Summary
ونحن لشرح كيفية تحديد وعزل 6 مجموعات فرعية من فروعه النقوي من مورين نخاع العظام باستخدام مزيج من المغناطيسية والأسفار الفرز (أجهزة ماكينتوش ونظام مراقبة الأصول الميدانية). يمكن استخدام هذا البروتوكول في المختبر فحوصات الثقافة (الثقافات methylcellulose أو السائل) و في فيفو المتبنيين نقل التجارب وتحاليل الحمض النووي الريبي/البروتين.
Abstract
يمكن تحديدها في فروعه النقوي التي تسفر عن العَدلات ووحيدات الخلايا الجذعية (DCs) والمعزولة من نخاع العظام من الفئران للتحاليل الدموية والمناعية. على سبيل المثال، دراسات عن الخصائص الخلوية والجزيئية للسكان السلف النقوي يمكن أن تكشف عن الآليات الكامنة وراء التحول ليوكيميك، أو تبين كيفية استجابة النظام المناعي للتعرض للعوامل الممرضة. سبق وصف التدفق الخلوي استراتيجيات لتحديد السلف النقوي مكنت إنجازات هامة في العديد من المجالات، ولكن الكسور وهي تحدد متباينة للغاية. تعريف استراتيجيات النابضة الأكثر استخداماً الكسور نخاع العظام هي إثراء للسكان المطلوب، ولكنها تحتوي أيضا على عدد كبير من فروعه "تلويث". لدينا الدراسات الأخيرة قد حل جزء كبير من هذا التباين، والبروتوكول ونحن الحاضرين هنا تصاريح عزل الفئات السكانية الفرعية 6 من أوليجوبوتينت والنسب التي ارتكبت النقوي موروث من 2 الموصوفة سابقا الكسور نخاع العظام. ويصف البروتوكول 3 مراحل: 1) عزل نخاع العظم خلايا، 2) إثراء لفروعه المكونة للدم بالفرز المغناطيسي تنشيط الخلية (استنفاد النسب من أجهزة ماكينتوش)، 3) تحديد مجموعات فرعية النقوي السلف بالتدفق الخلوي (بما في ذلك الأسفار تنشيط الخلية الفرز، نظام مراقبة الأصول الميدانية، إذا رغبت في ذلك). هذا النهج يسمح بتقدير السلف والعزلة لمجموعة متنوعة من التطبيقات في المختبر و في فيفو ، وأسفرت بالفعل رواية ثاقبة مسارات وآليات العَدلات والوحيدات، وتمايز DC.
Introduction
وحيدات، العَدلات، والخلايا الجذعية (DCs) هي النقوي الخلايا التي تنشأ من فروعه المكونة للدم في نخاع العظام، أساسا بعملية تسمى ميلوبويسيس. موروث النقوي المشتركة (CMPs) لديها القدرة على إنتاج خلايا النقوي، فضلا عن ميجاكاريوسيتيس والكريات الحمراء، ولكن الخلايا اللمفاوية لا. موروث المحببات الوحيدات (غمبس)، التي هي مستمدة من CMPs، تنتج المحببة ووحيدات، ولكن قد فقدت ميجاكاريوسيتي وكرات الدم الحمراء المحتملة. وحيدات والكلاسيكية وأيضا بلاسماسيتويد DCs (المؤلفان/pDCs) ويعتقد أن تنشأ من فروعه المشتركة المعروفة باسم المتكفل الوحيدات-DC (مدبس)، التي يتم إنتاجها بواسطة CMPs. تدريجيا في نهاية المطاف يؤدي تقييد إمكانات النسب النسب التي ارتكبت فروعه: المتكفل المحببات والوحيدات المتكفل والخلايا الجذعية موروث (الشكل 1).
ويسمان والزملاء أفادت أن CMPs موجودة في لين– ج-كيت+ هيئة الأوراق المالية-1– CD34 (LKS–)+ FcγRلو جزء بسيط من الماوس نخاع العظام، بينما ترد غمبس في CD34 LKS– + FcγR مرحبا جزء1. ومع ذلك، هذه الكسور "كيوتو" و "جي أم بي" متباينة للغاية. على سبيل المثال، كسر "GMP" يحتوي أيضا على موروث النسب التي ارتكبت المحببات والوحيدات موروث1،2. مدبس أفيد كل على حدة بأن CX3CR1+ Flt3+ CD115+ فروعه أيضا تعبر عن CD34 و FcγR3،4. مدبس تثير cDC/الحزب الديمقراطي المسيحي-إنتاج مشترك DC موروث (توضع)، التي أبلغت للتعبير عن مستويات أدنى من ج-كيت (CD117) ولم يتم تضمينها في جزء LKS– 5.
وكان يفترض مسبقاً أن وحيدات تنشأ عن طريق مسار واحد (CMP-GMP-الديمقراطي-الوحيدات). يتفق مع هذا موروث النموذج، وارتكبت الوحيدات التي تنتجها غمبس (المسمى المتكفل الوحيدات، أعضاء البرلمان)2 ومدبس (المسمى شيوعاً الوحيدات موروث، كموبس)6 يبدو أن نفس الخلايا على أساس التعبير علامة السطحية المشتركة . ومع ذلك، نحن مؤخرا أظهرت أن وحيدات تصدر بشكل مستقل عن غمبس ومدبس، وكانت قادرة على التمييز بين أعضاء البرلمان، وكموبس ب تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة7.
