Identifikation og isolering af Oligopotent og afstamning-begået myeloide ophav fra mus knoglemarv

Summary

Vi demonstrere, hvordan til at identificere og isolere 6 delmængder af myeloide stamceller fra murine knoglemarven ved hjælp af en kombination af magnetiske og fluorescens sortering (MACS og FACS). Denne protokol kan bruges til i vitro kultur assays (methylcellulose eller flydende kulturer), i vivo adoptiv overførsel eksperimenter og RNA/protein analyser.

Abstract

Myeloide stamceller, der giver neutrofiler, monocytter og dendritiske celler (DCs) kan identificeres i og isoleret fra knoglemarven af mus til hematological og immunologiske analyser. For eksempel, kan undersøgelser af de cellulære og molekylære egenskaber af myeloide stamceller befolkninger afsløre underliggende leukemic transformation mekanismer, eller demonstrere hvordan immunsystemet reagerer på patogen eksponering. Tidligere beskrevet flow flowcytometri strategier for myeloide stamceller identifikation har gjort betydelige fremskridt på mange områder, men fraktioner de identificere er meget heterogen. De mest almindeligt anvendte gating strategier definere knoglemarv fraktioner, der er beriget til de ønskede befolkninger, men også indeholder store mængder af "forurener" stamfaderen. Vores nylige undersøgelser har løst en stor del af denne forskelligartethed, og den protokol, vi præsenterer her tillader dyrkning af 6 delpopulationer af oligopotent og afstamning-begået myeloide stamceller fra 2 tidligere beskrevet knoglemarv fraktioner. Protokollen beskriver 3 stadier: 1) isolering af knoglemarv celler, 2) berigelse for hæmatopoietisk stamfaderen ved magnetisk aktiveret celle sortering (lineage udtynding af MLA), og 3) identifikation af myeloide stamceller delmængder af flowcytometri (herunder Fluorescens-aktiveret celle sortering, FACS, hvis det ønskes). Denne fremgangsmåde tillader stamfader kvantificering og isolation for en række in vitro og i vivo applikationer, og har allerede givet roman indsigt i veje og mekanismer af neutrofile, monocyt og DC differentiering.

Introduction

Neutrofile og monocytter og dendritiske celler (DCs) er myeloide celler, der opstår fra hæmatopoietisk progenitorceller, primært i knoglemarven, ved en proces kaldet myelopoiesis. Fælles myeloide stamceller (Kystforvaltningsplaner) har potentiale til at producere myeloide celler, samt megakaryocytes og erytrocytter, men ikke lymfoide celler. Granulocyt-monocyt stamfaderen (GMPs), som er afledt af Kystforvaltningsplaner, producere granulocytter og monocytter, men har mistet megakaryocyte og erytrocyt potentielle. Monocytter og klassisk og plasmacytoid DCs (cDCs/fremdaterede) menes også at opstå fra fælles ophav kendt som monocyt-DC stamfaderen (MDP'er), som er produceret af Kystforvaltningsplaner. gradvis begrænsning af lineage potentiale i sidste ende resulterer i slægt-begået ophav: granulocyt progenitorceller, monocyt ophav og dendritiske celle stamfaderen (figur 1).

Weissman og kolleger rapporteret at Kystforvaltningsplaner findes i Lin^- c-Kit⁺ Sca-1^- (LKS^-) CD34⁺ FcγR^lo brøkdel af musen knoglemarven, mens GMPs er indeholdt i LKS^- CD34⁺ FcγR ^Hej fraktion¹. Men disse "CMP" og "GMP" brøker er meget heterogen. For eksempel, indeholder "GMP" brøkdel også afstamning-begået granulocyt ophav og monocyt stamfaderen^1,2. MDP'er separat blev rapporteret til at være CX3CR1⁺ Flt3⁺ CD115⁺ progenitorceller, som også udtrykker CD34 og FcγR^3,4. MDP'er give anledning til cDC/pDC-producerende fælles DC stamfaderen (CDPs), som er blevet rapporteret at udtrykke lavere niveauer af c-Kit (CD117) og er ikke inkluderet i LKS^- brøkdel⁵.

