukturer.
   6. Välj en sekvens som har GC innehåller 50 – 60%.
   7. Undvika upprepningar av Gs och Cs längre än 3 baser.
   8. Välj grundfärg med Gs och Cs på deras 3' Avsluta när det är möjligt.
   9. Se till att 3' ände Parade primers inte har betydande komplementaritet att undvika primer-dimerer. Amplikoner bör vara mindre än 150 bp att effektivt förstärka cfDNA (betyder storlek 170 bp⁸) och DNA extraheras från FFPE, som ofta är fragmenterad.
2. Sonden design
   Obs: Hydrolys sonder är märkta med fluorescerande reporter i slutet 5' och en törstsläckare i slutet 3'. De ger hög specificitet, hög signal-brus-förhållande och att multiplexering om det behövs. Två-kanals droplet läsare är kompatibla med FAM och HEX eller VIC färgämnen samt analys av FAM/HEX eller FAM/VIC kopplade sonder.
   1. Design hydrolys sonder komplement till WT sekvensen av målregionen och intilliggande icke-variabla regionen.
   2. Välj sonder som båda ligger inom ospädd definieras av primer paret tidigare utformat. Primer sekvenser kan inte överlappa den sond sekvenser, även om de kan sitta bredvid varandra.
   3. Välja den strand som har mer Cs än Gs. sonder måste ha GC innehåller 30-80%.
   4. Välj sonder som är mellan 13 och 30 nukleotider i längd. Längre sonder tenderar att visa högre bakgrund fluorescens eftersom avståndet mellan fluorophore och törstsläckare påverkar snabbkylning av fluorophore reporter.
   5. Välj T_m av sonderna vara 3 till 10 ° C högre än den T_m av primers att säkerställa sonden hydrolys under primer glödgning och förlängning. T_m förstärkare rekommenderas att nå den nödvändiga T_m samtidigt sonden kort, som kortare sonder diskriminera enda nukleotid varianter mer effektivt. Sonder bör inte ha en G i slutet 5' eftersom detta släcker fluorescens signalen även efter hydrolys.
   6. Utforma drop-off sonder som följer: 5'-(VIC) -kompletterande WT sekvens av muterade regionen-(MGB NFQ)-3' och referens sond som: 5'-(6-FAM) -kompletterande sekvens av en icke-variabel region-(MGB NFQ)-3'. Andra kombinationer av reporter/törstsläckare är också möjliga.

3. optimering av ddPCR reaktion (figur 2A)

Obs: Wild-type och muterat DNA-kontroller som används i detta steg kan erhållas från cellinjer, tumörprover eller kommersiellt tillgängliga DNA referensstandarder, till exempel.

1. Utföra en konventionell PCR på en termocykel med hjälp av termisk gradient funktionen för att validera specificiteten av PCR-produkten förstärks av primers utformad.
   1. Förbereda en unik PCR-reaktionsblandning som beskrivs nedan i steg 4.1 (utan sonder) på ett vildtyps-DNA kontrollmall för minst 8 reaktioner att ha minst en reaktion per temperatur.
   2. Kör förstärkning med hjälp av programmet som beskrivs i steg 4.3.2 och en rad glödgning temperaturer runt den teoretiska glödgning temperaturen av primers.
   3. Ladda PCR-produkter på en 3% agarosgel välja för glödgning temperaturer ger specifika produkter.
2. Utföra en serie drop-off ddPCRs med hjälp av parametrar som beskrivs ovan men den här gången inklusive båda sonder.
   1. Använd 100% WT DNA, 100% MUT DNA och en blandning av WT och MUT DNA (t.ex. 50% MUT/50% WT) att avgöra de bästa förutsättningarna för tydlig separation mellan WT och MUT droplet moln.
   2. Välj en rad glödgning temperaturer över den temperatur som valts i steg 4.1.
   3. Välj glödgning temperatur vilket möjliggör specifik detektion av WT eller MUT signaler när du använder 100% WT DNA eller 100% MUT DNA och bästa separation av WT och MUT droplet moln.
   4. Glödgning tid och primer/sond koncentrationer kan också justeras att förbättra separation av moln och minska antalet droppar med mellanliggande fluorescens (regn effekt).
3. Utvärdera bakgrund eller gräns av tomma (LOB) för analys.
   1. Utför minst 48 enskilda drop-off ddPCR reaktioner med en WT kontroll DNA med hjälp av glödgning parametrar och primers/sonder koncentrationer valt i 3.2.
   2. För varje reaktion, beräkna frekvensen mutant allel (MAF) enligt följande: (antalet mutanta droppar/antal fyllda droppar) x 100.
      Obs: LOB definieras som falskt positiva MAF medelvärdet och associerade SD från vilken det 95% konfidensintervallet (95% CI) beräknas. LOB = (medelvärdet av falskt positiva MAF) + 95% CI.
4. Utvärdera detektionsgränsen (LOD) för analys.
   1. Utföra drop-off ddPCR reaktioner med seriespädningar av MUT DNA i WT DNA, med MAFs varierar från 5% till 0,01% (≥ 8 replikeras per tillstånd). Använd glödgning parametrar och primers/sonder koncentrationer som valts i 3.2.
      Obs: LOD definieras som de minsta MAF-värdena som replikerar nuvarande genomsnittliga värden och SD ovan LOB (se Decraene m.fl. ⁶ för mer detaljer).