مؤخرا قمنا بتعديل استراتيجية "GMP" النابضة ويسمان "كيوتو" لتحديد اﻷفخاذ 6 C57BL/6J الماوس نخاع العظام التي تحتوي على أوليجوبوتينت مختلفة ومجموعات فرعية السلف النقوي النسب التي ارتكبت. نحن ذكرت أولاً أن تلطيخ ل Ly6C و CD115 يسمح بعزل غمبس أوليجوبوتينت، فضلا عن فروعه المحببات (GPs) وفروعه الوحيدات (MPs وكموبس، ونحن حاليا غير قادر على فصل) من "جي أم بي" جزء2 (LKS - CD34+ FcγRمرحبا البوابة؛ الشكل 1). أظهرنا في وقت لاحق أن مدبس هي في الأغلب في جزء "كيوتو" (CD34 LKS– + FcγRلو البوابة)، الذي يحتوي أيضا على Flt3+ CD115لو و Flt3– المجموعات الفرعية7 (الرقم 1 ). + CD115لو كسر CMP-Flt3 غلة غمبس ومدبس عند نقل التبني. مجموعة فرعية CMP-Flt3– يحتوي على فروعه التي تظهر أن تكون وسيطة بين غمبس ولو خلايا CMP-Flt3+ CD115. على عكس مدبس، تمتلك CMP-Flt3+ CD115لو والكسور CMP-Flt3– أيضا ميجاكاريوسيتي وكرات الدم الحمراء المحتملة.
من المهم أن نلاحظ، مع ذلك، أنه من غير الواضح حاليا ما إذا كان يتضمن كسور "كيوتو" فروعه التي هي حقاً أوليجوبوتينت (مثل الخلايا الفردية داخل CMP-Flt3+ CD115لو كسر التي تمتلك العَدلات، الوحيدات، العاصمة، ميجاكاريوسيتي، وكرات الدم الحمراء المحتملة)، أو بدلاً من ذلك، تضم خليطا فروعه مع إمكانات النسب أكثر تقييداً. وكشفت مستعمرة تشكيل فحوصات (الثقافات methylcellulose) الخلايا مع المحببات (العَدلات) وكرات الدم الحمراء والوحيدات و megakaryocyte المحتملة (جيم الخلايا) في "كيوتو"، CMP-Flt3+ CD115لو والكسور CMP-Flt3– 1 ،7، ولكن لا تسمح بتقييم إمكانات DC. وفي المقابل، مستعمرة تشكيل فحوصات أثبتت وجود أوليجوبوتينت غمبس (فروعه مع العَدلات والوحيدات المحتملة) في جزء "GMP"1،2، وهذا معتمد من قبل الأخيرة وحيدة الخلية تحليل ترانسكريبتوميك8. لا حاليا المعروف، ومع ذلك، ما إذا كانت هذه غمبس أوليجوبوتينت أيضا إنتاج المحببة الأخرى (الحمضات، الاسسه، وخلايا mast).
استناداً إلى هذه الدراسات، تبين لنا الآن كيف السطح 7 علامات (ج-كيت، هيئة الأوراق المالية-1، CD34، FcγR، Flt3، Ly6C و CD115) يمكن استخدامها لتحديد وعزل هذه المجموعات الفرعية 6 أوليجوبوتينت وفروعه النقوي النسب التي ارتكبت. يمكن تطبيق البروتوكول الموصوفة هنا في المختبر فحوصات الثقافة (الثقافات methylcellulose أو السائل)، في فيفو تجارب نقل التبني في الفئران، والتحليل الجزيئي (تسلسل الحمض النووي الريبي السائبة وخلية واحدة، النشاف الغربية، إلخ).
البروتوكول ويتكون من 3 مراحل: 1) إعداد تعليق خلية مفردة لنخاع العظم خلايا، 2) إثراء ل 3) تحديد، فروعه المكونة للدم (الفرز المغناطيسي تنشيط الخلية)، وعزله إذا رغبت، من مجموعات فرعية السلف بالتدفق الخلوي (باستخدام محلل أو من أرز، حسب الاقتضاء). الخطوة الأولى هو عزل خلايا نخاع العظام من قصبة وتيبياس من الفئران euthanized ومشابه للأخرى بروتوكولات تم وصفه مسبقاً9. بعد ذلك، أثري العينة للخلايا الجذعية والسلف باستخدام خليط من الأجسام المضادة ضد علامات خلية سطح الكريات الحمراء، العَدلات، وحيدات، الخلايا الليمفاوية، إلخ، إلى استنزاف الخلايا المتمايزة. وهذا ليس إلزامياً، ولكن الموصى به بشدة لتحسين الكشف عن المجموعات السلف، وتقليل كمية الأجسام المضادة اللازمة لتحديد السلف والوقت المطلوب للتدفق الخلوي. بروتوكول نضوب النسب أدناه توضح استخدام الماوس النسب خلية استنفاد عدة فرز الخلايا ماجنيتيكاكتيفاتيد (ماك) (الذي يحتوي على أضداد بيوتينيلاتيد CD5، CD45R (B220)، CD11b وغرام-1 (Ly6G/C)، 7-4، ومكررا ثانيا-119، بالإضافة إلى مكافحة البيوتين ميكروبيدس) وفاصل مغناطيسي الآلي. والخطوة الأخيرة هي تحديد (والفرز، وإذا رغبت في ذلك) من المجموعات السلف بالتدفق الخلوي. الفريق الضد المبينة أدناه (انظر أيضا الجدول 1) قد صممت لاستخدامها في تدفق سيتوميتير (محلل أو أرز) مع الليزر 4 (405 نانومتر، 488 نانومتر، 561 نانومتر، 640 nm).
