Summary
Las técnicas de reproducción asistida (ARTs) están en continua evaluación para mejorar los resultados y reducir los riesgos asociados. Este manuscrito describe un procedimiento de transferencia de embriones mínimamente invasivo con un eficiente protocolo de criopreservación que permite el uso de conejos como un modelo animal ideal de reproducción humana.
Abstract
Las técnicas de reproducción asistida (ARTs), como la cultura embrionaria in vitro o la criopreservación de embriones, afectan a los patrones de desarrollo natural con consecuencias perinatales y postnatales. Para garantizar la inocuidad de las aplicaciones de ART, es necesario realizar estudios en modelos animales. Además, como último paso, los estudios de desarrollo de embriones requieren la evaluación de su capacidad para desarrollar crías sanas a término. Aquí, la transferencia de embriones al útero es indispensable para realizar cualquier experimento relacionado con las artes.
El conejo se ha utilizado como un organismo modelo para estudiar la reproducción de mamíferos durante más de un siglo. Además de su proximidad filogenética a la especie humana y su pequeño tamaño y bajo costo de mantenimiento, tiene características reproductivas importantes como la ovulación inducida, una cronología de desarrollo embrionario temprano similar a los seres humanos y una breve gestación que nos permiten estudiar fácilmente las consecuencias de la aplicación de ART. Además, las Artes (como la inyección intracitoplasmática de espermatozoides, el cultivo de embriones o la criopreservación) se aplican con la eficiencia adecuada en esta especie.
Utilizando la técnica de transferencia de embriones laparoscópica y el protocolo de criopreservación presentados en este artículo, describimos 1) Cómo transferir embriones a través de una técnica fácil, mínimamente invasiva y 2) un protocolo eficaz para el almacenamiento a largo plazo de conejo embriones para proporcionar capacidades logísticas flexibles en el tiempo y la capacidad de transportar la muestra. Los resultados obtenidos después de la transferencia de embriones de conejo en diferentes etapas de desarrollo indican que la Mórula es la etapa ideal para la recuperación y transferencia de embriones de conejo. Por lo tanto, se requiere una transferencia de embriones oviductal, justificando el procedimiento quirúrgico. Además, las morulae de conejo se vitrifican con éxito y se transfieren por vía laparoscópica, demostrando la efectividad de las técnicas descritas.
Introduction
Con los objetivos de eludir la infertilidad humana o mejorar la difusión de ganado de alto valor genético y preservar los recursos genéticos animales, un conjunto de técnicas colectivamente denominadas tecnologías de reproducción asistida, tales como la superovulación, en la fertilización vitro, la cultura embrionaria o la criopreservación, se desarrollaron1,2. Actualmente, se administran tratamientos hormonales para estimular los ovarios y producir un gran número de folículos ováricos antrales1. Los ovocitos recolectados de estos folículos se pueden madurar, fertilizar y desarrollar in vitro hasta que sean criopreservados o transferidos a madres sustitutas3. Sin embargo, durante estos tratamientos, los gametos y los cigotos están expuestos a una serie de procesos no fisiológicos que podrían requerir la adaptación del embrión para sobrevivir en estas condiciones4,5. Esta adaptación es posible debido a la plasticidad embrionaria temprana, que permite cambios en los embriones en la expresión génica y la programación del desarrollo6. Sin embargo, estas modificaciones pueden influir en las etapas subsiguientes del desarrollo del embrión hasta la edad adulta, y ahora se acepta ampliamente que los métodos, el tiempo, el procedimiento de criopreservación o las condiciones de cultivo muestran diferentes resultados en el destino del embrión7 , 8. por lo tanto, para dilucidar los efectos específicos inducidos de las artes, el uso de modelos animales bien caracterizados es inevitable.
El primer parto en vivo documentado resultante de la transferencia de embriones de mamíferos tuvo lugar en 18909. Hoy, la transferencia de embriones (ET) a una hembra sustituta es un paso crucial en el estudio de los efectos inducidos por el arte durante la preimplantación en las siguientes etapas de desarrollo del embrión10. Las técnicas ET dependen del tamaño y la estructura anatómica de cada animal. En el caso de modelos animales de gran tamaño, ha sido posible realizar ET por técnicas no quirúrgicas ET transcervicales, pero en las especies de tamaño más pequeño el cateterismo del cuello uterino es más complejo y las técnicas quirúrgicas se utilizan con frecuencia11. Sin embargo, la ET quirúrgica puede causar hemorragia que podría perjudicar la implantación y el desarrollo del embrión, ya que la sangre puede invadir el lumen uterino, causando la muerte del embrión10. Las técnicas transcervicales no quirúrgicas et se siguen aplicando en humanos, babuinos, bovinos, cerdos y ratones12,13,14,15,16,17, pero quirúrgicos Los ETS se siguen utilizando en especies como cabras, ovejas u otros animales que presentan dificultades adicionales10,18,19,20,21, como conejos (dos cervices independientes) o ratones (tamaño pequeño). Sin embargo, los métodos de transferencia quirúrgica tienden a haber sido reemplazados gradualmente por métodos menos invasivos. La endoscopia se utilizó para transferir embriones, por ejemplo, en conejos, cerdos y pequeños rumiantes18,19,20. Estos métodos de endoscopia mínimamente invasivas se pueden utilizar para transferir embriones a la ampolla a través del infundibulum, que es esencial en los conejos y ha demostrado efectos beneficiosos en algunas especies20. Esto se basa en la importancia del diálogo correcto entre el embrión y la madre durante las etapas tempranas del embrión en el oviducto. Como se mencionó anteriormente, la remodelación del embrión que tiene lugar en conejos durante la migración de embriones a través del oviducto es esencial para lograr embriones capaces de implantar22,23.
