Summary
補助生殖技術 (ARTs) は、結果を改善し、関連するリスクを軽減するために継続的に評価されています。本稿では、ヒト生殖の理想的な動物モデルとしてのウサギの使用を可能にする効率的な凍結保存プロトコルを用いた低侵襲胚移植手順について述べる。
Abstract
胚培養または胚凍結保存などの補助生殖技術は、周産期および出生後の結果によって自然発症パターンに影響を及ぼす。アートアプリケーションの安全性を確実にするためには、動物モデルに関する研究が必要である。さらに、胚発生研究では、最後の段階として、健常な子孫を育てる能力を評価する必要があります。ここで、子宮への胚の移植は、あらゆる芸術関連実験を行うために不可欠である。
ウサギは、1世紀以上にわたって哺乳類の生殖を研究するモデル生物として使用されてきた。人間の種とその小さなサイズと低い維持費への系統の近接に加えて、誘発された排卵、ヒトに類似した初期の胚発生の年表、短い妊娠のような重要な生殖特性を有するそれは私たちが簡単に芸術のアプリケーションの結果を研究することができます。さらに、芸術 (細胞質内精子注入、胚培養、または凍結保存など) は、この種で適切な効率で適用される。
この記事で提示された腹腔鏡胚移植技術と凍結保存プロトコルを使用して、1) 簡単に、最小限に侵略的な技術を通して胚を移す方法および 2) ウサギの長期保存のための効果的なプロトコール時間の柔軟な物流能力とサンプルを輸送する能力を提供する胚。異なる発達段階でウサギの胚を移した後に得られた結果は、桑実胚がウサギの胚の回復および伝達にとって理想的な段階であることを示している。したがって、oviductal 胚移植が必要であり、外科的処置を正当化する。さらに、ウサギ morulae は、正常にガラス化および laparoscopically 転写され、記載した技術の有効性を証明する。
Introduction
ヒトの不妊症を迂回すること、または遺伝価値の高い家畜の繁殖を改善し、動物の遺伝資源を保全することを目的として、superovulation のような補助生殖技術と総称される一連の技術体外受精、胚培養、または凍結保存、1、2を開発した。現在、卵巣を刺激し、多数の腹腔卵巣卵胞を生成するホルモン治療が与えられています1.これらの卵胞から採取した卵母細胞は、成熟し、受精し、そして、それらが凍結保存されるか、または代理母3に移されるまで、インビトロで発達させることができる。しかし、これらの治療の間、配偶子および zygotes は、これらの条件4、5で生き残るために胚の適応を必要とする可能性のある一連の非生理的プロセスに暴露される。この適応は、初期胚の可塑性によって可能であり、これは胚の遺伝子発現および発達的プログラミング6の変化を可能にする。しかし、これらの修飾は成人するまでの胚発生のその後の段階に影響を及ぼし、現在広く受け入れられている方法、タイミング、凍結保存手順または培養条件は、胚の運命7に異なる結果を示す,8.したがって、芸術の具体的な誘発効果を解明するためには、よく特徴付けられた動物モデルの使用は不可避である。
哺乳動物胚の移動によってもたらされる最初の記録された生年月日は 18909において起こった。今日、サロゲートメスへの胚移入 (ET) は、その後の胚発達段階10での着床前中の芸術誘発効果を研究する上で極めて重要なステップである。ET の技法は、各動物のサイズおよび解剖学的構造に依存する。大型動物モデルの場合、あおむけ非外科的 ET 法によって ET を行うことが可能であったが、より小型の種では子宮頸部のカテーテル法がより複雑であり、外科的な技術が頻繁に使用されている11.しかし、外科的 ET は、血液が子宮内腔に浸潤して、移植および胚発生を損なう可能性のある出血を引き起こし、胚死10を引き起こす可能性がある。あおむけ非外科的 ET の技術は、依然としてヒト、ヒヒ、ウシ、ブタおよびマウス12、13、14、15、16、17において適用されるが、外科ETs は依然としてヤギ、ヒツジ、またはウサギなどの追加の困難10、18、19、20、21を提示する他の動物などの種で使用されている (2独立 cervices) またはマウス (小サイズ)。それにもかかわらず、外科的伝達方法は、より少ない侵襲的方法で徐々に置き換えられている傾向がある。内視鏡は、例えばウサギ、ブタおよび小さな反芻動物18、19、20において胚を移送するために用いられた。これらの低侵襲性内視鏡検査法は、ウサギに不可欠であり、いくつかの種20で有益な効果を実証している infundibulum を介して合流に胚を移すために使用することができる。これは、卵管の初期胚段階における胚と母親の間の正しい対話の重要性に基づいている。前述したように、卵管を介した胚遊走の間にウサギで起こる胚リモデリングは、22,23を移植することができる胚を達成するために不可欠である。
