Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

Minimalt invasivt Embryo Transfer og embryo Vitrificering på det optimale embryo stadie i kanin model

doi: 10.3791/58055 Published: May 16, 2019

Summary

Assisteret reproduktionsteknik (ARTs) er i løbende evaluering for at forbedre resultaterne og reducere de dermed forbundne risici. Dette manuskript beskriver en minimalt invasiv Embryo Transfer procedure med en effektiv kryopreserverings protokol, der tillader brug af kaniner som en ideel dyremodel for menneskelig reproduktion.

Abstract

Assisteret reproduktionsteknik (ARTs), såsom in vitro embryo kultur eller embryo kryopræservering, påvirker naturlige udviklingsmønstre med perinatal og postnatale konsekvenser. For at sikre en uskadelighed af ART-anvendelser er det nødvendigt at studere dyremodeller. Desuden kræver embryo udviklingsundersøgelser som et sidste skridt en evaluering af deres evne til at udvikle sunde afkom af fuld varighed. Her, embryo overførsel til livmoderen er uundværlig for at udføre enhver ARTs-relaterede eksperiment.

Kaninen er blevet brugt som en model organisme til at studere pattedyrs reproduktion i over et århundrede. Ud over sin fylogenetiske nærhed til den menneskelige art og dens lille størrelse og lave vedligeholdelsesomkostninger, det har vigtige reproduktive egenskaber såsom induceret ægløsning, en kronologi af tidlig fosterudvikling svarende til mennesker og en kort drægtighed der giver os mulighed for at studere konsekvenserne af ART ansøgning nemt. Desuden anvendes ARTs (såsom intracytoplasmisk sædinjektion, embryo kultur eller kryopræservering) med passende effektivitet i denne art.

Ved hjælp af laparoskopisk Embryo Transfer teknik og cryopreservations protokollen præsenteret i denne artikel, vi beskriver 1) hvordan man kan overføre embryoner gennem en nem, minimalt invasiv teknik og 2) en effektiv protokol for langtidsopbevaring af kanin embryoer for at give tids fleksibel logistisk kapacitet og evnen til at transportere stikprøven. De resultater, der opnås efter overførsel af kanin embryoner på forskellige udviklingsstadier, indikerer, at Morula er det ideelle Stadium for genvinding og overførsel af kanin embryoer. Således, en oviductal embryo overførsel er nødvendig, begrunder den kirurgiske procedure. Endvidere, kanin morulae er med succes vitrificeret og laparoscopover føres, beviser effektiviteten af de beskrevne teknikker.

Introduction

Med henblik på at omgå menneskelig infertilitet eller forbedre udbredelsen af husdyr af høj genetisk værdi og bevare dyregenetiske ressourcer, en række teknikker kollektivt betegnes assisteret reproduktion teknologier, såsom superovulation, i vitro -befrugtning, embryo kultur eller kryopræservering, blev udviklet1,2. I øjeblikket, hormonelle behandlinger er givet for at stimulere æggestokkene og producere et stort antal af follikeltal ovarde follikler1. Oocytter indsamlet fra disse follikler kan modnes, befrugtet, og udviklet in vitro indtil de er enten nedfrosne eller overføres til surrogat mødre3. Under disse behandlinger udsættes kønsceller og zygotter dog for en række ikke-fysiologiske processer, der kan kræve embryo tilpasning for at overleve under disse betingelser4,5. Denne tilpasning er mulig på grund af tidlig embryo plasticitet, som tillader Foster ændringer i genekspression og udviklingsmæssig programmering6. Men disse ændringer kan påvirke de efterfølgende stadier af embryo udvikling indtil voksenalderen, og det er nu almindeligt accepteret, at metoder, timing, kryopreserverings procedure eller kulturforhold viser forskellige resultater på embryo skæbne7 , 8. for at belyse de specifikke afledte virkninger af ARTs, er brugen af velkarakteriserede dyremodeller derfor uundgåelig.

Den første dokumenterede levende fødsel som følge af overførsel af pattedyr embryoner fandt sted i 18909. I dag er embryo overførsel (ET) til en surrogat kvinde et afgørende skridt i studiet af ART-induceret effekt under præimplantationen på de efterfølgende embryon udviklingsstadier10. ET teknikker afhænger af størrelsen og anatomisk struktur af hvert dyr. I tilfælde af store animalske modeller, har det været muligt at udføre et ved transcervikal ikke-kirurgiske et-teknikker, men i mindre-størrelse arter kateterisering af livmoderhalsen er mere komplekse og kirurgiske teknikker er ofte anvendes11. Men kirurgisk ET kan forårsage hæmoraging, der kan forringe implantation og embryo udvikling, som blodet kan invadere uterus lumen, forårsager embryo død10. Overskridende ikke-kirurgiske et-teknikker anvendes stadig i mennesker, bavian, kvæg, grise og mus12,13,14,15,16,17, men kirurgisk ETS anvendes stadig i arter som geder, får eller andre dyr, der udgør yderligere vanskeligheder10,18,19,20,21, såsom kaniner (to uafhængige cervices) eller mus (lille størrelse). Ikke desto mindre, kirurgisk overførsel metoder tendens til at have gradvist blevet erstattet af mindre invasive metoder. Endoskopi blev brugt til at overføre embryoner, for eksempel i kaniner, svin og små drøvtyggere18,19,20. Disse minimalt invasive endoskopi metoder kan anvendes til at overføre embryoner til ampulla via infundibulum, som er afgørende for kaniner og har påvist gavnlig effekt i nogle arter20. Dette er baseret på betydningen af den korrekte dialog mellem embryo og mor under tidlige embryon stadier i ovikanalen. Som nævnt ovenfor, embryo Remodeling, der finder sted i kaniner under embryo migration gennem ovidukten er afgørende for at opnå embryoner i stand til implantat22,23.