Los modelos animales de mayor tamaño, como el bovino, son interesantes porque las características bioquímicas y preimplantarias son similares a las de las especies humanas24. Sin embargo, los animales grandes son demasiado caros de usar en los ensayos preliminares, y los roedores se consideran un modelo ideal (76% los organismos modelo son roedores) para la investigación de laboratorio25. Sin embargo, el modelo de conejo ofrece algunas ventajas sobre los roedores en los estudios reproductivos, ya que algunos procesos biológicos reproductivos expuestos por los seres humanos son más similares en conejos que en los ratones. Los humanos y los conejos presentan una activación cronológica del genoma embrionario similar, la gastrulación y la estructura emocorial de la placenta. Además, el uso de conejos es posible conocer el momento exacto de la fertilización y las etapas del embarazo debido a su ovulación inducida25. Los ciclos de vida del conejo son cortos, completando la gestación en 31 días y alcanzando la pubertad en aproximadamente 4-5 meses; el animal es fácil de manejar debido a su comportamiento dócil y no agresivo, y su mantenimiento es muy económico comparado con el gasto de animales más grandes. Por otra parte, es crucial mencionar que los conejos tienen un útero dúplex con dos cervixes independientes11,25. Esto coloca al conejo en una posición preferencial, ya que los embriones de los diferentes grupos experimentales pueden transferirse al mismo animal, pero en un cuerno uterino diferente. Esto nos permite comparar ambos efectos experimentales, reduciendo el factor materno de los resultados.
En la actualidad, los métodos de ET no quirúrgicos no se utilizan en conejos. Algunos estudios realizados a finales de los años 90 utilizando una técnica transcervical et resultaron en tasas de entrega bajas que oscilan entre el 5,5% y el 20,0%11,26 versus el 50-65% por métodos quirúrgicos, entre ellos el procedimiento de laparoscopia descrito por Besenfelder y Brem18. Las bajas tasas de éxito de estos métodos no quirúrgicos de ET en conejos coinciden con la falta de la remodelación necesaria del embrión en el oviducto, que se evita en la ET transcervical. Aquí, describimos un procedimiento de ET laparoscópica mínimamente invasivo eficaz utilizando conejos como un organismo modelo. Esta técnica proporciona un modelo para una mayor investigación reproductiva en animales grandes y humanos.
Debido a que los conejos tienen una ventana de tiempo particularmente estrecha para la implantación de embriones, la ET en esta especie requiere un alto grado de sincro entre la etapa de desarrollo del embrión en ET y el estado fisiológico del receptor27. En algunos casos, después de un tratamiento reproductivo que ralentiza el desarrollo del embrión (como la cultura in vitro ) o altera la receptividad endometrial (como los tratamientos de superovulación), no hay ninguna sincronía entre el embrión y el útero materno. Estas situaciones pueden afectar negativamente al resultado. Para responder en estos contextos, describimos un protocolo de vitrificación de mórula de conejo eficaz que nos permite pausar, organizar y reanudar los experimentos. Este proceso es logísticamente deseable para los estudios reproductivos y nos da la capacidad para el almacenamiento a largo plazo de embriones, permitiendo su transporte. El procedimiento laparoscópico y las estrategias de criopreservación permiten una mejor planificación de los estudios con menos animales. Por lo tanto, nuestra metodología ofrece ventajas higiénicas y económicas y se ajusta al concepto de la 3Rs (sustitución, reducción y refinamiento) de la investigación animal con el objetivo declarado de mejorar el tratamiento humano de los animales experimentales. Así, con estos métodos, los conejos constituyen un organismo modelo ideal para los ensayos reproductivos in vivo .
