Summary
We laten zien hoe te identificeren en te isoleren 6 deelverzamelingen van myeloïde voorlopercellen uit lymfkliertest beenmerg met behulp van een combinatie van magnetische en fluorescentie sorteren (MACS en FACS). Dit protocol kan worden gebruikt voor in vitro cultuur assays (methylcellulose of vloeistof culturen), in vivo adoptief overdracht experimenten en RNA/eiwit analyses.
Abstract
Myeloïde voorlopercellen dat de opbrengst van neutrofiele granulocyten, monocyten en dendritische cellen (DC's) kunnen worden geïdentificeerd in en geïsoleerd uit het beenmerg van muizen voor hematologische en immunologische analyses. Bijvoorbeeld, kunnen studies naar de cellulaire en moleculaire eigenschappen van myeloïde voorlopercellen populaties onthullen mechanismen ten grondslag liggen aan de leukemische transformatie, of aantonen hoe het immuunsysteem reageert pathogen blootstelling. Eerder beschreven stroom cytometry strategieën voor identificatie van myeloïde voorlopercellen vooruitgang op vele terreinen hebt ingeschakeld, maar de breuken die zij identificeren zijn zeer heterogeen. De meest gebruikte gating strategieën definiëren beenmerg breuken die voor de gewenste populaties zijn verrijkt, maar ook grote aantallen van voorlopercellen "besmetten" bevatten. Onze recente studies hebben veel van deze heterogeniteit, opgelost en het protocol die wij hier presenteren toelaat het isolement van 6 subpopulaties van oligopotent en lineage-begaan myeloïde voorlopercellen van 2 eerder beschreven beenmerg breuken. Het protocol beschrijft 3 fasen: 1) isolatie van beenmerg cellen, 2) verrijking voor hematopoietische progenitorcellen door magnetische-geactiveerde cel sorteren (lineage uitputting door MACS) en 3) de identificatie van myeloïde voorlopercellen deelverzamelingen door stroom cytometry (met inbegrip van fluorescentie-geactiveerde cel sorteren, FACS, indien gewenst). Deze aanpak toelaat voorlopercellen kwantificering en isolatie voor allerlei toepassingen in vitro en in vivo , en al nieuwe inzicht in trajecten en mechanismen van neutrofiele monocyt en DC differentiatie heeft opgeleverd.
Introduction
Monocyten, neutrofielen en dendritische cellen (DC's) zijn myeloïde cellen die uit hematopoietische progenitorcellen, voornamelijk in het beenmerg, door een proces genaamd myelopoiesis voortvloeien. Gemeenschappelijke myeloïde voorlopercellen (CMPs) hebben het potentieel om te produceren myeloïde cellen, evenals megakaryocytes en erytrocyten, maar niet lymfoïde cellen. Granulocyt-monocyt progenitoren (GGP's), die zijn afgeleid van CMPs, produceren granulocyten en monocyten, maar Megakaryocyt en erytrocyt potentiële hebben verloren. Monocyten en klassieke en plasmacytoid DCs (cDCs/PDC's) wordt ook gedacht dat ze voortvloeien uit gemeenschappelijk progenitoren bekend als monocyt-DC progenitoren (MDP's), die worden geproduceerd door CMPs. geleidelijke beperking van de bloedlijn potentieel uiteindelijk in de bloedlijn-gepleegd resulteert progenitoren: granulocyt progenitorcellen, monocyt progenitoren en dendritische cel progenitoren (Figuur 1).
Weissman en collega's gemeld dat CMPs zijn gevonden in de Lin- c-Kit+ Sca-1- (LKS-) CD34+ FcγRlo Fractie van muis beenmerg, terwijl GGP's zijn opgenomen in de LKS- -CD34+ FcγR Hallo breuk1. Deze "CMP" en "GMP" breuken zijn echter zeer heterogeen. Bijvoorbeeld, bevat de "GMP" breuk ook lineage-begaan granulocyt progenitoren en monocyt progenitoren1,2. MDP's gemeld afzonderlijk te worden CX3CR1+ Flt3+ CD115+ progenitoren die ook uitdrukking geven aan CD34 en FcγR3,4. MDP's aanleiding geven tot cDC/pDC-producerende gemeenschappelijk DC progenitoren (CDP's), die zijn gemeld bij het uiten van lagere niveaus van c-Kit (CD117) en zijn niet opgenomen in de LKS- deel5.