Dyremodeller af større størrelse, såsom kvæg, er interessante, fordi de biokemiske og præimplantations funktioner ligner dem i menneskelige arter24. Store dyr er imidlertid for dyre at bruge i forundersøgelser, og gnavere betragtes som en ideel model (76% modelorganismer er gnavere) til laboratorieforskning25. Ikke desto mindre giver kanin modellen nogle fordele i forhold til gnavere i reproduktionsstudier, da nogle reproduktive biologiske processer udstillet af mennesker er mere ens hos kaniner end hos mus. Mennesker og kaniner præsenterer en lignende kronologisk embryonale genomaktivering, gastrulation og hemochorial placenta struktur. Desuden, ved hjælp af kaniner er det muligt at kende den nøjagtige timing af befrugtning og graviditet stadier på grund af deres induceret ægløsning25. Kanin livscyklus er kort, fuldføre dræningen i 31 dage og nå puberteten på omkring 4-5 måneder; dyret er let at håndtere på grund af sin føjeligt og ikke-aggressive adfærd, og dens vedligeholdelse er meget økonomisk i forhold til bekostning af større dyr. Desuden er det afgørende at nævne, at kaniner har en duplex livmoder med to uafhængige cervixer11,25. Dette placerer kaninen i en privilegeret position, da embryoner fra de forskellige forsøgsgrupper kan overføres til det samme dyr, men til et andet uterin horn. Dette giver os mulighed for at sammenligne både eksperimentelle virkninger, reducere den maternel faktor fra resultaterne.

I dag, ikke-kirurgiske ET-metoder er ikke i brug i kanin. Nogle undersøgelser foretaget i slutningen af 90 ' erne ved hjælp af en transcervikal et teknik resulterede i lave leveringshastigheder spænder fra 5,5% til 20,0%11,26 versus 50-65% ved kirurgiske metoder, blandt dem laparoskopi procedure beskrevet af Besenfelder og brem18. Den lave succesrate for disse ikke-kirurgiske ET-metoder i kaniner sammenfaldende med manglen på den nødvendige embryo remodeling i ovikanalen, som undgås i transkvical ET. Her beskriver vi en effektiv minimalt invasiv laparoskopisk et procedure ved hjælp af kaniner som model organisme. Denne teknik giver en model for yderligere reproduktiv forskning i store dyr og mennesker.

Da kaniner har et særligt snævert tidsvindue til embryo implantation, kræver et i denne art en høj grad af synkronisering mellem fostrets udviklingsfase og den fysiologiske status for recipient27. I nogle tilfælde, efter en reproduktionsbehandling, der bremser embryo udvikling (såsom in vitro -kultur) eller ændrer endometriets modtagelighed (såsom superovulation behandlinger), der er ingen Synchrony mellem embryonet og moderen livmoderen. Disse situationer kan have en negativ indvirkning på udfaldet. For at reagere i disse sammenhænge, beskriver vi en effektiv kanin Morula forglasning protokol, der giver os mulighed for at pause, organisere og genoptage forsøgene. Denne proces er logistisk ønskelig for reproduktive undersøgelser og giver os kapacitet til langtidsopbevaring af embryoner, så deres transport. Den laparoskopiske procedure og kryopreserverings strategier giver bedre planlægning af undersøgelser med færre dyr. Således tilbyder vores metodologi hygiejniske og økonomiske fordele og er i overensstemmelse med konceptet om 3Rs (udskiftning, reduktion og forfinelse) af animalsk forskning med det erklærede mål at forbedre menneskelig behandling af forsøgsdyr. Således, med disse metoder, kaniner udgør en ideel model organisme for in vivo reproduktive assays.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle procedurer, der blev anvendt i dette studie, blev udført i overensstemmelse med direktiv 2010/63/EU om dyreforsøg og revideret og godkendt af det etiske udvalg til forsøg med dyr fra Universitat Politècnica de València. Spanien (forsknings kode: 2015/VSC/PEA/00170). XGD, FMJ, MPVC og JSV er indehaver af et autorisations certifikat udstedt af den valencianske regerings administration til forsøg på dyr. XGD er bemyndiget til på stedet at føre tilsyn med dyrenes velfærd og pasning under forsøget.