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales utilizados en este estudio se realizaron de conformidad con la Directiva 2010/63/CEE de la UE para experimentos con animales y fueron revisados y aprobados por el Comité ético para la experimentación con animales de la Universitat Politècnica de València, España (código de investigación: 2015/VSC/PEA/00170). XGD, FMJ, MPVC y JSV posee un certificado de autorización expedido por la administración gubernamental Valenciana para experimentar con animales. XGD está autorizada a supervisar in situ el bienestar y el cuidado de los animales durante el experimento.
1. transferencia de embriones
- Preparación de hembras beneficiarias
- Utilice únicamente hembras sexualmente maduras (> 4,5 meses de edad).
- Una semana antes del ET, adaptar las hembras a un régimen de 16 h de luz/8 h oscuro para iniciar el crecimiento folicular y la receptividad femenina mejorada.
- Seleccione las hembras destinatarias, observando la turgencia y el color de la vulva. Si la vulva es turgentes y rojiza, la hembra es receptiva.
- Inducir pseudoembarazo (ovulación) por una sola inyección intramuscular de 1 μg de acetato de buserelina (análogo sintético de la hormona liberadora de gonadotropina) independientemente del peso corporal.
Nota: normalmente, 0,8 μg es una dosis adecuada para la inducción de la ovulación en conejos de tamaño mediano (4-5 kg), por lo que 1 μg generalmente garantiza la ovulación. - Inducir la ovulación con tantos días de antelación como la edad de los embriones a ser transferidos (por ejemplo, 70-72 h antes de la mórula fresca et).
- La anestesia y la analgesia
- Pesar el conejo y cargar los siguientes anestésicos y analgésicos.
- En una jeringa de 1 mL con una aguja de 30G: carga de xilazina (5mg/kg) y clorhidrato de buprenorfina (0,03 mg/kg). En otra jeringa de 1 mL con una aguja pericranial 23G, cargue clorhidrato de ketamina (35 mg/kg).
- Sostenga el conejo e inyecte la mezcla de xilazina-buprenorfina por vía intramuscular.
- Inserte la aguja pericranial con ketamina en la vena del oído marginal, introduciendo lentamente todo el contenido de la jeringa por vía intravenosa.
- Fije la aguja y déjala insertada a lo largo de los pasos restantes para administrar más anestesia si es necesario.
- Dejar el conejo en la jaula (limpia y sin ningún otro animal) en un escenario cálido.
- Una vez inconsciente, aplicar ungüento ocular para evitar la sequedad del ojo y comprobar la ausencia del Freflex palpebral.
Nota: este protocolo proporciona un plano quirúrgico de anestesia durante un mínimo de 30 min. Si se requiere un tiempo más largo, inyectar dosis adicionales con la mitad de la cantidad de hidrocloruro de ketamina descrita en 1.2.1 después de 30 min. - Controle la profundidad de la anestesia comprobando el reflejo del pedal y el movimiento respiratorio. Los cambios en el patrón respiratorio a una tasa irregular y más rápida indican la pérdida del plano adecuado de la anestesia.
- Monitorear el color de las membranas mucosas (ojos, labios, etc.), la frecuencia respiratoria (30-60 respiraciones por minuto), la frecuencia cardíaca (120-325 latidos por minuto) y la temperatura rectal (38-39.6 ° c).
- Ocho horas antes de la transferencia, retener los alimentos de los animales para evitar el mayor tamaño del intestino y la actividad hasta que el proceso de ET está terminado. Deje libre el acceso al agua.
- Pesar el conejo y cargar los siguientes anestésicos y analgésicos.
- La preparación del embrión
- Calentar el medio de manipulación del embrión a 25 ° c: medio base (BM), que consiste en la solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco (DPBS) complementada con un 0,2% (p/v) de albúmina sérica bovina.
- Al trabajar bajo un microscopio Estereomicroscopio, enjuague los embriones frescos o descongelados (paso 2) con BM.
- Con guantes estériles, fije un catéter epidural 17G apropiadamente configurado a una jeringa de 1 mL.
- Aspiran 1 cm de BM en el catéter, seguido de una pequeña burbuja de aire.
- Aspirar 5-7embriones en un volumen de 10 μL de BM, seguido de otra pequeña burbuja de aire.
- Terminar de cargar el catéter aspirando 1 cm de BM.
- La transferencia de embriones
- Considere el uso de guantes estériles, vestido y máscara para asegurar un ambiente aséptico.
- Esterilice los instrumentos quirúrgicos, limpie las superficies donde se realizará la cirugía y límpielos con etanol al 70%.
- Realice la anestesia como se detalla anteriormente (paso 1,2), comprobando la pérdida de reflejos.
- Afeita el pelaje del abdomen ventral con una maquinilla de afeitar eléctrica.
- Preparar el abdomen ventral asépticamente.
- Limpie el área quirúrgica y retire el vello restante. Lavar el área quirúrgica con un jabón de gluconato de clorhexidina. Sanitizar la zona con solución de clorhexidina y etanol 96 º (3 veces).