ウシのような大型動物モデルは、生化学的および着床前の特徴がヒト種24のものと類似しているため興味深い。しかし、大規模な動物は予備試験で使用するには高価すぎる、とげっ歯類は、実験室の研究25のための理想的なモデル (76% モデル生物がげっ歯類である) と考えられています。それにもかかわらず、ウサギモデルは、ヒトによって示されるいくつかの生殖生物学的プロセスがマウスのものよりもウサギの方が類似しているので、生殖研究においてげっ歯類よりいくつかの利点を提供するヒトおよびウサギは、同様の経時的な胚ゲノム活性化、gastrulation および hemochorial 胎盤構造を提示する。加えて、ウサギを用いて、それらの誘発排卵25による受精および妊娠段階の正確なタイミングを知ることができる。ウサギのライフサイクルは短く、31日で妊娠を完了し、約4-5 ヶ月で思春期に達する。動物は、その従順で非攻撃的な行動のために扱いやすいです、そして、その維持は、より大きな動物の費用に比べて非常に経済的です。さらに、ウサギは2つの独立した cervixes11,25を有する二重子宮を有することを言及することが重要である。これにより、異なる実験群からの胚は同じ動物に、しかし別の子宮の角に移すことができるので、ウサギは優先的な位置に置かれる。これにより、両方の実験効果を比較し、母体因子を結果から減らすことができます。
今日では、非外科的 ET 法はウサギでは使用されていません。あおむけ ET 技術を用いて90年代後半に実施されたいくつかの研究は、外科的方法によって 5.5% 〜 20.0%11、26対 50-65% までの低い送達率をもたらしたが、それらの中でも記載の腹腔鏡検査手順Besenfelder と Brem18.ウサギにおけるこれらの非外科的 ET 法の低い成功率は、あおむけ ET で回避される卵管において必要な胚リモデリングの欠如と一致する。ここでは、モデル生物としてウサギを用いた効果的な低侵襲性腹腔鏡 ET 手順について述べる。この技術は、大型動物およびヒトにおけるさらなる生殖研究のためのモデルを提供する。
ウサギは胚移植のために特に狭い時間枠を有するので、この種での ET は、胚の発生段階とレシピエント27の生理的状態との間で高い程度の同期性を必要とする。場合によっては、胚の発育を遅らせ (体外培養など)、または子宮内膜の受容性を変化させる生殖治療 (superovulation 治療など) の後に、胚と母体子宮との間の同調性はない。このような状況は、結果に悪影響を及ぼします。これらの文脈で応答するために、我々は、実験を一時停止し、組織化し、再開することを可能にする効果的なウサギ桑実胚ガラス化プロトコルを説明する。このプロセスは生殖研究のためにロジスティックに望ましい、私達に胚の長期貯蔵のための容量を与え、輸送を許可する。腹腔鏡処置および凍結保存戦略は、より少ない動物での研究のより良い計画を可能にします.このように、我々の方法論は、衛生的で経済的な優位性を提供し、動物研究の 3R (置換、還元、精製) の概念に準拠し、実験動物の人間の治療を改善するという目標を掲げています。したがって、これらの方法を用いて、ウサギはインビボ生殖アッセイのための理想的なモデル生物を構成する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
本研究で使用されたすべての実験手順は、動物実験のための指令 2010/63/EU EEC に従って行われ、ウニベルシタット Politècnica ・デ・バレンシアの動物との実験のための倫理的委員会によってレビューと承認を受けました。スペイン (研究コード: 2015/VSC/エンドウ/00170).XGD、FMJ、MPVC、JSV はバレンシア政府が発行した承認証明書を持って、動物実験を行います。XGD は実験の間に動物の福利および心配を現場で監督するために認可される。
1. 胚移植
- レシピエント女性の作製
- 性的に成熟した女性だけを使用してください (> 4.5 ヶ月).
- ET の1週間前に, 16 h 光/8 時間の暗い体制に女性を適応させる濾胞成長を開始し、女性の受容を強化.
- 受信者の女性を選択し、外陰部の turgidity と色を観察する。外陰部が turgid、赤みがかっている場合、メスは受容型である。
- 体重に関係なく酢酸ブセレリン (ゴナドトロピン放出ホルモンの合成アナログ) の1μ g の単一筋肉注射によって pseudopregnancy (排卵) を誘発する。
注: 通常、0.8 μ g は、中サイズのウサギ (4-5 kg) での排卵誘発に適した用量であるため、1μ g は一般的に排卵を保証する。 - (例えば、新鮮な桑実胚 ET の前に 70-72 h)、移入される胚の年齢として、できるだけ多くの日前に排卵を誘導します。
- 麻酔と鎮痛
- ウサギを計量し、次の麻酔薬と鎮痛薬をロードします。
- 30G 針で1ml の注射器で: 負荷キシラジン (5mg/kg) と塩酸ブプレノルフィン (0.03 mg/kg).別の 1 mL シリンジで 23G pericranial 針を用いて、塩酸ケタミン (35 mg/kg) を負荷する。
- ウサギを持ち、キシラジン・ブプレノルフィン混合物を筋肉内に注入する。
- Pericranial 針をマージナル耳静脈にケタミンで挿入し、すべてのシリンジの中身を静脈内に徐々に導入する。
- 針を固定し、必要に応じてより多くの麻酔を管理するために残りの手順を通して挿入を残します.