Tidligere var det antaget at monocytter opstår via en enkelt vej (CMP-GMP-MDP-monocyt). Overensstemmelse med denne model, monocyt-begået stamfaderen produceret af GMPs (opkaldt monocyt progenitorceller, MPs)² og MDP'er (opkaldt fælles monocyt progenitorceller, cMoPs)⁶ synes at være de samme celler på grundlag af fælles overflade markør udtryk . Dog, vi for nylig demonstreret at monocytter produceres uafhængigt af GMPs og MDP'er, og var i stand til at skelne mellem parlamentsmedlemmer og cMoPs af encellede RNA sekventering⁷.

Vi har for nylig ændret Weissman "CMP" og "GMP" gating strategi for at identificere 6 subfractions af C57BL/6J mus knoglemarv indeholdende forskellige oligopotent og afstamning-begået myeloide stamceller undersæt. Vi første gang rapporteret, at farvning for Ly6C og CD115 tillader dyrkning af oligopotent GMPs, samt granulocyt stamfaderen (GPs) og monocyt stamfaderen (både MPs og cMoPs, som vi er i øjeblikket ude af stand til at adskille) fra "GMP" fraktion² (LKS ^- CD34⁺ FcγR^Hej gate; Figur 1). Vi viste efterfølgende, at MDP'er findes overvejende i "CMP" fraktion (LKS^- CD34⁺ FcγR^lo gate), som også indeholder Flt3⁺ CD115^lo og Flt3^- delmængder⁷ (figur 1 ). CMP-Flt3⁺ CD115^lo brøkdel udbytter både GMPs og MDP'er ved adoptiv overførsel. CMP-Flt3^- delmængde indeholder stamfaderen, der synes at være mellemprodukter mellem CMP-Flt3⁺ CD115^lo celler og GMPs. I modsætning til MDP'er besidder både den CMP-Flt3⁺ CD115^lo og CMP-Flt3^- fraktioner også megakaryocyte og erytrocyt potentielle.

Det er vigtigt at bemærke, at det er i øjeblikket uklart, om "CMP" fraktioner indeholder stamfaderen, der virkelig er oligopotent (f.eks. individuelle celler i CMP-Flt3⁺ CD115^lo brøkdel der besidder neutrofile, monocyt, DC, megakaryocyte og erytrocyt potentielle), eller alternativt, omfatter en blanding af stamfaderen med mere begrænset lineage potentiale. Kolonidannende assays (methylcellulose kulturer) afslørede celler med granulocyt (neutrofile), erytrocyt, monocyt og megakaryocyte potentielle (CLAUSS celler) i "CMP", CMP-Flt3⁺ CD115^lo og CMP-Flt3^- fraktioner^{1 ,7}, men tillader ikke vurderingen af DC potentiale. Derimod kolonidannende assays påvist eksistensen af oligopotent GMPs (ophav med både neutrofile og monocyt potentielle) i "GMP" fraktion^1,2, og dette er understøttet af de seneste single-celle transkriptom analyse⁸. Det vides i øjeblikket ikke, men om disse oligopotent GMPs også producere andre granulocytter (eosinofile, basofile og mastceller).

Baseret på disse undersøgelser, vi nu demonstrere kan hvordan 7 overflade markører (c-Kit, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C og CD115) bruges til at identificere og isolere disse 6 delmængder af oligopotent og afstamning-begået myeloide stamceller. Protokollen beskrevet her kan anvendes til in vitro- kultur assays (methylcellulose eller flydende kulturer), i vivo adoptiv overførsel eksperimenter i mus og molekylær analyse (bulk og encellede RNA sekventering, Western blotting, etc.).

Protokollen består af 3 faser: 1) udarbejdelse af en enkelt cellesuspension af knoglemarv celler, 2) berigelse for hæmatopoietisk stamfaderen (magnetisk aktiveret celle sortering), og 3) identifikation og isolation, hvis det ønskes af stamfader delmængder af flow flowcytometri (ved hjælp af et analyseapparat eller et sorteringsanlæg, som passende). Det første skridt er isolering af knoglemarv celler fra lårben og skinneben af aflivede mus og svarer til andre tidligere beskrevet protokoller⁹. Næste, prøven er beriget til stilken og stamfader celler ved hjælp af en cocktail af antistoffer mod celle overflade markører af erytrocytter, neutrofiler, monocytter, lymfocytter, osv., nedbryder de differentierede celler. Dette er ikke obligatorisk, men anbefales kraftigt at optimere påvisning af stamfader delmængder og reducere mængden af antistoffer til stamfader identifikation og den nødvendige tid til flowcytometri. Lineage udtynding protokol nedenfor beskriver Magnetic-Activated celle sortering (MLA) ved hjælp af en mus afstamning celle nedbrydningen Kit (som indeholder biotinylated antistoffer mod CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4, og Ter-119, plus anti-biotin microbeads) og en automatiseret magnetisk separator. Det sidste trin er at identificere (og sortering, hvis det ønskes) af stamfader delmængder ved flowcytometri. Panelet antistof beskrevet nedenfor (Se også tabel 1) er udviklet til at blive brugt i et flow forskellige (analyzer eller sorteringsanlæg) med 4 lasere (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).

Figur 1: neutrofile, monocyt og DC ophav og differentiering veje. Den seneste reviderede model af myelopoiesis⁷ illustreres med Weissman gates for "Kystforvaltningsplaner" (blå) og "GMPs" (grøn)¹ overlejret. Dette tal er blevet ændret fra Yáñez et al. 2017⁷. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

Alle metoder, der beskrives her blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Cedars-Sinai Medical Center.

1. isolering af musen knoglemarven og forberedelse af en enkelt cellesuspension

1. Aflive mus efter institutionelle retningslinjer.
2. Placer de aflivede mus på ryggen og spray det med 70% ethanol (EtOH). Lave en lille (3-5 mm) snit i hver hind lemmer på ankel niveau bruger skarpe, spidse sakse, og træk huden op mod kroppen til at fjerne det fra benene og udsætter de muskler og knogler.
3. Fjerne musklerne (quadriceps, hamstrings, osv.) fra knoglerne ved at trimme dem med en saks, efter retningen af knoglen. Pas på ikke at beskadige ben.
4. Splitte lårben fra hofteleddene og skåret væk bindevæv og muskler til at afmontere benene, være omhyggelig med ikke at skære i knogler.
5. Fjerne fødderne af forstyrrende ankler fra forbenede, placere knoglerne i et rør af steril PBS eller medier, og transportere dem på is til vævskultur værelse.
   Bemærk: For nogle andre programmer (f.eks., der følger makrofager fra samlede knoglemarv celler) er det muligt at forlade knoglerne på is i et stykke tid, men for stamfader isolering er det vigtigt at fortsætte så hurtigt som muligt for at undgå downregulation af vigtigt celleoverflademarkører (især CD115).
6. I en biosikkerhed kabinet, skal du fjerne eventuelle resterende bløddele fra knoglerne ved at gnide dem med silkepapir.
   Bemærk: Protokollen bør udføres i et kabinet biosikkerhed, hvis en steril prøve er nødvendig for celle kultur eller i vivo assays efter FACS sortering. Hvis der ikke kræves sterile celler, kan hele processen udføres på laboratorium bænk.
7. Kort fordybe knogler i 70% EtOH desinficere dem, og derefter i steril PBS til at vaske dem.
8. Adskille lårben fra forbenede og fibulas ved at skære gennem knæet, og kassér fibulas.
9. Skær enderne af knoglerne med en skarp saks.
10. Høste knoglemarven med kolde steril PBS som følger, indtil knoglerne vises hvide:
    1. Greb hver knogle med pincet og indsætte en 26G kanyle tilsluttet en 10 mL sprøjte indeholdende kolde steril PBS til knogle akslen i den ene ende.
    2. Holde knoglen ovenfor et 50 mL centrifugeglas og skylle 2-5 mL PBS igennem den ben til at høste marv.
    3. Høste marv fra alle 4 ben pr. mus (2 lårben og 2 forbenede).
11. Forsigtigt pipetteres op og ned med 1 mL pipette til at disaggregate knoglemarven til at danne en cellesuspension.
12. Filtrer knoglemarv suspension gennem et stykke af 30 μm nylon mesh til at fjerne knogle stykker og celle aggregater, dermed genererer en enkelt cellesuspension.
13. Enkelt cellesuspension på 280 x g der centrifugeres i 5 min, og resuspend celle pellet i sterile farvning buffer (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA), ved hjælp af 5 mL farvning buffer pr. mus (fx 10 mL for celler samles fra lårben og skinneben af 2 mus).
14. Tag en 10 μL alikvot af prøven, bland det med 10 μl Trypan blå og belastning 10 μl af den resulterende Trypan blå-mærket prøve på en hemocytometer. Tælle celler ved hjælp af et lysmikroskop.
    Bemærk: Hvis cellerne er for koncentreret til pålidelige optælling, fortyndes prøven før tilføje Trypan blå.

2. stamfader berigelse af magnetisk aktiveret celle sortering (MLA)

1. Centrifugeres hele enkelt cellesuspension (eller så mange celler som er nødvendige for at opnå det ønskede udbytte) ved 280 x g i 5 min. ved 4° C og resuspend celle pellet i 40 μL farvning buffer (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA) pr. 10⁷ celler.
   Bemærk: Det er også muligt at bruge MACS buffer fra lineage udtynding kit producent (Se Tabel af materialer) som et alternativ til farvning-bufferen.
2. Udføre lineage nedbrydningen ifølge instruktionerne, der følger med lineage udtynding kit. Følgende vejledning gælder for kit ses i Tabel af materialer. Hvis en anden kit bruges, Følg fabrikantens anvisninger og derefter gå videre til trin 2.3.
   1. Tilføje 10 μL biotin-antistof cocktail pr. 10⁷ celler, mix af pipettering og inkuberes i 10 min. ved 4 ° C.
   2. Tilsæt 30 μL farvning buffer/MACS buffer pr. 10⁷ celler og bland.
   3. Tilsæt 20 μL anti-biotin microbeads pr. 10⁷ celler. Bland godt og Inkuber i et yderligere 15 min. ved 4 ° C.
      Bemærk: Vortex microbeads før du tilføjer dem til cellerne for at sikre, at de er helt spredt.
   4. Der tilsættes 1 mL farvning buffer/MACS buffer pr. 10⁷ celler, centrifugeres celler ved 280 x g i 5 min, og resuspend celle pellet i 500 μL farvning buffer/MACS buffer for op til 10⁸ celler. For mere end 10⁸ celler, vinduesdiameter af farvning buffer/MACS buffer i overensstemmelse hermed.
   5. Forberede den automatiserede magnetisk separator ifølge producentens anvisninger.
   6. Placere røret med de mærkede celler i separatoren, og vælg programmet negative valg.
   7. Indsamle de negative brøkdel, som indeholder stamfader-beriget afstamning-negative (Lin^-) celler. Kassér den positive brøkdel, som indeholder magnetisk mærket afstamning-positive celler.
3. Centrifugeres Lin^- celler ved 280 x g i 5 min, og celle resuspenderes i 2 mL farvning buffer/MACS buffer pr. mus (f.eks. 4 mL Hvis knoglemarven var samlet fra 2 mus).
   Bemærk: Pellet skulle nu være hvid i stedet for rød fordi erytrocytter er blevet udtyndet.
4. Tag en 10 μL alikvot af Lin^- celler, bland det med 10 μL Trypan blå og belastning 10 μl af den resulterende Trypan blå-mærket prøve på en hemocytometer. Tælle celler ved hjælp af et lysmikroskop.
   Bemærk: Hvis cellerne er for koncentreret til pålidelige optælling, fortyndes prøven før tilføje Trypan blå.

3. myeloide stamceller identifikation og Isolation af fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS)

1. Label 9 microcentrifuge (1,5 eller 2 mL) rør til: 1) unstained celler, 2-8) celler enkelt farves med fluorophore-konjugerede antistoffer mod FcγR (CD16/32), c-Kit, Sca-1, CD34, Flt3 (CD135), Ly6C og CD115 for spænding udvælgelse og farve kompensation, og 9) prøve celler til at være plettet med alle 7 antistoffer for stamfader identifikation og sortering.
2. Distribuere 100.000 celler til hver kontrol rør (rør 1-8), og alle de resterende celler (eller færre hvis det ønskes) til prøveglas (tube 9).
   Bemærk: Hvis prøven er større end 1,5-2 mL, kan det være nødvendigt at distribuere prøve celler ind i en 15 mL tube, centrifugeres dem og resuspenderes (trin 3.3 nedenfor), og derefter overføre cellerne til et microcentrifuge for de efterfølgende farvning trin.
3. Centrifugeres celler på 1.500 x g i 5 min, og pelleten kontrol tube pellets i 100 μL farvning buffer (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA) og prøve tube pellet i 100 μL farvning buffer pr. 5 x 10⁶ celler (fx 200 μl til 1 x 10⁷ celler).
4. Tilføje 2 μg/mL anti-CD16/CD32-APC-Cy7 til FcγR enkelt pletten tube og prøveglas. Vortex forsigtigt at blandes og inkuberes i 10 min. ved 4 ° C.
   Bemærk: Det er vigtigt at plette prøve celler med FcγR (CD16/32) antistof før tilføjelse af andre antistoffer til at forhindre konkurrence på grund af ikke-specifik Fc-medieret antistof bindende. Inkuber ikke cellerne med en FcγR blokerer reagens.
5. Tilføje andre antistoffer til de tilsvarende enkelt pletten rør (1 antistof) og prøveglas (alle 6 antistoffer): 10 μg/mL c-Kit-Pacific Blue, 2 μg/mL Sca-1-PE-Cy7, 25 μg/mL CD34-FITC, 10 μg/mL Flt3-APC, 2 μg/mL Ly6C-PerCP-Cy5.5 og 4 μg/mL CD115-PE. Vortex forsigtigt, og der inkuberes i 15 min. ved 4 ° C.
6. Tilføje 900 μl farvning buffer til kontrol rør, og 1 mL farvning buffer pr. 10⁷ celler til prøveglas. Centrifugeres celler på 1.500 x g i 5 min og resuspenderes celle i farvning buffer: 200 μl pr. kontrol rør og 500 μl pr. 25 x 10⁶ celler i prøveglas. Overføre de resuspenderede celler til 5 mL FACS rør.
   Bemærk: Hvis prøven er større end 1,5-2 mL, kan det være nødvendigt at overføre cellerne til en 15 mL tube til centrifugering.
7. Forberede flow forskellige (analyzer eller sorteringsanlæg) ifølge producentens anvisninger.
8. Kør unstained og enkelt farves kontrol celler gennem flow forskellige spændinger og farve kompensationer.
9. Køre prøve celler, gate stamfader delmængder som skitseret nedenfor og sammenfattet i figur 2, og hvis det ønskes, udføre FACS sortering for at isolere de relevante stamfader undersæt.
   Bemærk: Det er normalt nødvendigt at erhverve ca 200.000 celler for at opnå mindst 1.000 begivenheder i hver stamfader gate.
   1. Oprette en dot plot af alle celler, visning af FSC-A (x-aksen) og SSC-A (y-aksen), og gate for at udelukke snavs og døde celler = > "live" celler.
   2. Oprette en dot plot af "live" celler, visning af FSC-H (x-aksen) og FSC-W (y-aksen), og gate for at udelukke dubletter = > live/singlet (FSC) gate.
   3. Oprette en dot plot af live/singlet (FSC) celler, visning af SSC-H (x-aksen) og SSC-W (y-aksen), og gate for at udelukke dubletter = > live/singlet (FSC) / singlet (SSC) gate.
   4. Oprette en dot plot af live/singlet (FSC) / singlet (SSC) celler, visning af Sca-1 (x-aksen) og c-Kit (y-aksen), og porten til Vælg c-Kit⁺ Sca-1^- celler = > LKS^- celler.
   5. Oprette en dot plot af LKS^- celler, vise CD34 (x-aksen) og FcγR (y-aksen) og Tor at vælge CD34⁺ FcγR^lo celler = > "Kystforvaltningsplaner" og CD34⁺ FcγR^Hej celler = > "GMPs".
      Bemærk: Det er vigtigt at gate "Kystforvaltningsplaner" og "GMPs" så præcist som muligt. Det er nyttigt at bruge en pseudocolor tæthed plot eller en kontur plot for korrekt gating.
   6. Oprette en dot plot af "Kystforvaltningsplaner", viser CD115 (x-aksen) og Flt3 (y-aksen), og porten til at vælge:
      Flt3⁺ CD115^lo celler = > CMP-Flt3⁺ CD115^lo celler,
      Flt3^- CD115^lo celler = > CMP-Flt3^- celler,
      Flt3⁺ CD115^Hej celler = > MDP'er.
   7. Oprette en dot plot af "GMPs", viser Ly6C (x-aksen) og FcγR (y-aksen) og Tor at vælge Ly6C^-celler = > "GMP-Ly6C^- celler", og Ly6C⁺ celler = > "GMP-Ly6C⁺ celler".
   8. Oprette en dot plot "GMP-Ly6C^- celler", viser CD115 (x-aksen) og Flt3 (y-aksen), og porten til at vælge:
      Flt3^- CD115^lo celler = > GMPs.
   9. Oprette en dot plot "GMP-Ly6C⁺ celler", viser CD115 (x-aksen) og Flt3 (y-aksen), og porten til at vælge:
      Flt3^- CD115^lo celler = > GPs,
      Flt3^- CD115^Hej celler = > MPs + cMoPs.

Representative Results

Ved hjælp af protokollen, der er beskrevet ovenfor, er det muligt at opnå ~ 100 millioner celler (herunder røde blodlegemer, eller ~ 50 millioner nukleeret celler) fra både lårben og skinneben (2 ben) af en C57BL/6J mus (6-8 uger gammel, mand eller kvinde). 1-2 millioner Lin^- celler kan isoleres pr. mus af MACS udtynding af Lin⁺ celler.

Hver af de 6 myeloide stamceller delmængder udgør ~ 1-4% af Lin^- celler. Lineage udtynding er effektiv på nedbryder differentierede celler og berigende for progenitorceller, men Lin^- fraktion indeholder en stor andel af c-Kit^- celler ud over c-Kit⁺ ophav (figur 3A). Stamfader udbytter efter FACS sortering kan variere afhængigt af sorteringsanlæg indstillinger anvendes (f.eks. maksimalt udbytte versus optimal renhed), men generelt er det muligt at få 10.000-40.000 celler pr. fraktion (figur 3B). Efter sortering flow flowcytometri analyse skal afsløre > 95% renhed af hver fraktion (figur 3 c).

Figur 2: Gating strategi til identifikation af de 6 myeloide stamceller fraktioner. (A) Progressive gating af de levende celler, Lin^- -> slåbrokker (FSC) -> slåbrokker (SSC) -> LKS^- celler -> CD34⁺ FcγR^lo ("CMP") og CD34⁺ FcγR^Hej ("GMP") fraktioner -> 6 myeloide stamfader undersæt. (B) Resumé af overflade markør udtryk af 6 stamfader fraktioner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: repræsentant stamfader udbytter og renhed. (A) repræsentative flowcytometri observationsområder viser c-Kit og CD11b udtryk af knoglemarv celler før og efter afstamning udtynding, demonstrerer berigelse af stamfaderen (c-Kit⁺ celler). (B) celle udbytter for hver stamfader fraktion, præsenteret som middelværdi + standardafvigelse på 30 eksperimenter. Knoglemarv celler fra op til 20 mus blev samlet for hvert forsøg. (C) repræsentative flowcytometri parceller fra efter sortering analyse, demonstrerer renheden af FACS-sorteret stamfader fraktioner. Panelet C er blevet ændret fra Yáñez et al. 2017⁷. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Laser	Kanal	Filter	Spejl
405 nm	A.	670/30	635LP
	B.	525/50	505LP
	C. c-Kit-Pacific Blue	450/50
488 nm	A. (FSC)
	B. Ly6C-PerCP-Cy5.5	710/50	690LP
	C. CD34-FITC	525/50	505LP
	D. SSC	488/10
561 nm	A. Sca-1-PE-Cy7	780/40	750LP
	B.	710/50	690LP
	C.	660/20	640LP
	D.	610/20	600LP
	E. CD115-PE	582/15
640 nm	A. FcϒR-APC-Cy7	780/60	750LP
	B.	730/45	690LP
	C. Flt3-APC	670/30

Tabel 1: Antistof panel og flow forskellige konfiguration.

Discussion

Weissman gating strategi for musen myeloide stamceller identifikation¹ har været guldstandarden for immunologists og Hematologer for næsten 20 år, men det er nu tydeligt, at "CMP" og "GMP" gates er meget heterogen og mere præcise gating strategier er nødvendige. Den protokol, som vi har beskrevet her tillader identifikation af oligopotent og afstamning-begået delmængder i C57BL/6J mus for mere præcis kvantificering af specifikke myeloide stamceller og kortlægning af myelopoiesis veje, samt undersøgelse af molekylære mekanismer, der opererer i bestemte faser af myeloide differentiering. Stamfader delmængder kan sorteres, hvis det ønskes, molekylære analyser, in vitro- og i vivo vurdering af differentiering osv.

Protokollen blev udviklet ved hjælp af unge (6-8 uger gamle) C57BL/6J mus og er velegnet til både mandlige og kvindelige mus. Vi har ikke karakteriseret stamfader delmængder i ældre mus. Vi ikke foregribe markørerne vil ændre sig med alderen, men de relative proportioner af delmængder kan variere. Vi har ikke vurderet stamfader delmængder i andre mus stammer.

Den første anvendelse af vores ændrede gating strategi var at give mekanistiske indblik i reguleringen af myeloide celler skæbne valg af transskription faktor interferon regulerende faktor 8 (IRF8)². IRF8 blev tidligere rapporteret skal udtrykkes som GMPs (Weissman "GMP" brøkdel) og krævede monocyt differentiering af fremme monocyt genekspression, undertrykke neutrofile genekspression og fremme neutrofile apoptose¹⁰. Ved hjælp af vores ændrede gating strategi, viste vi, at IRF8 ikke er udtrykt ved oligopotent GMPs, men er udtrykt af både GPs og MPs + cMoPs². Vi viste desuden, at IRF8 regulerer GP og MP + cMoP overlevelse og differentiering, snarere end produktion ophavenes afstamning-begået af oligopotent GMPs. På samme måde, vi for nylig brugte vores ændrede gating strategi at re-definere model af myelopoiesis, og viste, at GMPs og MDP'er producere funktionelt adskilte inflammatoriske monocytter via 2 uafhængige veje⁷.

Lineage udtynding trin kan udføres ved hjælp af en manuel magnetisk separator i stedet for en automatiseret magnetisk separator, og lineage nedbrydning kan også opnås ved flowcytometri ved hjælp af biotinylated afstamning markør antistof cocktail og en fluorophore-konjugerede anti-biotin antistof, med gating for at vælge de unstained celler. Lineage udtynding udelukker mest differentierede celler og beriger for c-Kit⁺ ophav til at minimere den tid og omkostninger i forbindelse med de efterfølgende trin (dvs. mindsker antistof diskenheder til flowcytometri, analyzer/Diassortering tid, etc.). Efterforskere bør henvise til producentens dataark til at bestemme om lineage udtynding skridt arbejdede så effektivt som forventet for den specifikke kit bruges. Men det gør ikke noget hvis lineage udtynding ikke er 100% effektiv, fordi differentieret (Lin⁺) celler ikke udtrykke c-Kit, så nogen differentierede celler tilbage efter afstamning udtynding (såvel som andre celler, c-Kit^- ) er efterfølgende udelukket ved flow flowcytometri gating. Det er også vigtigt at bemærke, at GPs og MPs udtrykkelige Ly6C men, i modsætning til Ly6C udtrykt ved monocytter, stamfader Ly6C (formentlig en anden isoform) registreres ikke af Gr-1 antistof ofte inkluderet i lineage udtynding kits, og dermed GPs og MPs er fortsat efter Lineage udtynding².

God farvning er vigtigt for alle celleoverflademarkører, men særligt kritisk til FcγR til at tillade præcise gating af FcγR^lo "Kystforvaltningsplaner" og FcγR^Hej "GMPs". Optimal fluorophore valg og antistof fortynding er afgørende for god adskillelse, og en FcγR blokerende reagens (almindeligt anvendt før farvning for flowcytometri) må ikke anvendes. Det er også vigtigt at bemærke, at CD115 er downregulated, når cellerne er opretholdt ved 4° C eller på is i længere perioder, så det er vigtigt at arbejde hurtigt for at opnå god farvning. Vi anbefaler behandling cellerne inden for 1-2 timer at bevare deres integritet. Hvis der ikke kræves levende celler, kan farvede celler fast og erhvervet inden for 48 timer.

Hvis de isolerede fraktioner indeholder betydelige antal døde celler, er det muligt at medtage en levedygtighed farvestof (f.eks. propidium Iodid) for at mere præcist gate levende celler, selv om dette ville sandsynligvis kræve en ændring i kombinationen af fluorokrom-konjugerede antistoffer. Hvis det ønskes, kan celletal beregnes ved at tilføje tælle perler på en kendt koncentration til fra prøver udtaget ved flowcytometri. Tælle perler er fluorescerende latex perler, der kan adskilles fra cellerne af FSC-A og SSC-A eller af deres høje fluorescens intensitet. Celle tal kan beregnes ved hjælp af følgende formel:

(antallet af celle begivenheder / antallet af perle begivenheder) x (antal perler føjet til prøven / volumen af prøven i μL) = koncentration af prøven som celler/μl

En begrænsning af den nuværende protokol er at det ikke tillader særskilt identifikation af parlamentsmedlemmer og cMoPs, hvilket komplicerer evaluering af disse progenitorceller, undersøgelse af deres genekspression og funktionelle egenskaber, etc. For eksempel, en observeret stigning i MP + cMoP tal indikerer ikke om forbedret monocyt produktion sker via GMP pathway og/eller MDP pathway. I igangværende undersøgelser håber vi at identificere overflade markører, at skelner mellem parlamentsmedlemmer og cMoPs. I mellemtiden, kan evaluering af disse stamfaderen af encellede RNA sekventering⁷ bruges til at profilere de relative proportioner af parlamentsmedlemmer og cMoPs.

Encellede RNA sekventering undersøgelser vil sandsynligvis også afsløre yderligere heterogenitet i de 6 stamfader fraktioner beskrevet i denne protokol, hvoraf nogle afspejler forskellige modning hedder fx, GPs, der først for nylig har mistet monocyt potentiale versus GPs, der er klar til at gå videre til den næste fase af differentiering. "GMP" brøkdel delmængder kan også indeholde stamfaderen med potentiale til at producere andre granulocytter (eosinofile, basofile og mastceller), men vi har ikke undersøgt dette. Som nævnt i indledningen, er det også i øjeblikket uklart, om CMP-Flt3⁺ CD115^lo, CMP-Flt3^- og MDP fraktioner virkelig indeholder de forudsagte oligopotent ophav eller alternativt omfatter en blanding af stamfaderen med mere begrænset lineage potentielle, men én celle RNA sekvensering kan give indsigt i dette vigtige spørgsmål.

En ny tilgang er nu kræves for identifikation af delmængder af menneskelige myeloide stamceller. Weissman og kolleger tidligere defineret myeloide delmængder (herunder "Kystforvaltningsplaner" og "GMPs") i menneskelige knoglemarven og ledningen blod¹¹, men de er ligeledes heterogene. Desværre, oversættelse af musen gating strategier til menneskelige stamfaderen kompliceres af bemærkelsesværdige forskelle i overfladen markør udtryk mellem mennesker og mus stamfaderen; f.eks. CD34 udtryk er begrænset til myeloide stamceller delgrupper i mus, men mere bredt observeret på menneskelige stamfaderen herunder hæmatopoietisk stamceller. Encellede RNA sekventering undersøgelser bør imidlertid også til identificering af kandidat markører til at adskille menneskelige stamfader undersæt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2)	The Jackson Laboratories	Cat#JAX:000664
Lineage Cell Depletion Kit, mouse	Miltenyi Biotec	Cat#130-090-858
Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC	BD Biosciences	Cat#553733
Rat anti-mouse CD16/CD32 (FcγR; clone 93) APC-Cy7	BioLegend	Cat#101327
Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7	BioLegend	Cat#108114
Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue	BioLegend	Cat#105820
Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5	BioLegend	Cat#128012
Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE	BioLegend	Cat#135506
Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC	BD Biosciences	Cat#560718
CountBright Absolute Counting Beads	Thermo Fisher Scientific	Cat#C36950
AutoMACS Separator	Miltenyi Biotec	N/A	Use the "deplete" program
BD LSRFortessa	BD Biosciences	N/A	5 lasers, 15 colors
BD FACS Aria III cell sorter	BD Biosciences	N/A	5 lasers, 13 colors
FlowJo	FlowJo, LLC	https://www.flowjo.com	For further analysis of the .fcs files