- Coloque el animal en una mesa quirúrgica tibia, en la posición de Trendelenburg (diríjase hacia abajo a 45 °) para asegurarse de que el estómago y los intestinos están localizados craneal. Considere la evacuación de la vejiga si es turgid. Si alguna vísceras se dañan en el proceso, el animal puede morir. Por lo tanto, es importante que se encuentran correctamente (figura 1).
- Cubra el área con una toalla estéril, con un orificio (fenestration) que exponga el área afeitada, para separar el sitio quirúrgico de cualquier posible contaminación.
- Insertar un trocar endoscópico 5 cm en la cavidad abdominal, 2 cm caudal al proceso xifoides, e insufflar a través de ella la cavidad peritoneal con un Insufflator mecánico regulador de presión.
Nota: la presión intraabdominal debe ser de 8-12 mmHg con CO2 (figura 1A). - Inserte la cámara del endoscopio a través del trocar endoscópico (figura 1B).
Nota: identificar el tracto reproductivo, determinar el estado y la posición del infundíbulo y ampolla antes de et para facilitar los siguientes pasos. - Inserte la aguja epidural 17-G en la región inguinal entre 2-3 cm del infundíbulo (figura 1B).
- Identifique la entrada del infundíbulo (figura 2A, 2B).
- Inserte el catéter cargado (paso 1,3) a través de la aguja epidural en el abdomen (figura 1C).
- Localice el oviducto e inserte 1-2 cm del catéter epidural a través del infundíbulo en la ampolla (figura 2A-2C). No avance muy lejos en el oviducto para evitar daños y hemorragias.
- Suelte los embriones en el oviducto presionando suavemente el émbolo de la jeringa acoplada al catéter (Figura 2D-2F). Ambas burbujas de aire deben salir del catéter.
- Retire el catéter justo después de que los embriones hayan sido liberados.
- Enjuague el catéter, aspirando y liberando el medio de manipulación para comprobar la ausencia de los embriones y confirmar su transferencia exitosa.
- Repita los pasos 1.4.11 a 1.4.16 en el otro lado del útero, si lo desea.
- Retire la aguja epidural y la cámara endoscopio.
- Libere el CO2 a través del trocar endoscópico. Si el exceso de gas permanece en el abdomen del animal, tendrá dolor y molestias.
- Retire el trocar endoscópico de la cavidad abdominal. Retire la toalla quirúrgica.
- Suspenda la anestesia.
- Limpie la incisión hecha por el trocar con solución de clorhexidina. Cerrar la incisión hecha por el trocar con un aluminio micronizado y un apósito de plástico.
- La atención postoperatoria
- Tratar a los animales con antibióticos: 10 mg/kg de enrofloxacina, por vía subcutánea, cada 24-h durante 5 días.
- Administrar analgésicos: clorhidrato de buprenorfina (0,03 mg/kg), por vía intramuscular, cada 12 horas durante 3 días; Meloxicam (0,2 mg/kg), por vía subcutánea, cada 24-h durante 3 días.
- Vigilar a los animales durante al menos 30 minutos después de la cirugía (dependiendo del animal y la dosis de anestesia utilizada) asegurándose de que recuperen sus condiciones fisiológicas.
- Identifique el recipiente (por ejemplo, el tatuaje del oído) y los animales de la casa individualmente en una jaula limpia con la condición ambiental apropiada.
Figura 1: transferencia de embriones laparoscópica asistida por laparoscopia (vista externa). A) inserción del trocar endoscópico (un puerto). B) inserción de la cámara endoscópica y de la aguja epidural (flecha negra). C) inserción del catéter de transferencia de embriones (flecha blanca) a través de la aguja epidural. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: transferencia de embriones laparoscópica asistida por laparoscopia (vista interna). A: Inserción del catéter a través de la aguja epidural en la zona abdominal. El asterisco indica el infundibulum. B, C, D: El catéter cargado con los embriones se inserta en la región de ampolla a través del infundibulum. E, F: Liberación de los embriones, confirmado por la visualización de un oviducto inflamado. Esta figura ha sido adaptada de marco-Jiménez et al. 38. por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. vitrificación y calentamiento de embriones
- Realice todas las manipulaciones a temperatura ambiente (alrededor de 22 ° c) para reducir la toxicidad de la solución de vitrificación a temperaturas más cálidas.
Nota: los embriones pueden ser movidos usando pipetas automáticas de 0,1-2 μL en este protocolo, pero otros dispositivos similares para mover los embriones que arrastran el volumen mínimo pueden ser adecuados. - Vitrificar los embriones en un procedimiento de adición de dos pasos:
- Colocar los embriones durante 2 minutos en solución equilibrante consistente en un 10% (v/v) de etilenglicol y un 10% (v/v) de dimetilsulfóxido disuelto en BM.