- うさぎをケージの中に残します (きれいにして、他の動物なしで) 暖かい段階で。
- 無意識のうちに、目の乾燥を避けるために目の軟膏を塗布し、瞼 freflex が存在しないかどうかを確認します。
注: この議定書は最低30分の外科麻酔の平面を提供する。より長い時間が必要な場合は、1.2.1 の30分後に記載されている塩酸ケタミンの量の半分で追加の投薬量を注入します。 - ペダル反射と呼吸の動きをチェックして、麻酔の深さを監視します。不規則で速い速度への呼吸のパターンの変化は麻酔の適切な平面の損失を示す。
- 粘膜の色 (目、唇など)、呼吸数(1 分あたり30-60 の呼吸)、心拍数 (1 分あたり120-325 拍) および直腸の温度 (38-39.6 ° c) を監視します。
- 転送の8時間前に、ET プロセスが終了するまで、より大きな腸のサイズと活動を避けるために動物から食物を差し控えます。水への無料アクセスを残します。
- ウサギを計量し、次の麻酔薬と鎮痛薬をロードします。
- 胚調製
- 25° c に胚操作メディアを温めます: ベース培地 (BM)、ダルベッコ改変のリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) で構成され、ウシ血清アルブミンの 0.2%(w/v) を添加した。
- 実体顕微鏡の下で働いて、新鮮または解凍された (ステップ 2) 胚を凍結します。
- 滅菌手袋を使用して、適切に構成された17G 硬膜外カテーテルを1Ml のシリンジに取り付けます。
- カテーテルに BM の1センチメートルを吸引し、続いて小さな気泡を注入します。
- 10μ l の BM の容積に 5-7embryos を吸引し、その後に別の小さな気泡が続く。
- BM の 1 cm を吸い出すことによってカテーテルのローディングを完了しなさい。
- 胚移植
- 無菌環境を確保するために無菌手袋、ガウンおよびマスクの使用を考慮してください。
- 外科手術器具を滅菌し、手術が行われる表面を清浄にし、70% のエタノールで拭き取ってください。
- 前に詳述したように麻酔を行い (ステップ 1.2)、反射神経の喪失をチェックする。
- 電気かみそりで腹部から毛皮を剃る。
- 腹側腹部無菌的を準備します。
- 外科区域をきれいにし、残りの毛を取除きなさい。クロルヘキシジングルコン酸石鹸で手術場を洗う。クロルヘキシジン溶液およびエタノール96º (3 回) で領域を消毒します。
- 暖かい外科テーブルの上に動物を置き、トレンデレンブルクの位置 (45 °で頭を下げる) で胃と腸が cranially に位置していることを確認します。それが turgid である場合、膀胱の避難を検討してください。もしその過程で内臓が損傷した場合、その動物は死ぬかもしれません。したがって、それらを適切に配置することが重要です (図 1)。
- 滅菌タオルを使用して領域を覆い、剃毛領域を露出させた穴 (開窓) を用いて、手術部位を任意の潜在的な汚染領域から分離する。
- 1つの内視鏡用トロカール 5 cm を腹腔内に挿入し、2cm 尾部を剣状突起プロセスにかけ、それにより、圧力調節機械注入で腹膜腔を insufflate。
注: 腹腔内圧は、CO2で 8-12 mmHg とする必要があります (図 1a)。 - 内視鏡用のカメラを内視鏡用トロカールを通して挿入します (図 1b)。
注: 次のステップを容易にするために、ET 前に infundibulum と合流の状態と位置を決定し、生殖管を特定します。 - Infundibulum から 2-3 cm の間の鼠径部に 17-G 硬膜外針を挿入します (図 1b)。
- Infundibulum の入り口を識別します (図 2a, 2b)。
- ロードされたカテーテル (ステップ 1.3) を硬膜外針を通して腹部に挿入する (図 1c)。
- 卵管を見つけ、合流の infundibulum を通して硬膜外カテーテルの 1-2 cm を挿入します (図 2a~ 2c)。損傷や出血を防ぐために、卵管に非常に遠くまで進まないでください。
- 注射器のプランジャーをカテーテルに結合させることによって、卵管に胚を放出する (図 2d-2f)。両方の気泡は、カテーテルを終了する必要があります。
- 胚が放出された直後にカテーテルを除去する。
- 吸引し、胚の不在を確認し、その成功した転送を確認するために操作媒体を解放し、カテーテルをすすぎます。
- 必要に応じて、子宮の反対側に1.4.16 するために、ステップ1.4.11 を繰り返します。
- 硬膜外針と内視鏡カメラを取り外します。
- 内視鏡トロカールを介して co2 を放出する。余分なガスは、動物の腹部に残っている場合、それは痛みや不快感を持つことになります。
- 腹腔から内視鏡用トロカールを除去する。手術タオルを取り外します。
- 麻酔を中止する。
- クロルヘキシジン溶液でトロカールによって作られた切開をきれいにします。微粉化したアルミニウムとプラスチック製のドレッシングでトロカールによって作られた切開を閉じます。
- 術後ケア
- 抗生物質で動物を治療:10 mg/kg のエンロフロキサシン, 皮下, すべての 24-h 5 日間.