رقم 1: المتكفل العَدلات والوحيدات والعاصمة ومسارات التمايز. ويوضح النموذج المنقح مؤخرا من ميلوبويسيس7 ، مع بوابات وايزمن عن "CMPs" (أزرق) و "غمبس" (أخضر)1 مضافين. لقد تم تعديل هذا الرقم من يانيز et al. عام 20177. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافق جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من مركز سيدرز-سيناء الطبي.
1-عزل نخاع العظام الماوس وإعداد تعليق خلية مفردة
- Euthanize الماوس وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
- ضع الماوس يوثانيزيد على ظهرها والرش مع 70% إيثانول (EtOH). جعل شق صغيرة (3-5 مم) في كل أطرافه هند في استخدام المستوى الكاحل الحادة، أشار المقص، وسحب الجلد نحو الجسم إلى إزالته من الساقين وعرض العضلات والعظام.
- إزالة العضلات (عضلات الفخذ وأوتار الركبة و غيرها) من العظام تقليم لهم مع مقص، عقب اتجاه العظم. أن الحرص على عدم الأضرار العظام.
- انخﻻع قصبة من مفاصل الورك وقطع الأنسجة الضامة والعضلات لفصل الساقين، والحرص على عدم قطع في العظام.
- إزالة القدمين بواسطة انخلع الكاحلين من تيبياس ومكان العظام في أنبوب عقيم برنامج تلفزيوني أو وسائل الإعلام ونقلهم على الجليد إلى غرفة زراعة الأنسجة.
ملاحظة: لبعض التطبيقات الأخرى (مثلاً، المستمدة الضامة من خلايا نخاع العظام المجموع) من الممكن أن تترك العظام على الجليد لفترة من الوقت، ولكن للسلف العزلة من المهم الشروع، في أقرب وقت ممكن لتجنب دوونريجوليشن من علامات هامة السطحية (وبخاصة CD115). - في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء، إزالة أي أنسجة لينة المتبقية من العظام بفرك لهم مع المناديل الورقية.
ملاحظة: ينبغي إجراء البروتوكول في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء إذا كان مطلوباً عينة عقيمة لفحوصات الثقافة أو في فيفو الخلية بعد الفرز نظام مراقبة الأصول الميدانية. إذا كانت خلايا عقيمة غير المطلوبة، يمكن إجراء العملية برمتها على مقاعد البدلاء المختبر. - تزج بإيجاز العظام في 70% EtOH لتطهير لهم، ومن ثم في برنامج تلفزيوني العقيمة غسلها.
- فصل في قصبة من تيبياس وفيبولاس بالقطع عن طريق الركبة، وتجاهل فيبولاس.
- قطع ينتهي قبالة العظام مع مقص حاد.
- حصاد نخاع العظام مع PBS العقيمة الباردة كالتالي حتى تظهر العظام بيضاء:
- قبضة كل العظام مع الملقط، وإدراج ز 26 إبرة متصلة بحقنه 10 مل يحتوي على البارد PBS العقيمة في رمح العظام في نهاية واحدة.
- عقد العظام فوق أنبوب الطرد مركزي 50 مل وتدفق 2-5 مل برنامج تلفزيوني عن طريق للحصاد النخاع العظام.
- حصاد النخاع من عظام 4 جميع كل الماوس (قصبة 2 وتيبياس 2).
- بلطف "الماصة؛" صعودا وهبوطاً مع ماصة 1 مل تفصيل نخاع العظام شكل تعليق خلية.
- تصفية تعليق نخاع العظام عن طريق قطعة من 30 ميكرو النايلون مش للقضاء على قطع العظام وخلية المجاميع، مولده بذلك تعليق خلية مفردة.
- استخدام أجهزة الطرد المركزي تعليق خلية مفردة في ز 280 x لمدة 5 دقائق، وريسوسبيند بيليه الخلية في المخزن المؤقت المصبوغة العقيمة (برنامج تلفزيوني 0.5% FBS + + 2 مم يدتا)، 5 مل تلطيخ المخزن المؤقت للماوس (مثلاً، 10 مل للخلايا المجمعة من قصبة وتيبياس من الفئران 2).
- تأخذ 10 ميكروليتر اليكووت للعينة، ومزجها مع 10 ميكروليتر تريبان الأزرق، وتحميل 10 ميكروليتر عينة المسمى تريبان الأزرق الناتج إلى هيموسيتوميتير. عد الخلايا باستخدام مجهر ضوء.
ملاحظة: إذا كانت الخلايا مركزة جداً لعد موثوقة، تخفف العينة قبل إضافة تريبان الأزرق.
2-السلف الإثراء المغناطيسي تنشيط الخلية الفرز (ماك)
- الطرد المركزي من تعليق خلية واحدة كاملة (أو عدد من الخلايا مطلوبة للحصول على العائد المطلوب) في ز 280 x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وريسوسبيند بيليه الخلية في 40 ميكروليتر تلطيخ المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني + 0.5% FBS + 2 مم يدتا) كل 107 الخلايا.
ملاحظة: من الممكن أيضا استخدام المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش من الشركة المصنعة لطقم استنفاد النسب (انظر الجدول للمواد) كبديل للمخزن المؤقت المصبوغة. - أداء نضوب النسب وفقا للإرشادات المتوفرة مع الطقم استنفاد النسب. التعليمات التالية الطقم ينظر في الجدول للمواد. إذا تم استخدام مجموعة أدوات مختلفة، اتبع إرشادات الشركة المصنعة وثم انتقل إلى الخطوة 2، 3.
- إضافة 10 ميكروليتر جسم البيوتين كوكتيل كل 107 خلايا ومزيج من بيبيتينج واحتضان لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إضافة 30 ميكروليتر تلطيخ المخزن المؤقت/أجهزة ماكينتوش المخزن المؤقت كل 107 خلايا ومزيج.
- إضافة 20 ميكروليتر البيوتين المضادة ميكروبيدس الواحدة 107 الخلايا. يخلط جيدا واحتضانها 15 دقيقة إضافية في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: دوامة ميكروبيدس قبل إضافتها إلى الخلايا للتأكد من أن أنها مشتتة تماما. - أضف 1 مل تلطيخ المخزن المؤقت المخزن المؤقت/أجهزة ماكينتوش الواحدة 107 الخلايا، والطرد المركزي الخلايا في 280 x ز لمدة 5 دقائق، وريسوسبيند بيليه الخلية في 500 ميكروليتر المصبوغة المخزن المؤقت/أجهزة ماكينتوش المخزن المؤقت لمدة تصل إلى 108 خلايا. لأكثر من 108 خلايا، مضاعفة حجم تلطيخ المخزن المؤقت المخزن المؤقت/أجهزة ماكينتوش تبعاً لذلك.
- إعداد الفاصل المغناطيسي الآلي وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- ضع الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا المسماة إلى الفاصل واختر البرنامج الانتقاء السلبي.
- جمع الكسر السلبية، التي تحتوي على الخلايا (لين–) النسب السلبية أثري السلف. تجاهل الكسر الإيجابية، التي تحتوي على الخلايا المسماة مغناطيسيا مصابات بالنسب.
- الطرد المركزي لين– الخلايا في ز 280 x لمدة 5 دقائق، وريسوسبيند بيليه الخلية في 2 مل تلطيخ المخزن المؤقت المخزن المؤقت/أجهزة ماكينتوش للماوس (مثلاً، 4 مل إذا كان تجميع نخاع العظم من الفئران 2).
ملاحظة: بيليه ينبغي الآن الأبيض بدلاً من الأحمر لأنه قد نفدت في الكريات الحمراء. - تأخذ 10 ميكروليتر الكوة الخلايا لين– ، ومزجها مع 10 ميكروليتر تريبان الأزرق، وتحميل 10 ميكروليتر عينة المسمى تريبان الأزرق الناتج إلى هيموسيتوميتير. عد الخلايا باستخدام مجهر ضوء.
ملاحظة: إذا كانت الخلايا مركزة جداً لعد موثوقة، تخفف العينة قبل إضافة تريبان الأزرق.
3. تحديد السلف النقوي والعزل بواسطة Fluorescence تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)
- 9 تسمية أنابيب ميكروسينتريفوجي (1.5 أو 2 مل): 1) أونستينيد الخلايا، 2-8) خلايا مفردة ملطخة بالأجسام المضادة مترافق فلوروفوري ضد FcγR (CD16/32)، ج-كيت، هيئة الأوراق المالية-1، CD34، Flt3 (CD135)، Ly6C و CD115 لتعويض لون واختيار الجهد، و 9) عينة خلايا تكون ملطخة بجميع الأجسام المضادة 7 لتحديد السلف والفرز.
- توزيع الخلايا 100,000 لكل عنصر تحكم الأنابيب (أنابيب 1-8)، وجميع الخلايا المتبقية (أو أقل إذا رغبت في ذلك) إلى أنبوب العينة (أنبوب 9).
ملاحظة: إذا كان حجم عينة أكبر من 1.5-2 مل، قد يكون من الضروري توزيع الخلايا العينة في أنبوب 15 مل والطرد المركزي لهم وريسوسبيند بيليه (الخطوة 3، 3 أدناه)، وثم نقل الخلايا إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي للخطوات اللاحقة المصبوغة. - الطرد المركزي الخلايا في س 1,500 ز لمدة 5 دقائق، وريسوسبيند الكريات أنبوب التحكم في 100 ميكروليتر تلطيخ المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني + 0.5% FBS + 2 مم يدتا) وبيليه أنبوب عينة في 100 ميكروليتر تلطيخ العازلة الواحدة 5 × 106 خلايا (مثلاً 200 ميكروليتر للخلايا 1 × 107 ).
- إضافة 2 ميكروغرام/مل المضادة-CD16/CD32--آسيا والمحيط الهادئ--Cy7 إلى أنبوب وصمة عار واحد FcγR وأنبوب عينة. الدوامة بلطف مزيج، واحتضان لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: من المهم وصمة عار عينة الخلايا بجسم FcγR (CD16/32) قبل إضافة الأجسام المضادة الأخرى لمنع المنافسة بسبب ربط جسم Fc بوساطة غير محددة. عدم احتضان الخلايا مع FcγR حجب كاشف. - إضافة أجسام أخرى إلى أنابيب وصمة عار واحد المناظرة (1 جسم في كل) وأنبوب العينة (جميع الأجسام المضادة 6): 10 ميكروغرام/مل ج-كيت--المحيط الهادئ الأزرق 2 ميكروغرام/مل Sca-1-PE-Cy7، 25 ميكروغرام/مل CD34-فيتك، 10 ميكروغرام/مل Flt3-آسيا والمحيط الهادئ، 2 ميكروغرام/مل Ly6C-بيركب-Cy5.5 و 4 ميكروغرام/مل CD115-PE. الدوامة بلطف، واحتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- إضافة 900 ميكروليتر المصبوغة العازلة للأنابيب التحكم، 1 مل المصبوغة المخزن المؤقت لكل 10 خلايا7 إلى أنبوب عينة. الطرد المركزي الخلايا في 1,500 س ز لمدة 5 دقائق وريسوسبيند بيليه الخلية في تلطيخ المخزن المؤقت: 200 ميكروليتر كل أنبوب التحكم، و 500 ميكروليتر الواحدة 25 x 106 خلايا في أنبوب عينة. نقل الخلايا ريسوسبينديد إلى أنابيب 5 مل نظام مراقبة الأصول الميدانية.
ملاحظة: إذا كان حجم عينة أكبر من 1.5-2 مل، قد يكون من الضروري نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل للطرد المركزي. - إعداد cytometer تدفق (محلل أو أرز) وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- تشغيل أونستاينيد وواحد ملون الخلايا التحكم عن طريق سيتوميتير تدفق إعداد الفولتية وتعويضات اللون.
- تشغيل الخلايا عينة وبوابة المجموعات السلف المبين أدناه وملخصه في الشكل 2، وإذا رغبت في ذلك، تنفيذ نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز لعزل المجموعات ذات الصلة السلف.
ملاحظة: من الضروري عادة الحصول على حوالي 200,000 الخلايا للحصول على الأحداث على الأقل 1,000 في كل بوابة السلف.- إنشاء قطعة دوت كافة الخلايا، عرض منتدى التعاون الأمني-أ (س) وال SSC-أ (العمودي)، وبوابة لاستبعاد الحطام والخلايا الميتة = > "لايف" الخلايا.
- إنشاء قطعة دوت الخلايا "حية"، عرض منتدى التعاون الأمني-ح (س)، ومنتدى التعاون الأمني-W (المحور الصادي)، وبوابة لاستبعاد doublets = > بوابة لايف/القميص (FSC).
- إنشاء قطعة دوت لايف/القميص الخلايا (FSC)، عرض SSC-ح (المحور السيني) والتعاون بين بلدان الجنوب-W (المحور الصادي)، وبوابة لاستبعاد doublets = > لايف/القميص (FSC)/بوابة القميص (SSC).
- إنشاء قطعة دوت لايف/القميص (FSC)/خلايا القميص (SSC)، عرض Sca-1 (س) وج-كيت (المحور الصادي)، وبوابة لتحديد الخلايا ج-كيت+ هيئة الأوراق المالية-1– = > الخلايا LKS– .
- إنشاء قطعة دوت الخلايا LKS– ، عرض CD34 محور (س) ومحور (ص) FcγR، وبوابة لتحديد CD34+ FcγRلو الخلايا = > "CMPs"، و CD34+ FcγRمرحبا الخلايا = > "غمبس".
ملاحظة: من المهم لبوابة "CMPs" و "غمبس" بدقة قدر الإمكان. فمن المفيد استخدام قطعة كثافة بسيودوكولور أو مؤامرة كفاف النابضة دقيقة. - إنشاء قطعة دوت "CMPs"، عرض CD115 (المحور السيني) و Flt3 المحور (ص)، وبوابة لتحديد:
Flt3+ CD115لو الخلايا = > CMP-Flt3+ CD115لو الخلايا،
Flt3– CD115لو الخلايا = > CMP-Flt3– الخلايا،
Flt3+ CD115مرحبا الخلايا = > مدبس. - إنشاء قطعة دوت "غمبس"، عرض Ly6C (المحور السيني) والمحور (ص) FcγR، وبوابة لتحديد Ly6C الخلايا–= > "الخلايا GMP-Ly6C– "، و Ly6C+ الخلايا = > "GMP-Ly6C+ الخلايا".
