Summary
Assisterad reproduktions teknik (ARTs) är i ständig utvärdering för att förbättra resultaten och minska riskerna. Detta manuskript beskriver ett minimalt invasivt embryo överförings förfarande med en effektiv frys förvaring protokoll som tillåter användning av kaniner som en idealisk djur modell av mänsklig reproduktion.
Abstract
Assisterad reproduktions teknik (ARTs), till exempel in vitro embryokultur eller kryokonservering i embryon, påverkar naturliga utvecklings mönster med perinatal och postnatal följder. För att säkerställa att ART-tillämpningar är ofarliga är studier i djur modeller nödvändiga. Dessutom, som ett sista steg, embryonal utveckling studier kräver utvärdering av deras förmåga att utveckla fullvärdiga friska avkomma. Här är embryo överföring till livmodern oumbärlig för att utföra någon ARTs-relaterade experiment.
Kanin har använts som en modellorganism för att studera däggdjurs reproduktion i över ett sekel. Förutom sin fylogenetiska närhet till den mänskliga arten och dess ringa storlek och låga underhållskostnader, det har viktiga reproduktiva egenskaper såsom inducerad ägg lossning, en kronologi av tidig embryonal utveckling som liknar människor och en kort dräktighet som tillåter oss att studera konsekvenserna av ART ansökan lätt. Dessutom, ARTs (såsom intracytoplasmatisk spermie injektion, embryokultur, eller frys förvaring) tillämpas med lämplig effektivitet hos denna art.
Med hjälp av den laparoskopiska Embryo Transfer teknik och frys förvaring protokoll som presenteras i denna artikel, vi beskriver 1) hur man överför embryon genom en enkel, minimalt invasiv teknik och 2) ett effektivt protokoll för långtids lagring av kanin embryon för att ge tid-flexibel logistik kapacitet och förmåga att transportera provet. De resultat som erhålls efter överföring av kanin embryon på olika utvecklingsstadier visar att morula är den idealiska scenen för kanin embryo återhämtning och överföring. Således krävs en oviductal embryo överföring, vilket motiverar det kirurgiska ingreppet. Dessutom är kanin morulae framgångs rikt förglasade och laparoscopically överförs, vilket bevisar effektiviteten av de beskrivna teknikerna.
Introduction
Med syftet att kringgå mänsklig infertilitet eller förbättra spridningen av boskap med högt genetiskt värde och bevara djurens genetiska resurser, en uppsättning tekniker kollektivt kallas Assisterad befruktning teknik, såsom superovulation, i provrörsbefruktning, embryokultur eller frys förvaring utvecklades1,2. För närvarande, hormonella behandlingar ges för att stimulera äggstockarna och producera ett stort antal antrala äggstocks cancer folliklar1. Oocyter som samlats in från dessa folliklar kan mognas, befruktas, och utvecklas in vitro tills de antingen är kryskonserverade eller överförs till surrogat mödrar3. Emellertid, under dessa behandlingar, köns celler och zygoter utsätts för en rad icke-fysiologiska processer som kan kräva embryonal anpassning för att överleva i dessa villkor4,5. Denna anpassning är möjlig på grund av tidig embryo plasticitet, som tillåter embryonala förändringar i gen uttryck och utvecklingsprogram6. Dessa modifieringar kan dock påverka de efterföljande stadierna av embryots utveckling fram till vuxen ålder, och det är nu allmänt accepterat att metoder, timing, kryokonservering eller odlings förhållanden uppvisar olika utfall på embryots öde7 , 8. därför, för att belysa de specifika inducerade effekterna av ARTs, är användningen av väl karaktäriserade djur modeller oundviklig.
Den första dokumenterade levande födelsen till följd av överföring av däggdjurs embryon ägde rum i 18909. Idag, Embryo Transfer (ET) till en surrogat hona är ett avgörande steg i att studera de ART-inducerad effekter under preimplantationen på efterföljande embryonal utveckling stadier10. ET tekniker beror på storleken och anatomiska strukturen hos varje djur. När det gäller stora djur modeller, har det varit möjligt att utföra et genom transcervikal kirurgisk et tekniker, men i mindre storlek arter kateterisering av livmoder halsen är mer komplex och kirurgisk teknik används ofta11. Men, kirurgiska ET kan orsaka blödningar som kan försämra implantation och embryonal utveckling, som blod kan invadera livmoder lumen, orsakar embryo död10. Transcervical kirurgisk et tekniker tillämpas fortfarande på människor, babianer, nötkreatur, svin och möss12,13,14,15,16,17, men kirurgiska ETS används fortfarande på arter som getter, får eller andra djur som medför ytterligare svårigheter10,18,19,20,21, såsom kaniner (två oberoende livmoder halsen) eller möss (liten storlek). Men kirurgiska överförings metoder tenderar att gradvis ha ersatts av mindre invasiva metoder. Endoskopi användes för att överföra embryon, till exempel i kaniner, grisar och små idisslare18,19,20. Dessa minimalt invasiva endoskopi metoder kan användas för att överföra embryon i ampulla via infundibulum, vilket är viktigt hos kaniner och har visat positiva effekter hos vissa arter20. Detta bygger på vikten av en korrekt dialog mellan embryo och mor under tidiga embryonala stadier i oviduct. Som nämnts ovan, är det embryo remodeling som sker i kaniner under embryo migration genom utväxande viktigt att uppnå embryon som kan implantatet22,23.
