Summary
我们展示了如何用磁性和荧光分选 (mac 和流动力学) 相结合的方法, 从小鼠骨髓中识别和分离出6个髓样祖细胞。本协议可用于体外培养测定 (纤维素或液体培养),体内移植实验, RNA/蛋白质分析。
Abstract
产生中性粒细胞、单核细胞和树突状干细胞 (DCs) 的髓祖原体可以在小鼠骨髓中发现并分离, 用于血液和免疫学分析。例如, 对髓祖种群的细胞和分子特性的研究可以揭示白血病转化的机制, 或者证明免疫系统对病原体暴露的反应。以前描述的流式细胞术策略, 为髓质祖鉴定已在许多领域取得了重大进展, 但他们确定的分数是非常异构的。最常用的浇口策略定义了为所需种群丰富的骨髓成分, 但也含有大量的 "污染" 祖细胞。我们最近的研究已经解决了这种异质性的大部分问题, 我们在这里提出的协议允许从2以前描述的骨髓分数中分离出6亚 oligopotent 和沿袭的髓样祖细胞。该协议描述了3个阶段: 1) 骨髓细胞的分离, 2) 通过磁活化细胞分选 (互连法) 对造血祖体细胞进行浓缩, 3) 流式细胞仪识别髓祖亚群 (包括荧光活化细胞分类, 如有需要, 则进行。这种方法允许祖细胞的数量和分离的各种体外和体内应用, 并已产生了新的洞察力的途径和机制的中性粒, 单核细胞和 DC 分化。
Introduction
单核细胞, 中性粒细胞和树突状干细胞 (DCs) 是由造血祖, 主要是在骨髓中, 由一个称为 myelopoiesis 的过程中产生的髓体细胞。常见的髓样祖细胞 (中医) 有可能产生髓体细胞, 以及巨和红细胞, 而不是淋巴细胞。粒细胞-单核细胞祖 (GMPs) 是由中医衍生而成的, 其产生的是颗粒和单核细胞, 但失去了巨和红细胞电位。单核细胞和经典和浆 DCs (招揽/pDCs) 也被认为是由一般的祖细胞-DC 祖 (mdp 以) 产生的, 这是由中医生产的. 世系势的逐步限制最终导致沿袭前身: 粒细胞祖, 单核细胞祖, 树突状体细胞祖 (图 1)。
魏斯曼和同事报告说, 中医是在林 c-试剂盒+ Sca-1- (LKS) CD34+ FcγR 的小鼠骨髓部分, 而 GMPs 包含在 LKS CD34 + FcγR嗨分数1。然而, 这些 "CMP" 和 "GMP" 分数是非常异构的。例如, "GMP" 分数也包含血统承诺粒细胞祖和单核细胞祖1,2。mdp 以分别被报告为 CX3CR1+ Flt3+ CD115+祖细胞也表达 CD34 和 FcγR3,4。mdp 以产生了 cDC/pDC 产生的共同 DC 祖 (CDPs), 据报道, 它表示较低水平的 c 套件 (CD117), 并没有包括在 LKS 分数5.