- 鎮痛薬の投与: 塩酸ブプレノルフィン (0.03 mg/kg)、筋肉内、3日間の各12時間;メロキシカム (0.2 mg/kg)、皮下、3日間のすべての 24-h。
- 手術後少なくとも30分間は動物を観察してください (動物と使用する麻酔の量によって異なります) 生理的条件を回復させるようにしてください。
- 適切な環境条件を持つ清潔なケージの中で、受信者 (例えば、耳の入れ墨) と動物を個別に識別します。
図 1: 腹腔鏡検査 (外部視野) によって支援される腹腔鏡下胚移植。A)内視鏡用トロカール (1 つのポート) の挿入。B)内視鏡カメラと硬膜外針 (黒色矢印) の挿入。C)硬膜外針を介した胚移植カテーテル (白色矢印) の挿入。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: 腹腔鏡検査 (内部ビュー) によって補助される腹腔鏡下胚移植。A:硬膜外針を通したカテーテルの腹部ゾーンへの挿入。アスタリスクは、infundibulum を示します。B、C、D:胚を装填したカテーテルは、infundibulum を横切って合流領域に挿入される。E、F:胚の放出は、膨潤した卵管の可視化によって確認される。この図は、マルコ-・ヒメネスet al.38この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
2. 胚ガラス化・加温
- 室温 (22 ° c 前後) ですべての操作を行い、より暖かい温度でのガラス化溶液の毒性を低減します。
注: 胚はこの議定書で 0.1-2 μ l の自動ピペットを使用して動くことができるが、最低の容積をドラッグする胚を動かす他の類似した装置は適することができる。 - 2段階の添加手順で胚を Vitrify:
- 10%(v/v) エチレングリコールと 10%(v/v) BM に溶解したジメチルスルホキシドで構成される平衡化溶液中で2分間胚を配置する。
- (ステップ2.2.1 から) 胚を1分間移動して、20%(v/v) エチレングリコールおよび 20%(v/v) BM に溶解されたジメチルスルホキシドで構成されるガラス化溶液にする。
- 125μ l のプラスチック ministraw (綿プラグと1つのオープンエクストリームを持つ1つの閉じた端が含まれている) に胚をロードします。このプロセスは図 3で図式化されています。
- 0.125 μ l ministraw の閉端を適切な microdispenser (例えば Captroll III®) と結合させる。
- このストローの長さが1/3 になるまで BM を吸引除去し、小さな気泡により追従させる。
- 40μ l のガラス化溶液の容量で胚を吸引除去し、続いて別の小さな気泡が続く。
- BM を吸引して最初の液体分画 (ステップ 2.3.2) 綿に到達する。
- 開いた端をストロープラグで閉じます。
- ステップ2.3 が行われている間にステップ2.2.2 を実行し、1分間を超えないようにして、胚に対して有毒であろう。
- Ministraw を液体窒素に直接突入させることでガラス化を実現します。
- 所望の時間のための窒素のデュワーに ministraw を保存します。
- 胚を1ステップで解凍します。
- Ministraw を液体窒素蒸気から 20-30 s の水平 10 cm に置きます。
- 結晶化プロセスは、ministraw の内側に開始すると、10-15 s のために25° c の水浴で ministraw を浸します。
- Ministraw プラグを取り外し、綿栓を切ってください。
- カップリング microdispenser を使用して、ministraw のすべての内容を5分間 BM で25° c で 0.33 M ショ糖溶液を含むプレートに排出します。
注: ガラス化溶液への胚曝露を減らすために、このステップを迅速に行う必要があります。 - 別の5分間 BM 溶液を含む新しいプレートに胚を移動します。
- (そのままのムチンコートと透明帯を持つ) 損傷していない胚のみが ET を継続することを考慮してください。
注: 解凍された胚では、非同期転送 (例えば、桑実胚転送における 60-62 h) は、胚と母体の子宮内膜との間の再同期を可能にすることによって結果を改善し得ることを考慮してください。
図 3: Schematization が正しく装填されていること。A) BM は、ガラス化中に用いられる媒体を操作する胚を指す。胚はガラス化保存液に装填しなければならない。B)胚の位置の詳細を拡大した、装填されたわらの巨視的な外観。この大量の装置は最低の容積装置とは違って私達が多数の胚を vitrify ことを可能にする。なお、この装置の処理は最低の容積装置と比較され易く、結果はウサギ41で類似している。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
新鮮なまたはガラス化された胚の低侵襲的な腹腔鏡下移動は、生殖研究のための最高のモデル動物の中にウサギを配置します。表 1は、転移した胚の異なる発達段階 (図 4) における新鮮な ET の結果を示す。出生時の生存率 (pup に起因する胚の割合) は、この論文で説明されている腹腔鏡技術の有効性を証明した。より高い値は、ET が桑実胚段階の胚で行われたときに達成された, 早期またはコンパクト morulae のいずれか.これらの結果に基づいて、これらの胚のガラス化後の生存率を実証するための第2の実験を行った。このように、表 2では、同時に回収したガラス化ウサギ morulae を移送した後に得られた結果を示し、良好な圧縮度に達していたそれらの胚間の分化を示す。出生時の生存率は、異なる胚の段階の間で異なっていた, 圧縮された morulae で高くなっています.したがって、腹腔鏡下胚移植は、ウサギに新鮮なおよびガラス化された胚を移す信頼性の高い技術である
図 4: ウサギの胚。A)前核期。B) 8 個の細胞。C)初期の桑実胚。D)コンパクトな桑実胚。E)胚盤胞。アスタリスクは、2つの pronuclei を示す。黒色の矢印は透明帯を示す。白い矢印は、通常、胚の間で変化するムチンのコートを示しています。ICM: 内部セル質量。 TE: Trophectoderm。スケールバー:50 μ m。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 発達段階1 | 胚 | 受信者 | 移転先 | 妊娠率 (%) | 着床率 (%) | 出生時生存率 (%)2 |
| 前核期 | 78 | 7 | 卵管 | 7 (100) | 50 (64.0)b | 34 (43.6)b |
| 8細胞 | 81 | 7 | 卵管 | 7 (100) | 60 (74.1)b | 53 (65.4)a |
| 早期桑実胚 | 81 | 7 | 卵管 | 7 (100) | 80 (98.8)a | 60 (74.1)a |
| コンパクト桑実胚 | 80 | 7 | 卵管 | 7 (100) | 80 (100)a | 58 (72.5)a |
| 胚 盤 胞 | 80 | 7 | 子宮 | 7 (100) | 73 (91.3)a | 38 (47.5)b |
表 1.腹腔鏡検査による新鮮なウサギ胚移入 (invivo導出) の効率。 1つの異なる胚を 18-20h (前核期)、36-38h (8 細胞)、60-62 h (初期桑実胚)、70-72 h (コンパクト桑実胚) および 80-82 h (胚盤) 交配後に回収した。密集した (> 32 細胞) および非密集した morulae (≈32細胞) は 70-72 h で創設することができるが、密集した morulae だけ移された。2妊婦の出生時の生存率は、.a、b異なる上付き文字を持つ値は、統計的に異なります (P < 0.001)。
| 発達段階 | 転移した胚 | 受信者 | 妊娠率 (%) | 出生時生存率 (%)1 |