Större djur modeller, såsom nötkreatur, är intressanta eftersom biokemiska och preimplantatorisk egenskaper liknar dem i mänskliga arter24. Men stora djur är för dyra att använda i preliminära prövningar, och gnagare anses vara en idealisk modell (76% modellorganismer är gnagare) för laboratorie forskning25. Ändå ger kanin-modellen vissa fördelar jämfört med gnagare i reproduktions studier, eftersom vissa reproduktiva biologiska processer utställda av människor är mer likartade hos kaniner än hos möss. Människor och kaniner presentera en liknande kronologisk embryonal arvs massa aktivering, gastrulering och hemochorial moderkakan struktur. Dessutom, med hjälp av kaniner är det möjligt att veta den exakta tidpunkten för befruktning och graviditets stadier på grund av deras inducerad ägg lossning25. Kanin livscykler är korta, slutföra dräktitet i 31 dagar och nå puberteten vid ungefär 4-5 månader; djuret är lätt att hantera på grund av dess fogliga och icke-aggressiva beteende, och dess underhåll är mycket ekonomiskt jämfört med bekostnad av större djur. Dessutom är det viktigt att nämna att kaniner har en duplex livmoder med två oberoende cervixes11,25. Detta placerar kaninen i ett preferens-placerar, som embryon från de olika experimentella grupperna kan överföras in i samma djur, men in i ett olikt livmoder-horn. Detta gör att vi kan jämföra både experimentella effekter, minska maternell faktor från resultaten.
Idag, kirurgisk et metoder är inte i bruk i kanin. Vissa studier som genomfördes i slutet av 90-talet med hjälp av en transcervikal et-teknik resulterade i låga leverans hastigheter från 5,5% till 20,0%11,26 mot 50-65% av kirurgiska metoder, bland dem laparoskopi förfarande som beskrivs av Besenfelder och Brem18. Den låga andelen lyckade av dessa kirurgisk et metoder i kaniner sammanfaller med avsaknaden av nödvändiga embryo remodeling i oviduct, vilket undviks i transcervikal et. Här beskriver vi en effektiv minimalt invasiv laparoskopisk ET-procedur med kaniner som modellorganism. Denna teknik ger en modell för ytterligare reproduktiv forskning i stora djur och människor.
Eftersom kaniner har ett särskilt smalt tidsfönster för embryoimplantation kräver ET i denna art en hög grad av synkronisering mellan embryots utvecklingsstadium vid ET och mottagarens fysiologiska status27. I vissa fall, efter en reproduktiv behandling som bromsar embryots utveckling (t. ex. in vitro -kultur) eller förändrar den endometriereceptivitet (såsom superovulation behandlingar), det finns ingen synkronisering mellan embryot och moderns livmoder. Dessa situationer kan påverka utfallet negativt. För att svara i dessa sammanhang, beskriver vi en effektiv kanin morula förglasning protokoll som tillåter oss att pausa, organisera och återuppta experimenten. Denna process är logistiskt önskvärt för reproduktiva studier och ger oss kapacitet för långsiktig lagring av embryon, vilket möjliggör deras transport. Laparoskopisk procedur och frys bevarande strategier möjliggör bättre planering av studier med färre djur. Således, vår metodik erbjuder hygieniska och ekonomiska fördelar och överensstämmer med begreppet 3R (ersättning, minskning och förfining) av djur försök med det uttalade målet att förbättra människors behandling av försöks djur. Således, med dessa metoder, kaniner utgör en idealisk modellorganism för in vivo reproduktiva analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella metoder som användes i denna studie utfördes i enlighet med direktiv 2010/63/EU EEG för djur försök och granskades och godkändes av etik kommittén för försöks verksamhet med djur av Universitat Politècnica de València. Spanien (forsknings kod: 2015/VSC/PEA/00170). XGD, FMJ, MPVC och JSV innehar ett tillstånds intyg utfärdat av den statliga administrationen i Valencia för att experimentera på djur. XGD är bemyndigad att på plats övervaka djurens välbefinnande och skötsel under experimentet.
1. överföring av embryon
- Beredning av mottagar Honor
- Använd endast könsmogna Honor (> 4,5 månader gamla).
- En vecka före ET, anpassa Honor till en 16 h ljus/8 h mörk regim för att initiera follikulär tillväxt och förbättrad kvinnlig mottaglighet.
- Välj mottagaren Honor, Observera saftspändhet och färg på vulva. Om vulvan är saftig och rödaktig är honan mottaglig.
- Inducera pseudograviditet (ägg lossning) genom en intramuskulär engångs injektion på 1 μg Buserelin acetat (syntetisk analog av gonadotropin-releasing hormon) oavsett kropps vikt.
Anmärkning: normalt är 0,8 μg en lämplig dos för ovulationsinduktion i medel stora kaniner (4-5 kg), så 1 μg garanterar i allmänhet ägg lossningen. - Inducera ägg lossning så många dagar i förväg som åldern på de embryon som ska överföras (till exempel, 70-72 h före färsk morula ET).
- Anestesi och analgesi
- Väg kaninen och ladda följande anestetika och analgetika.
- I en 1 mL spruta med en 30 g nål: lasta xylazin (5mg/kg) och buprenorfinhydroklorid (0,03 mg/kg). I en annan 1 mL spruta med en 23G perikranial nål, lastketaminhydroklorid (35 mg/kg).
- Håll kaninen och injicera xylazin-buprenorfinblandningen intramuskulärt.
- För in den perikraniala nålen med Ketamin i den marginella öron venen, och långsamt införa alla sprutans innehåll intravenöst.
- Fixera nålen och låt den sättas in under resterande steg för att administrera mer anestesi vid behov.
- Lämna kaninen i buren (ren och utan några andra djur) på en varm scen.
- När medvetslös, applicera Eye salva för att undvika torrhet i ögat och kontrol lera frånvaron av palpebrala freflex.
Obs: detta protokoll ger ett kirurgiskt anestesi plan i minst 30 minuter. Om en längre tid krävs, injicera ytterligare doser med hälften av mängden ketaminhydroklorid som beskrivs i 1.2.1 efter 30 min. - Övervaka anestesi djupet genom att kontrol lera Pedal Reflexen och andnings rörelsen. Förändringar i andnings mönstret till en oregelbunden och snabbare takt indikerar förlust av rätt plan för anestesi.
- Övervaka färgen på slem hinnor (ögon, läppar, etc.), andnings frekvens (30-60 andetag per minut), hjärt frekvens (120-325 slag per minut) och rektal temperatur (38-39,6 ° c).
- Åtta timmar före överföring, undanhålla livsmedel från djur för att undvika större gut storlek och aktivitet tills ET-processen är klar. Lämna fri till gång till vatten.
- Väg kaninen och ladda följande anestetika och analgetika.
- Förberedelse av embryo
- Värm embryonala manipulations mediet till 25 ° c: bas medium (BM), bestående av Dulbeccos Fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) kompletterat med 0,2% (w/v) av bovint serum albumin.
- Arbeta under ett stereomicroscope, skölj färska eller tinade (steg 2) embryon med BM.
- Använd sterila handskar och fäst en korrekt konfigurerad 17G epiduralkateter i en 1 mL spruta.
- Aspirera 1 cm av BM i katetern, följt av en liten luft bubbla.
- Aspirera 5-7embryon i en volym av 10 μL av BM, följt av en annan liten luft bubbla.
- Avsluta lastningen av katetern genom att aspirera 1 cm BM.
- Överföring av embryon
- Överväg användning av sterila handskar, klänning och mask för att säkerställa en aseptisk miljö.
- Sterilisera kirurgiska instrument, rengör ytorna där kirurgi kommer att utföras, och torka dem med 70% etanol.
- Utför anestesi som tidigare detaljerad (steg 1,2), kontroll för förlust av reflexer.
- Raka pälsen från den ventrala buken med en rakhyvel.
- Förbered den ventrala buken aseptiskt.
- Rengör Operations området och avlägsna kvarvarande hår. Tvätta Operations området med en klorhexidinglukonattvål. Sanitisera området med klorhexidinlösning och etanol 96 º (3 gånger).
- Placera djuret på en varm Operations bord, i Trendelenburg position (huvudet ner på 45 °) för att säkerställa att magen och tarmarna är kraniellt belägna. Överväg evakuering av urin blåsan om det är Turgid. Om någon inälvor skadas i processen, djuret kan dö. Det är därför viktigt att ha dem ordentligt placerade (figur 1).
- Täck området med en steril handduk, med ett hål (fenestration) utsätta rakade området, att separera den kirurgiska platsen från alla potentiella kontaminerande områden.
- Sätt en endoskopisk troakaren 5 cm i bukhålan, 2 cm stjärtfenan till Xiphoid processen, och insufflate genom det peritonealkaviteten med en tryck reglerande mekanisk insufflator.
Anmärkning: Intraabdominellt tryck ska vara 8-12 mmHg med CO2 (figur 1a). - Sätt in endoskopkameran genom endoskopisk troakaren (figur 1b).
Notera: identifiera fortplantnings organen, bestämma status och position för infundibulum och ampulla innan ET för att under lätta nästa steg. - Sätt in den 17-G epiduralnålen i ljumsk regionen mellan 2-3 cm från infundibulum (figur 1b).
- Identifiera ingången till infundibulum (figur 2A, 2b).
- Sätt in den laddade katetern (steg 1,3) genom epiduralnålen i buken (figur 1c).
- Lokalisera utväxande och sätt in 1-2 cm av epiduralkatetern genom infundibulum i ampulla (figur 2A-2C). Inte utvecklas mycket långt in i utväxande för att förhindra skador och blödning.
- Frigör embryona i ovivedukten genom att försiktigt trycka på sprutans kolv kopplad till katetern (figur 2D-2F). Båda luft bubblorna måste lämna katetern.
- Ta bort katetern strax efter att embryona har släppts.
- Skölj katetern, aspirera och frigöra manipulerande medium för att kontrol lera frånvaron av embryon och bekräfta deras framgångs rika överföring.
- Upprepa steg 1.4.11 till 1.4.16 på andra sidan av livmodern, om så önskas.
- Ta bort epiduralnålen och endoskop-kameran.
- Släpp CO2 genom endoskopisk Trocar. Om överskott gas kvar i buken av djuret, kommer det att ha smärta och obehag.
- Ta bort endoskopisk troakaren från bukhålan. Ta bort den kirurgiska hand duken.
- Avbryt anestesi.
- Rengör snitt som gjorts av troakaren med klorhexidinlösning. Stäng snitt gjord av troakaren med en mikroniserad aluminium och en plast dressing.
- Postoperativ vård
- Behandla djuren med antibiotika: 10 mg/kg enrofloxacin, subkutant, var 24-h för 5 dagar.
- Administrera analgetika: buprenorfinhydroklorid (0,03 mg/kg), intramuskulärt, var 12: e timme under 3 dagar; Meloxikam (0,2 mg/kg) subkutant, var 24: e timme i 3 dagar.
- Övervaka djuren i minst 30 minuter efter operationen (beroende på djuret och den dos av anestesi som används) och se till att de återställer sina fysiologiska tillstånd.
- Identifiera mottagaren (t. ex. öron tatuering) och hus djur individuellt i en ren bur med lämpligt miljö tillstånd.