Eerder werd aangenomen dat de monocyten ontstaan via een enkel traject (CMP-GMP-MDP-monocyt). Overeenstemming is met dit model, monocyt-begaan progenitoren geproduceerd door GGP's (genaamd monocyt progenitorcellen, MPs)2 en MDP's (genoemd gemeenschappelijk monocyt progenitorcellen, cMoPs)6 lijken te zijn dezelfde cellen op basis van gedeelde oppervlakte marker expressie . Echter we onlangs aangetoond dat monocyten onafhankelijk worden geproduceerd door GGP's en MDP's, en waren in staat om onderscheid te maken tussen MPs en cMoPs door eencellige RNA sequencing7.
We hebben onlangs gewijzigd de Weissman "CMP" en de "GMP" gating strategie ter identificatie van de 6 subfractions van C57BL/6J muis beenmerg met verschillende oligopotent en geslacht-begaan myeloïde voorlopercellen deelverzamelingen. We eerst gemeld dat kleuring voor Ly6C en CD115 het isolement van oligopotent GGP's, evenals granulocyt progenitoren (GPs) en monocyt progenitoren (zowel MPs als cMoPs, die wij op dit moment niet te scheiden) vergunningen van de "GMP" breuk2 (LKS - CD34+ FcγRHallo poort; Figuur 1). Wij vervolgens aangetoond dat MDP's voornamelijk te in de "CMP" breuk vinden zijn (LKS- CD34+ FcγRlo gate), waarin ook Flt3+ CD115lo en Flt3- deelverzamelingen7 (Figuur 1 ). De CMP-Flt3+ CD115lo breuk levert zowel GGP's en MDP's bij adoptief overdracht. De CMP-Flt3- -subset bevat progenitoren die lijken te zijn van tussenproducten tussen CMP-Flt3+ CD115lo cellen en GGP's. In tegenstelling tot MDP's, zowel de CMP-Flt3+ CD115lo en CMP-Flt3- fracties ook beschikken over Megakaryocyt en erytrocyt potentiële.
Het is belangrijk op te merken echter dat er op dit moment onduidelijk of de fracties "CMP" progenitoren die echt zijn oligopotent (bijvoorbeeld individuele cellen binnen de CMP-Flt3+ CD115lo breuk die neutrofiele bezitten, bevatten monocyt, DC, Megakaryocyt en erytrocyt potentiële), of als alternatief, bestaan uit een mengsel van progenitoren met beperktere lineage potentieel. Kolonievormende assays (methylcellulose culturen) geopenbaard cellen met granulocyt (neutrofiele), erytrocyt, monocyt en Megakaryocyt potentiële (GEMM cellen) in de "CMP", CMP-Flt3+ CD115lo en breuken van de CMP-Flt3- 1 ,7, maar niet mogelijk is de evaluatie van DC kansen. In tegenstelling, kolonievormende testen aangetoond dat het bestaan van oligopotent GGP's (progenitoren met neutrofiele én monocyt potentiële) in de "GMP" breuk1,2, en dit wordt ondersteund door recente eencellige Transcriptomic analyse8. Het is niet momenteel bekend, echter of deze oligopotent GGP's ook andere granulocyten (eosinofielen, basofielen en mast cellen produceren).
Op basis van deze studies, we laten nu zien kunnen hoe 7 oppervlakte markeringen (c-Kit, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C en CD115) worden gebruikt om te identificeren en deze 6 deelverzamelingen van oligopotent en myeloïde voorlopercellen lineage-begaan te isoleren. Het protocol hier beschreven kan worden toegepast voor in vitro cultuur assays (methylcellulose of vloeistof culturen), in vivo adoptief overdracht experimenten in muizen en moleculaire analyse (bulk en eencellige RNA sequencing, westelijke bevlekken, etc.).
Het protocol bestaat uit 3 fasen: 1) voorbereiding van een enkele celsuspensie van beenmerg cellen, 2) verrijking voor hematopoietische progenitorcellen (magnetische-geactiveerde cel Sorteren), en 3) identificatie en isolatie, indien gewenst, van voorlopercellen deelverzamelingen door stroom Cytometry (met een analyzer of een sorteerder, voorkomend). De eerste stap is het isolement van beenmergcellen van het dijbeen en zijn verbeend euthanized muizen en is vergelijkbaar met andere eerder beschreven protocollen9. Vervolgens wordt het monster verrijkt voor stuurpen en voorlopercellen cellen met behulp van een cocktail van antilichamen tegen cel oppervlakte markers van erytrocyten, neutrofiele granulocyten, monocyten, lymfocyten, enz., tot het afbreken van de gedifferentieerde cellen. Dit is niet verplicht, maar sterk aanbevolen voor het optimaliseren van de detectie van de deelverzamelingen van voorlopercellen, en aan het verminderen van de hoeveelheid antilichamen nodig voor identificatie van voorlopercellen en de tijd die nodig is voor de stroom cytometry. Het geslacht uitputting protocol hieronder beschrijft Magnetic-Activated cel sorteren (MACS) met behulp van een muis Lineage cel uitputting Kit (waarin biotinyleerd antilichamen tegen CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4, en Ter-119, plus anti-Biotine microbeads) en een geautomatiseerde magnetische scheidingsteken. De laatste stap is de identificatie (en sorteren, indien gewenst) van de voorvader deelverzamelingen door stroom cytometry. Het antilichaam paneel hieronder beschreven (Zie ook tabel 1) is ontwikkeld om te worden gebruikt in een flow cytometer (analyzer of diasorteerderweergave) met 4 lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).