1. overførsel af embryoner

  1. Forberedelse af recipient hundyr
    1. Brug kun seksuelt modne kvinder (> 4,5 måneder gamle).
    2. En uge før ET, tilpasse hunnerne til en 16 h lys/8 h mørkt regime til at initiere follikelvækst og øget kvindelig modtagelighed.
    3. Vælg recipient hunnerne, observere turgiditet og farve af vulva. Hvis vulva er bombastiske og rødlig, er kvinden modtagelig.
    4. Inducerer pseudodrægtighed (ægløsning) ved en enkelt intramuskulær injektion på 1 μg buserelin acetat (syntetisk analog af gonadotropin-releasing hormon) uanset legemsvægt.
      Bemærk: normalt 0,8 μg er en passende dosis til ægløsning induktion i mellemstore kaniner (4-5 kg), så 1 μg generelt garanterer ægløsning.
    5. Fremkald ægløsning så mange dage forinden som alderen på embryonerne, der skal overføres (for eksempel 70-72 h før frisk Morula ET).
  2. Anæstesi og analgesi
    1. Lad kaninen veje og læg følgende bedøvelsesmidler og analgetika i.
      1. I en 1 mL sprøjte med en 30G nål: Load xylazin (5mg/kg) og buprenorphinhydrochlorid (0,03 mg/kg). I en anden 1 mL sprøjte med en 23G pericranial nål, load ketamin hydrochlorid (35 mg/kg).
    2. Hold kaninen og Injicer xylazin-buprenorphin-blandingen intramuskulært.
    3. Indsæt den pericraniale nål med ketamin i den marginale øre, langsomt at introducere alle sprøjtens indhold intravenøst.
    4. Fastgør nålen og lad den blive indsat i de resterende trin for at administrere mere anæstesi, hvis det er nødvendigt.
    5. Lad kanin i buret (ren og uden andre dyr) på en varm fase.
    6. Når bevidstløshed, anvende øjensalve for at undgå tørhed i øjet og kontrollere for fraværet af øjen freflex.
      Bemærk: denne protokol giver et kirurgisk anæstesi plan i mindst 30 minutter. Hvis der er behov for længere tid, indsprøjtes yderligere doser med halvdelen af den mængde ketaminhydrochlorid, der er beskrevet i 1.2.1 efter 30 minutter.
    7. Overvåg dybden af anæstesi ved at kontrollere pedal refleks og vejrtrækning bevægelse. Ændringer i vejrtrækningen mønster til en uregelmæssig og hurtigere hastighed indikerer tab af den rette plan af anæstesi.
    8. Overvåg farven på slimhinderne (øjne, læber osv.), åndedrætsfrekvens (30-60 vejrtrækninger pr. minut), hjerterytme (120-325 slag pr. minut) og rektal temperatur (38-39,6 °c).
    9. Otte timer før overførsel, tilbageholde fødevarer fra dyr for at undgå den større tarm størrelse og aktivitet, indtil ET-processen er færdig. Lad fri adgang til vand.
  3. Forberedelse af embryoner
    1. Opvarm embryon manipulerende medie til 25 °C: base medium (BM), bestående af Dulbecco's fosfat-Buffered Saline (DPBS) suppleret med 0,2% (w/v) kvæg serum albumin.
    2. Arbejder under en stereo mikroskopi, skyl frisk eller optøet (trin 2) embryoner med BM.
    3. Brug sterile handsker til at vedhæfte et korrekt konfigureret 17G epiduralkateter til en 1 mL sprøjte.
    4. Aspirer 1 cm BM ind i kateteret, efterfulgt af en lille luftboble.
    5. Aspirer 5-7embryoner i et volumen på 10 μL BM, efterfulgt af en anden lille luftboble.
    6. indlæsningen af kateteret ved at aspirere 1 cm BM.
  4. Overførsel af embryoner
    1. Overvej brugen af sterile handsker, kjole og maske for at sikre et aseptisk miljø.
    2. Steriliser kirurgiske instrumenter, rengør de overflader, hvor operationen vil blive udført, og tør dem med 70% ethanol.
    3. Udfør anæstesi som tidligere beskrevet (trin 1,2), kontrol for tab af reflekser.
    4. Barber pels fra den ventrale abdomen med en elektrisk barbermaskine.
    5. Forbered den ventrale abdomen aseptisk.
      1. Rengør det kirurgiske område og Fjern eventuelt resterende hår. Vask det kirurgiske område med et chlorhexidin-gluconat-sæbe. Sanitize området med chlorhexidin opløsning og ethanol 96 º (3 gange).
    6. Placer dyret på et varmt kirurgisk bord, i Trendelenburgs position (hoved ned ved 45 °) for at sikre, at maven og tarmene er cranially placeret. Overvej evakuering af blæren, hvis det er turgid. Hvis nogen organer er beskadiget i processen, dyret kan dø. Det er derfor vigtigt at have dem placeret korrekt (figur 1).
    7. Dæk området med et sterilt håndklæde, med et hul (fenestration), der udsætter det barberede område, for at adskille operationsstedet fra potentielle kontaminerende områder.
    8. Indsæt en endoskopisk trobil 5 cm i bughulen, 2 cm hale til xiphoideus processen, og insufflate gennem det peritoneale hulrum med en Tryk regulerende mekanisk insufflator.
      Bemærk: Intraabdominalt tryk skal være 8-12 mmHg med CO2 (figur 1a).
    9. Indsæt endoskop kameraet gennem den endoskopiske trobil (figur 1b).
      Bemærk: Identificer reproduktions vejene, bestemmelse af status og placering af infundibulum og ampulla før ET for at lette de næste skridt.
    10. Den 17-G epidurale nål indsættes i den lyske region mellem 2-3 cm fra infundibulum (figur 1b).
    11. Identificer indgangen til infundibulum (figur 2a, 2b).
    12. Indsæt det ilagte kateter (trin 1,3) gennem epiduralnålen i maven (figur 1c).
    13. Find ovikanalen, og Indsæt 1-2 cm af epiduralkateteret gennem infundibulum i ampulla (figur 2a-2c). Fremskridt ikke meget langt ind i ovikanalen for at forhindre skader og blødning.
    14. Slip embryonerne ind i ovikanalen ved forsigtigt at trykke på stemplet på sprøjten koblet til kateteret (figur 2D-2F). Begge luftbobler skal forlade kateteret.
    15. Fjern kateteret lige efter, at embryonerne er blevet frigivet.
    16. Skyl kateteret, aspirerer og frigive manipulerende medium for at kontrollere fraværet af embryonerne og bekræfte deres vellykkede overførsel.
    17. Gentag trin 1.4.11 til 1.4.16 på den anden side af livmoderen, hvis det ønskes.
    18. Fjern epidural nålen og endoskop kameraet.
    19. Slip CO2 gennem den endoskopiske trobil. Hvis overskydende gas forbliver i maven på dyret, vil det have smerter og ubehag.
    20. Fjern den endoskopiske trobil fra bughulen. Fjern det kirurgiske håndklæde.
    21. Afbryd anæstesi.
    22. Rengør den indsnit, der er foretaget af trobilen, med chlorhexidin-opløsning. Luk indsnittet foretaget af trobilen med en Mikroniseret aluminium og en plastik dressing.
  5. Postoperativ pleje
    1. Behandl dyrene med antibiotika: 10 mg/kg enrofloxacin, subkutant, hver 24-h i 5 dage.
    2. Giv analgetika: buprenorphinhydrochlorid (0,03 mg/kg), intramuskulært, hver 12 timer i 3 dage; Meloxicam (0,2 mg/kg), subkutant hver 24-h i 3 dage.
    3. Overvåg dyrene i mindst 30 minutter efter operationen (afhængigt af dyret og den anvendte anæstesi dosis), og sørg for, at de genvinder deres fysiologiske tilstand.
    4. Identificer modtageren (f. eks. øre- tatovering) og husdyrene enkeltvis i et rent bur med den rette miljømæssige tilstand.