Figur 1: laparoskopisk embryoöverföring assisterad av laparoskopi (extern vy). A) införande av endoskopisk troakaren (en port). B) insättning av endoskopisk kamera och epiduralnål (svart pil). C) införing av embryoöverföringskatetern (vit pil) genom epiduralnålen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: laparoskopisk embryoöverföring assisterad av laparoskopi (intern vy). A: Införing av katetern genom epiduralnålen i buk zonen. Asterisk indikerar infundibulum. B, C, D: Katetern laddad med embryona förs in i ampulla regionen över infundibulum. E, F: Frisättning av embryon, bekräftas genom visualisering av en svullen oviduct. Denna siffra har anpassats från Marco-Jiménez et al. 38. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. embryo-förglasning och uppvärmning
- Utför alla manipulationer vid rums temperatur (runt 22 ° c) för att reducera toxiciteten vid varmare temperaturer.
Anmärkning: embryon kan flyttas med 0.1-2 μL automatisk pipett i detta protokoll, men andra liknande anordningar för att flytta embryon dra den minsta volymen kan vara lämpligt. - Vitrify embryona i ett två-stegs tillägg förfarande:
- Placera embryona i 2 minuter i en utjämningslösning bestående av 10% (v/v) etylenglykol och 10% (v/v) dimetylsulfoxid upplöst i BM.
- Flytta embryona (från steg 2.2.1) i 1 minut till förglasnings lösning bestående av 20% (v/v) etylenglykol och 20% (v/v) dimetylsulfoxid upplöst i BM.
- Fyll på embryona till en 125 μL plastministraw (som innehåller en sluten ände med en bomulls plugg och en öppen extrem). Processen är schematiserad i figur 3.
- Koppla den slutna änden av 0,125 μL ministraw till lämplig mikrodispenser (t. ex. Captroll III®).
- Aspirera BM tills 1/3 av halm längd, efter av en liten luft bubbla.
- Aspirera embryona i en volym av 40 μL av förglasning lösning, följt av en annan liten luft bubbla.
- Aspirera BM tills den första vätske fraktionen (steg 2.3.2) når bomullen.
- Stäng den öppna änden med en halm plugg.
- Utför steg 2.2.2 medan steg 2,3 görs för att säkerställa att inte mer än en minut förlöper, vilket skulle vara giftigt för embryon.
- Störta ministraw direkt i flytande kväve för att uppnå förglasning.
- Förvara ministraw i en Dewar för kväve för önskad tid.
- Tina embryona i ett enda steg.
- Placera ministraw horisontellt 10 cm från flytande kväve ånga för 20-30 s.
- När kristalliserings processen börjar inne i ministraw, Sänk ministraw i ett vatten bad vid 25 ° c för 10-15 s.
- Ta bort ministraw pluggen och skär bomulls pluggen.
- Med en kopplad mikrodispenser, avlägsna all ministraw innehåll till en platta som innehåller 0,33 M sackaros lösning vid 25 ° c i BM i 5 minuter.
Anmärkning: detta steg måste göras snabbt för att minska embryots exponering för förglasning lösningen. - Flytta embryona till en ny tallrik som innehåller BM lösning för ytterligare 5 min.
- Överväg endast icke-skadade embryon (med intakt mucin päls och zona pellucida) att fortsätta med ET.
Anmärkning: ta hänsyn till att i upptinade embryon kan asynkrona överföringar (t. ex. 60-62 h i morula överföringar) förbättra resultaten genom att tillåta en omsynkronisering mellan embryot och moderns endometrium.
Figur 3: Schematisering av korrekt belastade halm. A) BM avser det embryonala manipulerande mediet som används vid förglasning. Embryon måste lastas i förglasnings lösning. B) det laddade strået har ett makroskopiskt utseende med en för sto rad detalj i embryots position. Denna stora volym enhet gör att vi kan vitrify stort antal embryon, till skillnad från minsta volym enheter. Dessutom är hanteringen av denna enhet lättare jämfört med minsta volym enheter, medan resultaten är likartade hos kaniner41. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Minimalt invasiv laparoskopisk överföring av färska eller förglasade embryon placerar kaninen bland de bästa modell djuren för reproduktions studier. Tabell 1 visar resultaten av färska et i olika utvecklingsstadier (figur 4) av överförda embryon. Överlevnads graden vid födseln (andelen embryon som resulterade i en PUP) visade på effekten av den laparoskopiska teknik som beskrivs i detta dokument. De högre värdena uppnåddes när ET utfördes med embryon i morula scenen, antingen tidigt eller kompakt morulae. Baserat på dessa resultat, genomförde vi ett andra experiment för att demonstrera överlevnaden efter förglasning av dessa embryon. Således, i tabell 2 visar vi de resultat som erhållits efter överföring förglasade kanin morulae återvinns samtidigt, differentiera mellan de embryon som hade nått en god grad av packning eller inte. Överlevnads graden vid födseln var annorlunda mellan de olika embryonala stadierna, som var högre i kompakte morulae. Laparoskopisk embryoöverföring är därför en pålitlig teknik för att överföra färska och förglasade embryon till kaniner
Figur 4: kanin-embryon. A) pronuclear. B) åtta celler. C) tidig morula. D) kompakt morula. E) blastocysta. Asterisk anger de två pronuclei. Svarta pilar indikerar zona pellucida. Vita pilar visar mucinpälsen, som normalt varierar mellan embryon. ICM: inre cell massa. TE: trophectoderm. Scale bar: 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Utvecklingsstadium1 | Embryon | Mottagare | Plats för överlåtelse | Graviditets frekvens (%) | Implantations frekvens (%) | Överlevnads grad vid födseln (%)2 |
| Pronukleär | 78 | 7 | Utväxande | 7 (100) | 50 (64,0)b | 34 (43,6)b |
| 8 celler | 81 | 7 | Utväxande | 7 (100) | 60 (74,1)b | 53 (65,4)a |
| Tidig morula | 81 | 7 | Utväxande | 7 (100) | 80 (98,8)a | 60 (74,1)a |
| Kompakt morula | 80 | 7 | Utväxande | 7 (100) | 80 (100)a | 58 (72,5)a |
| Blastocyststadiet | 80 | 7 | Livmodern | 7 (100) | 73 (91,3)a | 38 (47,5)b |
I tabell 1. Effektivitet av färsk kanin embryo överföring (in vivo härledda) genom laparoskopi. 1olika embryon återfanns vid 18-20h (pronuclear), 36-38h (8 celler), 60-62 h (tidig morula), 70-72 h (Compact morula) och 80-82 h (blastocyst) efter parning. Compact (> 32 celler) och icke-kompakta morulae (≈ 32 celler) kan bildas på 70-72 h, men endast kompakta morulae överfördes. 2 för att Överlevnads frekvens vid födseln från mottagaren gravida gör. a, b Värden med olika upphöjd är statistiskt olika (P < 0,001).
| Utvecklingsstadiet | Överförda embryon | Mottagare | Graviditets frekvens (%) | Överlevnads grad vid födseln (%)1 |
| Icke-komprimerad | 135 | 10 | 9 (90) | 62 (45,9)b |
| Komprimerade | 150 | 10 | 10 (100,0) | 98 (65,3)a |
| Totala | 285 | 20 | 19 (95) | 160 (56,1) |
I tabell 2. Lönsamhet av icke-kompakte vs kompakt förglasat morula. a, b-värden med olika upphöjd är statistiskt olika (P < 0,001). 1 den första Överlevnads frekvens vid födseln från mottagaren gravida gör. Embryon återfanns samtidigt (70-72 h) och utmärkte sig i kompakta (> 32 celler) och icke-kompakta morulae (≈ 32 celler).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sedan det första dokumenterade levande födelse fallet från överförda embryon9, denna teknik och kanin arter har blivit avgörande i reproduktions studier. Dessutom kräver embryoforskning med manipulation, produktion, frys förvaring etc. som ett sista steg en utvärdering av embryokapaciteten för att generera friska fullgångna avkomlingar. Därför är embryotransferteknik oumbärlig13,28. Under årens lopp har de kirurgiska metoder som ursprungligen användes för att överföra embryon till moderlivmodern successivt ersatts av mindre invasiva metoder i de allra flesta arterna13,14,15, 21 för att , den 27 , 29 (på) , 30. hos kaniner blir dock intraoviductal et i tidiga embryonala utvecklingsstadier och in vitro -producerade embryon oundvikliga för att säkerställa ett liknande resultat som naturliga förhållanden. I kaniner, intraoviductal mucin päls är en avgörande faktor som möjliggör embryo implantation, eftersom det sker efter ombyggnad av embryonala beläggningar under blastocyststadiet expansion i livmoder hornen. Emellertid, mucin Coat deposition är begränsad till utväxande för 3 dagar efter ägg lossningen, och de molekyl ära mekanismerna för päls material deposition är till stor del okända31. Av dessa skäl är det känt att in vitro-utvecklade blastocystor inte överlevde när de överfördes till livmodern32,33,34, och embryon med en skadad mucin coat har en lägre överlevnads grad 35. likaså resulterade grupper som rapporterade en transcervikal embryoöverföring hos kaniner i mycket låga levande födda priser11,26. Här presenterar vi en minimalt invasiv teknik, anpassad från Besenfelder och Brem18, för att överföra embryon med lyckade födelse tal. Enligt resultaten i tabell 1var morula-stadiet i kaninembryon det bästa embryonala stadiet för att uppnå en hög överlevnads frekvens vid födseln. En möjlig förklaring är den större känsligheten för manipulation av de tidigaste stadierna. Intressant, framgången ökar när det embryonala stadiet fortskrider, möjligen på grund av den större exponeringen av embryot till oviductal sekret innan dess återhämtning. Men när embryon når blastocysta stadiet och är plats-Concordant överförs till livmodern, värdena minskar drastiskt. Inte utesluta vad som har sagts, en möjlig förklaring kan vara att de embryon som överförs till utväxande kan återställa eventuella skador som genereras i mucin skiktet under embryonal manipulation. Därför skulle blastocystor som överförts till livmodern berövas denna mekanism, vilket skulle kunna äventyra deras implantations förmåga.
Tekniken utförs med ett enda port instrument (5 mm endoskop Trocar), med liten, kort manipulation. Därför kräver the5-mm endoskop troakaren snitt inte förslutning. Laparoskopisk teknik fördelar inkluderar minskad postoperativ smärta, snabbare återgång till normal aktivitet, och färre postoperativa komplikationer. Dessutom inducerar endoskopiska ingrepp färre buk-sammanväxningar och möjliggöra ett bättre immun svar av mottagaren jämfört med öppen kirurgi21,36,37. Ackumulera bevis från vårt labb har visat effektiviteten i denna ET förfarande i kanin-modellen. Under de senaste fem åren överfördes således sammanlagt 3 909 embryon (1 335 färska och 2 574 förglasade embryon) genom det förfarande som beskrivs i det nuvarande manuskriptet. Som en följd av denna teknik var avkomma av färska och förglasade transferembryon 62,9% och 42,5%, respektive38,39,40,41,42, 43 , 44 , 45 , 46 , 47. många studier bygger på denna teknik: Marco-Jiménez et al. 38 , 39 , 40 , 41, Vicente et al. 42, viudes-de-Castro et al. 43, Saenz-de-juano et al. 44 , 45 , 47, lavara et al. på 46.
Praktiska rekommendationer för att genomföra denna teknik beskrivs nedan. I experiment med embryokulturer är det också tillrådligt att använda en ny kateter för embryoöverföring i stället för den som används för att flytta embryona mellan odlings mediet och manipulations mediet. Detta undviker överföring av mineral olja och säkerställer ett optimalt flöde. Under et är det viktigt att minimera hanteringen av fortplantnings organen, eftersom överdriven manipulering av utväxande kan resultera i adhesioner. Om utväxande är vriden, anställa epidural sprutan för att försöka placera den på rätt sätt, inte katetern, eftersom den innehåller embryon och mekanisk manipulation kan orsaka deras förlust. När katetern passerar genom oviduct, glider den lätt. Om den inte gör det kan katetern ha avviskat. Väl inne i oviduct, om mediet inte flödar, flytta katetern ut något och försök att sätta tillbaka den igen. Om den fortfarande inte flyter, är katetern igensatt. Ta bort den från utväxande och släpp innehållet i en skål med ett rent medium. Sedan, ladda om embryon till en annan kateter och försök att sätta in den i utväxande igen. Leverans sker vanligt vis platser 28-30 dagar efter morula överföring.
Dessutom finns det belägg för att embryots utvecklingsstadium kan vara mer avancerad än livmoder miljön i pseudogravida Honor, men inte tvärtom. Specifikt, embryon har förmågan att vänta på den gynnsamma livmoder miljön, men livmodern miljön kan inte vänta på embryona i rätt skede för implantation10. När det gäller förglasade embryon, efter en kort/lång sikt lagring är det möjligt att synkronisera utvecklingsstadiet av embryot med motsvarande gynnsamma livmoder miljön. Dessutom, om embryodonator också är den embryonala mottagaren, kan de skadliga effekterna av superovulation på livmoder slem hinnan kringgås genom att använda förglasning teknik och överföra embryon i en efterföljande cykel48. Hos kaniner har förglasade embryon som överförts till ovikanaler av mottagare som inducerats för att ägg lossning 60-62 h dessförinnan (asynchrony) är en mycket effektiv teknik44,49. I samband med detta har det föreslagits att oviductal embryots över gång under 10-12 h kan förklara de positiva effekterna i restaurering av cellfysiologi och utbyte av döda celler, och förmodligen reparera den skada som induceras i mucin päls under embryo Manipulation. Dessutom förglasade embryon presentera en försening i utvecklingen, eftersom de har varit metaboliskt suspenderade under lagringen. Överföring av frys konserverade embryon till asynkrona mottagare gör det därför möjligt för embryot att återaktivera sin metaboliska aktivitet och därmed synkroniseras embryots utvecklingsstadium med livmoder miljön. I stället, om frys förvarade embryon överförs till synbara receptorer, hindrar kors samtalet mellan modern och embryot uppkomsten av en lyckad graviditet. Hos kanin har den högsta överlevnads graden erhållits efter intraoviductal överföring av kryokonserverad morulae49. Våra uppgifter är förenliga med denna rapport, även om morula scenen uppvisar olika överlevnads grad efter frys förvaring beroende på deras grad av packning på 70-72 h (tabell 2). Här visade kompakte morulae högre överlevnads tal vid födseln i jämförelse med icke-komprimerade morulae, vilket överensstämde med tidigare rapporter som visar att varje utvecklingsstadium hade sin egen mekanism i förhållande till genomträngning av kryoprotectants och Dehydrering under tillsats av frys konserverings lösningen50. Bakom dessa tekniker har vi visat att en kombination av förglasning och intraoviductal embryo överföring är en framgångs rik strategi för att återupprätta kanin populationer efter 15 års lagring i flytande kväve, utan negativa effekter på deras efter Thaw överlevnad och levande födelse51.
Följande uppgifter bör tas med i beräkningen för att framgångs rikt utföra denna teknik. Det är viktigt att komma ihåg att den ökande tätheten av de på varandra följande medier som används för förglasning (DPBS, jämvikt lösning, förglasning lösning) kan framkalla embryonal sammandragning på grund av progressiv embryo uttorkning. Emellertid, dess normala utseende återvinns när embryot är utjämnat med mediet. Dessutom, när embryot flyttas mellan ökande densitet media, tenderar att flytta till ytan av medierna på grund av densitetsrörelser. För att undvika embryonal förlust och säkerställa tiden för förglasning, är det rekommendabelt att utföra vitrifiering i små droppar av media som kommer att hålla embryot på plats.
Sammanfattnings vis, här beskriver vi både en ET-teknik och en embryo-förglasning metod som underlättar framtida studier som använder kaniner som modell. Baserat på den nära fylogenetiska avståndet mellan kaniner och människor, användning av denna modell kan ge resultat lätt överföras till Human klinisk medicin. Dessutom ger vår metod några hygieniska och ekonomiska fördelar, som överensstämmer med begreppet 3 rs av djurens välbefinnande (ersättning, minskning och förfining), samtidigt som målet att förbättra human behandling av försöks djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av medel från ministeriet för ekonomi och konkurrens kraft i Spanien (AGL2017-85162-C2-1-R) och Generalitat Valenciana Research Programme (PrometeoII 2014/036). Engelsk text version reviderad av N. Macowan English language service
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 332 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Alvet Escartí | 626 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Buserelin Acetate | Sigma Aldrich | B3303 | |
| Clorhexidine digluconate soap | Alvet Escartí | 0265DCCJ500B | |
| Clorhexidine digluconate solution | Alvet Escartí | 0265DCCA500B | |
| CO2 | Air Liquide | 99921 | CO2 N48. |
| CO2 Incubator | Fisher scientific | 15385194 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | W387509 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D5773 | Without calcium chloride. |
| Electric razor | Oster Golden A5 | 078005-140-002 | |
| Endoscope camera | Optomic Spain S.A | OP-714 | |
| Endoscope trocar with silicone leaflet valve | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | 30114GK | Lightweight trocar model. |
| Enrofloxacin | Alvet Escartí | 9993046 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Epicraneal needle 23G | Alvet Escartí | 514056353 | Smaller needles can be also used. |
| Epidural catheter | Vygon corporate | 187.10 | |
| Epidural needle | Vygon corporate | 187.10 | |
| Ethylene Glycol | Sigma Aldrich | 102466-M | |
| Eye ointment | Alvet Escartí | 5273 | |
| Ketamine hydrochloride | Alvet Escartí | 184 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Laparoscopy equipment | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | 26003 AA | Hopkins® Laparoscope, 0º-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel. |
| Light source | Optomic Spain S.A | Fibrolux 250 | |
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | P1505XXX | |
| Mechanical CO2 insufflator | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | Endoflator® | |
| Meloxicam | Alvet Escartí | 9993501 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Petri dishes, 35-mm | Sigma Aldrich | CLS430165-500EA | |
| Plastic dressing (Nobecutan) | IBOR medica | 7140028 | |
| Plastic Straw 0.25 mL | IMV - technologies | 6431 | |
| Povidone iodide solution | Alvet Escartí | 02656DPYS500S | |
| Scissors | ROBOZ | RS-5880 | Any regular surgical grade steel small straight scissors will work. |
| Silicone tube for insufflator | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | 20400040 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16F | There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. |
| Sterile Gloves | Alvet Escartí | 087GL010075 | |
| Sterile gown | Alvet Escartí | 12261501 | |
| Sterile mask | Alvet Escartí | 058B15924B | |
| Straw Plug | IMV - technologies | 6431 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Syringe, 1-mL | Fisher scientific | 11750425 | |
| Syringe, 5-mL | Fisher scientific | 11773313 | |
| Urinary catheter | IMV - technologies | 17722 | |
| Waterbath | RAYPA | BAE-4 | |
| Xylazine | Alvet Escartí | 525225 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Rabbits | Universitat Politècnica de València | Line A | Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used. |
References
- Chen, M., Heilbronn, L. K. The health outcomes of human offspring conceived by assisted reproductive technologies (ART). Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 388-402 (2017).
- Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo vitrification in rabbits: Consequences for progeny growth. Theriogenology. 84 (5), 674-680 (2015).
- Sirard, M. A. The influence of in vitro. fertilization and embryo culture on the embryo epigenetic constituents and the possible consequences in the bovine model. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 411-417 (2017).
- Feuer, S. K., Rinaudo, P. F. Physiological, metabolic and transcriptional postnatal phenotypes of in vitro. fertilization (IVF) in the mouse. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 403-410 (2017).
- Jiang, Z., et al. Genetic and epigenetic risks of assisted reproduction. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 44, 90-104 (2017).
- Fleming, T. P., Velazquez, M. A., Eckert, J. J. Embryos, DOHaD and David Barker. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 6 (5), 377-383 (2015).
- Sparks, A. E. Human embryo cryopreservation-methods, timing, and other considerations for optimizing an embryo cryopreservation program. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (2), 128-144 (2015).
- Swain, J. E.
- Heape, W. Preliminary note on the transplantation and growth of mammalian ova within a uterine foster-mother. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 48, 457-459 (1890).
- Bermejo-Alvarez, P., Park, K. E., Telugu, B. P. Utero-tubal embryo transfer and vasectomy in the mouse model. Journal of Visualized Experiments. (84), e51214 (2014).
- Kidder, J. D., Roberts, P. J., Simkin, M. E., Foote, R. H., Richmond, M. E. Nonsurgical collection and nonsurgical transfer of preimplantation embryos in the domestic rabbit (Oryctolagus cuniculus) and domestic ferret (Mustela putorius furo). Journal of Reproduction and Fertility. 116 (2), 235-242 (1999).
- Tıras, B., Cenksoy, P. O. Practice of embryo transfer: recommendations during and after. Seminars in Reproductive Medicine. 32 (4), 291-296 (2014).
- Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (3), 228-231 (2014).
- Moreno-Moya, J. M., et al. Complete method to obtain, culture, and transfer mouse blastocysts nonsurgically to study implantation and development. Fertility and Sterility. 101 (3), e13 (2014).
- Hasler, J. F. Forty years of embryo transfer in cattle: a review focusing on the journal Theriogenology, the growth of the industry in North America, and personal reminisces. Theriogenology. 81 (1), 152-169 (2014).
- Bauer, C. The baboon (Papio sp.) as a model for female reproduction studies. Contraception. 92 (2), 120-123 (2015).
- Martinez, E. A., et al. Nonsurgical deep uterine transfer of vitrified, in vivo-derived, porcine embryos is as effective as the default surgical approach. Science Reports. 5, 10587 (2015).
- Besenfelder, U., Brem, G.
- Besenfelder, U., Mödl, J., Müller, M., Brem, G. Endoscopic embryo collection and embryo transfer into the oviduct and the uterus of pigs. Theriogenology. 47 (5), 1051-1060 (1997).
- Besenfelder, U., Havlicek, V., Kuzmany, A., Brem, G. Endoscopic approaches to manage in vitro and in vivo embryo development: use of the bovine oviduct. Theriogenology. 73 (6), 768-776 (2010).
- Fonseca, J. F., et al. Nonsurgical embryo recovery and transfer in sheep and goats. Theriogenology. 86 (1), 144-151 (2016).
- Denker, H. W. Structural dynamics and function of early embryonic coats. Cells Tissues Organs. 166, 180-207 (2000).
- Marco-Jiménez, F., López-Bejar, M. Detection of glycosylated proteins in rabbit oviductal isthmus and uterine endometrium during early embryo development. Reproduction in Domestic Animals. 48 (6), 967-973 (2013).
- Ménézo, Y. J., Hérubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reproductive BioMedicine Online. 4 (2), 170-175 (2002).
- Fischer, B., Chavatte-Palmer, P., Viebahn, C., Navarrete Santos, A., Duranthon, V. Rabbit as a reproductive model for human health. Reproduction. 144 (1), 1-10 (2012).
- Besenfelder, U., Strouhal, C., Brem, G. A method for endoscopic embryo collection and transfer in the rabbit. Zentralbl Veterinarmed A. 45 (9), 577-579 (1998).
- Daniel, N., Renard, J. P.
- Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters rabbit foetal placenta at transcriptomic and proteomic level. Reproduction. 147 (6), 789-801 (2014).
- Green, M., Bass, S., Spear, B. A device for the simple and rapid transcervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications. Biotechniques. 47 (5), 919-924 (2009).
- Duan, X., Li, Y., Di, K., Huang, Y., Li, X. A nonsurgical embryo transfer technique in mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 32 (4), 440-446 (2016).
- Denker, H. W., Gerdes, H. J. The dynamic structure of rabbit blastocyst coverings. I. Transformation during regular preimplantation development. Anatomy and Embryology. 157, 15-34 (1979).
- Seidel, G. E., Bowen, R. A., Kane, M. T. In vitro fertilization, culture and transfer of rabbit ova. Fertility and Sterility. 27, 861-870 (1976).
- Binkerd, P. E., Anderson, G. B. Transfer of cultured rabbit embryos. Gamete Research. 2, 65-73 (1979).
- Murakami, H., Imai, H. Successful implantation of in vitro cultured rabbit embryos after uterine transfer: a role for mucin. Molecular Reproduction and Development. 43, 167-170 (1996).
- Techakumphu, M., Wintenberger-Torrèsa, S., Sevelleca, C., Ménézo, Y. Survival of rabbit embryos after culture or culture/freezing. Animal Reproduction Science. 13 (3), 221-228 (1987).
- Gitzelmann, C. A., et al. Cell-mediated immune response is better preserved by laparoscopy than laparotomy. Surgery. 127 (1), 65-71 (2000).
- Huang, S. G., Li, Y. P., Zhang, Q., Redmond, H. P., Wang, J. H., Wang, J. Laparotomy and laparoscopy diversely affect macrophage-associated antimicrobial activity in a murine model. BMC Immunology. 14, 27 (2013).
- Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Almela-Miralles, V., Vicente, J. S. Development of Cheaper Embryo Vitrification Device Using the Minimum Volume Method. Public Library of Science One. 11 (2), e0148661 (2016).
- Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Generation of live offspring from vitrified embryos with synthetic polymers supercool X-1000 and Supercool Z-1000. CryoLetters. 35, 286-292 (2014).
- Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Use of cyclodextrins to increase cytoplasmic cholesterol in rabbit embryos and their impact on live KITs derived from vitrified embryos. Cryoletters. 35, 320-326 (2014).
- Marco-Jiménez, F., Lavara, R., Jiménez-Trigos, E., Vicente, J. S. In vivo development of vitrified rabbit embryos: Effects of vitrification device, recipient genotype, and asynchrony. Theriogenology. 79 (7), 1124-1129 (2013).
- Vicente, J. S., et al. Rabbit morula vitrification reduces early foetal growth and increases losses throughout gestation. Cryobiology. 67, 321-326 (2013).
- Viudes-de-Castro, M. P., Marco-Jiménez, F., Cedano-Castro, J. I., Vicente, J. S. Effect of corifollitropin alfa supplemented with or without Lh on ovarian stimulation and embryo viability in rabbit. Theriogenology. 98, 68-74 (2017).
- Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters at transcriptomic and proteomic level rabbit foetal placenta. Reproduction. 147, 789-801 (2014).
- Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Lavara, R., Vicente, J. S. Direct comparison of the effects of slow freezing and vitrification on late blastocyst gene expression, development, implantation and offspring of rabbit morulae. Reproduction in Domestic Animals. 49, 505-511 (2014).
- Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Long-term and transgenerational effects of cryopreservation on rabbit embryos. Theriogenology. 81, 988-992 (2014).
- Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo transfer manipulation cause gene expression variation in blastocysts that disrupt implantation and offspring rates at birth in rabbit. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 207, 50-55 (2016).
- Roque, M., Valle, M., Kostolias, A., Sampaio, M., Geber, S. Freeze-all cycle in reproductive medicine: current perspectives. JBRA Assisted Reproduction. 21 (1), 49-53 (2017).
- Tsunoda, Y., Soma, T., Sugie, T. Effect of post-ovulatory age of recipient on survival of frozen-thawed rabbit morulae. Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 483-487 (1982).
- Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
- Lavara, R., Baselga, M., Vicente, J. S. Does storage time in LN2 influence survival and pregnancy outcome of vitrified rabbit embryos? Theriogenology. 76 (4), 652-657 (2011).