| 非圧縮 | 135 | 10 | 9 (90) | 62 (45.9)b |
| 圧縮 | 150 | 10 | 10 (100.0) | 98 (65.3)a |
| 合計 | 285 | 20 | 19 (95) | 160 (56.1) |
表 2.非圧縮の対コンパクトなガラス化桑実胚の生存率。 a は、異なる上付き文字を持つ b 値は統計的に異なる (P < 0.001)。1妊婦の出生時の生存率は、.胚を同時に回収した (70-72 h) とコンパクト (> 32 細胞) と非コンパクト morulae (≈32細胞) に区別した。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
移入された胚9からの最初の文書化した生きた出生例以来、この技術およびウサギ種は生殖研究において決定的になっている。また、操作、生産、凍結保存などを含む胚研究の研究は、最後のステップとして、健康な完全期の子孫を生成する胚容量の評価を必要とします。従って、胚移植技術は13、28に不可欠である。長年にわたって、母体の子宮に胚を移すために最初に用いられた外科的な方法は、種13、14、15の大多数において徐々により少ない侵襲法によって置換される。21,27,29,30. しかし、ウサギでは、開発の初期胚段階での intraoviductal ET および in vitro産生胚は、自然条件と同様の結果を保証するために不可避となる。ウサギでは、intraoviductal ムチンコートは、子宮角の胚盤胞の拡大中に胚被膜の改造の後に起こるように、胚移植を可能にする重要な因子である。しかし、ムチンコート沈着は排卵後3日間の卵管に限定され、また、コート材料沈着の分子機構はほとんど知られていない31である。これらの理由から、インビトロで開発された胚盤胞は子宮32、33、34に移されると生存しなかったことが知られており、また、損傷を受けたムチンコートを持つ胚は残存率が低い35同様に、ウサギのあおむけ胚転移を報告したグループは、非常に低い生存率11,26をもたらした。ここでは、Besenfelder と Brem18から適応した低侵襲技術を用いて、正常な出生率で胚を移動させる。表 1の結果によると、ウサギの胚の桑実胚段階は、出生時に高い生存率を達成するための最良の胚期であった。1つの可能な説明は、最も早い段階の操作に対するより大きい感受性である。興味深いことに、成功率は、胚の段階が進行するにつれて増加し、おそらくその回復の前に分泌物を oviductal する胚のより大きな暴露による。しかし胚が胚盤胞の段階に達し、一致するペアが子宮に移されると、値は大幅に減少する。言われたことを除いて、卵管に移された胚が、胚操作中にムチン層で発生する可能性のある損傷を回復させることができるかもしれないという説明があります。したがって、子宮に移された胚盤胞はこのメカニズムを奪われることになり、その移植能力を損なう可能性がある。
この技術は、わずかな、簡単な操作で、単一のポート計器 (5 mm 内視鏡トロカール) を使用して行われます。従って、the5 内視鏡トロカール切開は閉鎖を必要としない。腹腔鏡技術の利点は、術後の痛みの減少, 正常な活動への迅速な復帰, そして、術後合併症が少ない.さらに、内視鏡の手順は、より少ない腹部癒着を誘発し、開いた手術21、36、37と比較してレシピエントによるより良い免疫応答を可能にする。私たちの研究室からの証拠を蓄積することは、ウサギモデルにおけるこの ET 手順の有効性を実証しました。したがって、最後の5年間に合計3909の胚 (1335 フレッシュおよび2574ガラス化胚) を、本稿に記載された手順を通じて移した。この技術の結果として、新鮮およびガラス化された移動胚の子孫率は、それぞれ38、39、40、41、42 、62.9% および 42.5% であった、43,44,45,46,47多くの研究は、この技術に基づいています: マルコ-・ヒメネスet al.38,39,40,41, ビセンテet al.42, Viudes ・ド・カストロet al.43, サエンス-ド-Juano et al.44,45,47、ペドララブラダet al.46
この技術を実施するための実用的な推奨事項を以下に説明する。胚培養実験において、培養培地と操作媒体との間で胚を移動させるために用いられるものの代わりに、胚移入のための新しいカテーテルを使用することも推奨される。これは鉱物油の移動を避け、最適の流れを保障する。卵管の過剰な操作は癒着をもたらす可能性があるので、ET の間に生殖管の取り扱いを最小限に抑えることが重要です。卵管がねじれている場合は、硬膜外シリンジを使用して、胚が含まれているためカテーテルではなく、正しく位置決めを試み、機械的な操作によって損失を引き起こす可能性があります。カテーテルが卵管を通過すると、滑りやすくなります。そうでない場合、カテーテルはずれている可能性がある。卵管の中に入ったら、メディアが流れない場合は、カテーテルをわずかに外に動かして再度挿入してみてください。それでも流れない場合は、カテーテルが詰まっています。卵管から取り出し、内容をきれいな媒体で皿に入れる。その後、別のカテーテルに胚をリロードし、再び卵管にそれを再挿入してみてください。配達は通常桑実胚転送後28-30 日に行われます。
さらに、胚発生段階は、女性の pseudopregnant における子宮環境よりも高度であるが、反対ではないことを示す証拠がある。具体的には、胚は、良好な子宮環境を待つ能力を有するが、子宮環境は、移植10のための右の段階で胚を待つことができない。ガラス化胚に関しては、短期/長期保存の後、対応する好ましい子宮環境と胚の発達段階を同期させることができる。さらに、胚ドナーが胚レシピエントでもある場合、子宮内膜に superovulation の有害な影響は、ガラス化技術を使用して、その後のサイクル48で胚を移すことによってバイパスすることができる。ウサギでは、事前に排卵 60-62 h に誘導された起こるのレシピエントに転写したガラス化胚 (非同期性) は、高効率な技術44、49である。これに関連して、10-12 の間の oviductal 胚転移は、細胞生理学の回復および死んだ細胞の置換における有益な効果を説明し、おそらく胚の間にムチンコートで誘発された損傷を修復することが示唆された。操作。また、ガラス化された胚は、それらが貯蔵中に代謝的に懸濁していたので、開発の遅れを提示する。したがって、凍結した胚を非同期のレシピエントに移すことにより、胚はその代謝活性を再活性化することができ、従って胚の発達段階は子宮環境と同期する。その代わりに、凍結保存された胚が共時的受容体に転移すると、母親と胚の間のクロストークが妊娠の成功の妨げとなる。ウサギでは、凍結保存 morulae49の intraoviductal 移動後に最も高い生存率が得られた。桑実胚段階では、70-72 h での圧縮の程度に応じて、凍結保存後の異なる生存率を示すが、我々のデータは、このレポートと一致している (表 2)。ここで、圧縮された morulae は、開発のすべての段階が cryoprotectants の浸透に対して独自のメカニズムを持っていたことを示す以前の報告と一致していた非圧縮 morulae と比較して、出生時に高い生存率を示した凍結保存液50を添加した際の脱水の程度。これらの技術の根底にある、我々は、ガラス化および intraoviductal 胚移植の組み合わせが、液体窒素中の15年間の貯蔵後にウサギ個体を再確立するための成功した戦略であることを示しており、それらの後解凍生存と生の誕生51.
この手法を正常に実行するには、次の詳細を考慮に入れる必要があります。ガラス化に使用される連続した媒体の密度の増加 (DPBS、平衡化溶液、ガラスに保存する溶液) は、進行性胚の脱水による胚の収縮を誘発する可能性があることを念頭に置くことが重要である。しかし、胚が培地で平衡化されると、その正常な外観が回復する。さらに、胚が高密度培地間で移動すると、密度移動による媒体の表面に移動する傾向がある。胚の損失を回避し、ガラス化の時間を確保するためには、胚が所定の位置に維持されるメディアの小さな滴でガラス化を行うことが推奨される。
