Summary
Vi viser hvordan å identifisere og isolere 6 delsett av myelogen progenitors fra murine benmarg bruker en kombinasjon av magnetiske og fluorescens sortering (Mac og FACS). Denne protokollen kan brukes i vitro kultur analyser (methylcellulose eller væske kulturer), i vivo adoptivforeldre overføring eksperimenter og RNA/protein analyser.
Abstract
Myeloid progenitors som gir nøytrofile og monocytter dendrittiske celler (DCs) kan identifiseres i og isolert fra benmargen av mus for Hematologisk og immunologiske analyser. For eksempel kan studier av mobilnettet og molekylære egenskapene myeloid progenitor befolkninger avsløre mekanismene bak leukemic transformasjon, eller vise hvordan immunsystem reagerer på patogen eksponering. Tidligere beskrevet flyt cytometri strategier for myeloid progenitor identifikasjon har aktivert betydelige fremskritt på mange felt, men fraksjoner de identifiserer er svært uensartet. De vanligste gating strategiene definere benmarg brøker som er beriket for ønsket befolkningen, men også inneholde store mengder "forurensende" progenitors. Våre studier har løst mye av denne heterogenitet, og protokollen vi presenterer her tillater isolering av 6 subpopulasjoner av oligopotent og avstamning forpliktet myelogen progenitors 2 beskrevet tidligere benmarg fraksjoner. Protokollen beskriver 3 faser: 1) isolering av bein margtransplantasjon celler, 2) berikelse for blodkreft progenitors av magnetiske-aktivert celle sortering (avstamning uttømming av Mac) og 3) identifikasjon av myeloid progenitor delsett av flowcytometri (inkludert fluorescens-aktivert celle sortering, FACS, om ønskelig). Denne tilnærmingen tillater stamfar kvantifisering og isolasjon for en rekke i vitro og i vivo , og har allerede gitt romanen innsikt stier og mekanismer av nøytrofile, monocyte og DC differensiering.
Introduction
Monocytter og nøytrofile dendrittiske celler (DCs) er myeloide celler som oppstår fra blodkreft progenitors, hovedsakelig i benmargen, ved en prosess kalt myelopoiesis. Vanlige myelogen progenitors (CMPs) har muligheten å tilvirke myeloide celler, samt megakaryocytes og erytrocytter, men ikke lymfoide celler. Granulocytt-monocytt progenitors (GMPs), som er avledet fra CMPs, produserer granulocytter og monocytter, men har mistet megakaryocyte og røde blodlegemer potensielle. Monocytter og klassisk og presenterer antigener DCs (cDCs/PDC) er også tenkt å oppstå fra vanlige progenitors kalles monocytt-DC progenitors (MDPs), som er produsert av CMPs. gradvis begrensning avstamning potensial til slutt resulterer i avstamning forpliktet progenitors: granulocytt progenitors og monocytt progenitors dendrittiske celle progenitors (figur 1).
Weissman og kolleger rapporterte at CMPs er funnet i Lin- c-Kit+ Sca-1- (LKS-) CD34+ FcγRlo brøkdel av musen benmargen, mens GMPs finnes i LKS- -CD34+ FcγR Hei del1. Men er disse "CMP" og "GMP" fraksjoner svært uensartet. For eksempel inneholder "GMP" delen også avstamning forpliktet granulocytt progenitors og monocytt progenitors1,2. MDPs separat rapportert å være CX3CR1+ Flt3+ CD115+ progenitors som uttrykker også CD34 og FcγR3,4. MDPs gi opphav til cDC/pDC-produserende felles DC progenitors (CDPs), som har blitt rapportert å uttrykke lavere nivåer av c-Kit (CD117) og er ikke inkludert i LKS- brøkdel5.
Det var tidligere antatt at monocytter oppstå via en enkelt sti (CMP-GMP-MDP-monocytt). Samsvar med denne modell, monocyte forpliktet progenitors produsert av GMPs (heter monocyte progenitors, MPs)2 og MDPs (kalt felles monocytt progenitors, cMoPs)6 synes å være de samme cellene på grunnlag av delte overflaten markør uttrykk . Men vi nylig vist at monocytter produseres uavhengig av GMPs og MDPs, og kunne skille mellom MPs og cMoPs av encellede RNA sekvensering7.
Vi har nylig endret Weissman "CMP" og "GMP" gating strategi for å identifisere 6 subfractions av C57BL/6J musen benmarg som inneholder forskjellige oligopotent og avstamning forpliktet myeloid progenitor delsett. Vi først rapportert at flekker for Ly6C og CD115 tillater isolering av oligopotent GMPs, samt granulocytt progenitors (GPs) og monocytt progenitors (MPs og cMoPs, som vi ikke skille) fra "GMP" del2 (LKS - CD34+ FcγRHei gate; Figur 1). Vi senere viste at MDPs er hovedsakelig funnet i "CMP" fraksjonen (LKS- CD34+ FcγRlo gate), som også inneholder Flt3+ CD115lo og Flt3- delsett7 (figur 1 ). CMP-Flt3+ CD115lo brøkdel gir både GMPs og MDPs ved adopsjon overføring. CMP-Flt3- delsettet inneholder progenitors som synes å være mellomprodukter mellom CMP-Flt3+ CD115lo celler og GMPs. I motsetning til MDPs har både CMP-Flt3+ CD115lo og CMP-Flt3- brøker megakaryocyte og røde blodlegemer potensielle.
Det er viktig å merke seg at det er foreløpig uklart om "CMP" fraksjoner inneholder progenitors som virkelig oligopotent (f.eks enkeltceller i CMP-Flt3+ CD115lo brøkdel har nøytrofile, monocytt, DC, megakaryocyte og røde blodlegemer potensielle), eller eventuelt består av en blanding av progenitors med mer begrenset avstamning potensial. Kolonien danner analyser (methylcellulose kulturer) avslørte celler med granulocytt (nøytrofile), røde blodlegemer, monocyte og megakaryocyte potensielle (GEMM celler) i "CMP", CMP-Flt3+ CD115lo og CMP-Flt3- fraksjoner1 ,7, men tillater ikke vurdering av DC potensial. Derimot kolonien danner analyser viste eksistensen av oligopotent GMPs (progenitors med både nøytrofile og monocytt potensielle) i "GMP" brøkdel1,2, og dette er støttet av siste encellede transcriptomic analyse8. Det kjent ikke er, men om disse oligopotent GMPs produserer også andre granulocytter (eosinofile, basofile og mastceller).
Basert på disse studiene har vi nå viser kan hvordan 7 overflate markører (c-utstyr, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C og CD115) brukes til å identifisere og isolere disse 6 delsett av oligopotent og avstamning forpliktet myelogen progenitors. Protokollen beskrevet her kan brukes for i vitro kultur analyser (methylcellulose eller flytende kulturer), i vivo adoptivforeldre overføring eksperimenter i mus og molekylære analyse (bulk og encellede RNA sekvensering, vestlige blotting, etc.).
Protokollen består av 3 faser: 1) utarbeidelse av en enkelt celle suspensjon av bein margtransplantasjon celler, 2) berikelse blodkreft progenitors (magnetisk-aktivert celle sortering), og 3) identifisering og isolering eventuelt av stamfar undergrupper av flyt cytometri (med en analyserer eller sortering, avhengig). Det første trinnet er isolering av bein margtransplantasjon celler fra femurs og tibias av euthanized mus og ligner andre beskrevet tidligere protokoller9. Deretter er prøven beriket for stammen og stamfar celler ved hjelp av en cocktail av antistoffer mot celle overflate markører erytrocytter, nøytrofile, monocytter, lymfocytter, etc., til deplete differensierte celler. Dette er ikke obligatorisk, men anbefales sterkt å optimalisere oppdagelsen stamfar delsettene og redusere mengden av antistoffer nødvendig for stamfar identifikasjon og tiden som kreves for flowcytometri. Avstamning uttømming protokollen nedenfor beskriver Magnetic-Activated celle sortering (Mac) bruker en mus avstamning celle uttømming Kit (som inneholder biotinylated antistoffer mot CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4 og Ter-119, pluss anti-biotin microbeads) og en automatisert magnetiske skilletegnet. Det siste trinnet er identifikasjonen (og sortering, hvis ønskelig) stamfar delsettene av flowcytometri. Antistoff panelet beskrevet nedenfor (se tabell 1) er utformet for å brukes i en flyt cytometer (analyzer eller sorter) med 4 lasere (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).
Figur 1: nøytrofile, monocyte og DC progenitors og differensiering trasé. Nylig revidert modell av myelopoiesis7 er illustrert med Weissman portene for "CMPs" (blå) og "GMPs" (grønn)1 kledde. Dette tallet er endret fra Yanez et al. 20177. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Cedars-Sinai Medical Center.
1. isolering av musen benmargen og utarbeidelse av en enkelt celle suspensjon
- Euthanize musen institusjonelle retningslinjer.
- Plasser euthanized musen på ryggen og spray den med 70% etanol (EtOH). Gjør en liten (3-5 mm) innsnitt i hver baklem på ankelen nivå med skarp, spisse saks, og trekke huden opp mot kroppen å fjerne det fra beina og utsette muskler og bein.
- Fjern musklene (quadriceps, hamstrings, etc.) fra bein av trimming dem med saks, etter retning av benet. Pass på at du ikke skade bein.
- Dislocate femurs fra hoften skjøt og utstanset bindevev og muskler til å løsne beina, være forsiktig med å kutte i bein.
- Fjerne føttene ved dislocating anklene fra tibias, sette beina i en tube sterilt PBS eller media og transportere dem på is til vev kultur rommet.
Merk: For noen andre programmer (f.eks som makrofager fra total bein margtransplantasjon celler) er det mulig å forlate bein på is for en stund, men for stamfar isolasjon er det viktig å fortsette så raskt som mulig for å unngå downregulation av viktig overflate markører (spesielt CD115). - I en biosafety skap, fjerne eventuelle gjenværende bløtvev fra beina ved å gni seg med papir.
Merk: Protokollen skal utføres i en biosafety CAB hvis et sterilt utvalg for celle kultur eller i vivo analyser etter FACS sortering. Hvis sterilt celler ikke er nødvendig, utføres hele prosessen på lab-benken. - Kort fordype bein i 70% EtOH å desinfisere dem, og deretter i sterilt PBS å vaske dem.
- Skille femurs fra tibias og fibulas ved å skjære gjennom kneet, og kast fibulas.
- Skjær endene av bein med skarp saks.
- Høste benmarg med kaldt sterilt PBS slik til bein vises:
- Grep hvert bein med tang, og sett en 26G nål koblet til 10 mL sprøyte som inneholder kald sterilt PBS i aksel bein i den ene enden.
- Hold benet over en 50 mL sentrifuge rør og tømme 2-5 mL PBS igjennom benet å høste margen.
- Høste margen fra alle 4 bein per mus (2 femurs og 2 tibias).
- Pipetter forsiktig opp og ned med en 1 mL pipette å disaggregate benmargen for å danne en celle suspensjon.
- Filtrere benmarg suspensjon gjennom et stykke 30 μm nylon maske å eliminere bein stykker og celle aggregater, og dermed generere en enkeltcelle suspensjon.
- Sentrifuger enkeltcelle suspensjon 280 x g for 5 min og resuspend celle pellet sterilt flekker buffer (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA), bruker 5 mL flekker buffer per mus (f.eks 10 mL for celler samlet fra femurs og tibias av 2 mus).
- Ta en 10 μL aliquot av prøven, bland det med 10 μL Trypan blå og Last 10 μL resulterende Trypan blå-merket prøven på en hemocytometer. Telle celler ved hjelp av lys mikroskop.
Merk: Hvis cellene for konsentrert for pålitelig opptelling, fortynne prøven før du legger Trypan blå.
2. stamfar berikelse magnetisk-aktivert celle sortering (Mac)
- Sentrifuge hele enkeltcelle suspensjon (eller så mange celler som er nødvendig for å få ønsket avkastning) på 280 x g i 5 min på 4° C og resuspend celle pellet i 40 μL flekker buffer (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA) per 107 celler.
Merk: Det er også mulig å bruke Mac buffer fra avstamning uttømming kit produsent (se Tabell for materiale) som et alternativ til farging bufferen. - Utføre avstamning uttømming i henhold til instruksjonene levert med avstamning uttømming kit. Følgende fremgangsmåte gjelder for kit sett i Tabellen for materiale. Hvis en annen kit, følger produsentens instruksjoner og går videre til trinn 2.3.
- Legge til 10 μL biotin-antistoff cocktail per 107 celler, blande av pipettering og ruge i 10 min på 4 ° C.
- Tilsett 30 μL flekker buffer/Mac buffer per 107 celler og bland.
- Legge til 20 μL anti-biotin microbeads per 107 celler. Bland godt og ruge for en ekstra 15 minutter på 4 ° C.
Merk: Vortex microbeads før du legger dem til cellene å sørge for at de er helt spredt. - Legg 1 mL flekker buffer/Mac buffer per 107 celler, sentrifuge cellene på 280 x g for 5 min og resuspend celle pellet i 500 μL flekker buffer/Mac buffer for opptil 108 celler. For mer enn 108 celler, skalere opp mengden fargingen buffer/Mac buffer tilsvarende.
- Forberede automatisert magnetiske skilletegnet i henhold til produsentens instruksjoner.
- Sett røret som inneholder de merkede cellene inn skilletegnet og Velg programmet negative utvalg.
- Samle den negative brøken, som inneholder stamfar-beriket avstamning-negativ (Lin-) cellene. Kast den positive brøken, som inneholder magnetisk-merket avstamning-positive cellene.
- Sentrifuge Lin- celler 280 x g i 5 min, og resuspend celle pellet i 2 mL flekker buffer/Mac buffer per mus (f.eks 4 mL hvis benmarg var samlet fra 2 mus).
Merk: Pellet skal nå være hvit istedet for rød fordi erytrocyttene er oppbrukt. - Ta en 10 μL aliquot Lin- cellene, bland det med 10 μL Trypan blå og Last 10 μL resulterende Trypan blå-merket prøven på en hemocytometer. Telle celler ved hjelp av lys mikroskop.
Merk: Hvis cellene for konsentrert for pålitelig opptelling, fortynne prøven før du legger Trypan blå.
3. myeloid Progenitor identifisering og isolering av fluorescens-aktivert celle sortering (FACS)
- Etikett 9 microcentrifuge (1.5 eller 2 mL) rør for: 1) unstained kvinne celler, 2-8) celler enkelt med fluorophore-konjugerte antistoffer mot FcγR (CD16/32), c-Kit, Sca-1, CD34, Flt3 (CD135), Ly6C og CD115 for spenning utvalg og farge kompensasjon og 9) eksempel celler å være farget med alle 7 antistoffer for stamfar identifikasjon og sortering.
- Distribuere 100.000 celler til hver av kontroll rør (rør 1-8), og alle gjenværende cellene (eller færre hvis ønskelig) å prøve tunnelbanen (tube 9).
Merk: Hvis prøven volumet er større enn 1,5-2 mL, kan det være nødvendig å distribuere eksempel cellene i en 15 mL tube, sentrifuge dem og resuspend pellets (trinn 3.3 nedenfor), og deretter overføre cellene til et microcentrifuge rør for påfølgende flekker trinnene. - Sentrifuge cellene på 1500 x g i 5 min og resuspend kontroll tube pellets i 100 μL flekker buffer (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA) og prøve tube pellet i 100 μL flekker buffer per 5 x 106 celler (f.eks 200 μL for 1 x 107 celler).
- Legge til 2 μg/mL anti-CD16/CD32-APC-Cy7 FcγR enkelt flekken røret og prøve røret. Vortex forsiktig å blande og ruge i 10 min på 4 ° C.
Merk: Det er viktig å flekken eksempel cellene med FcγR (CD16/32) antistoffer før du legger andre antistoffer for å hindre konkurranse på grunn av ikke-spesifikk Fc-mediert antistoff bindende. Ikke ruge cellene med en FcγR som blokkerer reagens. - Legge til andre antistoffer tilsvarende enkelt flekken rør (1 antistoff hver) og prøve røret (alle 6 antistoffer): 10 μg/mL c-Kit-Pacific Blue, 2 μg/mL Sca-1-PE-Cy7, 25 μg/mL CD34-FITC, 10 μg/mL Flt3-APC, 2 μg/mL Ly6C-PerCP-Cy5.5 og 4 μg/mL CD115-PE. Vortex forsiktig, og Inkuber i 15 min på 4 ° C.
- Legge til 900 μL flekker buffer til kontroll rør, og 1 mL flekker buffer per 107 celler til eksempel røret. Sentrifuge cellene på 1500 x g i 5 min og resuspend celle pellet i flekker buffer: 200 μL per kontroll rør og 500 μL per 25 x 106 celler i utvalget røret. Overføre resuspended cellene til 5 mL FACS rør.
Merk: Hvis prøven volumet er større enn 1,5-2 mL, kan det være nødvendig å overføre cellene til en 15 mL tube for sentrifugering. - Forberede flyt cytometer (analyzer eller sorter) i henhold til produsentens instruksjoner.
- Kjøre unstained kvinne og én farget kontroll cellene til flyt cytometer sette opp spenninger og farge kompensasjoner.
- Kjøre utvalg cellene, gate stamfar delsettene som skissert nedenfor og oppsummeres i figur 2og eventuelt utføre FACS sortering for å isolere de relevante stamfar delsettene.
Merk: Det er vanligvis nødvendig å skaffe seg ca 200.000 celler for å få minst 1000 hendelser i hver stamfar gate.- Opprette en prikk-handlingen i alle celler, FSC-A (x-aksen) og SSC-A (y-aksen), og gate for å utelate rusk og døde celler = > "live" celler.
- Opprette en prikk tomt "live" celler, FSC-H (x-aksen) og FSC-W (y-aksen), og gate for å utelukke doublets = > live/singlet (FSC) gate.
- Opprette en prikk tomt live/singlet (FSC) celler, SSC-H (x-aksen) og SSC-W (y-aksen), og gate for å utelukke doublets = > live/singlet (FSC) / singlet (SSC) gate.
- Opprette en prikk tomt live/singlet (FSC) / singlet (SSC) celler, Sca-1 (x-aksen) og c-Kit (y-aksen), og gate merke c-Kit+ Sca-1- celler = > LKS- celler.
- Opprette en prikk tomt LKS- celler, vise CD34 (x-aksen) og FcγR (y-aksen) og porten for å velge CD34+ FcγRlo celler = > "CMPs", og CD34+ FcγRHei celler = > "GMPs".
Merk: Det er viktig å gate "CMPs" og "GMPs" som nøyaktig som mulig. Det er nyttig å bruke en pseudofarger, det vil tetthet tomt eller en kontur tomt for nøyaktig gating. - Opprette en prikk tomt "CMPs", vise CD115 (x-aksen) og Flt3 (y-aksen), og gate å velge:
Flt3+ CD115lo celler = > CMP-Flt3+ CD115lo celler,
Flt3- CD115lo celler = > CMP-Flt3- celler,
Flt3+ CD115Hei celler = > MDPs. - Opprette en prikk tomt "GMPs", vise Ly6C (x-aksen) og FcγR (y-aksen) og porten for å velge Ly6C-celler = > "GMP-Ly6C- celler", og Ly6C+ celler = > "GMP-Ly6C+ celler".
- Opprette en prikk tomt "GMP-Ly6C- celler", vise CD115 (x-aksen) og Flt3 (y-aksen), og gate å velge:
Flt3- CD115lo celler = > GMPs. - Opprette en prikk tomt "GMP-Ly6C+ celler", vise CD115 (x-aksen) og Flt3 (y-aksen), og gate å velge:
Flt3- CD115lo celler = > GPs,
Flt3- CD115Hei celler = > MPs + cMoPs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av protokollen som er beskrevet ovenfor, er det mulig å få ~ 100 millioner celler (inkludert røde blodlegemer, eller ~ 50 millioner kjerne celler) fra både femurs og tibias (2 ben) en C57BL/6J mus (6-8 uker gamle, mann eller kvinne). 1-2 millioner Lin- celler kan isoleres per musen av Mac uttømming av Lin+ celler.
Hver 6 myeloid progenitor delsettene utgjør ~ 1-4% av Lin- celler. Avstamning uttømming er effektiv i å tappe differensierte celler og berikende progenitors, men brøken Lin- inneholder en stor andel av c-Kit- celler i tillegg til c-Kit+ progenitors (figur 3A). Stamfar gir etter FACS sortering kan variere avhengig av sorterer innstillingene brukes (f.eks maksimal avkastning versus optimal renhet), men generelt er det mulig å få 10,000-40,000 celler per brøkdel (figur 3B). Etter sortering flyt cytometri analyse skal avsløre > 95% renhet av hver fraksjon (Figur 3 c).
Figur 2: Gating strategi for identifikasjon av 6 myeloid progenitor fraksjoner. (A) Progressive gating Lin- -celleområde live -> singleter (FSC) -> singleter (SSC) -> LKS- celler -> CD34+ FcγRlo ("CMP") og CD34+ FcγRHei ("GMP") fraksjoner -> 6 myelogen stamfar delsett. (B) Sammendrag av overflaten markør uttrykk av 6 stamfar fraksjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representant stamfar avkastning og renhet. (A) representant flowcytometri tomter viser c-Kit og CD11b uttrykk av bein margtransplantasjon celler før og etter avstamning utarming, demonstrere anriking av progenitors (c-Kit+ celler). (B) gir cellen for hver stamfar brøk, som betyr + standardavvik 30 eksperimenter. Bone margtransplantasjon celler fra opptil 20 mus var samlet for hvert eksperiment. (C) representant flowcytometri tomter fra etter slag analyse, demonstrere renheten av FACS-sortert stamfar fraksjoner. Panelet C er endret fra Yanez et al. 20177. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Laser | Kanal | Filter | Speil |
| 405 nm | A. | 670/30 | 635LP |
| B. | 525/50 | 505LP | |
| C. c-Kit-Pacific Blue | 450/50 | ||
| 488 nm | A. (FSC) | ||
| B. Ly6C-PerCP-Cy5.5 | 710/50 | 690LP | |
| C. CD34-FITC | 525/50 | 505LP | |
| D. SSC | 488/10 | ||
| 561 nm | A. Sca-1-PE-Cy7 | 780/40 | 750LP |
| B. | 710/50 | 690LP | |
| C. | 660/20 | 640LP | |
| D. | 610/20 | 600LP | |
| E. CD115-PE | 582/15 | ||
| 640 nm | A. FcϒR-APC-Cy7 | 780/60 | 750LP |
| B. | 730/45 | 690LP | |
| C. Flt3-APC | 670/30 |
Tabell 1: Antistoff panelet og flyt cytometer konfigurasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Weissman gating strategi for musen myeloid progenitor identifikasjon1 har vært gullstandarden for immunologists og hematologists i nesten 20 år, men det er nå klart at "CMP" og "GMP" portene er svært heterogen og mer presis gating strategier er nødvendig. Protokollen som vi har beskrevet her tillater identifisering av oligopotent og avstamning forpliktet delsett i C57BL/6J mus for mer presise kvantifisering av bestemte myelogen progenitors og kartlegging av myelopoiesis, samt undersøkelse av molekylære mekanismer som opererer på bestemte stadier av myelogen differensiering. Stamfar delsettene kan sorteres, hvis ønskelig, for molekylær analyser, i vitro og vivo vurdering av differensiering osv.
Protokollen ble utviklet ved hjelp av unge (6-8 uker gamle) C57BL/6J mus og er egnet for både mannlige og kvinnelige mus. Vi har ikke preget stamfar delsettene i eldre mus. Vi regner ikke med markører endres med alderen, men de relative proporsjonene delsettene kan variere. Vi har ikke vurdert stamfar delsettene i andre musen stammer.
Den første anvendelsen av vår endret gating strategi var å gi mekanistisk innsikt i regulering av myelogen celle skjebne valg av transkripsjon faktor interferon regulatoriske faktoren 8 (IRF8)2. IRF8 tidligere rapportert uttrykkes av GMPs (Weissman "GMP" brøkdel) og nødvendig for monocytt differensiering av fremme monocytt genuttrykk undertrykke nøytrofile genuttrykk og fremme nøytrofile apoptose10. Bruker vår endret gating strategi, viste vi at IRF8 ikke er uttrykt ved oligopotent GMPs, men er uttrykt ved både GPs og MPs + cMoPs2. Videre har vi vist at IRF8 regulerer GP og MP + cMoP overlevelse og differensiering, snarere enn produksjon av de slektslinje forpliktet progenitors av oligopotent GMPs. Tilsvarende vi nylig brukt vår endret gating strategi for å definere modell av myelopoiesis, og vist at GMPs og MDPs produsere funksjonelt forskjellige inflammatorisk monocytter via 2 uavhengige trasé7.
Avstamning uttømming trinnet kan utføres med manuell magnetiske skilletegn i stedet for en automatisert magnetiske skilletegn og avstamning uttømming kan også oppnås ved flowcytometri hjelp biotinylated lineage markør antistoff cocktail og en fluorophore-konjugerte anti-biotin antistoff, med gating for å velge unstained kvinne cellene. Avstamning uttømming ekskluderer mest differensierte celler og beriker for c-Kit+ progenitors å redusere tid og kostnader forbundet med de påfølgende trinnene (dvs. reduserer antistoff volumer for flowcytometri, analyserer/sorter tid, etc.). Etterforskerne bør se i produsentens dataarket for å avgjøre om avstamning uttømming trinn jobbet så effektivt som forventet for bestemte kit brukes. Men det spiller ingen rolle om avstamning uttømming ikke er 100% effektiv fordi differensiert (Lin+) celler ikke uttrykke c-Kit, så alle differensierte celler igjen etter avstamning nedbryting (samt andre c-Kit- -celler) er senere utelukket av flyt cytometri gating. Det er også viktig å merke seg at GPs og MPs express Ly6C men i motsetning til Ly6C uttrykt av monocytter, stamfar Ly6C (antagelig en annen isoformen) ikke oppdages av Gr-1 antistoffer ofte inkludert i avstamning uttømming kits, og dermed GPs og MPs fortsatt etter Lineage uttømming2.
God flekker er viktig for alle overflate markører, men særlig viktig for FcγR å tillate nøyaktige gating av FcγRlo "CMPs" og den FcγRHei "GMPs". Optimale fluorophore valg og antistoff fortynning er avgjørende for god separasjon, og en FcγR blokkering reagens (vanligvis brukt før farging for flowcytometri) må ikke brukes. Det er også viktig å merke seg at CD115 er downregulated når cellene vedlikeholdes på 4° C eller på isen i lengre perioder, så det er viktig å arbeide raskt for å få god flekker. Vi anbefaler behandling cellene innen 1-2 timer å bevare sin integritet. Hvis det ikke kreves lever celler, kan farget celler fast og kjøpt innen 48 timer.
Hvis de isolerte fraksjonene inneholder betydelig antall døde celler, er det mulig å inkludere en levedyktighet fargestoff (f.eks propidium iodide) å mer nøyaktig gate lever celler, selv om dette ville sikkert nødvendiggjøre en endring i kombinasjonen av fluorochrome-konjugerte antistoffer. Eventuelt kan celletall beregnes ved å legge telling perler på en kjent konsentrasjon til utvalget for flowcytometri. Telling perler er fluorescerende latex perler som kan skilles fra cellene ved FSC-A og SSC-A eller høy fluorescens intensitet. Celle tall kan beregnes ved hjelp av følgende formel:
(mange celle hendelser / antall perle hendelser) x (antall perler lagt utvalg / volum på prøve i μL) = konsentrasjon av prøven som celler/μL
En begrensning av gjeldende protokollen er at den ikke tillater separate identifikasjon av MPs og cMoPs, noe som kompliserer evaluering av disse progenitors, undersøkelse av deres genuttrykk og funksjonelle egenskaper, etc. For eksempel en observert økning i MP + cMoP tall indikerer ikke om forbedret monocytt produksjon skjer via GMP veien, MDP veien eller begge. I pågående studier håper vi å identifisere overflate markører som skiller mellom MPs og cMoPs. I mellomtiden, kan evaluering av disse progenitors av encellede RNA sekvensering7 brukes å profilere de relative proporsjonene i MPs og cMoPs.
Encellede RNA sekvensering studier vil trolig også avsløre flere heterogene i 6 stamfar fraksjoner beskrevet i denne protokollen, noe som gjenspeiler ulike modning sier f.eks GPs som bare nylig har mistet monocytt potensialet versus GPs som er klar til å fortsette til neste trinn i differensiering. "GMP" brøkdel delsettene kan også inneholde progenitors til å produsere andre granulocytter (eosinofile, basofile og mastceller), men vi har ikke undersøkt dette. Som nevnt i innledningen, er det også foreløpig uklart om CMP-Flt3+ CD115lo, CMP-Flt3- og MDP fraksjoner virkelig inneholde den anslåtte oligopotent forfedre eller alternativt består av en blanding av progenitors med mer begrenset avstamning potensial, men encellede RNA sekvensering kan gi innsikt i dette viktige spørsmålet.
En ny tilnærming er nå kreves for identifikasjon av delsett av menneskelig myelogen progenitors. Weissman og kolleger tidligere definert myelogen delsett (inkludert "CMPs" og "GMPs") i human benmarg og ledningen blod11, men de tilsvarende heterogene. Dessverre, oversettelse av musen gating strategier for å menneskelig progenitors kompliseres av betydelige forskjeller i overflaten markør uttrykk mellom menneske og mus progenitors; f.eks CD34 uttrykk er begrenset til myeloid progenitor delsett i musen, men mer generelt observert på menneskelig progenitors inkludert blodkreft stamceller. Encellede RNA sekvensering studier bør imidlertid også tillater identifikasjon av kandidaten markører skille menneskelig stamfar delsettene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne protokollen ble utviklet ved hjelp av midler fra styret i guvernører regenerativ medisin Institute ved Cedars-Sinai Medical Center (til HSG), en karriere innen immunologi fellesskap fra den amerikanske foreningen Immunologists (til AY og HSG) og en Scholar Award fra American Society for hematologi (å Ja). Vi takker Flow cytometri kjernen ved Cedars-Sinai Medical Center for hjelp med FACS sortering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2) | The Jackson Laboratories | Cat#JAX:000664 | |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | Cat#130-090-858 | |
| Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC | BD Biosciences | Cat#553733 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 (FcγR; clone 93) APC-Cy7 | BioLegend | Cat#101327 | |
| Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7 | BioLegend | Cat#108114 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue | BioLegend | Cat#105820 | |
| Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5 | BioLegend | Cat#128012 | |
| Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE | BioLegend | Cat#135506 | |
| Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC | BD Biosciences | Cat#560718 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Thermo Fisher Scientific | Cat#C36950 | |
| AutoMACS Separator | Miltenyi Biotec | N/A | Use the "deplete" program |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | N/A | 5 lasers, 15 colors |
| BD FACS Aria III cell sorter | BD Biosciences | N/A | 5 lasers, 13 colors |
| FlowJo | FlowJo, LLC | https://www.flowjo.com | For further analysis of the .fcs files |
References
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).
- Yáñez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production. Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).
- Auffray, C., et al. CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation. Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 (2006).
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).
- Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).
- Yáñez, A., et al. Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes. Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).
- Olsson, A., et al. Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice. Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).
- Yáñez, A., Goodridge, H. S. Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production. Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
