تحديد وعزل أوليجوبوتينت والنسب التي ارتكبت النقوي موروث من نخاع العظام الماوس
Summary
ونحن لشرح كيفية تحديد وعزل 6 مجموعات فرعية من فروعه النقوي من مورين نخاع العظام باستخدام مزيج من المغناطيسية والأسفار الفرز (أجهزة ماكينتوش ونظام مراقبة الأصول الميدانية). يمكن استخدام هذا البروتوكول في المختبر فحوصات الثقافة (الثقافات methylcellulose أو السائل) و في فيفو المتبنيين نقل التجارب وتحاليل الحمض النووي الريبي/البروتين.
Abstract
يمكن تحديدها في فروعه النقوي التي تسفر عن العَدلات ووحيدات الخلايا الجذعية (DCs) والمعزولة من نخاع العظام من الفئران للتحاليل الدموية والمناعية. على سبيل المثال، دراسات عن الخصائص الخلوية والجزيئية للسكان السلف النقوي يمكن أن تكشف عن الآليات الكامنة وراء التحول ليوكيميك، أو تبين كيفية استجابة النظام المناعي للتعرض للعوامل الممرضة. سبق وصف التدفق الخلوي استراتيجيات لتحديد السلف النقوي مكنت إنجازات هامة في العديد من المجالات، ولكن الكسور وهي تحدد متباينة للغاية. تعريف استراتيجيات النابضة الأكثر استخداماً الكسور نخاع العظام هي إثراء للسكان المطلوب، ولكنها تحتوي أيضا على عدد كبير من فروعه “تلويث”. لدينا الدراسات الأخيرة قد حل جزء كبير من هذا التباين، والبروتوكول ونحن الحاضرين هنا تصاريح عزل الفئات السكانية الفرعية 6 من أوليجوبوتينت والنسب التي ارتكبت النقوي موروث من 2 الموصوفة سابقا الكسور نخاع العظام. ويصف البروتوكول 3 مراحل: 1) عزل نخاع العظم خلايا، 2) إثراء لفروعه المكونة للدم بالفرز المغناطيسي تنشيط الخلية (استنفاد النسب من أجهزة ماكينتوش)، 3) تحديد مجموعات فرعية النقوي السلف بالتدفق الخلوي (بما في ذلك الأسفار تنشيط الخلية الفرز، نظام مراقبة الأصول الميدانية، إذا رغبت في ذلك). هذا النهج يسمح بتقدير السلف والعزلة لمجموعة متنوعة من التطبيقات في المختبر و في فيفو ، وأسفرت بالفعل رواية ثاقبة مسارات وآليات العَدلات والوحيدات، وتمايز DC.
Introduction
وحيدات، العَدلات، والخلايا الجذعية (DCs) هي النقوي الخلايا التي تنشأ من فروعه المكونة للدم في نخاع العظام، أساسا بعملية تسمى ميلوبويسيس. موروث النقوي المشتركة (CMPs) لديها القدرة على إنتاج خلايا النقوي، فضلا عن ميجاكاريوسيتيس والكريات الحمراء، ولكن الخلايا اللمفاوية لا. موروث المحببات الوحيدات (غمبس)، التي هي مستمدة من CMPs، تنتج المحببة ووحيدات، ولكن قد فقدت ميجاكاريوسيتي وكرات الدم الحمراء المحتملة. وحيدات والكلاسيكية وأيضا بلاسماسيتويد DCs (المؤلفان/pDCs) ويعتقد أن تنشأ من فروعه المشتركة المعروفة باسم المتكفل الوحيدات-DC (مدبس)، التي يتم إنتاجها بواسطة CMPs. تدريجيا في نهاية المطاف يؤدي تقييد إمكانات النسب النسب التي ارتكبت فروعه: المتكفل المحببات والوحيدات المتكفل والخلايا الجذعية موروث (الشكل 1).
ويسمان والزملاء أفادت أن CMPs موجودة في لين– ج-كيت+ هيئة الأوراق المالية-1– CD34 (LKS–)+ FcγRلو جزء بسيط من الماوس نخاع العظام، بينما ترد غمبس في CD34 LKS– + FcγR مرحبا جزء1. ومع ذلك، هذه الكسور “كيوتو” و “جي أم بي” متباينة للغاية. على سبيل المثال، كسر “GMP” يحتوي أيضا على موروث النسب التي ارتكبت المحببات والوحيدات موروث1،2. مدبس أفيد كل على حدة بأن CX3CR1+ Flt3+ CD115+ فروعه أيضا تعبر عن CD34 و FcγR3،4. مدبس تثير cDC/الحزب الديمقراطي المسيحي-إنتاج مشترك DC موروث (توضع)، التي أبلغت للتعبير عن مستويات أدنى من ج-كيت (CD117) ولم يتم تضمينها في جزء LKS– 5.