4. ddPCR protokoll (figur 2B)

Obs: Liknar konventionella ddPCR, drop-off ddPCR protokollet består av 4 steg: a PCR blanda förberedelse, (ii) droplet generation, (iii) PCR-amplifiering och (iv) datainsamling.

1. PCR-mix förberedelse
   1. Följ standardmässiga försiktighetsåtgärder, såsom handskar, använda en ren PCR-huva, rena pipetter och RNase, DNAS-fri destillerat vatten för att undvika kontaminering.
   2. Tina och temperera reaktion komponenterna på RT.
   3. Förbereda 20 x primers/sonder mix i destillerat vatten, med primers på 18 µM varje och sonder på 5 µM varje.
   4. För alla enskilda PCR-reaktioner, förbereda en prov-mix genom att kombinera 2 x ddPCR supermix (10 μL), 1 µL 20 x primers/sonder mix och upp till 10 ng DNA prov qsp 20 µL destillerat vatten.
   5. Vortex reaktionen blanda noggrant för att säkerställa homogenitet och centrifugera kort för att samla in innehållet på botten av röret före dispensering. Tveka inte att upprepa detta steg för varje reaktionsblandning före användning.
2. Droplet generation
   1. Sätt i ddPCR bläckpatronen i hållaren och lasta 20 μL av Reaktionsblandning innehållande prover i mellersta brunnar av patronen för droplet generation (gröna positioner i figur 2B) med hjälp av en 8-kanals pipett.
   2. Tillsätt 70 μl droplet generator olja i botten brunnar (gula positioner).
   3. Sätt i bläckpatronen, med en packning, i den droplet generatorn; droppar kommer att produceras i övre brunnarna av patronen (blå positioner).
   4. Aspirera och expediera långsamt och försiktigt (för att undvika klippning) 40 μl droppar från patronerna i en PCR-plattan med 96 brunnar. Använda en flerkanalig pipett för att optimera överföringen av droppar.
3. PCR-amplifiering
   1. Försegla sista PCR-plattan med en aluminiumfolie med en tallrik sealer omedelbart efter överföring droppar för att undvika avdunstning. Kort Centrifugera plattan för att samla in innehållet på botten av brunnarna.
   2. Kör en konventionell PCR-amplifiering på en termocykel med följande program: 95 ° C 10 min, 40 cykler av [94 ° C 30 s, validerade glödgning T ° för 60 s], 98 ° C 10 min (ramp 2,5 ° C/s). Inkludera kontroller utan ingående DNA och wild type-DNA (≥3 replikat) i varje körning.
   3. När körningen är klar, kort Centrifugera plattan för att samla in innehållet på botten av brunnarna.
4. Datainsamling
   1. Efter PCR-amplifiering, Använd droplet läsaren med greve PCR-positiva PCR-negativ droppar, följa tillverkarens instruktioner.
      Obs: Droplet läsaren erbjuder oftast en två-färg optiska detektionssystemet kompatibel med FAM, VIC eller HEX fluorophores.

5. dataanalys (figur 2 c och figur 3)

Obs: PCR-positiva och PCR-negativa droppar räknas för att ge en absolut kvantifiering av MUT och de WT allelerna på den berörda regionen. Tilldelade droppar används för att beräkna MAF i varje brunn. Droplet uppskattning och analys av drop-off analyser kan utföras med hjälp av ddPCR R-paketet (https://github.com/daattali/ddpcr) som utvecklats av Attali och kollegor^9,10. Detta R-paketet klassificerar automatiskt droppar som Tom, en del av ”regn” (på grund av ineffektiva amplifiering) eller som fyllda med en riktig positiv signal (figur 3). I följande avsnitt presentera de olika stegen i analysen är en kort version av beskrivande vinjetten av algoritmen skriven av dess författare (se https://github.com/daattali/ddpcr/blob/master/vignettes/ algoritm. RMD för mer detaljer). Data exporteras till kommaavgränsade filer (FileName_Amplitude.csv) och laddas upp i ddPCR paketet ska analyseras direkt i R eller via det dedikerade webbgränssnittet.