結論として、ここでは、モデルとしてウサギを用いた将来の研究を促進する ET 手法と胚ガラス化法の両方について述べる。ウサギとヒトの間の近い系統間距離に基づいて、このモデルの使用は、ヒト臨床医学に容易に譲渡可能な結果を提供することができる。さらに、我々の方法は、実験動物の人道的な治療を改善するという目標を維持しながら、動物福祉の 3 Rs (置換、還元および精製) の概念に準拠し、いくつかの衛生的で経済的な利点を提供する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者は何も開示することはありません。
Acknowledgments
この作業は、スペインの経済産業省 (AGL2017 ・ 85162) と Generalitat バレンシアナ研究プログラム (PrometeoII 2014/036) の資金によって支えられました。N. Macowan 英語サービスによる英語テキストバージョンの改訂
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 332 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Alvet Escartí | 626 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Buserelin Acetate | Sigma Aldrich | B3303 | |
| Clorhexidine digluconate soap | Alvet Escartí | 0265DCCJ500B | |
| Clorhexidine digluconate solution | Alvet Escartí | 0265DCCA500B | |
| CO2 | Air Liquide | 99921 | CO2 N48. |
| CO2 Incubator | Fisher scientific | 15385194 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | W387509 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D5773 | Without calcium chloride. |
| Electric razor | Oster Golden A5 | 078005-140-002 | |
| Endoscope camera | Optomic Spain S.A | OP-714 | |
| Endoscope trocar with silicone leaflet valve | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | 30114GK | Lightweight trocar model. |
| Enrofloxacin | Alvet Escartí | 9993046 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Epicraneal needle 23G | Alvet Escartí | 514056353 | Smaller needles can be also used. |
| Epidural catheter | Vygon corporate | 187.10 | |
| Epidural needle | Vygon corporate | 187.10 | |
| Ethylene Glycol | Sigma Aldrich | 102466-M | |
| Eye ointment | Alvet Escartí | 5273 | |
| Ketamine hydrochloride | Alvet Escartí | 184 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Laparoscopy equipment | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | 26003 AA | Hopkins® Laparoscope, 0º-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel. |
| Light source | Optomic Spain S.A | Fibrolux 250 | |
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | P1505XXX | |
| Mechanical CO2 insufflator | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | Endoflator® | |
| Meloxicam | Alvet Escartí | 9993501 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Petri dishes, 35-mm | Sigma Aldrich | CLS430165-500EA | |
| Plastic dressing (Nobecutan) | IBOR medica | 7140028 | |
| Plastic Straw 0.25 mL | IMV - technologies | 6431 | |
| Povidone iodide solution | Alvet Escartí | 02656DPYS500S | |
| Scissors | ROBOZ | RS-5880 | Any regular surgical grade steel small straight scissors will work. |
| Silicone tube for insufflator | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | 20400040 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16F | There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. |
| Sterile Gloves | Alvet Escartí | 087GL010075 | |
| Sterile gown | Alvet Escartí | 12261501 | |
| Sterile mask | Alvet Escartí | 058B15924B | |
| Straw Plug | IMV - technologies | 6431 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Syringe, 1-mL | Fisher scientific | 11750425 | |
| Syringe, 5-mL | Fisher scientific | 11773313 | |
| Urinary catheter | IMV - technologies | 17722 | |
| Waterbath | RAYPA | BAE-4 | |
| Xylazine | Alvet Escartí | 525225 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Rabbits | Universitat Politècnica de València | Line A | Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used. |
References
- Chen, M., Heilbronn, L. K. The health outcomes of human offspring conceived by assisted reproductive technologies (ART). Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 388-402 (2017).
- Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo vitrification in rabbits: Consequences for progeny growth. Theriogenology. 84 (5), 674-680 (2015).
- Sirard, M. A. The influence of in vitro. fertilization and embryo culture on the embryo epigenetic constituents and the possible consequences in the bovine model. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 411-417 (2017).
- Feuer, S. K., Rinaudo, P. F. Physiological, metabolic and transcriptional postnatal phenotypes of in vitro. fertilization (IVF) in the mouse. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 403-410 (2017).
- Jiang, Z., et al. Genetic and epigenetic risks of assisted reproduction. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 44, 90-104 (2017).
- Fleming, T. P., Velazquez, M. A., Eckert, J. J. Embryos, DOHaD and David Barker. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 6 (5), 377-383 (2015).
- Sparks, A. E. Human embryo cryopreservation-methods, timing, and other considerations for optimizing an embryo cryopreservation program. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (2), 128-144 (2015).
- Swain, J. E.
- Heape, W. Preliminary note on the transplantation and growth of mammalian ova within a uterine foster-mother. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 48, 457-459 (1890).
- Bermejo-Alvarez, P., Park, K. E., Telugu, B. P. Utero-tubal embryo transfer and vasectomy in the mouse model. Journal of Visualized Experiments. (84), e51214 (2014).
- Kidder, J. D., Roberts, P. J., Simkin, M. E., Foote, R. H., Richmond, M. E. Nonsurgical collection and nonsurgical transfer of preimplantation embryos in the domestic rabbit (Oryctolagus cuniculus) and domestic ferret (Mustela putorius furo). Journal of Reproduction and Fertility. 116 (2), 235-242 (1999).
- Tıras, B., Cenksoy, P. O. Practice of embryo transfer: recommendations during and after. Seminars in Reproductive Medicine. 32 (4), 291-296 (2014).
- Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (3), 228-231 (2014).
- Moreno-Moya, J. M., et al. Complete method to obtain, culture, and transfer mouse blastocysts nonsurgically to study implantation and development. Fertility and Sterility. 101 (3), e13 (2014).
- Hasler, J. F. Forty years of embryo transfer in cattle: a review focusing on the journal Theriogenology, the growth of the industry in North America, and personal reminisces. Theriogenology. 81 (1), 152-169 (2014).
- Bauer, C. The baboon (Papio sp.) as a model for female reproduction studies. Contraception. 92 (2), 120-123 (2015).
- Martinez, E. A., et al. Nonsurgical deep uterine transfer of vitrified, in vivo-derived, porcine embryos is as effective as the default surgical approach. Science Reports. 5, 10587 (2015).
- Besenfelder, U., Brem, G.
- Besenfelder, U., Mödl, J., Müller, M., Brem, G. Endoscopic embryo collection and embryo transfer into the oviduct and the uterus of pigs. Theriogenology. 47 (5), 1051-1060 (1997).
- Besenfelder, U., Havlicek, V., Kuzmany, A., Brem, G. Endoscopic approaches to manage in vitro and in vivo embryo development: use of the bovine oviduct. Theriogenology. 73 (6), 768-776 (2010).
- Fonseca, J. F., et al. Nonsurgical embryo recovery and transfer in sheep and goats. Theriogenology. 86 (1), 144-151 (2016).