以前假定单核细胞是通过单一途径产生的 (CMP-GMP-MDP 单核细胞)。与这个模型相一致的是, 由 GMPs (命名的单核细胞祖, MPs)2和 mdp 以 (命名的共同单核细胞祖, cMoPs) 产生的单核细胞的祖细胞,6在共享表面标记表达式的基础上似乎是同一单元格.然而, 我们最近证明单核细胞是由 GMPs 和 mdp 以独立产生的, 并且能够通过单细胞 RNA 测序7区分 MPs 和 cMoPs。
我们最近修改了魏斯曼 "CMP" 和 "GMP" 浇口战略, 以确定6脂蛋白亚组分的 C57BL/6J 小鼠骨髓含有不同的 oligopotent 和血统承诺髓祖亚群。我们首次报告说, Ly6C 和 CD115 染色允许隔离 oligopotent GMPs, 以及粒细胞祖 (GPs) 和单核细胞祖 (我们目前无法分离的 MPs 和 cMoPs) 从 "GMP" 分数2 (LKS-CD34+ FcγRhi门;图 1)。我们随后证明, mdp 以主要见于 "CMP" 分数 (LKS- CD34+ FcγRlo门), 其中还包含 Flt3+ CD115lo和 Flt3-子集7 (图1).CMP-Flt3+ CD115 的 GMPs 和 mdp 以在收养转移时产生。CMP-Flt3 子集包含的祖细胞似乎是中间体之间的 CMP-Flt3+ CD115 和 GMPs。与 mdp 以不同, CMP-Flt3+ CD115 和 CMP-Flt3 分数也具有巨和红细胞电位。
然而, 必须指出的是, 目前尚不清楚 "CMP" 分数是否包含真正 oligopotent 的祖细胞 (例如, CMP-Flt3+ CD115 中的单个单元, 它拥有中性粒细胞,单核细胞、DC、巨和红细胞电位), 或二者择一地, 构成了一个具有更限制性血统潜能的祖先的混合物。菌落形成检测 (纤维素培养) 揭示了粒细胞 (中性粒细胞), 红细胞, 单核和巨电位 (GEMM 细胞) 在 "CMP", CMP-Flt3+ CD115lo和 CMP-Flt3-分数1 ,7、但不允许对直流电位进行评估。与此相反, 菌落形成检测表明, 在 "GMP" 分数1,2, oligopotent GMPs (祖细胞和单核细胞潜能) 的存在, 这是支持的最近单细胞transcriptomic 分析8。然而, 目前还不知道这些 oligopotent GMPs 是否也产生其他粒细胞 (嗜酸性粒、嗜碱性细胞和肥大的干细胞)。
在这些研究的基础上, 我们现在展示了7表面标记 (c 套件, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C 和 CD115) 可以用来识别和分离这6个子集的 oligopotent 和血统承诺的髓细胞祖细胞。这里描述的协议可以应用于体外培养试验 (纤维素或液体培养), 在小鼠体内移植实验, 分子分析 (块状和单细胞 RNA 测序, 西方印迹, 等)。
该协议由3个阶段组成: 1) 制备骨髓细胞单细胞悬浮液, 2) 对造血祖 (磁性活化细胞分选) 和 3) 进行富集鉴定, 并根据需要隔离祖子集, 通过流动细胞术 (根据需要使用分析仪或分拣机)。第一步是从安乐死小鼠的股骨和胫骨中分离骨髓细胞, 类似于先前描述的9项协议。接下来, 通过对红细胞、中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等细胞表面标志物的抗体, 对茎和祖细胞进行浓缩, 以耗尽分化的细胞。这不是强制性的, 但强烈建议优化检测的祖子集, 并减少所需的抗体数量的祖鉴定和流式细胞术所需的时间。下面的沿袭损耗协议描述了磁活化细胞分类 (mac) 使用鼠标谱系细胞耗尽套件 (其中包含生物素化抗体对 CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4 和 Ter-119, 外加抗生物素微珠) 和自动磁选机。最后一步是流式细胞术对祖子集的识别 (和排序, 如果需要的话)。下面描述的抗体面板 (另见表 1) 已设计用于流式细胞仪 (分析仪或分拣机) 与4激光器 (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm)。
图 1: 中性粒细胞、单核细胞、DC 祖和分化通路.最近修订的 myelopoiesis7模型被说明, 魏斯曼门为 "中医" (蓝色) 和 "GMPs" (绿色)1覆盖。这一数字已从亚涅斯等20177修改。请单击此处查看此图的较大版本.