Figuur 1: neutrofiele, monocyt en DC progenitoren en differentiatie trajecten. De onlangs herziene model van myelopoiesis7 is geïllustreerd, met de Weissman-poorten voor "CMPs" (blauw) en "GGP's" (groen)1 bedekt. Dit cijfer is gewijzigd van Yáñez et al. 20177. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van Cedars-Sinai Medical Center.
1. isolatie van muis beenmerg en voorbereiding van een schorsing van één cel
- De muis overeenkomstig de richtsnoeren van de institutionele euthanaseren.
- Plaats de euthanized muis op zijn rug en spuiten met 70% ethanol (EtOH). Het maken van een kleine (3-5 mm) incisie in elke hind-limb op de enkel niveau met behulp van scherpe, puntige schaar, en trek de huid omhoog naar het lichaam te verwijderen uit de benen en bloot de spieren en botten.
- Verwijder de spieren (quadriceps, hamstrings, enz.) uit de botten door ze te knippen met een schaar, na de richting van het bot. Wees voorzichtig niet te beschadigen de botten.
- Ontreddering van het dijbeen van de heupgewrichten en knip weg, het bindweefsel en de spieren aan het losmaken van de benen, voorzichtig niet te snijden in de botten.
- Verwijderen van de voeten door het dislocating van de enkels van de zijn verbeend, de botten in een buis of steriele PBS media plaatsen en vervoer ze op het ijs naar de kamer weefselkweek.
Opmerking: Voor sommige andere toepassingen (bijvoorbeeld voortvloeiende macrofagen van totale beenmergcellen) is het mogelijk om de botten op ijs te verlaten voor een tijdje, maar voor voorlopercellen isolatie is het belangrijk om door te gaan zo snel mogelijk om te voorkomen dat Downregulatie van belangrijke oppervlakte markeringen (vooral CD115). - In een kabinet bioveiligheid, Verwijder eventuele resterende weke delen uit de botten door wrijven ze met papieren zakdoekje.
Opmerking: Het protocol moet worden uitgevoerd in een kabinet bioveiligheid als een steriele steekproef vereist voor cel cultuur of in vivo tests na FACS sortering is. Als steriele cellen niet vereist zijn, kan het gehele proces worden uitgevoerd op de lab-Bank. - Kort het onderdompelen van de botten in 70% EtOH desinfecteren van hen, en vervolgens in steriele PBS om ze te wassen.
- Scheiden van het dijbeen van de zijn verbeend en fibulas door te snijden door de knie en negeren de fibulas.
- Snijd de uiteinden van de botten met een scherpe schaar.
- Oogst beenmerg met koude steriel PBS als volgt totdat de botten worden wit weergegeven:
- Elk been greep met pincet en voeg een 26G naald verbonden met een 10 mL spuit met koude steriel PBS in de schacht van de bot aan het ene uiteinde.
- Houd het bot boven een tube van 50 mL centrifuge en spoelen van 2-5 mL PBS door het been om de oogst van het beenmerg.
- Oogst het merg uit alle 4 beenderen per muis (2 dijbeen en 2 zijn verbeend).
- Pipetteer zachtjes op en neer met een pipet 1 mL tot gedesag van het beenmerg tot een celsuspensie.
- Het beenmerg schorsing door een stuk van 30 μm nylon gaas te heffen van been stukken en aggregaten, waardoor het genereren van een enkel celsuspensie cel filteren.
- Centrifugeer de eencellige schorsing bij 280 x g gedurende 5 min en resuspendeer de cel pellet in steriele kleuring buffer (PBS + 0.5% FBS + 2 mM EDTA), met behulp van 5 mL buffer per muis (bijvoorbeeld 10 mL voor cellen gebundeld van de dijbeen en zijn verbeend van 2 muizen) kleuring.
- Neem een 10 μL hoeveelheid van het monster, meng dit met 10 μL Trypan blauw en belasting 10 μL van de resulterende Trypan Blue-geëtiketteerden monster op een hemocytometer. De cellen met behulp van een lichte Microscoop te tellen.