- Mover los embriones (del paso 2.2.1) durante 1 minuto a la solución de vitrificación que consiste en un 20% (v/v) de etilenglicol y un 20% (v/v) de dimetilsulfóxido disuelto en BM.
- Cargue los embriones en un ministraw de plástico de 125 μL (que contiene un extremo cerrado con un tapón de algodón y un extremo abierto). El proceso se esquematiza en la figura 3.
- Acoplar el extremo cerrado de 0,125 μL ministraw con el microdispensador adecuado (p. ej. Captroll III®).
- Aspiran BM hasta 1/3 de la longitud de la paja, siguiendo por una pequeña burbuja de aire.
- Aspirar los embriones en un volumen de 40 μL de solución de vitrificación, seguida de otra pequeña burbuja de aire.
- Aspirar BM hasta que la primera fracción líquida (paso 2.3.2) llegue al algodón.
- Cierre el extremo abierto con un tapón de paja.
- Realice el paso 2.2.2 mientras se realiza el paso 2,3 para asegurarse de que no transcurera más de un minuto, lo que sería tóxico para los embriones.
- Sumergir el ministraw directamente en nitrógeno líquido para lograr la vitrificación.
- Almacene el ministraw en una Dewar por nitrógeno durante el tiempo deseado.
- Descongelar los embriones en un solo paso.
- Colocar el ministraw horizontalmente 10 cm de vapor de nitrógeno líquido para 20-30 s.
- Cuando el proceso de cristalización comienza dentro del ministraw, sumergir el ministraw en un baño de agua a 25 ° c para 10-15 s.
- Quite el tapón del ministraw y corte el tapón de algodón.
- Con un microdispensador acoplado, expulse todo el contenido del ministraw en una placa que contenga una solución de sacarosa de 0,33 M a 25 ° c en BM durante 5 minutos.
Nota: este paso debe realizarse rápidamente con el fin de reducir la exposición de embriones a la solución de vitrificación. - Mover los embriones a una nueva placa que contenga la solución BM durante otros 5 min.
- Considerar únicamente embriones no dañados (con capa de mucina intacta y zona pellucida) para continuar con el ET.
Nota: tenga en cuenta que en los embriones descongelados, las transferencias asíncronas (p. ej., 60-62 h en las transferencias de mórula) pueden mejorar los resultados permitiendo una resincronización entre el embrión y el endometrio materno.
Figura 3: esquematización de la paja correctamente cargada. A ) BM se refiere a los medios de manipulación de embriones empleados durante la vitrificación. Los embriones deben cargarse en la solución de vitrificación. B) aspecto macroscópico de la paja cargada con un detalle magnificado de la posición del embrión. Este dispositivo de gran volumen nos permite vitrificar un gran número de embriones, a diferencia de los dispositivos de volumen mínimos. Además, el manejo de este dispositivo es más fácil en comparación con los dispositivos de volumen mínimo, mientras que los resultados son similares en conejos41. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Representative Results
La transferencia laparoscópica mínimamente invasiva de embriones frescos o vitrificados coloca al conejo entre los mejores animales modelo para estudios reproductivos. El cuadro 1 muestra los resultados de la et fresca en diferentes etapas de desarrollo (figura 4) de embriones transferidos. La tasa de supervivencia al nacer (porcentaje de embriones que resultan en un cachorro) demostró la eficacia de la técnica laparoscópica descrita en este artículo. Los valores más elevados se alcanzaron cuando el et se realizó con embriones en la etapa de la mórula, ya sean morulae tempranas o compactas. Basándonos en estos resultados, realizamos un segundo experimento para demostrar la tasa de supervivencia después de la vitrificación de estos embriones. Así, en el cuadro 2 mostramos los resultados obtenidos tras la transferencia de morulae de conejo vitrificado recuperados al mismo tiempo, diferenciando entre los embriones que habían alcanzado un buen grado de compactación o no. La tasa de supervivencia al nacer fue diferente entre las diferentes etapas del embrión, siendo más alta en las morulae compactadas. Por lo tanto, la transferencia de embriones laparoscópicos es una técnica fiable para la transferencia del embrión fresco y vitrificado en conejos
Figura 4: embriones de conejo. A) pronuclear. B) ocho células. C) Morula temprana. D) Morula compacta. E) blastocisto. El asterisco indica los dos pronuclei. Las flechas negras indican la zona pellucida. Las flechas blancas indican el pelaje de mucina, que normalmente varía entre embriones. ICM: masa interna de la célula. TE: Trophectoderm. Barra de escala: 50 μm. por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Etapa de desarrollo1 | Embriones | Destinatarios | Lugar de la transferencia | Tasa de embarazo (%) | Tasa de implantación (%) | Tasa de supervivencia al nacer (%)2 |
| Pronuclear | 78 | 7 | Oviducto | 7 (100) | 50 (64,0)b | 34 (43,6)b |
| 8 células | 81 | 7 | Oviducto | 7 (100) | 60 (74,1)b | 53 (65,4)un |
| La mórula temprana | 81 | 7 | Oviducto | 7 (100) | 80 (98,8)un | 60 (74,1)un |
| Mórula compacta | 80 | 7 | Oviducto | 7 (100) | 80 (100)un | 58 (72,5)un |
| Blastocisto | 80 | 7 | útero | 7 (100) | 73 (91,3)un | 38 (47,5)b |
Tabla 1. Eficiencia de la transferencia de embriones de conejo fresco (in vivo derivado) por laparoscopia. se recuperaron 1embriones diferentes a 18-20h (pronuclear), 36-38h (8 células), 60-62 h (Morula temprana), 70-72 h (Morula compacta) y 80-82 h (blastocisto) después del apareamiento. Compactas (> 32 celdas) y morulae no compactas (≈ 32 celdas) pueden ser fundadas a 70-72 h, pero sólo se transfirieron morulae compactas. 2 Tasa de supervivencia al nacer del receptor embarazada. a, b Los valores con diferentes superíndices son estadísticamente diferentes (P < 0.001).