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Protocol
这里描述的所有方法都是由雪松-西奈医疗中心的机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准的。
1. 小鼠骨髓的分离和单细胞悬浮液的制备
- 按照机构指南弄死鼠标。
- 将安乐死的老鼠放在背部, 用70% 乙醇 (乙醇) 喷洒。用锋利的尖剪刀在脚踝的每个后肢上做一个小 (3-5 毫米) 切口, 然后将皮肤拉向身体, 从腿部取出, 露出肌肉和骨骼。
- 从骨骼中取出肌肉 (四头肌, 腿筋等), 用剪刀修剪, 跟随骨骼的方向。小心不要损坏骨头。
- 把股骨从髋关节上脱臼, 切断结缔组织和肌肉, 把腿分开, 小心不要切成骨头。
- 通过脱臼脚踝从胫骨中取出脚, 将骨骼放在不育的 PBS 或培养基管中, 然后将它们运到组织培养室。
注: 对于其他一些应用 (例如,从总骨髓细胞中提取大鼠), 可以将骨骼留在冰上一段时间, 但对于祖细胞来说, 要尽快进行, 以避免下调重要的表面标记 (特别是 CD115)。 - 在生物安全柜中, 用纸巾擦拭骨头中残留的软组织。
注: 本议定书应在生物安全柜内进行, 如果细胞培养或体内化验后需要无菌样本进行分类。如果不需要无菌细胞, 整个过程就可以在实验室的工作台上进行。 - 简单地浸泡在70% 乙醇的骨骼, 以消毒他们, 然后在无菌 PBS 洗。
- 将股骨从胫骨和腓骨分开, 通过膝盖切开, 并丢弃腓骨。
- 用锋利的剪刀切断骨头的末端。
- 用冷不育 PBS 采集骨髓, 直至骨骼呈白色:
- 用镊子夹住每根骨头, 并插入一个26G 针连接到一个10毫升的注射器, 其中含有冷不育 PBS 到骨轴一端。
- 把骨头放在50毫升离心管上面, 通过骨头冲洗 2-5 毫升的 PBS 以收获骨髓。
- 每只老鼠 (2 股骨和2胫骨) 从所有4块骨头中收获骨髓。
- 用1毫升的吸管轻轻地吸管, 将骨髓分解成细胞悬浮。
- 通过30微米尼龙网过滤骨髓悬浮物, 消除骨块和细胞团聚体, 从而产生单个细胞悬浮。
- 离心机的单细胞悬浮在 280 x g 5 分钟, 并并用重悬细胞颗粒在无菌染色缓冲 (PBS + 0.5% 血清 + 2 毫米 EDTA), 使用5毫升染色缓冲器每只老鼠 (例如, 10 毫升的细胞汇集从股骨和胫骨2小鼠)。
- 采取 10 ul 整除的样品, 混合它与 10 ul 台盼蓝, 并加载 10 ul 的结果, 台盼蓝标记的样品上的 hemocytometer。用光显微镜计算细胞数。
注: 如果单元格过于集中以进行可靠计数, 请在添加台盼蓝之前稀释样品。
2. 磁活化细胞分选 (mac) 的前驱富集
- 离心机整个单细胞悬浮 (或尽可能多的细胞, 以获得期望的产量) 在 280 x g 5 分钟在4°c 和并用重悬细胞颗粒在 40 ul 染色缓冲 (PBS + 0.5% 血清 + 2 毫米 EDTA) 每 107细胞。
注意: 还可以使用来自沿袭损耗套件制造商 (见材料表) 的 mac 缓冲器作为染色缓冲器的替代品。 - 按照沿袭损耗套件提供的说明执行沿袭损耗。下面的说明是在材料表中看到的套件。如果使用了不同的工具包, 请按照制造商的说明进行操作, 然后继续执行步骤2.3。
- 添加 10 ul 生物素抗体鸡尾酒每 107细胞, 混合吹打和孵化10分钟在4摄氏度。
- 添加 30 ul 染色缓冲/mac 缓冲每 107细胞和混合。
- 添加 20 ul 抗生物素微珠每 107细胞。混合好, 孵化15分钟, 在4摄氏度。
注: 在将微珠加入到细胞中之前, 将其涡流, 以确保它们完全分散。 - 添加1毫升染色缓冲/mac 缓冲每 107细胞, 离心细胞在 280 x g 为5分钟, 并并用重悬细胞颗粒在 500 ul 染色缓冲/mac 缓冲区多达 108个细胞。对于超过 108细胞, 相应地放大染色缓冲器/mac 缓冲器的体积。
- 根据制造商的说明准备自动磁选机。
- 将包含标记单元格的管放置到分隔符中, 然后选择负选择程序。
- 收集负分数, 其中包含祖丰富的血统阴性 (林) 细胞.放弃正分数, 其中包含磁性标记的谱系阳性细胞。
- 将林细胞在 280 x g 上离心为5分钟, 并用重悬每只老鼠的2毫升染色缓冲/mac 缓冲液中的细胞颗粒 (例如,如果骨髓从2只老鼠中汇集, 则4毫升)。
注: 颗粒现在应该是白色的而不是红色的, 因为红细胞已经耗尽。 - 采取 10 ul 整除的林细胞,混合它与 10 ul 台盼蓝, 并加载 10 ul 的结果, 台盼蓝标记的样品上的 hemocytometer。用光显微镜计算细胞数。
注: 如果单元格过于集中以进行可靠计数, 请在添加台盼蓝之前稀释样品。
3. 用荧光活化细胞分类法进行髓样祖鉴定和分离
- 标签9离心 (1.5 或2毫升) 管: 1) 无瑕细胞, 2-8) 细胞单一染色荧光共轭抗体对 FcγR (CD16/32), c 套件, Sca-1, CD34, Flt3 (CD135), Ly6C 和 CD115 的电压选择和颜色补偿, 和 9)样本细胞被染色的所有7抗体的祖鉴定和排序。
- 将10万个细胞分配给每个控制管 (管 1-8), 所有剩余的细胞 (或更少如果需要) 到样品管 (管 9)。
注: 如果样品体积大于 1.5-2 毫升, 可能需要将样品细胞分布到15毫升管中, 将其离心并并用重悬颗粒 (步骤 3.3), 然后将细胞转移到离心管中, 随后染色步骤。 - 将细胞在 1500 x g 处离心5分钟, 并并用重悬 100 ul 染色缓冲器 (PBS + 0.5% 胎体 + 2 毫米 EDTA) 和样品管颗粒在 100 ul 染色缓冲器每 5 x 106个细胞 (如200 x 1 10 细胞的 ul) 控制管丸 。
- 添加2微克/毫升 anti-CD16/CD32-APC-Cy7 到 FcγR 单染色管和样品管。涡旋轻轻地混合, 在4摄氏度孵育10分钟。
注意: 重要的是要染色样品细胞与 FcγR (CD16/32) 抗体之前添加其他抗体, 以防止竞争由于非特定 Fc 介导的抗体结合。不要用 FcγR 阻断试剂孵化细胞。 - 将其他抗体添加到相应的单一染色管 (每1抗体) 和取样管 (所有6抗体):10 微克/毫升 c 套件-太平洋蓝, 2 微克/毫升 Sca-1-PE-Cy7, 25 微克/毫升 CD34-FITC, 10 微克/毫升 Flt3-APC, 2 微克/毫升 Ly6C PerCP-Cy5.5, 4 微克/毫升 CD115-PE。轻轻地涡旋, 在4摄氏度孵育15分钟。
- 将 900 ul 染色缓冲器添加到控制管中, 将每 107个细胞的1毫升染色缓冲到样品管。离心细胞在 1500 x g 5 分钟和并用重悬细胞颗粒在染色缓冲: 200 ul 每控制管和 500 ul 每 25 x 106细胞在样品管。将悬浮细胞转移到5毫升的流管。
注: 如果样品体积大于 1.5-2 毫升, 则可能需要将细胞转移到15毫升管中进行离心。 - 根据制造商的指示, 准备流式细胞仪 (分析仪或分拣机)。
- 通过流式细胞仪运行无瑕和单染色控制单元, 设置电压和颜色补偿。
- 运行示例单元格, 浇下下面概述的祖子集, 并在图 2中进行总结, 如果需要, 则执行该操作的分类以隔离相关的祖子集。
注意: 通常需要获得大约20万个细胞, 以获得至少1000个事件在每个祖门。- 创建所有单元格的点图, 显示 FSC a (x 轴) 和 SSC a (y 轴) 和门, 以排除碎片和死细胞 = > "活" 细胞。
- 创建一个 "活" 单元格的点图, 显示 fsc H (x 轴) 和 fsc W (y 轴) 和门, 以排除双峰 = > 活/单线 (FSC) 门。
- 创建活/单线 (FSC) 单元格的点图, 显示 ssc H (x 轴) 和 ssc W (y 轴) 和门, 以排除双峰 = > 活/单线 (FSC)/单线 (SSC) 门。
- 创建活/单线 (FSC)/单线 (SSC) 单元格的点图, 显示 Sca-1 (x 轴) 和 c 套件 (y 轴), 以及选择 c 套件+ Sca-1 细胞 = > LKS 单元格的门.
- 创建 LKS 单元格的点图, 显示 CD34 (x 轴) 和 FcγR (y 轴) 和门以选择 CD34+ FcγRlo细胞 = > "中医", CD34+ FcγRhi细胞 = > "GMPs"。
注意: 必须尽可能准确地将 "中医" 和 "GMPs" 门。使用假彩色密度图或轮廓图来精确的浇口是有帮助的。 - 创建一个 "中医" 点图, 显示 CD115 (x 轴) 和 Flt3 (y 轴) 和门, 以选择:
Flt3+ CD115螺细胞 = > CMP-Flt3+ CD115lo细胞,
Flt3 CD115螺细胞 = > CMP-Flt3 细胞 ,
Flt3+ CD115hi细胞 = > mdp 以. - 创建一个 "GMPs" 的点图, 显示 Ly6C (x 轴) 和 FcγR (y 轴) 和门, 以选择 Ly6C 细胞 => "GMP-Ly6C 细胞", Ly6C+细胞 = > "GMP-Ly6C+细胞"。
- 创建 "GMP-Ly6C 单元格" 的点图, 显示 CD115 (x 轴) 和 Flt3 (y 轴) 和门以选择:
Flt3 CD115螺细胞 = > GMPs. - 创建 "GMP-Ly6C+单元格" 的点图, 显示 CD115 (x 轴) 和 Flt3 (y 轴) 和门以选择:
Flt3- CD115螺细胞 = > GPs,
Flt3- CD115hi细胞 = > MPs + cMoPs.
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Representative Results
使用上述协议, 有可能获得1亿细胞 (包括红细胞, 或5000万有核细胞) 的股骨和胫骨 (2 条腿) 的一个 C57BL/6J 鼠 (6-8 周, 男性或女性)。1-200万林细胞可以被孤立的每只老鼠的林+细胞耗竭。
6髓系祖群中的每一个都构成了 1- 4% 的林细胞。血统耗尽是有效的消耗分化细胞和丰富的祖细胞, 但林分包含了很大比例的 c 试剂盒 , 除了 c 套件+祖祖先 (图 3A)。根据使用的分类器设置 (例如,最大产量相对于最佳纯度), 在资产管制方案排序后的祖收益率可能会有所不同, 但一般而言, 每分数可获得 1万-4万个单元格 (图 3B)。后排序流式细胞分析应揭示 > 95% 纯度的每一个分数 (图 3C)。
图 2: 用于识别6髓系祖组分的浇口策略.(A)活林细胞 > 汗衫 ( FSC) > 汗衫 (SSC)-> LKS 细胞-> CD34+ FcγR lo ("CMP") 和 CD34 + FcγRhi ("GMP") 分数-> 6 髓的逐步门控祖子集。(B) 6 个祖分数的表面标记表达式摘要。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 代表祖的产量和纯度.(A)具有代表性的流式细胞仪图, 显示在血统耗尽前后骨髓细胞的 c-试剂盒和 CD11b 表达, 表明祖细胞的富集 (c 试剂盒+电池)。(B)每个祖分数的细胞产量, 呈平均值 + 标准偏差30项实验。20只小鼠的骨髓细胞被汇集为每个实验。(C)具有代表性的流式细胞仪地块, 从后排序分析, 证明了净量的分类祖分数的纯度。面板 C 已从亚涅斯等20177修改。请单击此处查看此图的较大版本.
| 激光 | 通道 | 滤波器 | 镜子 |
| 405毫微米 | 一个. | 670/30 | 635LP |
| B。 | 525/50 | 505LP | |
| c. 套件-太平洋蓝 | 450/50 | ||
| 488毫微米 | A. (FSC) | ||
| B. Ly6C-PerCP-Cy5。5 | 710/50 | 690LP | |
| C. CD34-FITC | 525/50 | 505LP | |
| D. SSC | 488/10 | ||
| 561毫微米 | A. Sca-1-PE-Cy7 | 780/40 | 750LP |
| B。 | 710/50 | 690LP | |
| C。 | 660/20 | 640LP | |
| D。 | 610/20 | 600LP | |
| E. CD115-PE | 582/15 | ||
| 640毫微米 | A. fcυr-apc-cy7 | 780/60 | 750LP |
| B。 | 730/45 | 690LP | |
| C. Flt3-APC | 670/30 |
表 1: 抗体板和流式细胞仪配置。
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Discussion
小鼠髓质祖细胞魏斯曼门策略1已经是位免疫学家和 hematologists 的黄金标准近20年, 但现在明显的是, "CMP" 和 "GMP" 门是非常异构和更精确需要浇口策略。我们在这里描述的协议允许在 C57BL/6J 小鼠中识别 oligopotent 和沿袭所承诺的子集, 以便更精确地定量化特定的髓样祖细胞和 myelopoiesis 通路的映射, 以及调查在髓系分化的特定阶段运作的分子机制。祖子集可以被排序, 如果需要的话, 为分子分析,体外和体内评价的分化等.
该议定书是利用年轻的 (6-8 周) C57BL/6J 小鼠, 并适用于雄性和雌性小鼠。我们没有特征的祖先子集的老鼠。我们不预期标记会随着年龄的变化而改变, 但是子集的相对比例可能会有所不同。我们还没有评估其他老鼠菌株的祖子集。
我们改进的门控策略的第一个应用是通过转录因子干扰素调节因子 8 (IRF8)2对髓细胞命运选择的调控提供机械的洞察力。IRF8 以前报告由 GMPs (魏斯曼 "GMP" 分数) 表达, 并要求单核细胞分化通过促进单核细胞基因表达, 抑制中性粒细胞基因表达, 促进中性粒细胞凋亡10。利用我们改进的门控策略, 我们证明 IRF8 不是由 oligopotent GMPs 表示, 而是由 GPs 和 MPs + cMoPs2表示。此外, 我们证明, IRF8 调节 GP 和 MP + cMoP 的生存和分化, 而不是生产的血统承诺祖由 oligopotent GMPs。同样, 我们最近使用我们的改进的浇口策略重新定义的 myelopoiesis 模型, 并表明 GMPs 和 mdp 以产生功能分明的炎症单核细胞通过2独立途径7。
沿袭损耗步骤可以使用手动磁选机代替自动磁选机进行, 并且通过使用生物素化谱系标记抗体鸡尾酒和一个荧光共轭抗生物素抗体, 与门控选择无瑕细胞。沿袭损耗排除了大多数分化的细胞, 并丰富了 c 套件+祖祖先, 以尽量减少与后续步骤相关的时间和成本 (即减少抗体体积的流式细胞仪, 分析仪/分拣时间, 等)。调查人员应参考制造商的数据表, 以确定沿袭损耗步骤是否有效地与所使用的特定套件的预期效果相同。然而, 不重要的是, 如果血统耗尽不是100% 有效的, 因为分化 (林+) 细胞不表达 c 套件, 所以任何分化的细胞后剩余的血统耗尽 (以及其他 c套件细胞) 随后流式细胞术门排除。同样重要的是, 全球定位系统和 mps 表达 Ly6C, 但不同于单核细胞表达的 Ly6C, 祖 Ly6C (想必是不同的异构体) 是不被发现的 Gr-1 抗体经常包括在沿袭损耗套件, 因此, GPs 和 MPs 留在后血统耗尽2。
良好的染色对所有的表面标志物都很重要, 但对于 FcγR, 使 FcγR 的 "中医 " 和 FcγRhi "GMPs" 的准确的门控尤为关键。最佳荧光选择和抗体稀释是良好分离的必要条件, 而 FcγR 阻断试剂 (通常用于流式细胞术染色前) 不得使用 。同样重要的是要注意的是, 当细胞在4°c 或冰上维持较长时间时, CD115 是 downregulated 的, 所以快速的工作以获得良好的染色是很重要的。我们建议在 1-2 小时内处理细胞以保持其完整性。如果不需要活细胞, 染色的细胞可以在48小时内固定和获取。
如果孤立的分数包含大量的死细胞, 可以将活性染料 (如碘碘化物) 纳入更精确的门活细胞, 虽然这可能需要改变的组合fluorochrome 共轭抗体。如果需要, 细胞计数可以计算通过添加计数珠在已知浓度的样本流式细胞术。计数珠子是荧光乳胶珠, 可以区别于细胞通过 FSC a 和 SSC a 或其高荧光强度。可以使用以下公式计算单元格编号:
(细胞事件的数量/珠事件的数量) x (在 ul 样品中添加的珠子数量/样品的数量) = 样品的浓度作为细胞/ul
当前协议的一个局限是它不允许单独辨认 MPs 和 cMoPs, 复杂化对这些祖父母的评估, 对他们的基因表达和功能属性的调查等.例如, 一个观察到的 MP + cMoP 数的增加并不表明通过 GMP 途径、MDP 途径或两者都能增强单核细胞的生产。在正在进行的研究中, 我们希望找出区分 MPs 和 cMoPs 的表面标记。同时, 用单细胞 RNA 测序7对这些祖细胞进行评价, 可用于分析 MPs 和 cMoPs 的相对比例。
单细胞 RNA 测序研究还可能揭示本议定书所描述的6个祖分式中的额外异质性, 其中一些将反映出不同的成熟状态, 例如,最近只失去单核细胞的 GPs潜在的与 GPs, 正准备进入下一阶段的分化。"GMP" 分数子集也可能含有祖细胞, 有可能产生其他的粒粒 (嗜酸性颗粒, 嗜碱性细胞和肥大单元), 但我们没有调查这一点。正如导言所指出的, 目前还不清楚 CMP-Flt3+ CD115、CMP-Flt3 和MDP 分数是否真的含有预测的 oligopotent 祖细胞, 或者是由祖细胞混合而成的有限的血统潜力, 但单细胞 RNA 测序可以提供对这个重要问题的洞察力。
现在需要一种新的方法来识别人类髓样祖细胞的子集。魏斯曼和同事先前定义了骨髓和脐带血中的髓样亚群 (包括 "中医" 和 "GMPs")11, 但它们同样是异质的。不幸的是, 人与小鼠祖细胞表面标记物表达的显著差异, 将小鼠门控策略转化为人类祖细胞是复杂的;例如,CD34 表达仅限于小鼠髓样祖群, 但更广泛地观察到人类祖细胞包括造血干细胞。然而, 单细胞 RNA 测序研究也应允许识别候选标记, 以分离人类祖群。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项议定书是利用在雪松-西奈医学中心的理事会再生医学研究所 (HSG) 的资金, 在美国位免疫学家协会 (HSG) 的免疫学奖学金的职业生涯, 以及学者奖美国血液学学会 (哎)。我们感谢雪松-西奈医疗中心的流式细胞术核心, 以协助进行外地分类。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2) | The Jackson Laboratories | Cat#JAX:000664 | |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | Cat#130-090-858 | |
| Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC | BD Biosciences | Cat#553733 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 (FcγR; clone 93) APC-Cy7 | BioLegend | Cat#101327 | |
| Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7 | BioLegend | Cat#108114 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue | BioLegend | Cat#105820 | |
| Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5 | BioLegend | Cat#128012 | |
| Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE | BioLegend | Cat#135506 | |
| Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC | BD Biosciences | Cat#560718 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Thermo Fisher Scientific | Cat#C36950 | |
| AutoMACS Separator | Miltenyi Biotec | N/A | Use the "deplete" program |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | N/A | 5 lasers, 15 colors |
| BD FACS Aria III cell sorter | BD Biosciences | N/A | 5 lasers, 13 colors |
| FlowJo | FlowJo, LLC | https://www.flowjo.com | For further analysis of the .fcs files |
References
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