- Denker, H. W. Structural dynamics and function of early embryonic coats. Cells Tissues Organs. 166, 180-207 (2000).
- Marco-Jiménez, F., López-Bejar, M. Detection of glycosylated proteins in rabbit oviductal isthmus and uterine endometrium during early embryo development. Reproduction in Domestic Animals. 48 (6), 967-973 (2013).
- Ménézo, Y. J., Hérubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reproductive BioMedicine Online. 4 (2), 170-175 (2002).
- Fischer, B., Chavatte-Palmer, P., Viebahn, C., Navarrete Santos, A., Duranthon, V. Rabbit as a reproductive model for human health. Reproduction. 144 (1), 1-10 (2012).
- Besenfelder, U., Strouhal, C., Brem, G. A method for endoscopic embryo collection and transfer in the rabbit. Zentralbl Veterinarmed A. 45 (9), 577-579 (1998).
- Daniel, N., Renard, J. P.
- Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters rabbit foetal placenta at transcriptomic and proteomic level. Reproduction. 147 (6), 789-801 (2014).
- Green, M., Bass, S., Spear, B. A device for the simple and rapid transcervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications. Biotechniques. 47 (5), 919-924 (2009).
- Duan, X., Li, Y., Di, K., Huang, Y., Li, X. A nonsurgical embryo transfer technique in mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 32 (4), 440-446 (2016).
- Denker, H. W., Gerdes, H. J. The dynamic structure of rabbit blastocyst coverings. I. Transformation during regular preimplantation development. Anatomy and Embryology. 157, 15-34 (1979).
- Seidel, G. E., Bowen, R. A., Kane, M. T. In vitro fertilization, culture and transfer of rabbit ova. Fertility and Sterility. 27, 861-870 (1976).
- Binkerd, P. E., Anderson, G. B. Transfer of cultured rabbit embryos. Gamete Research. 2, 65-73 (1979).
- Murakami, H., Imai, H. Successful implantation of in vitro cultured rabbit embryos after uterine transfer: a role for mucin. Molecular Reproduction and Development. 43, 167-170 (1996).
- Techakumphu, M., Wintenberger-Torrèsa, S., Sevelleca, C., Ménézo, Y. Survival of rabbit embryos after culture or culture/freezing. Animal Reproduction Science. 13 (3), 221-228 (1987).
- Gitzelmann, C. A., et al. Cell-mediated immune response is better preserved by laparoscopy than laparotomy. Surgery. 127 (1), 65-71 (2000).
- Huang, S. G., Li, Y. P., Zhang, Q., Redmond, H. P., Wang, J. H., Wang, J. Laparotomy and laparoscopy diversely affect macrophage-associated antimicrobial activity in a murine model. BMC Immunology. 14, 27 (2013).
- Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Almela-Miralles, V., Vicente, J. S. Development of Cheaper Embryo Vitrification Device Using the Minimum Volume Method. Public Library of Science One. 11 (2), e0148661 (2016).
- Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Generation of live offspring from vitrified embryos with synthetic polymers supercool X-1000 and Supercool Z-1000. CryoLetters. 35, 286-292 (2014).
- Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Use of cyclodextrins to increase cytoplasmic cholesterol in rabbit embryos and their impact on live KITs derived from vitrified embryos. Cryoletters. 35, 320-326 (2014).
- Marco-Jiménez, F., Lavara, R., Jiménez-Trigos, E., Vicente, J. S. In vivo development of vitrified rabbit embryos: Effects of vitrification device, recipient genotype, and asynchrony. Theriogenology. 79 (7), 1124-1129 (2013).
- Vicente, J. S., et al. Rabbit morula vitrification reduces early foetal growth and increases losses throughout gestation. Cryobiology. 67, 321-326 (2013).
- Viudes-de-Castro, M. P., Marco-Jiménez, F., Cedano-Castro, J. I., Vicente, J. S. Effect of corifollitropin alfa supplemented with or without Lh on ovarian stimulation and embryo viability in rabbit. Theriogenology. 98, 68-74 (2017).
- Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters at transcriptomic and proteomic level rabbit foetal placenta. Reproduction. 147, 789-801 (2014).
- Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Lavara, R., Vicente, J. S. Direct comparison of the effects of slow freezing and vitrification on late blastocyst gene expression, development, implantation and offspring of rabbit morulae. Reproduction in Domestic Animals. 49, 505-511 (2014).
- Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Long-term and transgenerational effects of cryopreservation on rabbit embryos. Theriogenology. 81, 988-992 (2014).
- Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo transfer manipulation cause gene expression variation in blastocysts that disrupt implantation and offspring rates at birth in rabbit. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 207, 50-55 (2016).
- Roque, M., Valle, M., Kostolias, A., Sampaio, M., Geber, S. Freeze-all cycle in reproductive medicine: current perspectives. JBRA Assisted Reproduction. 21 (1), 49-53 (2017).
- Tsunoda, Y., Soma, T., Sugie, T. Effect of post-ovulatory age of recipient on survival of frozen-thawed rabbit morulae. Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 483-487 (1982).
- Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
- Lavara, R., Baselga, M., Vicente, J. S. Does storage time in LN2 influence survival and pregnancy outcome of vitrified rabbit embryos? Theriogenology. 76 (4), 652-657 (2011).