Figure 1
Figur 1: Laparoscopisk embryo overførsel bistået af Laparoskopi (ekstern visning). A) indsættelse af den endoskopiske trobil (en port). B) indsættelse af det endoskopiske kamera og den epidurale nål (sort pil). C) indsættelse af embryo overførings kateteret (hvid pil) gennem epiduralnålen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Laparoscopisk embryo overførsel bistået af Laparoskopi (intern visning). A: Indsættelse af kateteret gennem epiduralnålen i abdominalzonen. Asterisk angiver infundibulum. B, C, D: Det kateter, der er lastet med embryonerne, indsættes i ampulla-regionen på tværs af infundibulum. E, F: Frigivelse af embryonerne, bekræftet ved visualisering af en opsvulmet oviduct. Dette tal er blevet tilpasset fra Marco-Jiménez et al. 38. Klik venligst her for at se en større version af dette tal.

2. embryo Vitrificering og opvarmning

  1. Udfør alle manipulationer ved stuetemperatur (ca. 22 °C) for at reducere toksiciteten ved varmere temperaturer.
    Bemærk: embryoner kan flyttes ved hjælp af 0,1-2 μL automatisk pipette i denne protokol, men andre lignende anordninger til at flytte embryonerne trække den mindste volumen kan være egnet.
  2. Vitrify embryonerne i en to-trins tilføjelse procedure:
    1. Embryonerne anbringes i 2 minutter i ækvilibrerende opløsning bestående af 10% (v/v) ethylenglycol og 10% (v/v) dimethylsulfoxid opløst i BM.
    2. Embryonerne (fra trin 2.2.1) flyttes i 1 minut til forglasnings opløsning bestående af 20% (v/v) ethylenglycol og 20% (v/v) dimethylsulfoxid opløst i BM.
  3. Embryonerne indlæses i en 125 μL plastik ministraw (som indeholder en lukket ende med et bomulds stik og en åben ekstrem). Processen er skematiseret i figur 3.
    1. Par den lukkede ende af 0,125 μL ministraw med den passende mikrodispenser (f. eks. Captroll III®).
    2. Der Aspirer BM indtil 1/3 af strå længden efter en lille luftboble.
    3. Aspirer embryonerne i et volumen på 40 μL vitrificeringsopløsning efterfulgt af en anden lille luftboble.
    4. Der Aspirer BM, indtil den første væske fraktion (trin 2.3.2) når bomuld.
    5. Luk den åbne ende med et halm stik.
  4. Udfør trin 2.2.2, mens trin 2,3 udføres for at sikre, at der ikke går mere end et minut, hvilket ville være giftigt for embryoner.
  5. Kast administrationen direkte ind i flydende kvælstof for at opnå forglasning.
  6. Opbevar administrationen i en Dewar for nitrogen for den ønskede tid.
  7. Optø embryonerne i et enkelt trin.
    1. Placer administrationen vandret 10 cm fra flydende nitrogen dampe til 20-30 s.
    2. Når Krystalliseringsprocessen begynder inde i administrationen, nedsænkes administrationen i et vandbad ved 25 °C i 10-15 s.
    3. Fjern det administrative stik, og skær bomulds proppen af.
    4. Med en koblet mikrodispenser skal alt indholdet i en plade indeholdende 0,33 M saccharoseopløsning ved 25 °C i BM i 5 minutter bortforklares.
      Bemærk: dette trin skal udføres hurtigt for at reducere embryo eksponeringen til forvitringsopløsningen.
    5. Flyt embryonerne til en ny plade indeholdende BM opløsning til yderligere 5 min.
    6. Overvej kun ikke-beskadigede embryoner (med intakt mucin coat og zona pellucida) for at fortsætte med ET.
      Bemærk: Tag hensyn til, at i optøede embryoner kan asynkrone overførsler (f. eks. 60-62 h i Morula-overførsler) forbedre resultaterne ved at tillade en Gensynkronisering mellem embryonet og moderdyrets endometrium.

Figure 3
Figur 3: skematisering af korrekt lastet halm. A) BM refererer til det embryon manipulerende medie, der anvendes under forglasningen. Embryonerne skal være lastet i forglasnings opløsning. B) makroskopisk udseende af det lastede strå med en forstørret detalje af embryo positionen. Denne store volumenenhed giver os mulighed for at vitrify stort antal embryoner, i modsætning til minimum volumenenheder. Desuden er håndteringen af denne enhed lettere sammenlignet med minimum volumenenheder, mens resultaterne er ens i kaniner41. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Minimal invasiv laparoskopisk overførsel af friske eller forglasset embryoner placerer kanin blandt de bedste model dyr til reproduktive undersøgelser. Tabel 1 viser resultaterne af det friske ET-et på forskellige udviklingsstadier (figur 4) af de overførte embryoner. Overlevelsesraten ved fødslen (procentdel af embryoner resulterer i en hvalp) bevist effekten af laparoskopisk teknik beskrevet i dette papir. De højere værdier blev opnået, da ET blev udført med embryoner i Morula scenen, enten tidligt eller kompakt morulae. Baseret på disse resultater, udførte vi et andet eksperiment for at demonstrere overlevelsesraten efter forglasning af disse embryoner. I tabel 2 viser vi således de resultater, der er opnået efter overførsel af vitrificeret kanin morulae, der er udvundet på samme tid, og som differentierer mellem de embryoner, der har nået en god grad af komprimering eller ej. Overlevelsesraten ved fødslen var forskellig mellem de forskellige embryon stadier, at være højere i komprimeret morulae. Derfor er laparoscopisk embryo overførsel en pålidelig teknik til overførsel af friske og forglasset embryoner i kaniner