Opmerking: Als de cellen ook geconcentreerd voor het tellen van betrouwbare, Verdun het monster vóór Trypan blauw toe te voegen.
2. progenitor verrijking door magnetische-geactiveerde cel sorteren (MACS)
- Centrifugeer het hele één celsuspensie (of net zoveel cellen als nodig zijn om te verkrijgen van de gewenste opbrengst) bij 280 x g gedurende 5 min bij 4° C en resuspendeer de pellet cel in 40 μL kleuring buffer (PBS + 0.5% FBS + 2 mM EDTA) per 107 cellen.
Opmerking: Het is ook mogelijk gebruik van MACS buffer van de bloedlijn uitputting kit fabrikant (Zie Tabel van materialen) als alternatief voor de kleuring buffer. - De uitputting van de bloedlijn volgens de aanwijzingen die bij de bloedlijn uitputting kit uitvoeren De volgende instructies gelden voor de kit gezien in de Tabel van materialen. Als een verschillende kit wordt gebruikt, volg de instructies van de fabrikant en gaat u verder met stap 2.3.
- 10 μL Biotine-antilichaam cocktail per 107 cellen toevoegen, Meng door pipetteren en incubeer gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Voeg 30 l kleuring buffer/MACS buffer per 107 cellen en meng.
- Voeg toe 20 μL anti-Biotine microbeads per 107 cellen. Meng goed en incubeer gedurende een extra 15 min bij 4 ° C.
Opmerking: Vortex de microbeads voordat u deze toevoegt aan de cellen om ervoor te zorgen dat ze volledig zijn verspreid. - Voeg 1 mL buffer/MACS buffer per 107 cellen kleuring, centrifugeren van de cellen bij 280 x g gedurende 5 min en resuspendeer de pellet cel in 500 μL kleuring buffer/MACS buffer voor maximaal 108 cellen. Voor meer dan 108 cellen, schaal omhoog de omvang van de buffer/MACS buffer dienovereenkomstig kleuring.
- Bereid het geautomatiseerde magnetische scheidingsteken volgens de instructies van de fabrikant.
- Plaats de buis met de gelabelde cellen in het scheidingsteken en de negatieve selectie programma kiezen.
- Het verzamelen van de negatieve breuk, waarin de voorlopercellen verrijkte lineage-negatief (Lin-) cellen. Gooi het positieve gedeelte, waarin de magnetisch-Label lineage-positieve cellen.
- Centrifugeer de Lin- cellen bij 280 x g gedurende 5 min, en resuspendeer de pellet cel in 2 mL buffer/MACS buffer per muis (bijvoorbeeld 4 mL als beenmerg werd gebundeld van 2 muizen) kleuring.
Opmerking: De pellet moet nu zijn wit in plaats van rood omdat de erythrocyten zijn uitgeput. - Neem een 10 μL aliquoot van de Lin- -cellen, meng dit met 10 μL Trypan blauw en belasting 10 μL van de resulterende Trypan Blue-geëtiketteerden monster op een hemocytometer. De cellen met behulp van een lichte Microscoop te tellen.
Opmerking: Als de cellen ook geconcentreerd voor het tellen van betrouwbare, Verdun het monster vóór Trypan blauw toe te voegen.
3. myeloïde voorlopercellen identificatie en isolatie door fluorescentie-activated Cell Sorting (FACS)
- Label 9 microcentrifuge (1,5 of 2 mL) buizen voor: 1) onbevlekt cellen, 2-8) cellen één gekleurd met fluorophore-geconjugeerde antilichamen tegen FcγR (CD16/32), c-Kit, Sca-1, CD34, Flt3 (CD135), Ly6C en CD115 voor selectie en compensatie van de spanning, en 9) monster cellen die moeten worden gekleurd met alle 7 antilichamen voor voorlopercellen identificatie en sorteren.
- 100.000 cellen aan elk van de controle-buizen (buizen 1-8), en alle overige cellen (of minder indien gewenst) te distribueren aan het monsterbuisje (buis 9).
Opmerking: Als het monstervolume groter dan 1,5-2 mL is, het kan noodzakelijk zijn de steekproef cellen verdelen over een tube van 15 mL, centrifugeer ze en resuspendeer de pellet (stap 3.3 hieronder) en de cellen vervolgens overbrengen in een microcentrifuge buis voor de opeenvolgende kleuring stappen. - Centrifugeer de cellen bij 1.500 x g gedurende 5 min en resuspendeer de controle buis pellets in 100 μl kleuring buffer (PBS + 0.5% FBS + 2 mM EDTA) en de Monster buis pellet in 100 μl kleuring buffer per 5 x 106 cellen (bijvoorbeeld 200 μl voor 1 x 107 cellen).
- 2 μg/mL anti-CD16/CD32-APC-Cy7 aan de FcγR één vlek buis en het monsterbuisje toevoegen. Vortex voorzichtig te mengen, en incubeer gedurende 10 min bij 4 ° C.
Opmerking: Het is belangrijk om de cellen van het monster met het antilichaam FcγR (CD16/32) voorafgaand aan het toevoegen van de andere antistoffen om te voorkomen dat de wedstrijd als gevolg van niet-specifieke Fc-gemedieerde antilichaam-bindende vlek. Niet Incubeer de cellen met een FcγR blokkeren reagens. - De andere antistoffen toevoegen aan de bijbehorende één vlek buizen (van elk 1 antilichaam) en het monsterbuisje (alle 6 antilichamen): 10 μg/mL c-Kit-Pacific Blue, 2 μg/mL Sca-1-PE-Cy7 25 μg/mL CD34-FITC, 10 μg/mL Flt3-APC, 2 μg/mL Ly6C-PerCP-Cy5.5 en 4 μg/mL CD115-PE. Vortex zachtjes, en incubeer gedurende 15 min bij 4 ° C.
- 900 μL kleuring buffer de buizen van de controle en de kleuring buffer 1 mL per 107 cellen aan het monsterbuisje toevoegen. Centrifugeer de cellen bij 1.500 x g gedurende 5 min en resuspendeer de pellet van de cel in de buffer kleuring: 200 μL per besturingselement buis, en 500 μL per 25 x 106 cellen in het monsterbuisje. De geresuspendeerde cellen omzetten in 5 mL FACS buizen.
Opmerking: Als het monstervolume groter dan 1,5-2 mL is, het kan noodzakelijk zijn om de cellen naar een tube van 15 mL voor centrifugeren. - Bereiden de stroom cytometer (analyzer of diasorteerderweergave) volgens instructies van de fabrikant.
- Onbevlekt en uitvoeren interne controle cellen via de cytometer van de stroom te richten aan de spanningen en de kleur compensaties gekleurd.
- Uitvoeren van de steekproef cellen, poort van de voorvader subsets als hieronder zijn geschetst, alsmede samengevatte in Figuur 2en indien gewenst, uitvoeren FACS sorteren om te isoleren van de relevante voorlopercellen subsets.
Opmerking: Het is meestal nodig te verwerven van ongeveer 200.000 cellen te verkrijgen van ten minste 1.000 evenementen in elke voorlopercellen poort.- Maak een stip plot van alle cellen, weergave van FSC-A (x-as) en SSC-A (y-as) en gate om vuil en dode cellen te sluiten = > "levende" cellen.
- Maak een stip plot van "levende" cellen, weergave van FSC-H (x-as) en FSC-W (y-as), en poort als u wilt uitsluiten van de paren = > live/singlet (FSC) poort.
- Maak een stip plot van leven/singlet (FSC) cellen, SSC-H (x-as) en SSC-W (y-as), weergeven en poort als u wilt uitsluiten van de paren = > live/singlet (FSC) / singlet (SSC) poort.
- Maak een stip plot van leven/singlet (FSC) / singlet (SSC) cellen, Sca-1 (x-as) en c-Kit (y-as), weergeven en poort naar Selecteer c-Kit+ Sca-1- cellen = > LKS- cellen.
- Maak een stip plot van LKS- cellen, worden CD34 getoond (x-as) en FcγR (y-as) en poort selecteren CD34+ FcγRlo cellen = > "CMPs", en CD34+ FcγRHallo cellen = > "GGP's".
Opmerking: Het is belangrijk dat de poort van de "CMPs" en "GGP's" zo nauwkeurig mogelijk. Het is nuttig een kleurcorrectie dichtheid perceel of een contour plot voor nauwkeurige gating te gebruiken. - Maak een stip plot van "CMPs", worden CD115 getoond (x-as) en Flt3 (y-as), en Tor om te selecteren:
Flt3+ CD115lo cellen = > CMP-Flt3+ CD115lo cellen,
Flt3- CD115lo cellen = > CMP-Flt3- cellen,
Flt3+ CD115Hallo cellen = > MDP's. - Maak een stip plot van "GGP's", worden Ly6C getoond (x-as) en FcγR (y-as) en poort selecteren Ly6C-cellen = > "GMP-Ly6C- cellen", en Ly6C+ cellen = > "GMP-Ly6C+ cellen".
- Maak een stip plot van "GMP-Ly6C- cellen", worden CD115 getoond (x-as) en Flt3 (y-as), en Tor om te selecteren:
Flt3- CD115lo cellen = > GGP. - Maak een stip plot van "GMP-Ly6C+ cellen", worden CD115 getoond (x-as) en Flt3 (y-as), en Tor om te selecteren:
Flt3- CD115lo cellen = > GPs,
Flt3- CD115Hallo cellen = > MPs + cMoPs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met het protocol zoals hierboven beschreven, is het mogelijk te krijgen van ~ 100 miljoen cellen (met inbegrip van de rode bloedcellen of ~ 50 miljoen genucleëerde cellen) van zowel dijbeen en zijn verbeend (2 benen) van een C57BL/6J muis (6-8 weken oud, man of vrouw). 1-2 miljoen Lin- cellen kunnen worden geïsoleerd per muis door MACS uitputting van Lin+ cellen.
- Cellen vormt elk van de 6 myeloïde voorlopercellen deelverzamelingen ~ 1-4% van de Lin. Lineage uitputting is efficiënt bij het afbreken van gedifferentieerde cellen en verrijken voor progenitorcellen, maar de breuk Lin- bevat een groot aantal c-Kit- cellen naast c-Kit+ progenitoren (figuur 3A). Voorlopercellen levert na FACS sorteren afhankelijk van de instellingen van de sorter gebruikt (bijvoorbeeld maximale opbrengst versus optimale zuiverheid variëren kan), maar in het algemeen het mogelijk is om 10.000-40.000 cellen per fractie (figuur 3B). Post sorteren stroom cytometry analyse moet onthullen > 95% zuiverheid van elke fractie (Figuur 3 c).
Figuur 2: strategie voor de identificatie van de 6 myeloïde voorlopercellen breuken Gating. (A) progressieve gating van de levende cellen Lin- -> onderhemden (FSC) -> onderhemden (SSC) ->- LKS cellen -> CD34+ FcγRlo ("CMP") en CD34+ FcγRHallo ("GMP") breuken -> 6 myeloïde voorlopercellen deelverzamelingen. (B) samenvatting van oppervlakte marker expressie door de 6 voorlopercellen breuken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: vertegenwoordiger voorlopercellen opbrengsten en zuiverheid. (A) representatieve stroom cytometry percelen weergegeven: c-Kit en expressie van de CD11b door beenmergcellen vóór en na de bloedlijn uitputting, demonstreren verrijking van progenitoren (c-Kit+ cellen). (B) cel levert voor elke fractie van voorlopercellen, gepresenteerd als gemiddelde + standaarddeviatie van 30 experimenten. Beenmergcellen van maximaal 20 muizen werden gebundeld voor elk experiment. (C) vertegenwoordiger stroom cytometry percelen van post sorteren analyse, demonstreren de zuiverheid van voorlopercellen FACS-gesorteerd op breuken. Deelvenster C is gewijzigd van Yáñez et al. 20177. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Laser | Kanaal | Filter | Spiegel |
| 405 nm | A. | 670/30 | 635LP |
| B. | 525/50 | 505LP | |
| C. c-Kit-Pacific Blue | 450/50 | ||
| 488 nm | A. (FSC) | ||
| B. Ly6C-PerCP-Cy5.5 | 710/50 | 690LP | |
| C. CD34-FITC | 525/50 | 505LP | |
| D. SSC | 488/10 | ||
| 561 nm | A. Sca-1-PE-Cy7 | 780/40 | 750LP |
| B. | 710/50 | 690LP | |
| C. | 660/20 | 640LP | |
| D. | 610/20 | 600LP | |
| E. CD115-PE | 582/15 | ||
| 640 nm | A. FcϒR-APC-Cy7 | 780/60 | 750LP |
| B. | 730/45 | 690LP | |
| C. Flt3-APC | 670/30 |
Tabel 1: Antilichaam paneel en stroom cytometer configuratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De gating strategie voor muis myeloïde voorlopercellen identificatie1 Weissman is de gouden standaard voor immunologen en Haematogen voor bijna 20 jaar, maar het is nu duidelijk dat de "CMP" en "GMP" poorten zeer heterogene en nauwkeuriger gating strategieën nodig. Het protocol dat wij hier hebben beschreven maakt de identificatie van oligopotent en geslacht-begaan deelverzamelingen in C57BL/6J muizen voor meer precieze kwantificering van specifieke myeloïde voorlopercellen en myelopoiesis trajecten in kaart te brengen, alsmede onderzoek naar moleculaire mechanismen die in specifieke stadia van myeloïde differentiatie. De voorlopercellen deelverzamelingen kunnen worden gesorteerd, indien gewenst, voor moleculaire analyses, in vitro en in vivo beoordeling van differentiatie enz.
Het protocol werd ontwikkeld met behulp van jongeren (6-8 weken oud) C57BL/6J muizen en is geschikt voor zowel vrouwelijke als mannelijke muizen. We hebben niet de voorlopercellen deelverzamelingen in oudere muizen gekenmerkt. Wij niet vooruitlopen op de markeringen zal veranderen met de leeftijd, maar de relatieve verhoudingen van de deelverzamelingen kunnen variëren. Wij hebben de voorlopercellen deelverzamelingen in andere stammen van de muis niet beoordeeld.
De eerste toepassing van onze gewijzigde gating strategie moest mechanistische inzicht geven in de verordening van myeloïde cel lot keuze door de factor interferon regelgevende transcriptiefactor 8 (IRF8)2. IRF8 voorheen werd gerapporteerd moet worden uitgedrukt door GGP's (de Weissman "GMP" breuk) en vereist voor monocyt differentiatie door bevordering van monocyt genexpressie, het onderdrukken van neutrofiele genexpressie en bevordering van neutrophil apoptosis10. Met behulp van onze gewijzigde gating strategie, we aangetoond dat de IRF8 niet door oligopotent GGP's wordt uitgedrukt, maar wordt uitgedrukt door zowel GPs en MPs + cMoPs-2. Bovendien, we laten zien dat IRF8 GP en MP + cMoP overleving en differentiatie, in plaats van productie van de progenitoren lineage-begaan door oligopotent GGP's regelt. Ook wij onlangs onze gewijzigde gating strategie gebruikt om het model van myelopoiesis opnieuw te definiëren, en aangetoond dat GGP's en MDP's functioneel verschillende inflammatoire monocyten via 2 onafhankelijke trajecten7 produceren.
De bloedlijn uitputting stap kan worden uitgevoerd met behulp van een handmatige magnetische scheidingsteken in plaats van een geautomatiseerde magnetische scheidingsteken en bloedlijn uitputting kan ook worden bereikt door cytometry van de stroom met behulp van de biotinyleerd afstamming marker antilichaam cocktail en een fluorophore-geconjugeerde anti-Biotine antilichaam, met gating als de onbevlekt cellen wilt selecteren. Lineage uitputting omvat niet de meest gedifferentieerde cellen en verrijkt voor c-Kit+ progenitoren om te minimaliseren van de tijd en kosten in verband met de volgende stappen (dat wil zeggen, vermindert antilichaam volumes voor stroom cytometry, analyzer/sorteerder tijd, etc.). Onderzoekers moeten verwijzen naar de fabrikant gegevensblad om te bepalen of de bloedlijn uitputting stap werkte zo efficiënt als verwachte voor de specifieke kit gebruikt. Echter, het maakt niet uit als bloedlijn uitputting niet 100% efficiënt is omdat onderscheiden (Lin+) cellen niet express c-Kit, dus ieder gedifferentieerde cellen overblijft na uitputting van het geslacht (evenals andere c-Kit- -cellen) zijn vervolgens door de stroom cytometry gating uitgesloten. Het is ook belangrijk op te merken dat GPs en MPs uitdrukkelijke Ly6C maar, in tegenstelling tot de Ly6C door monocyten, de voorvader Ly6C geuit (vermoedelijk een verschillende isovorm) wordt niet gedetecteerd door het antilichaam van de Gr-1 vaak opgenomen in de uitrustingen van de uitputting van de afkomst, en dus de GPs en MPs na blijven Lineage uitputting2.
Goede kleuring is belangrijk voor alle markeringen voor de oppervlakte, maar met name essentieel voor FcγR om nauwkeurige gating van de FcγRlo "CMPs" en de FcγRHallo "GGP's". Optimale fluorophore keuze en antilichaam verdunning zijn essentieel voor goede scheiding, en een FcγR blokkerende reagens gebruikt wordt (gewoonlijk gebruikt voorafgaand aan kleuring voor stroom cytometry) moet niet worden gebruikt. Het is ook belangrijk op te merken dat CD115 werden is wanneer de cellen worden gehandhaafd bij 4° C of op ijs voor langere tijd, dus het is belangrijk om snel te werken om het verkrijgen van goede kleuring. Het is raadzaam om de verwerking van de cellen binnen 1-2 uur om hun integriteit te behouden. Als levende cellen niet vereist zijn, kunnen gekleurde cellen worden vastgesteld en verworven binnen 48 uur.