- إنشاء مؤامرة دوت "الخلايا GMP-Ly6C– "، وعرض CD115 (المحور السيني) و Flt3 المحور (ص)، وبوابة لتحديد:
Flt3– CD115لو الخلايا = > غمبس. - إنشاء مؤامرة دوت "الخلايا GMP-Ly6C+ "، وعرض CD115 (المحور السيني) و Flt3 المحور (ص)، وبوابة لتحديد:
Flt3– CD115لو الخلايا = > لتحديد المواقع،
Flt3– CD115مرحبا الخلايا = > النواب + كموبس-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدام البروتوكول، المذكورة أعلاه، من الممكن الحصول على 100 مليون من الخلايا (بما في ذلك خلايا الدم الحمراء، أو خلايا عرطله 50 مليون) من قصبة و tibias (2 الساقين) واحدة بالماوس C57BL/6J (6-8 أسابيع القديمة، ذكرا كان أو أنثى) على حد سواء. يمكن أن تكون الخلايا لين– 1-2 مليون معزولة الواحدة الماوس بأجهزة ماكينتوش استنفاد الخلايا لين+ .
تشكل كل من مجموعات فرعية السلف النقوي 6 ~ 1-4% من لين الخلايا– . استنفاد النسب الكفاءة في استنفاد الخلايا المتمايزة وإثراء لفروعه، ولكن كسر لين– الذي يحتوي على نسبة كبيرة من الخلايا ج-كيت– بالإضافة إلى فروعه ج-كيت+ (الشكل 3A). السلف غلة بعد فرز نظام مراقبة الأصول الميدانية يمكن أن تختلف استناداً إلى إعدادات أرز المستخدمة (مثلاً، أقصى غلة مقابل النقاء الأمثل)، ولكن بشكل عام فمن الممكن الحصول على خلايا 10,000 40,000 كل جزء (الشكل 3B). يجب أن تكشف نوعا ما بعد التدفق الخلوي التحليل > نقاء 95% من كل جزء (الشكل 3).
رقم 2: النابضة استراتيجية لتحديد الكسور السلف النقوي 6- (أ) النابضة التدريجي للخلايا الحية لين– --> نوع (FSC)--> نوع (SSC)--> LKS– الخلايا CD34->+ FcγRلو ("اللجنة") و CD34+ FcγRمرحبا ("GMP") الكسور--> 6 النقوي مجموعات فرعية من السلف. (ب) ملخص للتعبير علامة السطحية بكسور السلف 6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: غلة السلف الممثل والنقاء. (أ) قطع الممثل التدفق الخلوي عرض ج-أدوات والتعبير CD11b بخلايا نخاع العظام قبل وبعد استنفاد النسب، مما يدل على إثراء فروعه (الخلايا ج-كيت+ ). (ب) خلية الغلة لكل جزء السلف، قدمت كمتوسط + الانحراف المعياري لتجارب 30. تم تجميع خلايا نخاع العظام من الفئران تصل إلى 20 لكل تجربة. (ج) قياس تدفق الممثل المؤامرات من تحليل ما بعد الفرز، مما يدل على نقاء الكسور السلف فرز نظام مراقبة الأصول الميدانية. لقد تم تعديل لوحة ج يانيز et al. عام 20177. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| ليزر | قناة | عامل التصفية | مرآة |
| 405 نانومتر | ألف | 670/30 | 635LP |
| باء | 525/50 | 505LP | |
| جيم-ج-كيت--المحيط الهادئ الأزرق | 450/50 | ||
| 488 نانومتر | ألف (FSC) | ||
| ب Ly6C-بيركب-Cy5.5 | 710/50 | 690LP | |
| جيم CD34-فيتك | 525/50 | 505LP | |
| دال SSC | 488/10 | ||
| 561 شمال البحر الأبيض المتوسط | ألف هيئة الأوراق المالية-1-PE-Cy7 | 780/40 | 750LP |
| باء | 710/50 | 690LP | |
| جيم | 660/20 | 640LP | |
| دال | 610/20 | 600LP | |
| هاء-PE CD115 | 582/15 | ||
| 640 nm | ألف FcϒR-آسيا والمحيط الهادئ--Cy7 | 780/60 | 750LP |
| باء | 730/45 | 690LP | |
| جيم Flt3-الجيش الشعبي الكونغولي | 670/30 |
الجدول 1: جسم الفريق وتدفق التكوين سيتوميتير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد يسمان النابضة استراتيجية ل تحديد السلف النقوي الماوس1 المعيار الذهبي للمناعة وهيماتولوجيستس لما يقرب من 20 عاماً، ولكن من الواضح الآن أن البوابات "كيوتو" و "جي أم بي" متباينة للغاية وأكثر دقة هناك حاجة إلى استراتيجيات النابضة. يسمح البروتوكول التي وصفناها هنا تحديد أوليجوبوتينت والنسب التي ارتكبت مجموعات فرعية في الفئران C57BL/6J للقياس الكمي أكثر دقة من فروعه النقوي محددة، ورسم خرائط لمسارات ميلوبويسيس، وكذلك التحقيق في الآليات الجزيئية التي تعمل في مراحل معينة من التمايز النقوي. يمكن فرز المجموعات السلف، إذا رغبت، للتحليلات الجزيئية، التقييم في المختبر و في فيفو التمايز إلخ
البروتوكول تم تطويرها باستخدام الشباب (6-8 أسابيع من العمر) C57BL/6J الفئران، وهي مناسبة للفئران الذكور والإناث على حد سواء. ونحن قد لا تتسم المجموعات السلف في الفئران الأكبر سنا. ونحن لا نتوقع العلامات ستتغير مع التقدم في السن، ولكن قد تختلف الارتفاع النسبي للمجموعات. ونحن لم تقييم المجموعات السلف في سلالات الماوس الأخرى.
كان أول تطبيق لاستراتيجيتنا النابضة تعديل توفير آليا إلى التبصر في تنظيم اختيار مصير الخلية النقوي عامل النسخ التنظيمية عامل مضاد للفيروسات 8 (IRF8)2. IRF8 ذكر سابقا أن تبديها غمبس (وايزمن "GMP" كسر) والمطلوب للتمايز الوحيدات بتشجيع التعبير الجيني الوحيدات، وقمع التعبير الجيني العَدلات، وتشجيع المبرمج العَدلات10. استخدام استراتيجيتنا النابضة المعدلة، أثبتنا أن IRF8 لا يعبر عن أوليجوبوتينت غمبس، لكنها أعربت عن كل المواقع وأعضاء البرلمان + كموبس2. وعلاوة على ذلك، أثبتنا أن ينظم IRF8 سباق الجائزة الكبرى و MP + بقاء كمب والتمايز، بدلاً من إنتاج موروث النسب التي ارتكبت قبل أوليجوبوتينت غمبس. وبالمثل، نحن مؤخرا تستخدم استراتيجيتنا النابضة المعدلة لإعادة تعريف نموذج ميلوبويسيس، وأظهرت أن إنتاج غمبس ومدبس وحيدات التحريضية متميزة وظيفيا عبر مسارات مستقلة 27.
يمكن تنفيذ الخطوة استنفاد النسب باستخدام فاصل مغناطيسي يدوي بدلاً من فاصل مغناطيسي الآلي، ونضوب النسب كما يمكن أن يتحقق بالتدفق الخلوي استخدام كوكتيل جسم علامة النسب بيوتينيلاتيد مترافق fluorophore البيوتين المضادة الأجسام المضادة، مع النابضة لتحديد الخلايا أونستينيد. استنفاد النسب تستبعد معظم الخلايا المتمايزة ويثري لموروث ج-كيت+ للتقليل من الوقت والتكاليف المرتبطة بالخطوات اللاحقة (أي، يقلل من حجم جسم للتدفق الخلوي، محلل/أرز الوقت، إلخ). ينبغي أن يشير المحققون إلى ورقة البيانات الخاص بالشركة المصنعة لتحديد ما إذا كان استخدام الخطوة استنفاد النسب يعمل بكفاءة كما كان متوقعا لمجموعة محددة. ومع ذلك، لا يهم إذا كان استنفاد النسب ليس 100 ٪ كفاءة نظراً للتمييز بين الخلايا (لين+) لا يعرب عن ج-كيت، أي خلايا متمايزة المتبقية بعد استنفاد النسب (فضلا عن غيرها من الخلايا ج-كيت– ) يتم في وقت لاحق استبعدت من التدفق الخلوي النابضة. من المهم أيضا أن نلاحظ أن GPs وأعضاء البرلمان من التعبير عن Ly6C ولكن، خلافا Ly6C أبداها وحيدات، السلف Ly6C (يفترض أن isoform مختلفة) لم يتم الكشف عن جسم غرام-1 غالباً ما تدرج في النسب استنفاد مجموعات، ومن ثم تظل لتحديد المواقع، وأعضاء البرلمان بعد النسب استنفاد2.
تلوين جيدة مهم لجميع العلامات السطحية، ولكن حاسمة بشكل خاص ل FcγR السماح النابضة دقيقة FcγRلو "CMPs" و FcγRمرحبا "غمبس". تمييع الاختيار وجسم fluorophore الأمثل ضرورية لفصل جيدة، ويجب كاشف حظر FcγR (تستخدم عادة قبل التلوين للتدفق الخلوي) لا يمكن استخدامها. من المهم أيضا أن نلاحظ أن CD115 دوونريجولاتيد عند الخلايا يتم الاحتفاظ عند 4 درجة مئوية أو على الجليد لفترات طويلة، ولذلك من الضروري العمل بسرعة للحصول على تلوين جيد. من المستحسن معالجة الخلايا خلال 1-2 ساعة للحفاظ على سلامتهم. إذا كانت الخلايا الحية غير المطلوبة، يمكن الخلايا الملون الثابتة والمكتسبة خلال 48 ساعة.