Figure 4
Figur 4: kanin embryoner. A) pronuclear. B) otte celler. C) tidlig Morula. D) kompakt Morula. E) blastocyst. Asterisk angiver de to pronuclei. Sorte pile angiver zona pellucida. Hvide pile indikerer mucin Coat, som normalt varierer mellem embryoner. ICM: indre cellemasse. TE: trophectoderm. Skala stang: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Udviklingstrin1 Embryoner Modtagere Sted for overførsel Graviditetsrate (%) Implantations hastighed (%) Overlevelsesrate ved fødslen (%)2
Utydelig 78 af 7 Ovidukten 7 (100) 50 (64,0)b 34 (43,6)b
otte celler 81 af 7 Ovidukten 7 (100) 60 (74,1)b 53 (65,4)en
Tidlig Morula 81 af 7 Ovidukten 7 (100) 80 (98,8)en 60 (74,1)en
Kompakt Morula 80 af 7 Ovidukten 7 (100) 80 (100)en 58 (72,5)en
Blastocyst 80 af 7 Livmoderen 7 (100) 73 (91,3)en 38 (47,5)b

Tabel 1. Virkningsgrad af frisk kanin embryo overførsel (in vivo afledt) ved laparoskopi. 1forskellige embryoner blev genvundet ved 18-20h (pronuclear), 36-38h (8 celler), 60-62 h (Early morula), 70-72 h (Compact morula) og 80-82 h (blastocyst) efter parring. Kompakt (> 32 celler) og ikke-kompakt morulae (≈ 32 celler) kan være grundlagt på 70-72 h, men kun kompakt morulae blev overført. 2 af Overlevelse sats ved fødslen fra modtager gravid gør. a, b Værdier med forskellige hævet skrift er statistisk forskellige (P < 0,001).

Udviklingsstadie Overførte embryoner Modtagere Graviditetsrate (%) Overlevelsesrate ved fødslen (%)1
Ikke-komprimeret 135 af 10 9 (90) 62 (45,9)b
Komprimeret 150 af 10 10 (100,0) 98 (65,3)en
Samlede 285 af 20 19 (95) 160 (56,1)

Tabel 2. Levedygtighed af ikke-komprimeret vs kompakt forglasset Morula. a, b-værdier med forskellige hævet skrift er statistisk forskellige (P < 0,001). 1 af Overlevelse sats ved fødslen fra modtager gravid gør. Embryoner blev genvundet på samme tid (70-72 h) og blev skelnet til kompakt (> 32 celler) og ikke-kompakte morulae (≈ 32 celler).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Siden den første dokumenterede levende fødsel tilfælde fra overførte embryoner9, denne teknik og kanin arter er blevet afgørende i reproduktive undersøgelser. Desuden kræver embryoforskning, der involverer manipulation, produktion, kryopræservering osv. , som et sidste trin evaluering af embryo kapacitet til at generere sundt, fuldtids afkom. Derfor er Embryo Transfer teknik uundværlig13,28. I årenes løb er de kirurgiske metoder, der oprindeligt blev anvendt til at overføre embryoner til moderen, gradvist blevet erstattet af mindre invasive metoder i langt de fleste af arterne13,14,15, 21 ud af , 27 stk. , 29 ud af , 30. i kaniner bliver intraoviductal et i tidlige embryon stadier af udvikling og in vitro -producerede embryoner imidlertid uundgåeligt for at sikre et tilsvarende resultat af naturforholdene. Hos kaniner er intraoviductal mucin coat en afgørende faktor, der tillader embryo implantation, da det finder sted efter remodellering af embryonale belægninger under blastocyst ekspansion i livmoder hornene. Men, mucin coat deposition er begrænset til ovidukten i 3 dage efter ægløsning, og de molekylære mekanismer af coat materiale deposition er stort set ukendte31. Af disse grunde er det kendt, at in vitro-udviklede blastocyster ikke overlevede, når de blev overført til livmoderen32,33,34, og embryoner med en beskadiget mucin coat har en lavere overlevelsesrate 35. på samme måde resulterede grupper, der rapporterede en tranervistisk embryo overførsel i kaniner, i meget lave levendefødte priser11,26. Her præsenterer vi en minimalt invasiv teknik, der er tilpasset fra Besenfelder og brem18, til at overføre embryoner med succesfulde fødsels rater. Ifølge resultaterne i tabel 1var Morula scenen i kanin embryoner den bedste embryonale fase for at opnå en høj overlevelsesrate ved fødslen. En mulig forklaring er den større følsomhed over for manipulation af de tidligste stadier. Interessant, succesraten stiger som den embryonale fase skrider frem, muligvis på grund af den større eksponering af embryonet til oviductal sekreter forud for sin helbredelse. Men når embryoner nå blastocyst scenen og er sted-konkordant overføres til livmoderen, værdierne falder drastisk. Ikke udelukker, hvad der er blevet sagt, en mulig forklaring kunne være, at embryoner overført til ovikanalen kan genoprette den mulige skade genereret i mucin lag under embryo manipulation. Derfor vil blastocyster, der overføres til livmoderen, blive frataget denne mekanisme, hvilket kan kompromittere deres implantations kapacitet.

Teknikken udføres ved hjælp af en enkelt port instrument (5 mm endoskop trocar), med let, kort manipulation. Derfor, the5-mm endoskop trokar indsnit kræver ikke lukning. Laparoscopic teknik fordele omfatter nedsat postoperative smerter, hurtigere tilbagevenden til normal aktivitet, og færre postoperative komplikationer. Desuden inducerer endoskopiske procedurer færre abdominale klæbemidler og giver en bedre immunrespons fra modtageren sammenlignet med åben kirurgi21,36,37. Akkumulerende beviser fra vores laboratorium har demonstreret effektiviteten af denne ET procedure i kanin model. I de sidste fem år blev der således overført i alt 3.909 embryoner (1.335 friske og 2.574 forglasset embryoner) gennem den procedure, der er beskrevet i dette manuskript. Som følge af denne teknik var afkom af friske og forglasset overførings embryoner 62,9% og 42,5% henholdsvis38,39,40,41,42, 43 af , 44 af , 45 af , 46 af , 47. mange undersøgelser er alle baseret på denne teknik: Marco-Jiménez et al. 38 af , 39 af , 40 af , 41, Vicente et al. 42, viudes-de-Castro et al. 43, Saenz-de-juano et al. 44 af , 45 af , 47, lavara et al. 46af