Als de geïsoleerde breuken aanzienlijke aantallen dode cellen bevatten, is het mogelijk om een levensvatbaarheid kleurstof (bv propidium jodide) om nauwkeuriger gate levende cellen, hoewel dit waarschijnlijk een verandering in de combinatie van vereisen zou fluorescerende-geconjugeerde antilichamen. Indien gewenst, kunnen de cellen worden berekend door toevoeging van tellen kralen aan een bekende concentratie aan het monster voor stroom cytometry. De parels van de tellen zijn fluorescerende latex kralen die door FSC-A en WS-A of door hun hoge fluorescentie-intensiteit van de cellen kunnen worden onderscheiden. Cel nummers kan worden berekend met de volgende formule:
(aantal cel evenementen / aantal kraal gebeurtenissen) x (aantal kralen toegevoegd aan monster / hoeveelheid monster in μL) = concentratie van monster als cellen/μL
Een beperking van het huidige protocol is dat het aparte identificatie van MPs en cMoPs, die evaluatie van deze progenitorcellen, onderzoek van hun genexpressie en functionele eigenschappen, enz. , bijvoorbeeld compliceert niet toestaat een waargenomen toename van MP + cMoP getallen geeft niet aan of verbeterde monocyt productie vindt plaats via de GMP-traject, het MDP-traject, of beide. In lopende studies hopen we te identificeren oppervlakte markeringen die onderscheid tussen MPs en cMoPs maken. In de tussentijd, kan evaluatie van deze progenitoren door eencellige RNA sequencing7 worden gebruikt om de relatieve verhoudingen van MPs en cMoPs.
Eencellige RNA sequencing studies zal waarschijnlijk onthullen ook extra heterogeniteit binnen de 6 voorlopercellen breuken beschreven in dit protocol, waarvan sommige zal weerspiegelen verschillende rijping stelt bijvoorbeeld GPs die pas onlangs monocyt verloren hebben potentieel versus GPs die zijn klaar om verder te gaan naar de volgende fase van differentiatie. De "GMP" breuk deelverzamelingen kunnen ook progenitoren met het potentieel voor de productie van andere granulocyten (eosinofielen basofielen en mestcellen) bevatten, maar we hebben dit niet onderzocht. Zoals opgemerkt in de inleiding, is het ook nog onduidelijk of de CMP-Flt3+ CD115lo, CMP-Flt3- en MDP breuken echt bevatten de voorspelde oligopotent progenitoren of als alternatief bestaat uit een mengsel van progenitoren met meer beperkte lineage potentiële, maar eencellige RNA sequencing kan inzicht geven in deze belangrijke kwestie.
Een nieuwe aanpak is nu vereist voor de identificatie van deelverzamelingen van menselijke myeloïde voorlopercellen. Weissman en collega's eerder in menselijke beenmerg en koord bloed11myeloïde deelverzamelingen (met inbegrip van "CMPs" en "GGP's") gedefinieerd, maar ze zijn ook heterogeen. Helaas, vertaling van muis gating strategieën om menselijke progenitoren wordt bemoeilijkt door de opmerkelijke verschillen in oppervlakte marker expressie tussen mens en muis progenitoren; bijvoorbeeld, CD34 expressie is beperkt tot myeloïde voorlopercellen deelverzamelingen in de muis, maar meer in het algemeen waargenomen op menselijke progenitoren waaronder hematopoietische stamcellen. Eencellige RNA sequencing onderzoek dienen ook evenwel toestaan dat de identificatie van kandidaat-markers te scheiden van de menselijke voorouder subsets.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit protocol werd ontwikkeld met behulp van fondsen van de Raad van gouverneurs regeneratieve geneeskunde Instituut in het Cedars-Sinai Medical Center (HSG), een carrière in immunologie fellowship van de Amerikaanse vereniging van immunologen (aan AY en HSG) en een geleerde Award uit de American Society of Hematology (aan AY). Wij danken de Stroom Cytometry kern in het Cedars-Sinai Medical Center voor hulp bij FACS sorteren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2) | The Jackson Laboratories | Cat#JAX:000664 | |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | Cat#130-090-858 | |
| Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC | BD Biosciences | Cat#553733 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 (FcγR; clone 93) APC-Cy7 | BioLegend | Cat#101327 | |
| Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7 | BioLegend | Cat#108114 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue | BioLegend | Cat#105820 | |
| Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5 | BioLegend | Cat#128012 | |
| Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE | BioLegend | Cat#135506 | |
| Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC | BD Biosciences | Cat#560718 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Thermo Fisher Scientific | Cat#C36950 | |
| AutoMACS Separator | Miltenyi Biotec | N/A | Use the "deplete" program |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | N/A | 5 lasers, 15 colors |
| BD FACS Aria III cell sorter | BD Biosciences | N/A | 5 lasers, 13 colors |
| FlowJo | FlowJo, LLC | https://www.flowjo.com | For further analysis of the .fcs files |
References
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).
- Yáñez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production. Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).
- Auffray, C., et al. CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation. Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 (2006).
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).
- Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).
- Yáñez, A., et al. Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes. Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).
- Olsson, A., et al. Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice. Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).
- Yáñez, A., Goodridge, H. S. Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production. Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