وكان يفترض مسبقاً أن وحيدات تنشأ عن طريق مسار واحد (CMP-GMP-الديمقراطي-الوحيدات). يتفق مع هذا موروث النموذج، وارتكبت الوحيدات التي تنتجها غمبس (المسمى المتكفل الوحيدات، أعضاء البرلمان)2 ومدبس (المسمى شيوعاً الوحيدات موروث، كموبس)6 يبدو أن نفس الخلايا على أساس التعبير علامة السطحية المشتركة . ومع ذلك، نحن مؤخرا أظهرت أن وحيدات تصدر بشكل مستقل عن غمبس ومدبس، وكانت قادرة على التمييز بين أعضاء البرلمان، وكموبس ب تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة7.
مؤخرا قمنا بتعديل استراتيجية “GMP” النابضة ويسمان “كيوتو” لتحديد اﻷفخاذ 6 C57BL/6J الماوس نخاع العظام التي تحتوي على أوليجوبوتينت مختلفة ومجموعات فرعية السلف النقوي النسب التي ارتكبت. نحن ذكرت أولاً أن تلطيخ ل Ly6C و CD115 يسمح بعزل غمبس أوليجوبوتينت، فضلا عن فروعه المحببات (GPs) وفروعه الوحيدات (MPs وكموبس، ونحن حاليا غير قادر على فصل) من “جي أم بي” جزء2 (LKS – CD34+ FcγRمرحبا البوابة؛ الشكل 1). أظهرنا في وقت لاحق أن مدبس هي في الأغلب في جزء “كيوتو” (CD34 LKS– + FcγRلو البوابة)، الذي يحتوي أيضا على Flt3+ CD115لو و Flt3– المجموعات الفرعية7 (الرقم 1 ). + CD115لو كسر CMP-Flt3 غلة غمبس ومدبس عند نقل التبني. مجموعة فرعية CMP-Flt3– يحتوي على فروعه التي تظهر أن تكون وسيطة بين غمبس ولو خلايا CMP-Flt3+ CD115. على عكس مدبس، تمتلك CMP-Flt3+ CD115لو والكسور CMP-Flt3– أيضا ميجاكاريوسيتي وكرات الدم الحمراء المحتملة.
من المهم أن نلاحظ، مع ذلك، أنه من غير الواضح حاليا ما إذا كان يتضمن كسور “كيوتو” فروعه التي هي حقاً أوليجوبوتينت (مثل الخلايا الفردية داخل CMP-Flt3+ CD115لو كسر التي تمتلك العَدلات، الوحيدات، العاصمة، ميجاكاريوسيتي، وكرات الدم الحمراء المحتملة)، أو بدلاً من ذلك، تضم خليطا فروعه مع إمكانات النسب أكثر تقييداً. وكشفت مستعمرة تشكيل فحوصات (الثقافات methylcellulose) الخلايا مع المحببات (العَدلات) وكرات الدم الحمراء والوحيدات و megakaryocyte المحتملة (جيم الخلايا) في “كيوتو”، CMP-Flt3+ CD115لو والكسور CMP-Flt3– 1 ،7، ولكن لا تسمح بتقييم إمكانات DC. وفي المقابل، مستعمرة تشكيل فحوصات أثبتت وجود أوليجوبوتينت غمبس (فروعه مع العَدلات والوحيدات المحتملة) في جزء “GMP”1،2، وهذا معتمد من قبل الأخيرة وحيدة الخلية تحليل ترانسكريبتوميك8. لا حاليا المعروف، ومع ذلك، ما إذا كانت هذه غمبس أوليجوبوتينت أيضا إنتاج المحببة الأخرى (الحمضات، الاسسه، وخلايا mast).
استناداً إلى هذه الدراسات، تبين لنا الآن كيف السطح 7 علامات (ج-كيت، هيئة الأوراق المالية-1، CD34، FcγR، Flt3، Ly6C و CD115) يمكن استخدامها لتحديد وعزل هذه المجموعات الفرعية 6 أوليجوبوتينت وفروعه النقوي النسب التي ارتكبت. يمكن تطبيق البروتوكول الموصوفة هنا في المختبر فحوصات الثقافة (الثقافات methylcellulose أو السائل)، في فيفو تجارب نقل التبني في الفئران، والتحليل الجزيئي (تسلسل الحمض النووي الريبي السائبة وخلية واحدة، النشاف الغربية، إلخ).
البروتوكول ويتكون من 3 مراحل: 1) إعداد تعليق خلية مفردة لنخاع العظم خلايا، 2) إثراء ل 3) تحديد، فروعه المكونة للدم (الفرز المغناطيسي تنشيط الخلية)، وعزله إذا رغبت، من مجموعات فرعية السلف بالتدفق الخلوي (باستخدام محلل أو من أرز، حسب الاقتضاء). الخطوة الأولى هو عزل خلايا نخاع العظام من قصبة وتيبياس من الفئران euthanized ومشابه للأخرى بروتوكولات تم وصفه مسبقاً9. بعد ذلك، أثري العينة للخلايا الجذعية والسلف باستخدام خليط من الأجسام المضادة ضد علامات خلية سطح الكريات الحمراء، العَدلات، وحيدات، الخلايا الليمفاوية، إلخ، إلى استنزاف الخلايا المتمايزة. وهذا ليس إلزامياً، ولكن الموصى به بشدة لتحسين الكشف عن المجموعات السلف، وتقليل كمية الأجسام المضادة اللازمة لتحديد السلف والوقت المطلوب للتدفق الخلوي. بروتوكول نضوب النسب أدناه توضح استخدام الماوس النسب خلية استنفاد عدة فرز الخلايا ماجنيتيكاكتيفاتيد (ماك) (الذي يحتوي على أضداد بيوتينيلاتيد CD5، CD45R (B220)، CD11b وغرام-1 (Ly6G/C)، 7-4، ومكررا ثانيا-119، بالإضافة إلى مكافحة البيوتين ميكروبيدس) وفاصل مغناطيسي الآلي. والخطوة الأخيرة هي تحديد (والفرز، وإذا رغبت في ذلك) من المجموعات السلف بالتدفق الخلوي. الفريق الضد المبينة أدناه (انظر أيضا الجدول 1) قد صممت لاستخدامها في تدفق سيتوميتير (محلل أو أرز) مع الليزر 4 (405 نانومتر، 488 نانومتر، 561 نانومتر، 640 nm).
رقم 1: المتكفل العَدلات والوحيدات والعاصمة ومسارات التمايز. ويوضح النموذج المنقح مؤخرا من ميلوبويسيس7 ، مع بوابات وايزمن عن “CMPs” (أزرق) و “غمبس” (أخضر)1 مضافين. لقد تم تعديل هذا الرقم من يانيز et al. عام 20177. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد يسمان النابضة استراتيجية ل تحديد السلف النقوي الماوس1 المعيار الذهبي للمناعة وهيماتولوجيستس لما يقرب من 20 عاماً، ولكن من الواضح الآن أن البوابات “كيوتو” و “جي أم بي” متباينة للغاية وأكثر دقة هناك حاجة إلى استراتيجيات النابضة. يسمح البروتوكول التي وصفناها هنا تحديد أوليجوب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام أموال من مجلس المحافظين التجدد الطب معهد في مركز سيدرز-سيناء الطبي (إلى [هسغ])، المهن في زمالة علم المناعة من “الرابطة الأمريكية للمناعة” (بأي و [هسغ])، وجائزة الباحث من الجمعية الأمريكية لأمراض الدم (بأي). ونشكر الأساسية التدفق الخلوي في مركز سيدرز-سيناي الطبي للمساعدة في فرز نظام مراقبة الأصول الميدانية.
Materials
| Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2) | The Jackson Laboratories | Cat#JAX:000664 | |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | Cat#130-090-858 | |
| Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC | BD Biosciences | Cat#553733 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 (FcγR; clone 93) APC-Cy7 | BioLegend | Cat#101327 | |
| Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7 | BioLegend | Cat#108114 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue | BioLegend | Cat#105820 | |
| Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5 | BioLegend | Cat#128012 | |
| Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE | BioLegend | Cat#135506 | |
| Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC | BD Biosciences | Cat#560718 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Thermo Fisher Scientific | Cat#C36950 | |
| AutoMACS Separator | Miltenyi Biotec | N/A | Use the "deplete" program |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | N/A | 5 lasers, 15 colors |
| BD FACS Aria III cell sorter | BD Biosciences | N/A | 5 lasers, 13 colors |
| FlowJo | FlowJo, LLC | https://www.flowjo.com | For further analysis of the .fcs files |
References
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).
- Yáñez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production. Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).
- Auffray, C., et al. CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation. Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 (2006).
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).
- Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).
- Yáñez, A., et al. Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes. Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).
- Olsson, A., et al. Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice. Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).
- Yáñez, A., Goodridge, H. S. Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production. Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