Praktiske anbefalinger til udførelse af denne teknik er beskrevet nedenfor. I embryon kultur eksperimenter, er det også tilrådeligt at bruge et nyt kateter til embryo overførsel i stedet for den, der anvendes til at flytte embryoner mellem kultur medier og manipulation medier. Dette undgår overførsel af mineralolie og sikrer et optimalt flow. Under ET er det vigtigt at minimere håndteringen af reproduktions vejene, da overdreven manipulation af ovikanalen kan resultere i klæbestoffer. Hvis ovikanalen er snoet, ansætte epidural sprøjte til at forsøge at placere det korrekt, ikke kateteret, da det indeholder embryoner og den mekaniske manipulation kan forårsage deres tab. Når kateteret passerer gennem ovikanalen, glider det let. Hvis det ikke gør det, kan kateteret være afgået. En gang inde i ovikanalen, hvis mediet ikke flyder, flytte kateteret ud lidt og forsøge at genindsætte det igen. Hvis det stadig ikke flyder, er kateteret tilstoppet. Fjern det fra ovikanalen og slip indholdet i en skål med et rent medium. Derefter genindlæse embryonerne i et andet kateter og forsøge at genindsætte det i ovikanalen igen. Levering normalt tager steder 28-30 dage efter Morula Transfer.

Desuden er der tegn på, at embryo udviklingsstadiet kan være mere avanceret end livmoder miljøet i pseudopregnant kvinder, men ikke det modsatte. Specifikt, embryoner har evnen til at vente på den gunstige livmoder miljø, men livmoder miljø kan ikke vente på embryonerne på det rigtige Stadium for implantation10. Med hensyn til forglasset embryoner, efter en kort/langvarig opbevaring er det muligt at synkronisere den udviklingsmæssige fase af embryonet med det tilsvarende gunstige livmoder miljø. Hvis embryo donoren også er embryo recipient, kan de skadelige virkninger af superovulation på endometriet omgås ved hjælp af vitrifikationsteknikken og overførsel af embryonerne i en efterfølgende cyklus48. Hos kaniner er vitrificerede embryoner, der overføres til ovidukter af recipienter induceret til ægløsning 60-62 h forinden (Asynk) en yderst effektiv teknik44,49. I forbindelse med dette, er det blevet foreslået, at oviductal embryo overgang i løbet af 10-12 h kunne forklare de gavnlige virkninger i restaurering af celle fysiologi og udskiftning af døde celler, og sandsynligvis reparere skader induceret i mucin coat under embryo Manipulation. Desuden frembyder forglasset embryoer en forsinkelse i udviklingen, da de er blevet metabolisk suspenderet under opbevaringen. Overførsel af kryopreserverede embryoner til asynkrone modtagere gør det derfor muligt for embryonet at genaktivere dets metaboliske aktivitet, og embryostadiet i udviklingen synkroniseres således med livmoder miljøet. Hvis kryopreserverede embryoner overføres til synkroniske-receptorer, hindrer kryds snakken mellem moderen og embryonet i stedet, at der indtræder en vellykket graviditet. Hos kaniner er den højeste overlevelsesrate opnået efter intraoviductisk overførsel af nedfrosne morulae49. Vores data er i overensstemmelse med denne rapport, selv om Morula scenen udviser forskellige overlevelsesrater efter kryopræservering afhængigt af deres grad af komprimering ved 70-72 h (tabel 2). Her viste komprimeret morulae højere overlevelsesrater ved fødslen i forhold til ikke-komprimeret morulae, som var i overensstemmelse med tidligere rapporter, der viser, at hver fase af udviklingen havde sin egen mekanisme i forhold til gennemtrængning af kryoprotectanter og omfanget af dehydrering under tilsætning af kryopreserverings opløsningen50. I forbindelse med disse teknikker har vi påvist, at en kombination af vitrificering og intraoviductal embryo overførsel er en vellykket strategi til genetablering af kanin populationer efter 15 års oplagring i flydende kvælstof uden negativ indvirkning på deres overlevelse og levende fødsel51.

Følgende oplysninger skal tages i betragtning for at kunne udføre denne teknik. Det er vigtigt at huske på, at den stigende tæthed af de efterfølgende medier, der anvendes til forglasning (DPBS, ækvibrationsopløsning, forglasnings opløsning), kan inducere embryo sammentrækning på grund af progressiv embryo dehydrering. Dens normale udseende genvindes dog, når embryonet er ækvilibreret med mediet. Desuden, når embryonet flyttes mellem stigende tæthed medier, det har tendens til at flytte til overfladen af medierne på grund af tæthed bevægelser. For at undgå embryo tab og sikre tidspunktet for forglasning, anbefales det at udføre vitrificering i små dråber af medierne, der vil holde embryonet på plads.

Afslutningsvis, her beskriver vi både en ET-teknik og en embryo vitrificering metode, der letter fremtidige undersøgelser, der bruger kaniner som model. Baseret på den tætte fylogenetiske afstand mellem kaniner og mennesker, kan brugen af denne model give resultater let overføres til human klinisk medicin. Desuden tilbyder vores metode nogle hygiejniske og økonomiske fordele, der er i overensstemmelse med begrebet 3 rs af dyrevelfærd (udskiftning, reduktion og raffinement), samtidig med at målet om at forbedre human behandling af forsøgsdyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af midler fra ministeriet for økonomi og konkurrenceevne i Spanien (AGL2017-85162-C2-1-R) og Generalitat Valenciana-forskningsprogrammet (PrometeoII 2014/036). Engelsk tekstversion revideret af N. Macowan English Language service