1. Parameter justeringar
   Obs: Varje drop-off assay design resulterar i särskilda slutliga droplet-distributioner och variationer i molnet formuläret, separationer eller positioner är förväntas. För att säkerställa effektiv automatiserad analys, behöver en uppsättning parametrar som justeras. Om en brunn har en oväntad profil, kan det orsaka analys av hela plattan att misslyckas, vilket resulterade i ett felmeddelande. Det problematiska som väl måste identifieras och tas bort från den automatiska analysen.
   1. Identifiera misslyckade brunnarna med (REMOVE_FAILURES). Använda TOTAL_DROPS_T (Standardvärdet är 5000) att justera det minimala antalet droppar i varje brunn. Använda EMPTY_LAMBDA_LOW_T (Standardvärdet är 0,3) och EMPTY_LAMBDA_HIGH_T (Standardvärdet är 0,99) justera mått som utvärdera förväntade droplet molnen (tom, MUT, WT) och deras kvalitet.
      Obs: Att ha alltför många tomma droppar är ett tecken på att det inte var nog amplifiable mall i reaktionen.
   2. Identifiera avvikare droppar använder (REMOVE_OUTLIERS). Använda TOP_PERCENT (standard är p = 1%) att justera de p procent av droppar med högsta signalvärdet i varje signal dimension (FAM, VIC/HEX) av droppar i hela plattan. Använda CUTOFF_IQR (standard är 5) justera tröskelvärdet avvikare på övre p procent av högsta signal.
   3. Identifiera tomma droppar använder (REMOVE_EMPTY). Använda CUTOFF_SD (standard är 7) justera standardavvikelsen för lägre (tom droppar) Gaussisk fördelning av Probe 1 värden.
   4. Gate droppar använder (klassificera). Använda CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD (standard är 3) justera standardavvikelsen för högre (fyllda droppar) Gaussisk fördelning av Probe 1 värden. Använda ADJUST_BW_MIN (standard är 4) och ADJUST_BW_MAX (standard är 20) att justera parametrarna k_min och k_max för att uppskatta kernel tätheten av sond 2 värdena och diskriminera MUT och WT molnet av droppar.
      1. Använda SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ (standard är p = 1%) och SIGNIFICANT_P_VALUE (standard är signifikansnivån s=0.01%) att klassificera brunnar som antingen mutant eller vildtyp.
         Obs: I denna algoritm, en mutant väl definieras som att ha en MAF som är statistiskt signifikant högre än p %.
2. Automatiserad analys
   Obs: För varje parameter som presenteras i detta avsnitt, har författarna av ddPCR R för föreslagna standardvärden utifrån deras kompetens och deras data. Alla parametrar kan dock ändras för att öka kvaliteten i analysen (figur 3).
   1. Identifiera misslyckade brunnar.
      1. Använd fyra kvalitetskontroll mätvärden (inställningar: REMOVE_FAILURES) att identifiera misslyckade brunnar; den första är det minsta antalet droppar som en brunn bör innehålla. De andra tre fokuserar på att identifiera giltiga kandidat populationer för tom, möjligen FAM + och HEX +/ VIC + droppar. Ta bort brunnar som inte uppfyller dessa kriterier från efterföljande analys.
   2. Identifiera avvikare droppar.
      1. För att undvika skevning droplet gating, ta bort avskilda (dvs droppar med en onormalt hög HEX/VIC eller FAM värde) från vidare analys genom att ange en övre gräns överskrids (inställningar: REMOVE_OUTLIERS).
   3. Identifiera tomma droppar.
      1. Identifiera tomma droppar för att minska dimensionen av data (i en typisk brunn, kommer de står för merparten av droppar) och eliminera statistisk bias på grund av närvaron av en stor del av värdelös information som bara mallen som innehåller droppar kvar () inställningar: REMOVE_EMPTY).
   4. Utföra droplet gating.
      1. Klassificera återstående droppar som antingen mutant, vildtyp eller regn (inställningar: klassificera).
   5. Identifiera regn droppar.
      1. Som regn droppar resultera från ineffektiva förstärkning, utesluta från FAM + eller HEX +/ VIC + moln. Bestämma gränserna för deras kluster med deras Probe 1 värden (inställning: CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD).
   6. Identifiera mutant kontra vildtyps-droppar.
      1. Som höjdpunkten i analysen är diskriminering mellan mutant och vildtyp mallar, identifiera alla återstående droppar i detta skede som antingen det ena eller det andra. Eftersom de bör har liknande sond 1-värden, använda sond 2 värden bäst förutsäga deras respektive karaktär (inställningar: ADJUST_BW_MIN och ADJUST_BW_MAX).
   7. Klassificera brunnar som mutant kontra vildtyp.
      1. Efter att fastställa vilka droppar beräkna MUT och WT, MAF. Med hjälp av mutationsfrekvensen och tillhörande p-värde i varje brunn, det är möjligt att klassificera dem (inställningar: SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ, SIGNIFICANT_P_VALUE) som WT (som innehåller mestadels WT droppar) eller MUT wells (innehållande ett statistiskt signifikant antal MUT droppar).
3. Utforska och exportera data
   1. Utforska och exportera data som antal droppar, extremvärden, Tom droppar, koncentrationer eller grafer som kan anpassas ytterligare för optimal representation.