إذا الكسور معزولة تحتوي على إعداد كبيرة من الخلايا الميتة، فمن الممكن أن تدرج صبغة جدوى (مثلاً يوديد propidium) البوابة أدق الخلايا الحية، على الرغم من أن هذا ربما سيتطلب تغييرا في تركيبة مترافق fluorochrome الأجسام المضادة. إذا رغبت في ذلك، يمكن حساب عدد خلايا عن طريق إضافة الخرز العد بتركيز معلوم للعينة للتدفق الخلوي. يتم عد حبات الخرز مطاط الفلورسنت التي يمكن تمييزها من الخلايا بمنتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب-أ أو بقوتها الفلورية العالية. ويمكن حساب أرقام الخلية باستخدام الصيغة التالية:
(عدد من أحداث خلية/عدد من الأحداث حبة) x (عدد حبات يضاف إلى العينة/حجم العينة في ميكروليتر) = تركيز العينة كخلية/ميكروليتر
واحد الحد من البروتوكول الحالي هو أن لا تسمح بتحديد هوية منفصلة من أعضاء البرلمان وكموبس، مما يزيد من تعقيد تقييم هذه فروعه، التحقيق التعبير الجيني والخصائص الفنية، و ما إلى ذلك على سبيل المثال، ولاحظ زيادة في MP + أرقام كمب لا يشير إلى ما إذا كان الوحيدات تعزيز الإنتاج يحدث عبر مسار برنامج الرصد العالمي، والمسار الديمقراطي، أو كليهما. ونأمل في الدراسات الجارية، لتحديد علامات السطحية التي تميز بين أعضاء البرلمان وكموبس. وفي الوقت نفسه، يمكن تقييم هذه المتكفل ب تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة7 الارتفاع النسبي لأعضاء البرلمان، وكموبس الشخصية.
كما ستكشف الدراسات تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة يرجح أن التغاير إضافية داخل السلف 6 الكسور الموصوفة في هذا البروتوكول، والتي سوف تعكس نضوج مختلف الدول مثلاً، لتحديد المواقع التي فقدت مؤخرا فقط الوحيدات إمكانية مقارنة لتحديد المواقع التي تستعد للانتقال إلى المرحلة التالية من التفريق. المجموعات الكسر "GMP" قد تحتوي أيضا على المتكفل بإمكانها أن تنتج المحببة الأخرى (الحمضات، الاسسه، وخلايا mast)، ولكن نحن لم التحقيق هذا. كما ذكر في المقدمة، وأيضا حاليا غير واضح عما إذا كان CMP-Flt3+ CD115لو، CMP-Flt3– والكسور حزب الألفية الديمقراطي حقاً تحتوي على موروث أوليجوبوتينت المتوقعة أو بدلاً من ذلك تشكل مزيجاً المتكفل بأكثر قد توفر نسب محدودة المحتملة، ولكن خلية واحدة تسلسل الحمض النووي الريبي التبصر في هذه المسألة الهامة.
نهج جديد الآن مطلوب للتعرف على مجموعات فرعية فروعه النقوي البشرية. ويسمان والزملاء المعرفة مسبقاً مجموعات فرعية النقوي (بما في ذلك "CMPs" و "غمبس") في نخاع العظام البشرية و دم الحبل السري11، لكنها غير متجانسة وبالمثل. ولسوء الحظ، ترجمة الماوس النابضة استراتيجيات لاجداد الإنسان معقد اختلافات ملحوظة في التعبير علامة السطحية بين الإنسان وفروعه الماوس؛ على سبيل المثال، CD34 التعبير محدودة لمجموعات فرعية السلف النقوي في الماوس، ولكن لوحظ على نطاق أوسع على موروث البشرية بما في ذلك الخلايا الجذعية المكونة للدم. دراسات تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة ينبغي، مع ذلك، تسمح أيضا تحديد علامات المرشح لفصل المجموعات البشرية السلف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام أموال من مجلس المحافظين التجدد الطب معهد في مركز سيدرز-سيناء الطبي (إلى [هسغ])، المهن في زمالة علم المناعة من "الرابطة الأمريكية للمناعة" (بأي و [هسغ])، وجائزة الباحث من الجمعية الأمريكية لأمراض الدم (بأي). ونشكر الأساسية التدفق الخلوي في مركز سيدرز-سيناي الطبي للمساعدة في فرز نظام مراقبة الأصول الميدانية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2) | The Jackson Laboratories | Cat#JAX:000664 | |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | Cat#130-090-858 | |
| Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC | BD Biosciences | Cat#553733 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 (FcγR; clone 93) APC-Cy7 | BioLegend | Cat#101327 | |
| Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7 | BioLegend | Cat#108114 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue | BioLegend | Cat#105820 | |
| Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5 | BioLegend | Cat#128012 | |
| Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE | BioLegend | Cat#135506 | |
| Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC | BD Biosciences | Cat#560718 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Thermo Fisher Scientific | Cat#C36950 | |
| AutoMACS Separator | Miltenyi Biotec | N/A | Use the "deplete" program |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | N/A | 5 lasers, 15 colors |
| BD FACS Aria III cell sorter | BD Biosciences | N/A | 5 lasers, 13 colors |
| FlowJo | FlowJo, LLC | https://www.flowjo.com | For further analysis of the .fcs files |
References
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).
- Yáñez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production. Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).
- Auffray, C., et al. CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation. Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 (2006).
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).
- Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).
- Yáñez, A., et al. Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes. Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).
- Olsson, A., et al. Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice. Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).
- Yáñez, A., Goodridge, H. S. Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production. Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