| Etapa de desarrollo | Los embriones transferidos | Destinatarios | Tasa de embarazo (%) | Tasa de supervivencia al nacer (%)1 |
| No compactado | 135 | 10 | 9 (90) | 62 (45,9)b |
| Compactado | 150 | 10 | 10 (100,0) | 98 (65,3)un |
| totalizar | 285 | 20 | 19 (95) | 160 (56,1) |
Tabla 2. Viabilidad de Morula vitrificada no compactada frente a compacta. a,los valores b con diferentes superíndices son estadísticamente diferentes (P < 0.001). 1 Tasa de supervivencia al nacer del receptor embarazada. Los embriones se recuperaron al mismo tiempo (70-72 h) y se distinguieron en compactas (> 32 células) y morulae no compactas (≈ 32 células).
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Discussion
Desde el primer caso documentado de nacimiento vivo de embriones transferidos9, esta técnica y las especies de conejo se han vuelto cruciales en los estudios reproductivos. Además, los estudios de investigación embrionaria que implican manipulación, producción, criopreservación, etc. requieren como último paso la evaluación de la capacidad de los embriones para generar crías sanas a término completo. Por lo tanto, la técnica de transferencia de embriones es indispensable13,28. A lo largo de los años, los métodos quirúrgicos empleados inicialmente para transferir embriones al útero materno han sido gradualmente sustituidos por métodos menos invasivos en la gran mayoría de las especies13,14,15, 21 , 27 , 29 , 30. sin embargo, en conejos, el intraoviductal et en las etapas tempranas del embrión de desarrollo y los embriones producidos in vitro resultan inevitables para garantizar un resultado similar a las condiciones naturales. En conejos, el manto de mucina intraoviductal es un factor crucial que permite la implantación del embrión, ya que tiene lugar después de la remodelación de los recubrimientos embrionarios durante la expansión de blastocisto en los cuernos uterinos. Sin embargo, la deposición de la capa de mucina se limita al oviducto durante 3 días después de la ovulación, y los mecanismos moleculares de deposición del material de la capa son ampliamente desconocidos31. Por estas razones, se sabe que los blastocistos desarrollados in vitrono sobrevivieron cuando se transfirieron al útero32,33,34, y los embriones con una capa de mucina dañada tienen una menor tasa de supervivencia 35. del mismo modo, los grupos que informaron una transferencia de embriones transcervical en conejos resultaron en tasas de nacidos vivos muy bajas11,26. Aquí, presentamos una técnica mínimamente invasiva, adaptada de Besenfelder y Brem18, para transferir embriones con tasas de natalidad exitosas. Según los resultados del cuadro 1, la etapa de mórula en embriones de conejo fue la mejor etapa embrionaria para lograr una alta tasa de supervivencia al nacer. Una posible explicación es la mayor sensibilidad a la manipulación de las primeras etapas. Curiosamente, la tasa de éxito aumenta a medida que avanza la etapa embrionaria, posiblemente debido a la mayor exposición del embrión a las secreciones oviductales antes de su recuperación. Pero cuando los embriones alcanzan el estadio de blastocisto y son transferidos al útero, los valores disminuyen drásticamente. Sin excluir lo que se ha dicho, una posible explicación podría ser que los embriones transferidos al oviducto pueden restaurar el posible daño generado en la capa de mucina durante la manipulación del embrión. Por lo tanto, los blastocistos transferidos al útero se privarían de este mecanismo, lo que podría comprometer su capacidad de implantación.