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 332
Buprenorphine hydrochloride Alvet Escartí 626 To be ordered by a licensed veterinarian.
Buserelin Acetate Sigma Aldrich B3303
Clorhexidine digluconate soap Alvet Escartí 0265DCCJ500B
Clorhexidine digluconate solution Alvet Escartí 0265DCCA500B
CO2 Air Liquide 99921 CO2 N48.
CO2 Incubator Fisher scientific 15385194
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich W387509
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) Sigma Aldrich D5773 Without calcium chloride.
Electric razor Oster Golden A5 078005-140-002
Endoscope camera Optomic Spain S.A OP-714
Endoscope trocar with silicone leaflet valve Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 30114GK Lightweight trocar model.
Enrofloxacin Alvet Escartí 9993046 To be ordered by a licensed veterinarian.
Epicraneal needle 23G Alvet Escartí 514056353 Smaller needles can be also used.
Epidural catheter Vygon corporate 187.10
Epidural needle Vygon corporate 187.10
Ethylene Glycol Sigma Aldrich 102466-M
Eye ointment Alvet Escartí 5273
Ketamine hydrochloride Alvet Escartí 184 To be ordered by a licensed veterinarian.
Laparoscopy equipment Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 26003 AA Hopkins® Laparoscope, 0º-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel.
Light source Optomic Spain S.A Fibrolux 250
Liquid Nitrogen Air Liquide P1505XXX
Mechanical CO2 insufflator Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. Endoflator®
Meloxicam Alvet Escartí 9993501 To be ordered by a licensed veterinarian.
Petri dishes, 35-mm Sigma Aldrich CLS430165-500EA
Plastic dressing (Nobecutan) IBOR medica 7140028
Plastic Straw 0.25 mL IMV - technologies 6431
Povidone iodide solution Alvet Escartí 02656DPYS500S
Scissors ROBOZ RS-5880 Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
Silicone tube for insufflator Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 20400040
Stereomicroscope Leica MZ16F There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few.
Sterile Gloves Alvet Escartí 087GL010075
Sterile gown Alvet Escartí 12261501
Sterile mask Alvet Escartí 058B15924B
Straw Plug IMV - technologies 6431
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Syringe, 1-mL Fisher scientific 11750425
Syringe, 5-mL Fisher scientific 11773313
Urinary catheter IMV - technologies 17722
Waterbath RAYPA BAE-4
Xylazine Alvet Escartí 525225 To be ordered by a licensed veterinarian.
Rabbits Universitat Politècnica de València Line A Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, M., Heilbronn, L. K. The health outcomes of human offspring conceived by assisted reproductive technologies (ART). Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8, (4), 388-402 (2017).
  2. Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo vitrification in rabbits: Consequences for progeny growth. Theriogenology. 84, (5), 674-680 (2015).
  3. Sirard, M. A. The influence of in vitro. fertilization and embryo culture on the embryo epigenetic constituents and the possible consequences in the bovine model. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8, (4), 411-417 (2017).
  4. Feuer, S. K., Rinaudo, P. F. Physiological, metabolic and transcriptional postnatal phenotypes of in vitro. fertilization (IVF) in the mouse. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8, (4), 403-410 (2017).
  5. Jiang, Z., et al. Genetic and epigenetic risks of assisted reproduction. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 44, 90-104 (2017).
  6. Fleming, T. P., Velazquez, M. A., Eckert, J. J. Embryos, DOHaD and David Barker. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 6, (5), 377-383 (2015).
  7. Sparks, A. E. Human embryo cryopreservation-methods, timing, and other considerations for optimizing an embryo cryopreservation program. Seminars in Reproductive Medicine. 33, (2), 128-144 (2015).
  8. Swain, J. E. Optimal human embryo culture. Seminars in Reproductive Medicine. 33, (2), 103-117 (2015).
  9. Heape, W. Preliminary note on the transplantation and growth of mammalian ova within a uterine foster-mother. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 48, 457-459 (1890).
  10. Bermejo-Alvarez, P., Park, K. E., Telugu, B. P. Utero-tubal embryo transfer and vasectomy in the mouse model. Journal of Visualized Experiments. (84), e51214 (2014).
  11. Kidder, J. D., Roberts, P. J., Simkin, M. E., Foote, R. H., Richmond, M. E. Nonsurgical collection and nonsurgical transfer of preimplantation embryos in the domestic rabbit (Oryctolagus cuniculus) and domestic ferret (Mustela putorius furo). Journal of Reproduction and Fertility. 116, (2), 235-242 (1999).
  12. Tıras, B., Cenksoy, P. O. Practice of embryo transfer: recommendations during and after. Seminars in Reproductive Medicine. 32, (4), 291-296 (2014).
  13. Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53, (3), 228-231 (2014).
  14. Moreno-Moya, J. M., et al. Complete method to obtain, culture, and transfer mouse blastocysts nonsurgically to study implantation and development. Fertility and Sterility. 101, (3), e13 (2014).
  15. Hasler, J. F. Forty years of embryo transfer in cattle: a review focusing on the journal Theriogenology, the growth of the industry in North America, and personal reminisces. Theriogenology. 81, (1), 152-169 (2014).
  16. Bauer, C. The baboon (Papio sp.) as a model for female reproduction studies. Contraception. 92, (2), 120-123 (2015).
  17. Martinez, E. A., et al. Nonsurgical deep uterine transfer of vitrified, in vivo-derived, porcine embryos is as effective as the default surgical approach. Science Reports. 5, 10587 (2015).
  18. Besenfelder, U., Brem, G. Laparoscopic embryo transfer in rabbits. Journal of Reproduction and Fertility. 99, 53-56 (1993).
  19. Besenfelder, U., Mödl, J., Müller, M., Brem, G. Endoscopic embryo collection and embryo transfer into the oviduct and the uterus of pigs. Theriogenology. 47, (5), 1051-1060 (1997).
  20. Besenfelder, U., Havlicek, V., Kuzmany, A., Brem, G. Endoscopic approaches to manage in vitro and in vivo embryo development: use of the bovine oviduct. Theriogenology. 73, (6), 768-776 (2010).
  21. Fonseca, J. F., et al. Nonsurgical embryo recovery and transfer in sheep and goats. Theriogenology. 86, (1), 144-151 (2016).
  22. Denker, H. W. Structural dynamics and function of early embryonic coats. Cells Tissues Organs. 166, 180-207 (2000).
  23. Marco-Jiménez, F., López-Bejar, M. Detection of glycosylated proteins in rabbit oviductal isthmus and uterine endometrium during early embryo development. Reproduction in Domestic Animals. 48, (6), 967-973 (2013).
  24. Ménézo, Y. J., Hérubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reproductive BioMedicine Online. 4, (2), 170-175 (2002).
  25. Fischer, B., Chavatte-Palmer, P., Viebahn, C., Navarrete Santos, A., Duranthon, V. Rabbit as a reproductive model for human health. Reproduction. 144, (1), 1-10 (2012).
  26. Besenfelder, U., Strouhal, C., Brem, G. A method for endoscopic embryo collection and transfer in the rabbit. Zentralbl Veterinarmed A. 45, (9), 577-579 (1998).
  27. Daniel, N., Renard, J. P. Embryo transfer in rabbits. Cold Spring Harbor Protocols. 2010, (1), (2010).
  28. Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters rabbit foetal placenta at transcriptomic and proteomic level. Reproduction. 147, (6), 789-801 (2014).
  29. Green, M., Bass, S., Spear, B. A device for the simple and rapid transcervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications. Biotechniques. 47, (5), 919-924 (2009).
  30. Duan, X., Li, Y., Di, K., Huang, Y., Li, X. A nonsurgical embryo transfer technique in mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 32, (4), 440-446 (2016).
  31. Denker, H. W., Gerdes, H. J. The dynamic structure of rabbit blastocyst coverings. I. Transformation during regular preimplantation development. Anatomy and Embryology. 157, 15-34 (1979).
  32. Seidel, G. E., Bowen, R. A., Kane, M. T. In vitro fertilization, culture and transfer of rabbit ova. Fertility and Sterility. 27, 861-870 (1976).
  33. Binkerd, P. E., Anderson, G. B. Transfer of cultured rabbit embryos. Gamete Research. 2, 65-73 (1979).
  34. Murakami, H., Imai, H. Successful implantation of in vitro cultured rabbit embryos after uterine transfer: a role for mucin. Molecular Reproduction and Development. 43, 167-170 (1996).
  35. Techakumphu, M., Wintenberger-Torrèsa, S., Sevelleca, C., Ménézo, Y. Survival of rabbit embryos after culture or culture/freezing. Animal Reproduction Science. 13, (3), 221-228 (1987).
  36. Gitzelmann, C. A., et al. Cell-mediated immune response is better preserved by laparoscopy than laparotomy. Surgery. 127, (1), 65-71 (2000).
  37. Huang, S. G., Li, Y. P., Zhang, Q., Redmond, H. P., Wang, J. H., Wang, J. Laparotomy and laparoscopy diversely affect macrophage-associated antimicrobial activity in a murine model. BMC Immunology. 14, 27 (2013).
  38. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Almela-Miralles, V., Vicente, J. S. Development of Cheaper Embryo Vitrification Device Using the Minimum Volume Method. Public Library of Science One. 11, (2), e0148661 (2016).
  39. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Generation of live offspring from vitrified embryos with synthetic polymers supercool X-1000 and Supercool Z-1000. CryoLetters. 35, 286-292 (2014).
  40. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Use of cyclodextrins to increase cytoplasmic cholesterol in rabbit embryos and their impact on live KITs derived from vitrified embryos. Cryoletters. 35, 320-326 (2014).
  41. Marco-Jiménez, F., Lavara, R., Jiménez-Trigos, E., Vicente, J. S. In vivo development of vitrified rabbit embryos: Effects of vitrification device, recipient genotype, and asynchrony. Theriogenology. 79, (7), 1124-1129 (2013).
  42. Vicente, J. S., et al. Rabbit morula vitrification reduces early foetal growth and increases losses throughout gestation. Cryobiology. 67, 321-326 (2013).
  43. Viudes-de-Castro, M. P., Marco-Jiménez, F., Cedano-Castro, J. I., Vicente, J. S. Effect of corifollitropin alfa supplemented with or without Lh on ovarian stimulation and embryo viability in rabbit. Theriogenology. 98, 68-74 (2017).
  44. Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters at transcriptomic and proteomic level rabbit foetal placenta. Reproduction. 147, 789-801 (2014).
  45. Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Lavara, R., Vicente, J. S. Direct comparison of the effects of slow freezing and vitrification on late blastocyst gene expression, development, implantation and offspring of rabbit morulae. Reproduction in Domestic Animals. 49, 505-511 (2014).
  46. Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Long-term and transgenerational effects of cryopreservation on rabbit embryos. Theriogenology. 81, 988-992 (2014).
  47. Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo transfer manipulation cause gene expression variation in blastocysts that disrupt implantation and offspring rates at birth in rabbit. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 207, 50-55 (2016).
  48. Roque, M., Valle, M., Kostolias, A., Sampaio, M., Geber, S. Freeze-all cycle in reproductive medicine: current perspectives. JBRA Assisted Reproduction. 21, (1), 49-53 (2017).
  49. Tsunoda, Y., Soma, T., Sugie, T. Effect of post-ovulatory age of recipient on survival of frozen-thawed rabbit morulae. Journal of Reproduction and Fertility. 65, (2), 483-487 (1982).
  50. Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17, (3), 744-751 (2002).
  51. Lavara, R., Baselga, M., Vicente, J. S. Does storage time in LN2 influence survival and pregnancy outcome of vitrified rabbit embryos? Theriogenology. 76, (4), 652-657 (2011).
Minimalt invasivt Embryo Transfer og embryo Vitrificering på det optimale embryo stadie i kanin model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Garcia-Dominguez, X., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Vicente, J. S. Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model. J. Vis. Exp. (147), e58055, doi:10.3791/58055 (2019).More

Garcia-Dominguez, X., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Vicente, J. S. Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model. J. Vis. Exp. (147), e58055, doi:10.3791/58055 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter