Summary
Dimostriamo come identificare e isolare 6 sottoinsiemi dei progenitori mieloidi dal midollo osseo murino utilizzando una combinazione di magnetico e fluorescenza ordinamento (MACS e FACS). Questo protocollo può essere usato per analisi di RNA/proteine, in vivo gli esperimenti di trasferimento adottivo e saggi di cultura in vitro (colture di metilcellulosa o liquido).
Abstract
Progenitori mieloidi che producono neutrofili, monociti e cellule dendritiche (DCs) possono essere identificati e isolati dal midollo osseo di topi per analisi ematologiche ed immunologiche. Ad esempio, studi delle proprietà molecolari e cellulari delle popolazioni di cellule progenitrici mieloidi possono rivelare meccanismi sottostanti la trasformazione leucemica o dimostrare come il sistema immunitario risponde all'esposizione di agente patogeno. In precedenza strategie di citometria a flusso descritto per l'identificazione di cellule progenitrici mieloidi hanno permesso significativi progressi in molti campi, ma le frazioni che identificano sono molto eterogenee. Le strategie più comunemente usate di Gate definiscono frazioni del midollo osseo che sono arricchite per le popolazioni desiderate, ma contengono anche un numero elevato di "contaminare" progenitori. Nostri studi recenti hanno risolto gran parte di questa eterogeneità e il protocollo che presentiamo qui consente l'isolamento 6 sottopopolazioni di oligopotent e dei progenitori mieloidi lignaggio-commessi da 2 precedentemente descritto frazioni del midollo osseo. Il protocollo descrive 3 fasi: 1) l'isolamento del midollo osseo cellule, 2) arricchimento di progenitori ematopoietici di ordinamento magnetico-attivata delle cellule (svuotamento di stirpe di MACS) e 3) identificazione dei sottoinsiemi di cellule progenitrici mieloidi mediante citometria a flusso (tra cui fluorescenza-attivato cella ordinamento, FACS, se lo si desidera). Questo approccio consente la quantificazione di progenitore e isolamento per una varietà di applicazioni in vitro e in vivo e ha già dato romanzo insight sulle vie e sui meccanismi di neutrofili, monociti e differenziazione delle DC.
Introduction
Monociti, neutrofili e cellule dendritiche (DCs) sono cellule mieloidi che derivano da progenitori ematopoietici, principalmente nel midollo osseo, tramite un processo chiamato mielopoiesi. Comune dei progenitori mieloidi (CMPs) hanno il potenziale per produrre cellule mieloidi, come pure i megacariociti ed eritrociti, ma cellule non linfoidi. Progenitori del granulocyte-monocito (GMP), che sono derivati da CMPs, producono di granulociti e monociti, ma hanno perso dei megacariociti e potenziali dell'eritrocito. Monociti e classica e plasmacytoid DCs (cDCs/PDC) sono anche pensato di derivano da progenitori comuni, noti come progenitori del monocito-DC (MDPs), che sono prodotte da CMPs. graduale limitazione del potenziale di lignaggio infine provoca lignaggio-commesso progenitori: progenitori granulociti, monociti progenitori e dei progenitori delle cellule dendritiche (Figura 1).
Weissman e colleghi ha riferito che CMPs si trovano in Lin– c-Kit+ Sca-1– CD34 (LKS–)+ FcγRlo frazione del midollo osseo di topo, mentre le GMP sono contenute nel CD34 LKS– + FcγR Ciao frazione1. Tuttavia, queste frazioni "CMP" e "GMP" sono molto eterogenee. Per esempio, la frazione "GMP" contiene anche dei progenitori del granulocyte lignaggio-commessi e monocito progenitori1,2. MDPs separatamente sono stati segnalati per essere CX3CR1+ Flt3+ CD115+ progenitori che inoltre esprimono CD34 e FcγR3,4. MDPs danno luogo a cDC/pDC-produzione comune DC progenitori (CDP), che sono stati segnalati per esprimere più bassi livelli di c-Kit (CD117) e non sono inclusi nella frazione LKS– 5.
Si è precedentemente ipotizzato che monociti derivano attraverso una singola via (CMP-GMP-MDP-monocito). Coerente con questo modello, monocito-commesso dei progenitori prodotto da PGM (denominato progenitori del monocito, MPs)2 e MDPs (denominato comuni progenitori del monocito, cMoPs)6 sembrano essere le stesse celle sulla base dell'espressione dei marker di superficie condivisa . Tuttavia, abbiamo recentemente dimostrato che monociti sono prodotte in modo indipendente da GMPs e MDPs e sono stati in grado di distinguere tra MPs e cMoPs di cella singola sequenziamento del RNA,7.
Abbiamo recentemente modificato il Weissman "CMP" e "GMP" gating strategia per identificare 6 subfractions del midollo osseo di topo C57BL/6J contenente diversi oligopotent e sottoinsiemi di lignaggio-commesso progenitrici mieloidi. Abbiamo segnalato prima che la macchiatura per Ly6C e CD115 consente l'isolamento di GMPs oligopotent, così come di progenitori del granulocyte (GPs) e di progenitori del monocito (MPs e cMoPs, che siamo attualmente in grado di separare) dalla frazione "GMP"2 (LKS - CD34+ FcγRCiao cancello; Figura 1). Abbiamo successivamente dimostrato che MDPs si trovano principalmente nella frazione "CMP" (CD34 LKS– + FcγRlo cancello), che contiene anche Flt3+ CD115lo e Flt3– sottoinsiemi7 (Figura 1 ). Il CMP-Flt3+ CD115lo frazione rendimenti sia GMPs e MDPs su trasferimento adottivo. Il sottoinsieme di CMP-Flt3– contiene dei progenitori che sembrano essere intermedi tralo cellule CD115 CMP-Flt3+ e GMP. A differenza di MDPs, CMP-Flt3+ CD115lo sia il CMP-Flt3– frazioni anche possiedono megacariocita e potenziali dell'eritrocito.
È importante notare, tuttavia, che non è attualmente chiaro se le frazioni "CMP" contengono progenitori che sono veramente oligopotent (ad es., cellule individuali all'interno del CMP-Flt3+ CD115lo frazione che possiedono dei neutrofili, monociti, DC, megacariocita e potenziali dell'eritrocito), o in alternativa, comprendono una miscela di progenitori con più limitato potenziale di lignaggio. Colonie del saggi (culture metilcellulosa) ha rivelato le cellule con potenziale megacariocita (cellule di GEMM) in "CMP", dell'eritrocito, monociti e granulociti (neutrofili) CMP-Flt3+ CD115lo e frazioni di CMP-Flt3– 1 ,7, ma non consentono la valutazione del potenziale di DC. Al contrario, Colonia formando le analisi ha dimostrato l'esistenza di oligopotent PGM (progenitori con neutrofili e monociti potenziali) in "GMP" frazione1,2, e questo è supportato da recenti unicellulare di analisi trascrittomica8. Non è attualmente noto, tuttavia, se questi PGM oligopotent produrre anche altri granulociti (eosinofili, basofili e mastociti).
Sulla base di questi studi, ora dimostriamo come 7 marcatori (c-Kit, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C e CD115) di superficie può essere utilizzato per identificare e isolare questi 6 sottogruppi della oligopotent e dei progenitori mieloidi lignaggio-commesso. Il protocollo descritto qui può essere applicato per i test di cultura in vitro (colture di metilcellulosa o liquido), esperimenti di trasferimento adottivo in vivo in topi e l'analisi molecolare (sequenziamento di RNA alla rinfusa e a cella singola, Western blotting, ecc).
Il protocollo consiste di 3 fasi: 1) preparazione di una sospensione di singola cellula del midollo osseo cellule, 2) arricchimento di progenitori ematopoietici (ordinamento magnetico-attivata delle cellule) e 3) l'identificazione e l'isolamento se lo si desidera, dei sottoinsiemi di cellule progenitrici di flusso cytometry (utilizzando un analizzatore o un fascicolatore, come appropriato). Il primo passo è l'isolamento delle cellule del midollo osseo dai femori e le tibie di topi eutanasizzati ed è simile ad altri protocolli precedentemente descritti9. Successivamente, il campione si arricchisce per cellule staminali e progenitrici usando un cocktail di anticorpi contro gli indicatori di superficie delle cellule di eritrociti, i neutrofili, monociti, linfociti, ecc., per vuotare le cellule differenziate. Questo non è obbligatorio, ma fortemente consigliato per ottimizzare il rilevamento dei sottoinsiemi progenitore e per ridurre la quantità di anticorpi necessari per l'identificazione di cellule progenitrici e il tempo necessario per citometria a flusso. Il protocollo di deplezione di lignaggio qui sotto descrive l'ordinamento delle cellule Magnetic-Activated (MACS) utilizzando un Kit di svuotamento di Mouse Lineage delle cellule (che contiene anticorpi biotinilati CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4 e Ter-119, plus anti-biotina microsfere) e un separatore magnetico automatizzato. Il passo finale è l'individuazione (e l'ordinamento, se lo si desidera) dei sottoinsiemi progenitore tramite flusso cytometry. Il pannello di anticorpi descritti di seguito (Vedi anche tabella 1) è stato progettato per essere utilizzato in un citometro a flusso (analizzatore o selezionatore) con 4 laser (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).
Figura 1: vie di differenziazione e progenitori dei neutrofili, monociti e DC. Il modello recentemente riveduto della mielopoiesi7 è illustrato, con i cancelli di Weissman per "CMP" (blu) e "PGM" (verde)1 sovrapposti. Questa figura è stata modificata da Yáñez et al 20177. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) del Cedars-Sinai Medical Center.
1. isolamento del midollo osseo di topo e preparazione di una sospensione singola cella
- Eutanasia il mouse secondo le linee guida istituzionali.
- Posizionare il mouse eutanasizzato sul dorso e spruzzarlo con 70% di etanolo (EtOH). Praticare un'incisione di piccolo (3-5 mm) in ogni arto presso la caviglia livello utilizzando sharp, forbici appuntite e tirare la pelle verso il corpo per rimuoverlo dalle gambe ed esporre i muscoli e ossa.
- Per rimuovere i muscoli (quadricipiti, muscoli posteriori della coscia, ecc.) dalle ossa, li taglio con le forbici, seguendo la direzione dell'osso. Fare attenzione a non danneggiare le ossa.
- Dislocare i femori da articolazioni dell'anca e tagliare via il tessuto connettivo e muscolare per staccare le gambe, facendo attenzione a non tagliare le ossa.
- Rimuovere i piedini di lussazione della caviglia dalle tibie, collocare le ossa in una provetta sterile PBS o media e trasportarli sul ghiaccio per la camera di coltura del tessuto.
Nota: Per alcune applicazioni (ad es., derivazione di macrofagi da cellule del midollo osseo totale) è possibile lasciare le ossa sul ghiaccio per un po', ma per l'isolamento di cellule progenitrici è importante procedere più rapidamente possibile per evitare downregulation di marcatori di superficie importanti (soprattutto CD115). - In una cappa di biosicurezza, rimuovere qualsiasi tessuto molle rimanente dalle ossa strofinandoli con carta velina.
Nota: Il protocollo deve essere eseguito in una cappa di biosicurezza se un campione sterile è necessario per le analisi di cultura o in vivo delle cellule dopo l'ordinamento FACS. Se le cellule sterili non sono necessari, l'intero processo può essere eseguito sul banco di laboratorio. - Immergere brevemente le ossa in 70% EtOH per disinfettare e poi in PBS sterile per lavarli.
- Separare i femori dalle tibie e fibule tagliando attraverso il ginocchio e scartare le fibule.
- Tagliare le estremità fuori le ossa con forbici affilate.
- Raccolta del midollo osseo con PBS sterile fredda come segue fino a quando le ossa appaiono bianche:
- Ogni osso di afferrare con una pinza e inserire un ago 26G collegato ad una siringa da 10 mL contenente PBS sterile fredda nell'albero dell'osso ad una estremità.
- Tenere l'osso sopra un tubo di centrifuga da 50 mL e a filo 2-5 mL di PBS attraverso l'osso per raccogliere il midollo.
- Raccogliere il midollo dalle ossa tutti 4 per topo (2 femori e 2 tibie).
- Pipettare delicatamente su e giù con una pipetta da 1 mL a disaggregare il midollo osseo per formare una sospensione cellulare.
- Filtrare la sospensione di midollo osseo attraverso un pezzo di maglia di nylon 30 μm per eliminare i pezzi di ossa e aggregati, generando così una sospensione singola cella di cella.
- Centrifugare la sospensione unicellulare a 280 x g per 5 min e risospendere il pellet cellulare in sterile colorazione buffer (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA), con 5 mL di tampone per topo (ad es., 10 mL per le cellule in pool dai femori e le tibie di 2 topi) di colorazione.
- Prendere un 10 μL di aliquota del campione, mescolare con 10 μL di Trypan Blue e carico 10 μL del campione tripan blu-etichettato risultante a un emocitometro. Contare le celle utilizzando un microscopio ottico.
Nota: Se le celle sono troppo concentrate per il conteggio affidabile, diluire il campione prima dell'aggiunta di Trypan Blue.
2. progenitore arricchimento di magnetico-Activated Cell Sorting (Mac)
- Centrifugare la sospensione intera singola cella (o il numero di celle come è necessari per ottenere la resa desiderata) a 280 x g per 5 min a 4° C e risospendere il pellet cellulare in 40 μL di buffer (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA) per 107 cellule di colorazione.
Nota: È anche possibile utilizzare MACS buffer del produttore di kit di svuotamento lignaggio (Vedi Tabella materiali) come alternativa al buffer di colorazione. - Eseguire lo svuotamento di stirpe secondo le istruzioni fornite con il kit di svuotamento di stirpe. Le seguenti istruzioni sono per il kit visto nella Tabella materiali. Se si utilizza un kit diverso, seguire le istruzioni del produttore e quindi passare al punto 2.3.
- Aggiungere 10 μL biotina-anticorpo cocktail a 107 cellule, Miscelare pipettando e incubare per 10 min a 4 ° C.
- Aggiungere 30 µ l tampone/Mac la macchiatura buffer per 107 cellule e mescolare.
- Aggiungere 20 μL anti-biotina microsfere per 107 cellule. Mescolare bene e incubare per altri 15 min a 4 ° C.
Nota: Vortex le microsfere prima di aggiungerli alle cellule per assicurarsi che essi sono completamente dispersa. - Aggiungere 1 mL di buffer buffer/Mac per 107 cellule di colorazione, centrifugare le cellule a 280 x g per 5 min e risospendere il pellet cellulare in 500 μL colorazione buffer/MACS tampone per fino a 108 celle. Per più di 108 cellule, aumentare il volume di macchiatura buffer buffer/MACS di conseguenza.
- Preparare il separatore magnetico automatizzato secondo le istruzioni del produttore.
- Collocare la provetta contenente le celle con etichettate nel separatore e scegliere il programma di selezione negativa.
- Raccogliere la frazione negativa, che contiene le cellule di progenitrici-arricchita lignaggio-negativi (Lin–). Scartare la frazione positiva, che contiene le cellule di lignaggio-positive magneticamente-etichettati.
- Centrifugare la Lin– cellule a 280 x g per 5 min e risospendere il pellet cellulare in 2 mL di buffer buffer/Mac per topo (ad es., 4 mL se midollo osseo era pool da 2 topi) di colorazione.
Nota: Il pellet dovrebbe essere bianco anziché rosso perché gli eritrociti sono stati esauriti. - Prendere un 10 μL di aliquota delle cellule Lin– , mescolare con 10 μL di Trypan Blue e carico 10 μL del campione tripan blu-etichettato risultante a un emocitometro. Contare le celle utilizzando un microscopio ottico.
Nota: Se le celle sono troppo concentrate per il conteggio affidabile, diluire il campione prima dell'aggiunta di Trypan Blue.
3. mieloidi progenitrici identificazione e isolamento di fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS)
- 9 etichetta per microcentrifuga (1,5 o 2 mL) per: 1) senza macchia celle, 2-8) cellule singole colorate con anticorpi coniugati fluoroforo contro FcγR (CD16/32), c-Kit, Sca-1, CD34, Flt3 (CD135), Ly6C e CD115 per compensazione della tensione di selezione e colore e 9) campione di cellule per essere macchiato con 7 tutti gli anticorpi per l'identificazione di cellule progenitrici e ordinamento.
- È possibile distribuire 100.000 cellule per ciascuna delle provette controllo (tubi 1-8) e tutte le celle rimanenti (o meno se lo si desidera) per il campione tubo (9).
Nota: Se il volume del campione è maggiore di 1,5-2 mL, può essere necessario distribuire le cellule del campione in una provetta da 15 mL, centrifugare li e risospendere il pellet (fase 3.3 sotto) e quindi trasferire le cellule ad un tubo del microcentrifuge per le successive fasi di colorazione. - Centrifugare le cellule a 1.500 x g per 5 min e risospendere il pellet di tubo di controllo in 100 μL buffer (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA) e il pellet di tubo campione in 100 μL di colorazione colorazione buffer per 5 x 106 cellule (ad es., 200 μL per 1 x 107 cellule).
- Aggiungere 2 μg/mL anti-CD16/CD32-APC-Cy7 FcγR macchia singolo tubo e il tubo di campionamento. Vortice delicatamente per mescolare e incubare per 10 min a 4 ° C.
Nota: È importante a macchiare il campione di cellule con l'anticorpo FcγR (CD16/32) prima di aggiungere gli altri anticorpi per impedire la concorrenza a causa del legame non specifico Fc-mediata anticorpo. Non Incubare le cellule con un FcγR reagente bloccante. - Aggiungere gli altri anticorpi per provette corrispondenti singola macchia (1 dell'anticorpo) e la provetta del campione (tutti gli 6 anticorpi): 10 μg/mL c-Kit-Pacific Blue, 2 μg/mL Sca-1-PE-Cy7, 25 μg/mL CD34-FITC, 10 μg/mL Flt3-APC, 2 μg/mL Ly6C-PerCP-Cy 5.5 e 4 μg/mL CD115-PE. Vortice delicatamente e incubare per 15 min a 4 ° C.
- Aggiungere 900 μL buffer colorazione per i tubi di controllo e 1 mL di tampone di colorazione per 107 cellule in provetta del campione. Centrifugare le cellule a 1.500 x g per 5 min e risospendere il pellet cellulare nella macchiatura buffer: 200 µ l per provetta di controllo e 500 μL per 25 x 106 cellule nella provetta del campione. Trasferire le cellule sedimento per provette da 5 mL FACS.
Nota: Se il volume del campione è maggiore di 1,5-2 mL, può essere necessario trasferire le cellule in una provetta da 15 mL per centrifugazione. - Preparare il citometro a flusso (analizzatore o selezionatore) secondo le istruzioni del produttore.
- Eseguire singole e non macchiate macchiato le cellule di controllo attraverso il citometro a flusso per impostare la compensazione di colore e di tensioni.
- Eseguire il campione di cellule, cancello i sottoinsiemi di cellule progenitrici come descritto qui di seguito e riassunti nella Figura 2e se lo si desidera, eseguire FACS ordinamento per isolare i sottoinsiemi di progenitrici pertinenti.
Nota: È in genere necessario acquisire circa 200.000 cellule per ottenere almeno 1.000 eventi in ogni cancello progenitrici.- Crea una stampa di puntino di tutte le cellule, visualizzazione FSC-A (asse x) e SSC-A (asse y) e del cancello per escludere detriti e cellule morte = > cellule "vive".
- Crea una stampa di puntino di cellule "vive", visualizzati da FSC-H (asse x) e FSC-W (asse y) e del cancello per escludere doppietti = > cancello live/canottiera (FSC).
- Creare un terreno di puntino di vivere/canottiera celle (FSC), visualizzazione SSC-H (asse x) e SSC-W (asse y) e del cancello per escludere doppietti = > live/canottiera (FSC) / porta di singoletto (SSC).
- Creare un terreno di puntino di vivere/canottiera (FSC) / cellule di singoletto (SSC), visualizzazione di Sca-1 (asse x) e c-Kit (asse y) e porta a selezionare c-Kit+ Sca-1– cellule = > cellule LKS– .
- Crea una stampa di puntino delle cellule LKS– , visualizzazione di CD34 (asse x) e FcγR (asse y) e porta a selezionare CD34+ FcγRlo cellule = > "CMP" e CD34+ FcγRCiao cellule = > "PGM".
Nota: È importante per cancello il "CMP" e "PGM" come precisamente possibile. È utile utilizzare una trama di densità pseudocolor o una trama di contorno per gating accurata. - Creare una trama di puntino del "CMP", visualizzazione CD115 (asse x) e Flt3 (asse y) e porta a selezionare:
FLT3+ CD115lo cellule = > CMP-Flt3+ CD115lo cellule,
FLT3– CD115lo cellule = > CMP-Flt3– cellule,
FLT3+ CD115Ciao cellule = > MDPs. - Crea una stampa di puntino delle "PGM", Ly6C di visualizzazione (asse x) e FcγR (asse y) e porta a selezionare Ly6C cellule–= > "Cellule GMP-Ly6C– " e Ly6C+ cellule = > "GMP-Ly6C+ cellule".
- Creare una trama di dot "GMP-Ly6C– di cellule", visualizzazione CD115 (asse x) e Flt3 (asse y) e porta a selezionare:
FLT3– CD115lo cellule = > GMPs. - Creare una trama di dot "GMP-Ly6C+ di cellule", visualizzazione CD115 (asse x) e Flt3 (asse y) e porta a selezionare:
FLT3– CD115lo cellule = > GPs,
FLT3– CD115Ciao cellule = > MPs + cMoPs.
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Representative Results
Utilizzando il protocollo descritto in precedenza, è possibile ottenere cellule 100 milioni (compresi i globuli rossi, o 50 milioni di cellule nucleate) da entrambi i femori e tibie (2 gambe) di un mouse C57BL/6J (6-8 settimane vecchie, maschile o femminile). 1-2 milioni Lin– cellule possono essere isolate per topo da svuotamento di MACS delle cellule Lin+ .
Ognuno dei 6 sottoinsiemi progenitrici mieloidi costituisce ~ 1-4% di Lin– cellule. Svuotamento di stirpe è efficiente a che impoveriscono lo strato di cellule differenziate e arricchente per progenitori, ma la frazione di Lin– contiene una grande percentuale di cellule c-Kit– oltre ai progenitori di c-Kit+ (Figura 3A). Progenitrici cede dopo l'ordinamento FACS può variare a seconda delle impostazioni di selezionatore usate (ad es., rendimento massimo contro purezza ottima), ma in generale è possibile ottenere 10.000-40.000 cellule per frazione (Figura 3B). Analisi di citometria a flusso post-ordinamento dovrebbe rivelare > 95% di purezza di ogni frazione (Figura 3).
Figura 2: strategia per l'identificazione delle 6 frazioni progenitrici mieloidi di Gating. (A) progressiva gating di cellule vive di Lin– -> canottiere (FSC) -> canottiere (SSC) -> LKS– cellule -> CD34+ FcγRlo ("CMP") e CD34+ FcγRCiao ("GMP") frazioni -> 6 mieloide sottoinsiemi di cellule progenitrici. (B) sintesi dell'espressione di superficie dell'indicatore dalle frazioni 6 progenitrici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: rendimenti rappresentativi progenitore e la purezza. (A) citometria rappresentativa trame visualizzando c-Kit e CD11b espressione di cellule del midollo osseo prima e dopo svuotamento di stirpe, dimostrando arricchimento dei progenitori (cellule c-Kit+ ). (B) cella restituisce per ogni frazione di progenitrici, presentati come media + deviazione standard di 30 esperimenti. Cellule del midollo osseo da fino a 20 topi sono state riunite per ogni esperimento. (C) citometria rappresentativa trame da analisi post-ordinamento, che dimostra la purezza delle frazioni di FACS-ordinato progenitrici. Pannello C è stato modificato da Yáñez et al 20177. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Laser | Canale | Filtro | Specchio |
| 405 nm | A. | 670/30 | 635LP |
| B. | 525/50 | 505LP | |
| C. c-Kit-Pacific Blue | 450/50 | ||
| 488 nm | R. (FSC) | ||
| B. Ly6C-PerCP-Cy 5.5 | 710/50 | 690LP | |
| C. CD34-FITC | 525/50 | 505LP | |
| D. SSC | 488/10 | ||
| 561 nm | R. Sca-1-PE-Cy7 | 780/40 | 750LP |
| B. | 710/50 | 690LP | |
| C. | 660/20 | 640LP | |
| D. | 610/20 | 600LP | |
| E. CD115-PE | 582/15 | ||
| 640 nm | R. FcϒR-APC-Cy7 | 780/60 | 750LP |
| B. | 730/45 | 690LP | |
| C. Flt3-APC | 670/30 |
Tabella 1: Anticorpo pannello e flusso cytometer configurazione.
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Discussion
Weissman gating strategia per mouse progenitrici mieloidi identificazione1 è stato il gold standard per gli immunologi ed ematologi per quasi 20 anni, ma ora è evidente che i cancelli "CMP" e "GMP" sono molto eterogenei e più preciso sono necessarie strategie di Gate. Il protocollo che abbiamo descritto qui consenta l'identificazione dell'oligopotent e dei sottoinsiemi di lignaggio-commesso in topi C57BL/6J per più precisa quantificazione dei progenitori mieloidi specifici e mappatura delle vie mielopoiesi, nonché indagini di meccanismi molecolari operanti in specifiche fasi di differenziazione mieloide. I sottoinsiemi di cellule progenitrici possono essere ordinati, se lo si desidera, per le analisi molecolari, valutazione in vitro e in vivo di differenziazione ecc.
Il protocollo è stato sviluppato utilizzando giovani (6-8 settimane) topi C57BL/6J ed è adatto per topi sia maschili che femminili. Non abbiamo caratterizzato i sottoinsiemi di cellule progenitrici in più vecchi topi. Non prevediamo i marcatori cambierà con l'età, ma possono variare le proporzioni relative dei sottoinsiemi. Non abbiamo valutato i sottoinsiemi di cellule progenitrici in altri ceppi di topi.
La prima applicazione della nostra strategia di gating modificato era quello di fornire informazioni mecanicistiche regolazione della scelta di destino delle cellule mieloidi dal fattore normativo di interferone del fattore di trascrizione 8 (IRF8)2. IRF8 precedentemente è stata segnalata per essere espresso da PGM (Weissman "GMP" frazione) e richiesto per differenziazione del monocito promuovendo l'espressione genica del monocito, sopprimendo l'espressione genica del neutrofilo e promuovendo l'apoptosi dei neutrofili10. Usando la nostra strategia di gating modificata, abbiamo dimostrato che IRF8 non è espressa da oligopotent PGM, ma è espresso sia GPs e MPs + cMoPs2. Inoltre, abbiamo dimostrato che IRF8 regola GP e MP + cMoP sopravvivenza e differenziazione, piuttosto che produzione dei progenitori lignaggio-commessi da oligopotent PGM. Analogamente, recentemente abbiamo utilizzato la nostra strategia di gating modificata per ri-definire il modello della mielopoiesi e dimostrato che GMPs e MDPs produrre funzionalmente distinti infiammatori monociti via 2 vie indipendenti7.
Il passo di svuotamento di stirpe può essere eseguito utilizzando un separatore magnetico manuale invece di un separatore magnetico automatizzato e svuotamento di stirpe può essere ottenuto anche tramite citofluorimetria usando il cocktail di anticorpi biotinilati marcatore lignaggio e un fluoroforo anti-biotina anticorpo coniugato, con gating per selezionare le celle non colorate. Svuotamento di stirpe esclude più cellule differenziate e arricchisce per progenitori di c-Kit+ per ridurre al minimo tempi e costi associati con i passaggi successivi (cioè, riduce volumi dell'anticorpo per citometria a flusso, tempo di analizzatore/sorter, ecc). Gli investigatori devono consultare il datasheet del costruttore per determinare se il passaggio di svuotamento di lignaggio ha lavorato in modo altrettanto efficiente come anticipato per il kit specifico utilizzato. Tuttavia, non importa se svuotamento di stirpe non è 100% efficiente perché (Lin+) cellule differenziate non esprimono c-Kit, così ogni residuo dopo svuotamento di stirpe di cellule differenziate (come pure altre cellule c-Kit– ) sono successivamente escluso dal flusso cytometry gating. È anche importante notare che GPs e MPs Ly6C espresso ma, a differenza del Ly6C espresso dai monociti, il progenitore Ly6C (presumibilmente un'isoforma diversa) non viene rilevato dall'anticorpo Gr-1 spesso incluso nel kit di svuotamento di stirpe, e GPs e MPs rimanere così dopo lo svuotamento di Lineage2.
Buona colorazione è importante per tutti i marcatori di superficie, ma particolarmente critico per FcγR consentire accurati gating del FcγRlo "CMP" e il FcγRCiao "PGM". Fluoroforo ottimale scelta e anticorpo diluizione sono essenziali per la buona separazione e un reagente bloccante FcγR (comunemente usato prima della colorazione per citometria a flusso) deve non essere utilizzato. È anche importante notare che CD115 è downregulated quando le cellule sono mantenute a 4° C o su ghiaccio per lunghi periodi, quindi è importante lavorare rapidamente per ottenere buona colorazione. Si consiglia di elaborazione le cellule entro 1-2 ore per preservare la loro integrità. Se cellule vive non sono necessari, cellule marcate possono essere fissa e acquisite entro 48 ore.
Se le frazioni isolate contengono un numero significativo di cellule morte, è possibile includere una tintura di redditività (ad es., ioduro di propidio) per maggiore precisione del cancello di cellule vive, anche se probabilmente questo richiederebbe un cambiamento nella combinazione di anticorpi coniugati fluorocromo. Se lo si desidera, i conteggi delle cellule possono essere calcolati aggiungendo perline conteggio a una concentrazione nota al campione per citometria a flusso. Branelli di conteggio sono granuli di lattice fluorescente che possono essere distinta dalle cellule di FSC-A e SSC-A o dalla loro intensità alta fluorescenza. Numeri delle cellule possono essere calcolati utilizzando la seguente formula:
(numero di eventi di cella / numero di eventi della perla) x (numero di perline aggiunti al campione / volume di campione in μL) = concentrazione del campione come cellule/μL
Una limitazione del protocollo attuale è che non permette di individuare separatamente MPs e cMoPs, che complica la valutazione di questi progenitori, indagine della loro espressione genica e proprietà funzionali, ecc. , per esempio, un osservato aumento di MP + cMoP numeri non indicano se monocito avanzata produzione avviene attraverso il pathway di GMP, la via MDP o entrambi. Negli studi in corso, speriamo di identificare marcatori di superficie che distinguono tra MPs e cMoPs. Nel frattempo, valutazione di questi progenitori di singola cellula sequenziamento del RNA,7 potrebbe essere utilizzata per analizzare le proporzioni relative di MPs e cMoPs.
Gli studi di sequenziamento di RNA singola cellula probabilmente rivelerà anche ulteriori eterogeneità all'interno delle frazioni di 6 progenitrici descritti nel presente protocollo, alcune delle quali rifletterà di maturazione diversi stati ad es., GPs che solo recentemente hanno perso il monocito potenziale rispetto al GPs che sono pronti per procedere alla fase successiva di differenziazione. I sottoinsiemi di frazione "GMP" possono contenere anche progenitori con il potenziale per produrre altri granulociti (eosinofili, basofili e mastociti), ma non abbiamo studiato questo. Come indicato nell'introduzione, non è attualmente chiaro anche se il CMP-Flt3+ CD115lo, CMP-Flt3– e frazioni MDP veramente contengono i progenitori del predetto oligopotent o in alternativa comprendono una miscela di progenitori con più sequenziamento di RNA di potenziale, ma la cella singola limitata lignaggio può fornire la comprensione in questa importante questione.
Un nuovo approccio è ora richiesto per l'identificazione dei sottoinsiemi dei progenitori mieloidi umani. Weissman e colleghi precedentemente definiti sottogruppi mieloide (tra cui "CMP" e "PGM") nel midollo osseo umano e cavo sangue11, ma sono allo stesso modo eterogenei. Purtroppo, traduzione di mouse gating strategie ai progenitori umani è complicata da notevoli differenze nell'espressione di superficie dell'indicatore tra umani e progenitori del mouse; ad esempio, Espressione di CD34 è limitato a sottoinsiemi di cellule progenitrici mieloidi nel topo, ma più ampiamente osservato sui progenitori umani tra cui cellule staminali ematopoietiche. Gli studi di sequenziamento di RNA unicellulare dovrebbero, tuttavia, inoltre consentire l'identificazione di marcatori candidati per separare i sottoinsiemi di progenitori umani.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo protocollo è stato sviluppato utilizzando fondi dal Consiglio dei governatori rigenerativa medicina Institute al Cedars-Sinai Medical Center (HSG), una carriera in comunione di immunologia dal Associazione americana di immunologi (a AY e HSG) e un Scholar Award da la società americana di Ematologia (di AY). Ringraziamo il nucleo di Cytometry di flusso al Cedars-Sinai Medical Center per assistenza con l'ordinamento FACS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2) | The Jackson Laboratories | Cat#JAX:000664 | |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | Cat#130-090-858 | |
| Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC | BD Biosciences | Cat#553733 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 (FcγR; clone 93) APC-Cy7 | BioLegend | Cat#101327 | |
| Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7 | BioLegend | Cat#108114 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue | BioLegend | Cat#105820 | |
| Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5 | BioLegend | Cat#128012 | |
| Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE | BioLegend | Cat#135506 | |
| Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC | BD Biosciences | Cat#560718 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Thermo Fisher Scientific | Cat#C36950 | |
| AutoMACS Separator | Miltenyi Biotec | N/A | Use the "deplete" program |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | N/A | 5 lasers, 15 colors |
| BD FACS Aria III cell sorter | BD Biosciences | N/A | 5 lasers, 13 colors |
| FlowJo | FlowJo, LLC | https://www.flowjo.com | For further analysis of the .fcs files |
References
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