La técnica se realiza utilizando un único instrumento de puerto (5 mm endoscopio trocar), con leve, breve manipulación. Por lo tanto, the5-mm endoscopio incisión trocar no requiere cierre. Los beneficios de la técnica laparoscópica incluyen dolor postoperatorio disminuido, retorno más rápido a la actividad normal y menos complicaciones postoperatorias. Además, los procedimientos endoscópicos inducen menos adherencias abdominales y permiten una mejor respuesta inmunitaria por parte del receptor en comparación con la cirugía abierta21,36,37. La acumulación de evidencia de nuestro laboratorio ha demostrado la efectividad de este procedimiento de ET en el modelo de conejo. Así, en los últimos cinco años se transfirieron un total de 3.909 embriones (1.335 embriones frescos y 2.574 vitrificados) a través del procedimiento descrito en el presente manuscrito. Como resultado de esta técnica, las tasas de crías de embriones de transferencia frescos y vitrificados fueron del 62,9% y del 42,5%, respectivamente38,39,40,41,42, 43 , 44 , 45 , 46 , 47. muchos estudios se basan en esta técnica: marco-Jiménez et al. 38 , 39 , 40 , 41, Vicente et al. 42, Viudes-de-Castro et al. 43, Saenz-de-Juano et al. 44 , 45 , 47, lavara et al. 46.
A continuación se describen las recomendaciones prácticas para llevar a cabo esta técnica. En experimentos de cultivo de embriones, también es aconsejable utilizar un nuevo catéter para la transferencia de embriones en lugar del utilizado para mover los embriones entre los medios de cultivo y medios de manipulación. Esto evita la transferencia de aceite mineral y asegura un flujo óptimo. Durante la ET es importante minimizar el manejo del tracto reproductivo, ya que la manipulación excesiva del oviducto podría dar lugar a adherencias. Si el oviducto está torcido, emplear la jeringa epidural para tratar de colocarlo correctamente, no el catéter, ya que contiene los embriones y la manipulación mecánica podría causar su pérdida. Una vez que el catéter pasa a través del oviducto, se desliza fácilmente. Si no lo hace, el catéter puede haberse desviado. Una vez dentro del oviducto, si los medios no fluyen, mueva el catéter ligeramente e intente volver a insertarlo. Si todavía no fluye, el catéter está obstruido. Retírela del oviducto y libere el contenido en un plato con un medio limpio. A continuación, vuelva a cargar los embriones en otro catéter e intente volver a insertarlo en el oviducto. La entrega por lo general toma lugares 28-30 días después de la transferencia de mórula.
Además, hay evidencia que indica que la etapa de desarrollo del embrión puede ser más avanzada que el ambiente uterino en las hembras pseudoembarazadas, pero no lo opuesto. Concretamente, los embriones tienen la capacidad de esperar el ambiente favorable del útero, pero el entorno de la matriz no puede esperar a que los embriones en la etapa correcta para la implantación10. Con respecto a los embriones vitrificados, después de un almacenamiento a corto/largo plazo es posible sincronizar la etapa de desarrollo del embrión con el entorno de útero favorable correspondiente. Además, si el donante de embriones es también el receptor del embrión, los efectos perjudiciales de la superovulación en el endometrio pueden ser anulando utilizando la técnica de vitrificación y transfiriendo los embriones en un ciclo posterior48. En conejos, los embriones vitrificados transferidos a oviductos de receptores inducidos a ovular 60-62 h previamente (asincronía) es una técnica altamente eficiente44,49. Relacionado con esto, se ha sugerido que la transición del embrión oviductal durante 10-12 h podría explicar los efectos beneficiosos en la restauración de la fisiología celular y el reemplazo de células muertas, y probablemente reparar el daño inducido en el pelaje de mucina durante el embrión manejo. Además, los embriones vitrificados presentan un retraso en el desarrollo, ya que han sido suspendidos metabólicamente durante el almacenamiento. Por lo tanto, la transferencia de embriones crioreservados a receptores asíncronos permite al embrión reactivar su actividad metabólica y, por lo tanto, la fase embrionaria del desarrollo se sincroniza con el entorno de la matriz. En cambio, si los embriones crioreservados se transfieren a receptores sincrónicos, la charla cruzada entre la madre y el embrión dificulta la aparición de un embarazo exitoso. En el conejo, la tasa de supervivencia más alta se ha obtenido después de la transferencia intraoviductal de las morulae criopreservadas49. Nuestros datos son consistentes con este informe, aunque la etapa de la mórula exhibe diferentes tasas de supervivencia después de la criopreservación dependiendo de su grado de compactación a 70-72 h (tabla 2). Aquí, las morulae compactadas mostraron mayores tasas de supervivencia al nacer en comparación con las morulae no compactadas, que estaba en concordancia con informes previos que mostraban que cada etapa del desarrollo tenía su propio mecanismo en relación con la permeación de los crioprotectores y la extensión de la deshidratación durante la adición de la solución de criopreservación50. Subyacentes a estas técnicas, hemos demostrado que una combinación de vitrificación y transferencia de embriones intraoviductal es una estrategia exitosa para restablecer las poblaciones de conejos después de 15 años de almacenamiento en nitrógeno líquido, sin efecto adverso en sus supervivencia post-deshielo y nacimiento vivo51.
Se deben tener en cuenta los siguientes detalles para realizar correctamente esta técnica. Es importante tener en cuenta que la creciente densidad de los medios consecutivos utilizados para la vitrificación (DPBS, solución de equilibrado, solución de vitrificación) podría inducir la contracción del embrión debido a la deshidratación progresiva de embriones. Sin embargo, su apariencia normal se recupera cuando el embrión se equilibra con el medio. Además, cuando el embrión se mueve entre los medios de densidad crecientes, tiende a desplazarse a la superficie de los medios debido a los movimientos de densidad. Para evitar la pérdida de embriones y garantizar el tiempo de vitrificación, es recomendable realizar la vitrificación en pequeñas gotas de los medios que mantendrán el embrión en su lugar.
En conclusión, aquí describimos tanto una técnica ET como un método de vitrificación de embriones que facilitan futuros estudios que utilizan conejos como modelo. Sobre la base de la estrecha distancia filogenética entre los conejos y los seres humanos, el uso de este modelo podría proporcionar resultados fácilmente transferibles a la medicina clínica humana. Además, nuestro método ofrece algunas ventajas higiénicas y económicas, que se ajustan al concepto de las 3 RS de bienestar animal (sustitución, reducción y refinamiento), manteniendo al mismo tiempo el objetivo de mejorar el trato humano de los animales experimentales.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por fondos del Ministerio de economía y competitividad de España (AGL2017-85162-C2-1-R) y del programa de investigación de la Generalitat Valenciana (PrometeoII 2014/036). Versión de texto en inglés revisada por el servicio de lenguaje inglés N. Macowan
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 332 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Alvet Escartí | 626 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Buserelin Acetate | Sigma Aldrich | B3303 | |
| Clorhexidine digluconate soap | Alvet Escartí | 0265DCCJ500B | |
| Clorhexidine digluconate solution | Alvet Escartí | 0265DCCA500B | |
| CO2 | Air Liquide | 99921 | CO2 N48. |
| CO2 Incubator | Fisher scientific | 15385194 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | W387509 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D5773 | Without calcium chloride. |
| Electric razor | Oster Golden A5 | 078005-140-002 | |
| Endoscope camera | Optomic Spain S.A | OP-714 | |
| Endoscope trocar with silicone leaflet valve | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | 30114GK | Lightweight trocar model. |
| Enrofloxacin | Alvet Escartí | 9993046 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Epicraneal needle 23G | Alvet Escartí | 514056353 | Smaller needles can be also used. |
| Epidural catheter | Vygon corporate | 187.10 | |
| Epidural needle | Vygon corporate | 187.10 | |
| Ethylene Glycol | Sigma Aldrich | 102466-M | |
| Eye ointment | Alvet Escartí | 5273 | |
| Ketamine hydrochloride | Alvet Escartí | 184 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Laparoscopy equipment | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | 26003 AA | Hopkins® Laparoscope, 0º-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel. |
| Light source | Optomic Spain S.A | Fibrolux 250 | |
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | P1505XXX | |
| Mechanical CO2 insufflator | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | Endoflator® | |
| Meloxicam | Alvet Escartí | 9993501 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Petri dishes, 35-mm | Sigma Aldrich | CLS430165-500EA | |
| Plastic dressing (Nobecutan) | IBOR medica | 7140028 | |
| Plastic Straw 0.25 mL | IMV - technologies | 6431 | |
| Povidone iodide solution | Alvet Escartí | 02656DPYS500S | |
| Scissors | ROBOZ | RS-5880 | Any regular surgical grade steel small straight scissors will work. |
| Silicone tube for insufflator | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | 20400040 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16F | There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. |
| Sterile Gloves | Alvet Escartí | 087GL010075 | |
| Sterile gown | Alvet Escartí | 12261501 | |
| Sterile mask | Alvet Escartí | 058B15924B | |
| Straw Plug | IMV - technologies | 6431 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Syringe, 1-mL | Fisher scientific | 11750425 | |
| Syringe, 5-mL | Fisher scientific | 11773313 | |
| Urinary catheter | IMV - technologies | 17722 | |
| Waterbath | RAYPA | BAE-4 | |
| Xylazine | Alvet Escartí | 525225 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Rabbits | Universitat Politècnica de València | Line A | Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used. |
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