Representative Results

I en studie på proof-of-concept undersöktes KRAS exon 2 mutationer (kodon 12 och 13) och EGFR exon 19 borttagningar i FFPE vävnader och plasmaprover från cancerpatienter använder drop-off ddPCR strategi⁶.

KRAS drop-off sonden förhördes en 16 bp region som omfattar flera mutationer i exon 2 av KRAS -genen, som hyser mer än 95% av de kända KRAS -mutationerna i mänskliga cancerformer¹¹. Referens sonden var 20 bp i längd och ligger 3 bp nedströms. För att optimera vår analys, vi använde DNA extraheras från cellinjer som innehåller 2 av de mest frekvent muterad KRAS aminosyrorna: G12V (c.35GT, SW480) och G13D (c.38GA, HCT 116).

EGFR drop-off analysen utformades för att söka efter alla aktiverande borttagningar av EGFR exon 19. Analysen används en 25 bp lång drop-off sond placeras över återkommande borttagna regionen tillsammans med en referens sond 21 bp, ligger 31 bp nedströms i den samma Amplikonen. För att optimera vår analys, vi använde en cfDNA referens standard uppsättning inklusive EGFR exon 19 borttagning c.2235_2249del, p.Glu746_Ala750del.

Känslighet, specificitet och plats för droppavskiljare moln har definierats med MUT kontrollprover och WT PBMC genomiskt DNA som visas i figur 4A för KRAS. Vi har vidare visat att denna typ av test fungerar på flera typer av genetiska förändringar såsom enda substitution, flera substitutioner eller borttagningar (figur 4B) samt på olika prov typ⁶.

Figur 1: den drop-off ddPCR kräver ett unikt par hydrolys oligo-prober att skanna alla mutationer av en hotspot region. Assay designs med Schematisk resultat visas som tvådimensionella scatter tomter visar droplet fluorescensintensiteten. (A) konventionella ddPCR med mutant (MUT probe) och vildtyp (WT probe) sonder inriktning exakt samma region. (B), avlastningsplatsen ddPCR innehåller en referens sond (Probe 1) som anneals till en icke-variabel region och en drop-off sond (sond 2) inriktning muterade regionen men kompletterar WT sekvensen, inom samma ospädd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Drop-off ddPCR arbetsflöde för plasma DNA mutation profilering. Hela arbetsflödet består av 5 viktiga steg: (A), (1) utformningen av primers och sonder, (2) optimering av assay, (B) (3) plasma isolering och cfDNA utvinning, (4) ddPCR kör och (C) (5) dataanalys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Drop-off ddPCR analys. Drop-off ddPCR analys arbetsflöde belysa viktiga parametrar som måste finjusteras. Detta säkerställer effektiv automatiserad identifiering av extremvärden, tom, regn eller positiva droppar; tilldela MUT eller WT droppar och computing MAF för varje brunn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Representativa resultat - KRAS och EGFR drop-off ddPCR analyser. (A) exempel på resultat erhållits under optimering steg i drop-off ddPCR analysen. Påvisande av mutant eller vildtyps-DNA i en reaktion som innehåller 100% MUT DNA, 5% MUT DNA och 100% WT DNA. (B) exempel på plasmaprover analyseras med det KRAS och den EGFR drop-off ddPCR analyser visar att upptäcka enda nukleotid och flera substitutioner i exon 2 i KRAS och borttagning i EGFR exon 19. Denna siffra har anpassats från Decraene et al. ⁶. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Discussion

För att designa en effektiv drop-off ddPCR analys, optimering är avgörande, och protokollet måste följas noggrant. Varje kombination av primers och sonder har en unik PCR-reaktion effektivitet. Således har en individuell analys valideras noggrant på kontrollprover innan de används på värdefulla provföremål. Optimering och validering är viktigt att certifiera peak signaldetektion och bedöma specificitet och känslighet. Som beskrivs i protokollet, kan alla mutationer i ett målregionen omfattas av ”sonden 2” potentiellt förhöras. Dock validering rekommenderas för mutationer ligger på 5' eller 3' ände ”sond 2”, eftersom dessa kan påverka effektiviteten i drop-off analysen.

Metoden presenteras här kan utföras med DNA extraheras från någon typ av ”vävnad”, inklusive FFPE vävnader, celler i kultur eller blod prover. Men kan kvaliteten på nukleinsyra utvinning dramatiskt påverka ddPCR resultat. PCR-hämmare såsom heparin, proteiner, heme, fenol, proteaser, kollagen, melanin, rengöringsmedel eller salter måste elimineras så mycket som möjligt under provtagning och reningssteg. Även om DNA-prover kan spädas för att minska effekterna av PCR-hämmare på ddPCR, minskar utspädning känsligheten för färre kopior av målet kommer att testas per reaktion. Detta bör beaktas när en viss nivå av känslighet är att nås, som ett minimum av kopior måste testas.

Drop-off ddPCR kan tillämpas på många typer av molekylära förändringar (enstaka och flera nukleotid substitutioner, borttagningar, etc.). Förutom med endast två sonder för att upptäcka alla förändringar (vilket ökar funktionalitet och kostnadseffektivitet i analysen), drop-off ddPCR genererar mindre bakgrund buller⁶ och visar ökad känslighet jämfört med multiplex analyser. Dessutom, eftersom det utförs i en enda reaktion, som minimala mängder av patientprover förbrukas. Denna analys är särskilt lockande i samband med flytande biopsi eftersom ctDNA ofta är låg i dessa prover.

Faktiskt den metod som presenteras här är tillämplig för mutation screening i vätska-biopsi material och har redan bevisat sin verktyg för klinisk praxis (ESR1 mutation screening i den kliniska prövningen för PADA-1 - NCT03079011). Det är dock viktigt att använda amplikoner så kort som möjligt i den här inställningen på grund av fragmenteringen av cfDNA⁸.

Nedströms karakterisering behöver fortfarande göras separat för att identifiera den exakta mutation som bärs av muterade alleler. Eftersom terapeutiska beslut baseras huvudsakligen på mutationsstatus av hotspot regioner i targetable onkgener (WT vs mutant), gör drop-off ddPCR förmåga att omedelbart identifiera mutationer det dock en kraftfulla diagnostikverktyg. Exakta mutationen behöver dessutom inte vara känd förhand att utforma ett test i motsats till nuvarande kommersiella lösningar. Dessutom kan drop-off ddPCRs kombineras med särskilda konventionella ddPCR analyser att ytterligare öka antalet mutationer screenas för (inga data anges). Slutligen kan drop-off ddPCR tillämpas för andra forskningsområden. I synnerhet kan det visa sig vara ett användbart verktyg för screening positiva kolonier i genomet redigering experiment.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
K2EDTA tube (color code : lavender)	BD	367863	EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol)	Qiagen	55114	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol)	Qiagen	937556	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony SP system	Qiagen	9001297	fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification
QIAvac 24 Plus	Qiagen	19413	For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously
Qubit fluorometer	Invitrogen	Q33226	The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA
QX100 or QX200 reader	Bio-Rad	186-3003 or186-4003, respectively	The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector
QX100 or QX200 droplet generator	Bio-Rad	186-3002 or 186-4002, respectively	Instrument used for droplet generation
C1000 thermal cycler	Bio-Rad	1851196	Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module
Plate sealer	Bio-Rad	181-4000	PX1™ PCR plate sealer
DG8 cartridge holder	Bio-Rad	186-3051	Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation
Droplet generator cartridges and gaskets	Bio-Rad	186-4007	Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation
PCR supermix	Bio-Rad	186-3010	ddPCR supermix for probes (no dUTP)
96-well PCR plates	Eppendorf	951020362	96-well semi-skirted plates
Foil seal	Bio-Rad	181-4040	Pierceable foil heat seal
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	oil used in the read
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	186-3005	oil for droplet generation
DNA loBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	0030 108.051	Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding
Multiplex I cfDNA Reference Standard Set	HORIZON	HD780	The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations
QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500	Life Technologies	Q32854	The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL
Qubit Assay Tubes	Life Technologies	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer