Summary
Вспомогательные репродуктивные методы (ARTs) находятся в постоянной оценке для улучшения результатов и снижения связанных с этим рисков. В этой рукописи описывается минимально инвазивная процедура переноса эмбрионов с эффективным криоконсервативным протоколом, который позволяет использовать кроликов в качестве идеальной модели животных для воспроизводства человека.
Abstract
Вспомогательные репродуктивные методы (искусство), такие как экстракорпоральное развитие эмбриона или криоконсервация эмбрионов, влияют на естественные модели развития с перинатальными и послеродовых последствиями. Для обеспечения безвредности Арт-приложений необходимы исследования на животных моделях. Кроме того, в качестве последнего шага исследования в области развития эмбриона требуют оценки их способности к развитию здорового потомства на полную перспективу. Здесь, перенос эмбрионов в матку незаменим для выполнения любого эксперимента, связанного с искусством.
Кролик использовался как образцовый организм для изучения воспроизводства млекопитающих на протяжении более века. В дополнение к своей филогенетическое близости к человеческому виду и его небольшого размера и низкой стоимости обслуживания, он имеет важные репродуктивные характеристики, такие как индуцированная овуляция, Хронология раннего эмбрионального развития, похожая на человека, и короткая беременность которые позволяют нам легко изучить последствия применения Арт. Более того, искусство (например, интрациклический впрыск спермы, культура эмбриона или криоконсервация) применяется с подходящей эффективностью для этого вида.
Используя лапароскопическую технику переноса эмбрионов и протокол криоконсервации, представленный в этой статье, мы описываем 1) как перенести эмбрионы через легкую, минимально инвазивную технику и 2) эффективный протокол для долгосрочного хранения кролика эмбрионов, чтобы обеспечить гибкий материально-технический потенциал и возможность транспортировки образца. Результаты, полученные после переноса эмбрионов кролика на различных стадиях развития, указывают на то, что морула является идеальной стадией для восстановления и переноса эмбрионов кролика. Таким образом, требуется перенос эмбриона, оправдывающий хирургическую процедуру. Кроме того, кролик morulae успешно витрифицированных и лапароскопию переданы, доказывая эффективность описанных методов.
Introduction
С целью обхода человеческого бесплодия или улучшения распространения скота высокой генетической ценности и сохранения животных генетических ресурсов, набор методов коллективно называют вспомогательных репродуктивных технологий, таких как суперовуляции, в Экстракорпоральное оплодотворение, культура эмбриона или криоконсервация были разработаны1,2. В настоящее время гормональное лечение дается, чтобы стимулировать яичники и производить большое количество антрального яичника фолликулов1. Ооциты, собранные из этих фолликулов, могут созреть, оплодотворены и развиваться в пробирке , пока они не будут либо криоконсервированными, либо переданы суррогатным матерям3. Тем не менее, во время этих процедур, гаметы и зиготы подвергаются ряд нефизиологических процессов, которые могут потребовать адаптации эмбриона, чтобы выжить в этих условиях4,5. Эта адаптация возможна из-за ранней пластичности эмбриона, что позволяет изменения эмбриона в экспрессии генов и программирования6. Однако, эти изменения могут влиять на последующие этапы развития эмбриона до совершеннолетия, и в настоящее время широко признается, что методы, сроки, криоконсервация процедуры или условия культуры показывают различные результаты на эмбрион судьбы7 , 8. Таким образом, для выяснения конкретных индуцированных эффектов искусства, использование хорошо охарактеризовать животных моделей неизбежна.
Первое документально живое рождение в результате переноса эмбрионов млекопитающих состоялось в 18909. Сегодня, эмбрион передачи (ET) для суррогатной женщины является решающим шагом в изучении Арт-индуцированных эффектов во время предимплантационной на последующих стадиях развития эмбриона10. Технологии ET зависят от размера и анатомической структуры каждого животного. В случае крупногабаритных моделей животных, было возможно выполнить ET путем транскерических нехирургических ET методов, но в меньших по размеру видов катетеризации шейки матки является более сложным и хирургические методы часто используются11. Тем не менее, хирургическое ET может вызвать кровотечение, которое может нарушить имплантацию и развитие эмбриона, как кровь может вторгнуться в просвет матки, вызывая гибель эмбриона10. Трансцервические нехирургические et методы по-прежнему применяются в организме человека, бабуинов, крупного рогатого скота, свиней и мышей12,13,14,15,16,17, но хирургические ETs все еще используются в таких видах, как козы, овцы или другие животные, которые представляют дополнительные трудности10,18,19,20,21, таких как кролики (два независимых черв) или мышей (малый размер). Тем не менее, хирургические методы переноса, как правило, постепенно заменялись менее инвазивными методами. Эндоскопия использовалась для переноса эмбрионов, например, у кроликов, свиней и мелких жвачных животных18,19,20. Эти малоинвазивные методы эндоскопии могут быть использованы для переноса эмбрионов в ампулу через инфундибулум, что имеет важное значение для кроликов и продемонстрировал благотворное влияние на некоторые виды20. Это основано на важности правильного диалога между эмбрионом и матерью во время ранних стадий эмбриона в яйцепроток. Как упоминалось выше, реконструкция эмбриона, которая имеет место в кроликах во время миграции эмбриона через яйцепроток, имеет важное значение для достижения эмбрионов, способных имплантировать22,23.
Более крупные животные модели, такие как бычий, интересны тем, что биохимические и преимплантационной функции аналогичны тем, в человеческом виде24. Тем не менее, крупные животные являются слишком дорогими, чтобы использовать в предварительных испытаниях, и грызуны считаются идеальной моделью (76% модели организмов грызунов) для лабораторных исследований25. Однако, модель кролика обеспечивает некоторые преимущества над грызунами в воспроизводственных изучениях, по мере того как некоторые воспроизводственные биологические процессы выставлены людьми более подобны в кроликах чем те в мышах. Человек и кролики представляют подобную хронологическую активацию эмбрионального генома, гастроляции и гемохальной плацентарной структуры. Кроме того, с помощью кроликов можно узнать точные сроки оплодотворения и стадии беременности из-за их индуцированной овуляции25. Жизни кролика циклы короткие, завершив беременность в 31 дней и достижения полового созревания около 4-5 месяцев; животное легко справляется из-за его послушного и неагрессивного поведения, и его содержание очень экономично по сравнению с расходами более крупных животных. Кроме того, очень важно упомянуть, что кролики имеют дуплексную матку с двумя независимыми сервиксы11,25. Это помещает кролика в преференциальное положение, по мере того как зародыши от по-разному экспериментально групп можно перенести в такое же животное, но в по-разному Рожочок матки. Это позволяет нам сравнивать как экспериментальные эффекты, уменьшая материнский фактор из результатов.
Сегодня, нехирургических ET методы не используются в кролике. Некоторые исследования, проведенные в конце 90-х годов с использованием трансцервикальной технологии et привели к низкой скорости доставки от 5,5% до 20,0%11,26 против 50-65% хирургические методы, среди них процедура Лапароскопия описывается Безенфельдер и Брем18. Низкие показатели успешности этих нехирургических ET методов у кроликов совпадают с отсутствием необходимого ремоделирования эмбриона в яйцепроток, которого можно избежать в трансцервикальной ET. Здесь мы описываем эффективную минимально инвазивную лапароскопическую процедуру ET с использованием кроликов в качестве модельного организма. Этот метод обеспечивает модель для дальнейшего репродуктивного исследования в крупных животных и людей.
Потому что кролики имеют особенно узкое окно времени для имплантации эмбриона, ET в этом виде требует высокой степенью синхронности между стадии развития эмбриона в ET и физиологический статус получателя27. В некоторых случаях, после репродуктивного лечения, что замедляет развитие эмбриона (например, в пробирке культуры) или изменяет Восприимчивость эндометрия (например, суперовуляции лечения), нет синхронности между эмбрионом и материнской матки. Эти ситуации могут негативно сказаться на результатах. Чтобы ответить в этих контекстах, мы описываем эффективный протокол витрификации кролика, который позволяет нам приостановить, организовать и возобновить эксперименты. Этот процесс является технически желательным для репродуктивных исследований и дает нам способность к долгосрочному хранению эмбрионов, позволяя их транспортировке. Лапароскопические процедуры и криоконсервация стратегии позволяют лучше планировать исследования с меньшим количеством животных. Таким образом, Наша методика предлагает гигиенические и экономические преимущества и соответствует концепции 3Rs (замена, сокращение и уточнение) исследований на животных с заявленной целью улучшения лечения человека подопытных животных. Таким образом, с помощью этих методов, кролики представляют собой идеальную модель организма для в естественных условиях репродуктивных анализов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры, используемые в данном исследовании, были выполнены в соответствии с директиве 2010/63/EU ЕЭК для экспериментов на животных и рассмотрены и утверждены этическим Комитетом по экспериментам с животными в университете Politècnica де València, Испания (исследовательский кодекс: 2015/VSC/горох/00170). XGD, ФМДЖ, ПВХ и ССВ имеют сертификат авторизации, выданный Валенсийским правительственным управлением для экспериментов с животными. XGD уполномочен на месте контролировать благосостояние и заботу о животных во время эксперимента.
1. перенос эмбрионов
- Подготовка реципиентов женского пола
- Использовать только сексуально зрелых самок (> 4,5 месяцев).
- За неделю до ET, адаптировать женщин 16 ч свет/8 ч темный режим, чтобы инициировать фолликулярный рост и повышение женской восприимчивости.
- Выберите реципиентов самок, наблюдая за тугезстью и цветом вульвы. Если вульвы напыщенный и красноватый, женщина восприимчива.
- Индуцировать pseudopregnancy (овуляция) одной внутримышечной инъекцией 1 мкг бузерелина ацетата (синтетический аналог гонадотропина-выпуская гормон) независимо от массы тела.
Примечание: обычно 0,8 мкг является подходящей дозой для индукции овуляции у кроликов среднего размера (4-5 кг), поэтому 1 мкг обычно гарантирует овуляцию. - Индуцировать овуляцию столько дней заранее, как возраст эмбрионов, подлежащих передаче (например, 70-72 h до свежего морула et).
- Анестезия и обезболивание
- Взвешивать кролика и загружать следующие анестетиков и анальгетиков.
- В 1 мл шприца с 30 г иглы: нагрузка ксилазин (5 мг/кг) и бупренорфин гидрохлорид (0,03 мг/кг). В другом 1 мл шприца с 23 г околокраниальной иглой, нагрузка гидрохлорида кетамина (35 мг/кг).
- Держать кролика и вводить ксилазин-бупренорфин смесь внутримышечно.
- Вставьте околокраниальную иглу с кетамином в предельную ушную Вену, медленно вводя все содержимое шприца внутривенно.
- Закрепите иглу и оставьте ее вставленной на протяжении оставшихся шагов, чтобы управлять больше анестезии, если это необходимо.
- Оставьте кролика в клетке (чистый и без каких-либо других животных) на теплой сцене.
- После бессознательного, нанесите глазную мазь, чтобы избежать сухости глаз и проверить на отсутствие палпейбральных FREFLEX.
Примечание: этот протокол обеспечивает хирургическую плоскость анестезии в течение как минимум 30 мин. Если требуется более длительное время, вводят дополнительные дозы с половиной количества гидрохлорида кетамина, описанного в 1.2.1 после 30 мин. - Контролировать глубину анестезии, проверяя педаль рефлекс и дыхание движения. Изменения в дыхании шаблон для нерегулярных и более быстрыми темпами указывают на потерю надлежащей плоскости анестезии.
- Монитор цвет слизистой оболочки (глаза, губы и т.д.), частота дыхания (30-60 вдохов в минуту), частота сердечных сокращений (120-325 ударов в минуту) и ректальная температура (38-39.6 ° c).
- За восемь часов до перевода, удерживать пищу от животных, чтобы избежать больший размер кишки и деятельности до тех пор, пока процесс ET закончена. Оставьте свободный доступ к воде.
- Взвешивать кролика и загружать следующие анестетиков и анальгетиков.
- Подготовка эмбрионов
- Подогреть носители эмбриона до 25 °C: базовая среда (БМ), состоящая из фосфата-буферного физиологического раствора Дульбекко (DPBS), дополнена 0,2% (w/v) коровьего сывороточного альбумина.
- Рабочая под стереомикроскопов, промыть свежей или талой (шаг 2) эмбрионов с BM.
- Используя стерильные перчатки, приложите правильно настроенный 17G эпидуральный катетер к шприцу 1 мл.
- Аспоте 1 см БМ в катетер, а затем небольшой воздушный пузырь.
- Аспирин 5-7embryos в объеме 10 мкл БМ, а затем еще один небольшой воздушный пузырь.
- Завершите погрузку катетера на 1 см БМ.
- Перенос эмбрионов
- Рассмотрим использование стерильных перчаток, платья и маски для обеспечения асекотической среды.
- Стерилизовать хирургические инструменты, чистить поверхностей, где операция будет выполнена, и протрите их с 70% этанола.
- Выполните анестезии, как предварительно подробные (шаг 1,2), проверка на потерю рефлексов.
- Бритье меха из брюшной брюшной полости электрической бритвой.
- Подготовка брюшной живот асемистически.
- Очистите хирургическую область и удалите оставшиеся волосы. Вымойте хирургическую область с мылом хлоргексидин глюконот. Дезинфицировать область с раствором хлоргексидина и этанол 96 º (3 раза).
- Поместите животное на теплый хирургический стол, в положении Тренделенбурга (голову вниз на 45 °), чтобы убедиться, что желудок и кишечник являются крано. Рассмотрим эвакуацию мочевого пузыря, если она Напыщенная. Если в процессе повреждения повреждены какие-либо внутренние органы, животное может погибнуть. Поэтому важно, чтобы они надлежащим образом расположены (рис. 1).
- Обложка области с помощью стерильного полотенца, с отверстием (порозность) подвергая выбритый области, чтобы отделить хирургическое сайт от любых потенциальных загрязняющих районов.
- Вставьте один эндоскопический троакар 5 см в брюшную полость, 2 см хвостовой к ксифоид процесса, и инсуфовой поздно через него брюшной полости с давлением регулирования механического инсувитель.
Примечание: внутрибрюшное давление должно быть 8-12 мм гектограмм с CO2 (рис. 1a). - Вставьте эндоскопом камеру через эндоскопической троакар (рис. 1b).
Примечание: Определите репродуктивный тракт, определяя статус и положение инфундибулума и ампулы перед ET для облегчения следующих шагов. - Вставьте 17-G эпидуральной иглы в паховой области между 2-3 см от infundibulum (рис. 1b).
- Определите вход в инфундибурум (рис.2A, 2A).
- Вставьте загруженный катетер (шаг 1,3) через эпидуральную иглу в брюшную полость (рис. 1C).
- Найдите яйцепроток и вставьте 1-2 см эпидурального катетера через инфундибулум в ампулу (рисунок 2A-2A). Не прогрессировать очень далеко в яйцевод для предотвращения повреждений и кровоизлияния.
- Выпустить эмбрионы в яйцепроток, осторожно нажав на поршень шприца, соединенный с катетером (Рисунок 2D-2D). Оба воздушных пузыря должны выйти из катетера.
- Удалите катетер сразу после того, как эмбрионы были освобождены.
- Промыть катетер, ассбрирования и освобождения манипулирования среды, чтобы проверить отсутствие эмбрионов и подтвердить их успешной передачи.
- Повторите шаги 1.4.11 к 1.4.16 в другой стороне матки, при желании.
- Удалите эпидуральной иглы и эндоскопа камеры.
- Релиз CO2 через эндоскопический trocar. Если избыток газа остается в животе животного, он будет иметь боль и дискомфорт.
- Снимите эндоскопический трокар из брюшной полости. Снимите хирургическое полотенце.
- Прекратите анестезию.
- Очистите разрез, сделанный тромашиной с раствором хлоргексидина. Закройте разрез, сделанный троакар с микронизированный алюминием и пластиковым соусом.
- Послеоперационный уход
- Лечить животных антибиотиками: 10 мг/кг энрофлоксацина, подкожно, каждые 24 ч в течение 5 дней.
- Администрирование анальгетиков: бупренорфин гидрохлорид (0,03 мг/кг), внутримышечно, каждые 12 часов в течение 3 дней; Мелоксикам (0,2 мг/кг), подкожно, каждый 24-h в течение 3 дней.
- Мониторинг животных, по крайней мере 30 минут после операции (в зависимости от животного и дозы анестезии) убедившись, что они восстановить свои физиологические условия.
- Определите получателя (например, тату уха) и домашних животных индивидуально в чистой клетке с соответствующим состоянием окружающей среды.
Рисунок 1: лапароскопическая передача эмбрионов при помощи лапароскопии (внешний вид). A) Вставка эндоскопического трокар (один порт). Б) Вставка эндоскопической камеры и эпидуральной иглы (черная стрелка). C) введение катетера переноса эмбриона (Белая стрела) через эпидуральную иглу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 2: лапароскопическая передача эмбрионов при помощи лапароскопии (внутренняя точка зрения). А: Ввод катетера через эпидуральную иглу в брюшную зону. Звездочка указывает на инфундибулум. B, C, D: Катетер, нагруженный эмбрионами, вставляется в область ампула через инфундибулум. E, F: Высвобождение эмбрионов, подтвержденное визуализацией вздутого яйцевода. Эта цифра была адаптирована из Марко-Хименеса и др. 38. пожалуйста, щелкните здесь для просмотра более крупной версии этой фигуры.
2. витрификация эмбрионов и потепление
- Выполните все манипуляции при комнатной температуре (около 22 °C) для уменьшения витрификации раствора токсичности при более теплой температуре.
Примечание: эмбрионы могут быть перемещены с помощью автоматической пипетки 0.1-2 мкл в этом протоколе, но другие подобные устройства для перемещения эмбрионов, перетаскивая минимальный объем, могут быть пригодны. - Витрифицировать эмбрионы в двухэтапной процедуре добавления:
- Поместите эмбрионы в течение 2 минут в equilibrating раствор, состоящий из 10% (v/v) этиленгликоль и 10% (v/v) диметилсульфоксид, растворенный в BM.
- Переместить эмбрионы (из Step 2.2.1) на 1 минуту в раствор витрификации, состоящий из 20% (v/v) этиленгликоля и 20% (v/v) диметилсульфоксид, растворенный в BM.
- Загрузите эмбрионы в пластическую минисолому 125 мкл (которая содержит один закрытый конец с хлопковой вилкой и один открытый Экстрим). Процесс схематизирован на рисунке 3.
- Пара закрытый конец 0,125 мкл минисолома с соответствующим микрораспылителем (например, Каптролль III®).
- Аспот БМ до 1/3 из соломы длины, после небольшой воздушный пузырь.
- Аспирин эмбрионов в объеме 40 мкл витрификации раствора, а затем еще один небольшой воздушный пузырь.
- Аспот БМ до первой жидкой фракции (Step 2.3.2) достигает хлопка.
- Закройте открытый конец соломенной вилкой.
- Выполните шаг 2.2.2 в то время как шаг 2,3 делается для того, чтобы не более чем на одну минуту истекает, который был бы токсичен для эмбрионов.
- Окунись минисоломой непосредственно в жидкий азот для достижения витрификации.
- Храните минисолому в Дьюар для азота в нужное время.
- Оттепель эмбрионов на один шаг.
- Поместите минисоломинку горизонтально на 10 см от паров жидкого азота для 20-30 s.
- Когда процесс кристаллизации начинается внутри минисоломы, погрузить Министро в водяной бане при температуре 25 ° c для 10-15 s.
- Снимите вилку минисоломы и вырежьте хлопковую вилку.
- С помощью соединенный микрораспылитель, высылать все содержание минисоломы в тарелку, содержащую 0,33 M раствор сахарозы при температуре 25 °C в течение 5 минут.
Примечание: этот шаг должен быть сделан быстро для того, чтобы уменьшить воздействие эмбриона на Витрификация раствора. - Перемещение эмбрионов на новую пластинку, содержащую раствор БМ, еще на 5 мин.
- Рассмотрим только не поврежденных эмбрионов (с нетронутыми муцина Пальто и зона пеллучиды), чтобы продолжить et.
Примечание: Примите во внимание, что в талые эмбрионы, асинхронных переводы (например, 60-62 h в морула переводы) может улучшить результаты, позволяя ресинхронизации между эмбрионом и материнский эндометрия.
Рисунок 3: схематизация правильно нагруженной соломы. А) БМ относится к эмбриону манипулирования СМИ, занятых во время витрификации. Эмбрионы должны быть загружены в витрификации раствора. Б) макроскопическое появление нагруженной соломы с увеличенной детализацией положения эмбриона. Это крупнообъемное устройство позволяет нам витрифицировать большое количество эмбрионов, в отличие от минимального объема устройств. Кроме того, обработка этого устройства легче по сравнению с минимальными объемами устройств, в то время как результаты схожи у кроликов41. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Минимально инвазивная лапароскопическая передача свежих или витрифицированных эмбрионов помещает кролика в число лучших моделей животных для репродуктивных исследований. Таблица 1 показывает результаты свежего et на различных стадиях развития (рис.4) переданных эмбрионов. Выживаемость при рождении (процент эмбрионов в результате щенка) доказали эффективность лапароскопической техники описаны в этой бумаге. Более высокие значения были достигнуты, когда et был выполнен с эмбрионами на стадии морула, либо ранние или компактные morulae. Основываясь на этих результатах, мы провели второй эксперимент, чтобы продемонстрировать выживаемость после витрификации этих эмбрионов. Таким образом, в таблице 2 мы показываем результаты, полученные после переноса витрифицированного кролика morulae, восстановленного в то же время, дифференцируя между теми эмбрионами, которые достигли хорошей степени уплотнения или нет. Выживаемость при рождении отличается от различных стадий эмбриона, будучи выше в уплотненных morulae. Таким образом, лапароскопической передачи эмбрионов является надежным методом для передачи свежих и витрифицированных эмбрионов в кроликах
Рис. 4: эмбрионы кролика. A) пронуклеарно. Б) восемь ячеек. C) ранняя морала. D) компактная морула. Е) бластоцист. Звездочка указывает на два пронуклея. Черные стрелки обозначают зона пелучиды. Белые стрелки указывают на муцин пальто, которое обычно варьируется между эмбрионами. МБГ: внутренняя клеточная масса. TE: Троептодермы. Шкала шкалы: 50 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
| Стадия развития1 | Эмбрионов | Получателей | Место трансфера | Частота беременностей (%) | Коэффициент имплантации (%) | Коэффициент выживаемости при рождении (%)2 |
| Доядерной | 78 | 7 | Яйцевод | 7 (100) | 50 (64,0)b | 34 (43,6)b |
| 8 ячеек | 81 | 7 | Яйцевод | 7 (100) | 60 (74,1)b | 53 (65,4) |
| Ранняя морула | 81 | 7 | Яйцевод | 7 (100) | 80 (98,8) | 60 (74,1) |
| Компактная морула | 80 | 7 | Яйцевод | 7 (100) | 80 (100) | 58 (72,5) |
| Бластоциста | 80 | 7 | Матки | 7 (100) | 73 (91,3) | 38 (47,5)b |
Таблица 1. Эффективность свежих кролика переноса эмбрионов (в естественных условиях производные) по лапароскопии. 1различные эмбрионы были обнаружены в 18-20h (пронуклеарный), 36-38 h (8 клеток), 60-62 h (ранняя morula), 70-72 h (компактный morula) и 80-82 h (бластоцист) после спаривания. Компактный (> 32 ячейки) и некомпактные morulae (≈ 32 клетки) могут быть основаны на 70-72 h, но только компактные morulae были переданы. 2-х Выживаемость при рождении от получателя беременной делает. a, b Значения с различными суперсценариями статистически различны (P < 0.001).
| Стадия развития | Перенеси эмбрионов | Получателей | Частота беременностей (%) | Коэффициент выживаемости при рождении (%)1 |
| Не уплотненный | 135 | 10 | 9 (90) | 62 (45,9)b |
| Уплотненных | 150 | 10 | 10 (100,0) | 98 (65,3) |
| Общая | 285 | 20 | 19 (95) | 160 (56,1) |
Таблица 2. Жизнеспособность неуплотненного против компактных витрифицированных morula. a, bзначения с различными суперскрипты статистически различны (P < 0.001). 1 Выживаемость при рождении от получателя беременной делает. Эмбрионы были обнаружены в то же время (70-72 h) и были разделены на компактные (> 32 клетки) и некомпактные morulae (≈ 32 клетки).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
С первых документально живых случае рождения из переданных эмбрионов9, этот метод и кроликов видов стали решающими в репродуктивные исследования. Кроме того, исследования эмбриона, включающие манипуляции, производство, криоконсервацию и т.д. , требуют в качестве последнего шага оценки способности эмбриона генерировать здоровое полноценное потомство. Таким образом, метод переноса эмбрионов незаменим13,28. На протяжении многих лет хирургические методы, которые первоначально использовались для переноса эмбрионов в материнскую матку, постепенно заменялись менее инвазивными методами в подавляющем большинстве видов13,14,15, 21 год , 27 , 29 , 30. Тем не менее, у кроликов интраяйпротоцальное et на ранних стадиях развития эмбриона и в пробирке произведенные эмбрионы становятся неизбежными для обеспечения аналогичного результата в естественных условиях. У кроликов интраяйцепротоктные муцина являются решающим фактором, позволяющим имплантацию эмбриона, так как она происходит после реконструкции эмбриональных покрытий во время расширения бластоциста в рогах матки. Однако, осаждение муцина пальто ограничено к яйцепротоку на 3 дня следуя за овуляцией, и молекулярные механизмы осаждения материала пальто больш неизвестны31. По этим причинам, известно, что в пробиркеразвитых бластоцисты не выжить, когда передается в матку32,33,34, и эмбрионы с поврежденным пальто муцина имеют более низкую выживаемость 35. Аналогичным образом, группы, сообщившимся о транспокальной передаче эмбрионов в кроликах, привели к тому, что показатели рождаемости были очень низкими11,26. Здесь мы представляем минимально инвазивную технику, адаптированную с Бесенфельдера и Брема18, для переноса эмбрионов с успешными показателями рождаемости. Согласно результатам в таблице 1, стадия морула в эмбрионах кролика была лучшей эмбриональной стадией для достижения высокого уровня выживаемости при рождении. Одним из возможных объяснений является большая чувствительность к манипуляциям на самых ранних стадиях. Интересно, что успех увеличивается, как эмбриональные стадии прогрессирует, возможно, из-за большего воздействия эмбриона яйк выделениями до его восстановления. Но когда эмбрионы достигают стадии бластоцист и имеют место-конкордант передается в матку, значения резко уменьшаются. Не исключая то, что было сказано, возможно объяснение может быть, что эмбрионы, перенесенные в яйцевод может восстановить возможный ущерб, генерируемый в муцин слоя во время манипуляции эмбриона. Таким образом, бластоцисты, переведённые в матку, будут лишены этого механизма, что может поставить под угрозу их способность к имплантации.
Техника выполняется с помощью одного портового инструмента (5 мм эндоскопа trocar), с небольшими, короткими манипуляциями. Таким образом, the5-мм разрез эндоскопа троакар не требует закрытия. Преимущества лапароскопической техники включают снижение послеоперационной боли, быстрое возвращение к нормальной активности и меньшее количество послеоперационных осложнений. Кроме того, эндоскопические процедуры вызывают меньшее количество абдоминальных спаек и позволяют лучше иммунный ответ получателя по сравнению с открытой хирургии21,36,37. Накопление доказательств из нашей лаборатории продемонстрировал эффективность этой процедуры в кроличьей модели. Так, за последние пять лет в рамках процедуры, описанной в настоящей рукописи, было передано в общей сложности 3 909 эмбрионов (1 335 свежих и 2 574 витрифицированных эмбрионов). В результате этой методики показатели потомства свежих и витрифицированных эмбрионов были 62,9% и 42,5%, соответственно38,39,40,41,42, 43 , 44 , 45 , 46 , 47. Многие исследования основаны на этой технике: Марко-Хименес и др. 38 , 39 , 40 , 41, Висенте и др. 42, виудес-де-Кастро и др. 43, Саенс-де-джуано и др. 44 , 45 , 47, лавара и др. 46.
Практические рекомендации по реализации этой методики описаны ниже. В экспериментах по культуре эмбриона также целесообразно использовать новый катетер для переноса эмбрионов вместо используемого для перемещения эмбрионов между мультимедийной культурой и манипуляциями. Это позволяет избежать передачи минерального масла и обеспечивает оптимальный поток. Во время ET важно минимизировать обработку половых путей, так как чрезмерное манипулирование яйцепроток может привести к спайки. Если яйцепроток скручивается, использовать эпидуральный шприц, чтобы попытаться расположить его правильно, а не катетер, так как он содержит эмбрионы и механические манипуляции могут привести к их потере. Как только катетер проходит через яйцепроток, он легко скользит. Если этого не произойдет, катетер может отклонился. Оказавшись внутри яйцепроток, если носитель не течет, слегка переместите катетер и попытайтесь повторно вставить его. Если он все еще не течет, катетер засорен. Удалите его из яйцепроток и отпустите содержимое в блюдо с чистой средой. Затем перезагрузите эмбрионы в другой катетер и попытайтесь снова повторно вставить его в яйцепроток. Доставка обычно занимает места через 28-30 дней после переноса морула.
Кроме того, есть свидетельства, указывающие на то, что стадия развития эмбриона может быть более продвинутой, чем маточная среда у псевдоженщин, но не наоборот. В частности, эмбрионы имеют способность ждать благоприятной среды матки, но среда матки не может ждать эмбрионов на правильной стадии для имплантации10. Что касается витрифицированных эмбрионов, то после короткого/длительного хранения можно синхронизировать стадию развития эмбриона с соответствующей благоприятной средой матки. Кроме того, если донор эмбриона также является реципиентом эмбриона, вредное воздействие суперовуляции на эндометрия можно обойти с помощью технологии витрификации и переноса эмбрионов в последующий цикл48. В кроликах, витрифицированные эмбрионы, перенесенные в овипротоки реципиентов, индуцированных к овуляции 60-62 h заранее (асинхрония), являются высокоэффективным методом44,49. Связанные с этим, было высказано предположение о том, что яйцеклетка переходного периода в течение 10-12 h может объяснить благотворное влияние на восстановление клеточной физиологии и замена мертвых клеток, и, вероятно, ремонт повреждений, индуцированных в муцина пальто во время эмбриона Манипуляции. Кроме того, витрифицированные эмбрионы представляют задержку в развитии, так как они были метаболически приостановлены во время хранения. Таким образом, перенос криоконсервированных эмбрионов в асинхронных реципиентов позволяет эмбриону активировать свою метаболическую активность и, таким образом, стадия развития эмбриона синхронизирована с окружающей средой матки. Вместо этого, если Криоконсервированные эмбрионы передаются в синхронирецепторы, перекрестное обсуждение между матерью и эмбрионом препятствует наступлению успешной беременности. У кролика самая высокая выживаемость была получена после внутрияйцовальной передачи криоконсервированных morulae49. Наши данные согласуются с этим отчетом, хотя стадия морула демонстрирует различные коэффициенты выживаемости после криоконсерваций в зависимости от степени уплотнения в 70-72 ч (Таблица 2). Здесь, уплотненные морали показали более высокие коэффициенты выживаемости при рождении по сравнению с неуплотненной morulae, который был в соответствие с предыдущими отчетами, показывающих, что каждый этап развития имел свой собственный механизм относительно проникновения крикопротекторов и степень обезвоживания при добавлении криоконсервации раствор50. В основе этих методов, мы показали, что сочетание витрификации и интраяйкупротоковой передачи эмбриона является успешной стратегией для восстановления популяции кроликов после 15 лет хранения в жидком азоте, без неблагоприятного воздействия на их выживание после оттаивания и живой рождения51.
Для успешного выполнения этой методики следует учесть следующие детали. Важно иметь в виду, что растущая плотность последовательных сред, используемых для витрификации (dpbs, решение состояния, Витрификация раствора) может вызвать сокращение эмбриона из-за прогрессивного обезвоживания эмбриона. Тем не менее, его нормальный внешний вид восстанавливается, когда эмбрион выравнируется со средой. Кроме того, когда эмбрион перемещается между возрастающей плотностью носителя, он имеет тенденцию переходить к поверхности носителя из-за движения плотности. Чтобы избежать потери эмбрионов и обеспечить время витрификации, рекомендуется выполнять витрификации в небольших капель средств массовой информации, которые будут держать эмбриона на месте.
В заключение, здесь мы описываем как технику ET и метод витрификации эмбриона, которые облегчают будущие исследования, которые используют кроликов в качестве модели. Основано на близком филогенетическое расстоянии между кроликами и людьми, польза этой модели смогла обеспечить результаты легко передаваемое к людской клинической медицине. Кроме того, наш метод предлагает некоторые гигиенические и экономические преимущества, соответствующие концепции 3 RS животного благосостояния (замена, сокращение и уточнение), сохраняя при этом цель улучшения гуманного обращения с подопытными животными.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Министерством экономики и конкурентоспособности Испании (AGL2017-85162-С2-1-R) и обобщением исследовательской программы в Валенсиане (пропрос-2014/036). Английская текстовая версия, пересмотренная службой английского языка N. Macowan
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 332 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Alvet Escartí | 626 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Buserelin Acetate | Sigma Aldrich | B3303 | |
| Clorhexidine digluconate soap | Alvet Escartí | 0265DCCJ500B | |
| Clorhexidine digluconate solution | Alvet Escartí | 0265DCCA500B | |
| CO2 | Air Liquide | 99921 | CO2 N48. |
| CO2 Incubator | Fisher scientific | 15385194 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | W387509 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D5773 | Without calcium chloride. |
| Electric razor | Oster Golden A5 | 078005-140-002 | |
| Endoscope camera | Optomic Spain S.A | OP-714 | |
| Endoscope trocar with silicone leaflet valve | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | 30114GK | Lightweight trocar model. |
| Enrofloxacin | Alvet Escartí | 9993046 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Epicraneal needle 23G | Alvet Escartí | 514056353 | Smaller needles can be also used. |
| Epidural catheter | Vygon corporate | 187.10 | |
| Epidural needle | Vygon corporate | 187.10 | |
| Ethylene Glycol | Sigma Aldrich | 102466-M | |
| Eye ointment | Alvet Escartí | 5273 | |
| Ketamine hydrochloride | Alvet Escartí | 184 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Laparoscopy equipment | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | 26003 AA | Hopkins® Laparoscope, 0º-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel. |
| Light source | Optomic Spain S.A | Fibrolux 250 | |
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | P1505XXX | |
| Mechanical CO2 insufflator | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | Endoflator® | |
| Meloxicam | Alvet Escartí | 9993501 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Petri dishes, 35-mm | Sigma Aldrich | CLS430165-500EA | |
| Plastic dressing (Nobecutan) | IBOR medica | 7140028 | |
| Plastic Straw 0.25 mL | IMV - technologies | 6431 | |
| Povidone iodide solution | Alvet Escartí | 02656DPYS500S | |
| Scissors | ROBOZ | RS-5880 | Any regular surgical grade steel small straight scissors will work. |
| Silicone tube for insufflator | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | 20400040 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16F | There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. |
| Sterile Gloves | Alvet Escartí | 087GL010075 | |
| Sterile gown | Alvet Escartí | 12261501 | |
| Sterile mask | Alvet Escartí | 058B15924B | |
| Straw Plug | IMV - technologies | 6431 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Syringe, 1-mL | Fisher scientific | 11750425 | |
| Syringe, 5-mL | Fisher scientific | 11773313 | |
| Urinary catheter | IMV - technologies | 17722 | |
| Waterbath | RAYPA | BAE-4 | |
| Xylazine | Alvet Escartí | 525225 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Rabbits | Universitat Politècnica de València | Line A | Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used. |
References
- Chen, M., Heilbronn, L. K. The health outcomes of human offspring conceived by assisted reproductive technologies (ART). Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 388-402 (2017).
- Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo vitrification in rabbits: Consequences for progeny growth. Theriogenology. 84 (5), 674-680 (2015).
- Sirard, M. A. The influence of in vitro. fertilization and embryo culture on the embryo epigenetic constituents and the possible consequences in the bovine model. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 411-417 (2017).
- Feuer, S. K., Rinaudo, P. F. Physiological, metabolic and transcriptional postnatal phenotypes of in vitro. fertilization (IVF) in the mouse. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 403-410 (2017).
- Jiang, Z., et al. Genetic and epigenetic risks of assisted reproduction. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 44, 90-104 (2017).
- Fleming, T. P., Velazquez, M. A., Eckert, J. J. Embryos, DOHaD and David Barker. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 6 (5), 377-383 (2015).
- Sparks, A. E. Human embryo cryopreservation-methods, timing, and other considerations for optimizing an embryo cryopreservation program. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (2), 128-144 (2015).
- Swain, J. E. Optimal human embryo culture. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (2), 103-117 (2015).
- Heape, W. Preliminary note on the transplantation and growth of mammalian ova within a uterine foster-mother. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 48, 457-459 (1890).
- Bermejo-Alvarez, P., Park, K. E., Telugu, B. P. Utero-tubal embryo transfer and vasectomy in the mouse model. Journal of Visualized Experiments. (84), e51214 (2014).
- Kidder, J. D., Roberts, P. J., Simkin, M. E., Foote, R. H., Richmond, M. E. Nonsurgical collection and nonsurgical transfer of preimplantation embryos in the domestic rabbit (Oryctolagus cuniculus) and domestic ferret (Mustela putorius furo). Journal of Reproduction and Fertility. 116 (2), 235-242 (1999).
- Tıras, B., Cenksoy, P. O. Practice of embryo transfer: recommendations during and after. Seminars in Reproductive Medicine. 32 (4), 291-296 (2014).
- Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (3), 228-231 (2014).
- Moreno-Moya, J. M., et al. Complete method to obtain, culture, and transfer mouse blastocysts nonsurgically to study implantation and development. Fertility and Sterility. 101 (3), e13 (2014).
- Hasler, J. F. Forty years of embryo transfer in cattle: a review focusing on the journal Theriogenology, the growth of the industry in North America, and personal reminisces. Theriogenology. 81 (1), 152-169 (2014).
- Bauer, C. The baboon (Papio sp.) as a model for female reproduction studies. Contraception. 92 (2), 120-123 (2015).
- Martinez, E. A., et al. Nonsurgical deep uterine transfer of vitrified, in vivo-derived, porcine embryos is as effective as the default surgical approach. Science Reports. 5, 10587 (2015).
- Besenfelder, U., Brem, G. Laparoscopic embryo transfer in rabbits. Journal of Reproduction and Fertility. 99, 53-56 (1993).
- Besenfelder, U., Mödl, J., Müller, M., Brem, G. Endoscopic embryo collection and embryo transfer into the oviduct and the uterus of pigs. Theriogenology. 47 (5), 1051-1060 (1997).
- Besenfelder, U., Havlicek, V., Kuzmany, A., Brem, G. Endoscopic approaches to manage in vitro and in vivo embryo development: use of the bovine oviduct. Theriogenology. 73 (6), 768-776 (2010).
- Fonseca, J. F., et al. Nonsurgical embryo recovery and transfer in sheep and goats. Theriogenology. 86 (1), 144-151 (2016).
- Denker, H. W. Structural dynamics and function of early embryonic coats. Cells Tissues Organs. 166, 180-207 (2000).
- Marco-Jiménez, F., López-Bejar, M. Detection of glycosylated proteins in rabbit oviductal isthmus and uterine endometrium during early embryo development. Reproduction in Domestic Animals. 48 (6), 967-973 (2013).
- Ménézo, Y. J., Hérubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reproductive BioMedicine Online. 4 (2), 170-175 (2002).
- Fischer, B., Chavatte-Palmer, P., Viebahn, C., Navarrete Santos, A., Duranthon, V. Rabbit as a reproductive model for human health. Reproduction. 144 (1), 1-10 (2012).
- Besenfelder, U., Strouhal, C., Brem, G. A method for endoscopic embryo collection and transfer in the rabbit. Zentralbl Veterinarmed A. 45 (9), 577-579 (1998).
- Daniel, N., Renard, J. P. Embryo transfer in rabbits. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (1), (2010).
- Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters rabbit foetal placenta at transcriptomic and proteomic level. Reproduction. 147 (6), 789-801 (2014).
- Green, M., Bass, S., Spear, B. A device for the simple and rapid transcervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications. Biotechniques. 47 (5), 919-924 (2009).
- Duan, X., Li, Y., Di, K., Huang, Y., Li, X. A nonsurgical embryo transfer technique in mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 32 (4), 440-446 (2016).
- Denker, H. W., Gerdes, H. J. The dynamic structure of rabbit blastocyst coverings. I. Transformation during regular preimplantation development. Anatomy and Embryology. 157, 15-34 (1979).
- Seidel, G. E., Bowen, R. A., Kane, M. T. In vitro fertilization, culture and transfer of rabbit ova. Fertility and Sterility. 27, 861-870 (1976).
- Binkerd, P. E., Anderson, G. B. Transfer of cultured rabbit embryos. Gamete Research. 2, 65-73 (1979).
- Murakami, H., Imai, H. Successful implantation of in vitro cultured rabbit embryos after uterine transfer: a role for mucin. Molecular Reproduction and Development. 43, 167-170 (1996).
- Techakumphu, M., Wintenberger-Torrèsa, S., Sevelleca, C., Ménézo, Y. Survival of rabbit embryos after culture or culture/freezing. Animal Reproduction Science. 13 (3), 221-228 (1987).
- Gitzelmann, C. A., et al. Cell-mediated immune response is better preserved by laparoscopy than laparotomy. Surgery. 127 (1), 65-71 (2000).
- Huang, S. G., Li, Y. P., Zhang, Q., Redmond, H. P., Wang, J. H., Wang, J. Laparotomy and laparoscopy diversely affect macrophage-associated antimicrobial activity in a murine model. BMC Immunology. 14, 27 (2013).
- Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Almela-Miralles, V., Vicente, J. S. Development of Cheaper Embryo Vitrification Device Using the Minimum Volume Method. Public Library of Science One. 11 (2), e0148661 (2016).
- Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Generation of live offspring from vitrified embryos with synthetic polymers supercool X-1000 and Supercool Z-1000. CryoLetters. 35, 286-292 (2014).
- Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Use of cyclodextrins to increase cytoplasmic cholesterol in rabbit embryos and their impact on live KITs derived from vitrified embryos. Cryoletters. 35, 320-326 (2014).
- Marco-Jiménez, F., Lavara, R., Jiménez-Trigos, E., Vicente, J. S. In vivo development of vitrified rabbit embryos: Effects of vitrification device, recipient genotype, and asynchrony. Theriogenology. 79 (7), 1124-1129 (2013).
- Vicente, J. S., et al. Rabbit morula vitrification reduces early foetal growth and increases losses throughout gestation. Cryobiology. 67, 321-326 (2013).
- Viudes-de-Castro, M. P., Marco-Jiménez, F., Cedano-Castro, J. I., Vicente, J. S. Effect of corifollitropin alfa supplemented with or without Lh on ovarian stimulation and embryo viability in rabbit. Theriogenology. 98, 68-74 (2017).
- Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters at transcriptomic and proteomic level rabbit foetal placenta. Reproduction. 147, 789-801 (2014).
- Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Lavara, R., Vicente, J. S. Direct comparison of the effects of slow freezing and vitrification on late blastocyst gene expression, development, implantation and offspring of rabbit morulae. Reproduction in Domestic Animals. 49, 505-511 (2014).
- Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Long-term and transgenerational effects of cryopreservation on rabbit embryos. Theriogenology. 81, 988-992 (2014).
- Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo transfer manipulation cause gene expression variation in blastocysts that disrupt implantation and offspring rates at birth in rabbit. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 207, 50-55 (2016).
- Roque, M., Valle, M., Kostolias, A., Sampaio, M., Geber, S. Freeze-all cycle in reproductive medicine: current perspectives. JBRA Assisted Reproduction. 21 (1), 49-53 (2017).
- Tsunoda, Y., Soma, T., Sugie, T. Effect of post-ovulatory age of recipient on survival of frozen-thawed rabbit morulae. Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 483-487 (1982).
- Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
- Lavara, R., Baselga, M., Vicente, J. S. Does storage time in LN2 influence survival and pregnancy outcome of vitrified rabbit embryos? Theriogenology. 76 (4), 652-657 (2011).
