Summary
Biz nasıl tanımlanmasını ve yalıtılmasını miyeloid ataları fare kemik iliği bir manyetik kombinasyonu ve floresan (MAC'ler ve FACS) sıralama kullanarak üzerinden 6 alt kümelerini göstermek. Bu iletişim kuralı vitro kültürü deneyleri (methylcellulose ya da sıvı kültürleri), in vivo evlat edinen transfer deneyler ve RNA/protein analizleri için kullanılabilir.
Abstract
Nötrofiller, monosit ve dendritik hücreler (DC) verim miyeloid ataları tespit ve hematolojik ve immünolojik analizleri farelerin kemik iliği dan izole. Örneğin, uygulama miyeloid progenitör nüfus hücresel ve moleküler özelliklerinin lösemik dönüştürme altında yatan mekanizmaları ortaya veya patojen maruz bağışıklık sistemin nasıl yanıt vereceğini gösterir. Daha önce açıklanan akış sitometresi stratejileri miyeloid progenitör tanımlama için birçok alanda önemli gelişmeler etkinleştirdim, ancak onlar tespit kesirler çok heterojen bulunmaktadır. En sık kullanılan gating stratejileri için istenen nüfus zenginleştirilmiş, ama aynı zamanda "bulaşıcı" ataları çok sayıda içeren kemik iliği kesirler tanımlayın. Bizim son yıllarda yapılan çalışmalarda bu heterojenlik çoğunu çözmüş ve ruhsatı burada mevcut protokol oligopotent 6 altgrupları yalıtım ve soy için kabul edilen miyeloid ataları 2 daha önce kemik iliği kesirler açıklanan. 3 kademeli protokolünü açıklar: 1) yalıtım kemik iliği hücreleri, hematopoetik ataları tarafından manyetik aktif hücre (soy tükenmesi MAC'ler tarafından) sıralama ve 3) akış sitometresi (dahil tarafından miyeloid progenitör alt kümeleri tanımlaması için zenginleştirme 2) floresans aktif hücre), sıralama FACS, isterseniz. Bu yaklaşım progenitör miktar ve yalıtım uygulamaları içinde in vitro ve in vivo çeşitli için izin verir ve zaten yolları ve nötrofil ve monosit DC farklılaşma mekanizmalarının içine roman fikir vermiştir.
Introduction
Monosit, nötrofil ve dendritik hücreler (DC) esas olarak kemik iliği hematopoetik ataları myelopoiesis adı verilen bir işlem tarafından ortaya miyeloid hücrelerdir. Ortak miyeloid ataları (CMPs) myeloid hücrelerin yanı sıra megakaryocytes ve eritrositler ama değil lenfoid hücre üretmek potansiyeline sahip. CMPs türetilmiştir, granülosit-monosit ataları (GMPs), granülosit ve monosit üretmek, ama megakaryocyte ve eritrosit potansiyel kaybettik. Monosit ve klasik ve plazmasitoid DCs (KGK/PDC'ler) da ortak ataları CMPs. kademeli kısıtlama lineage potansiyel sonuçta sonuçları lineage kaydedilmiş tarafından üretilen monosit-DC ataları (MDP'ler) olarak bilinen kaynaklanan için düşündüm ataları: granülosit ataları, monosit ataları ve dendritik hücre ataları (Şekil 1).
Weissman ve meslektaşları bildirdi CMPs Lin- c-Kit ile+ ani kalp durması-1- (LKS-) CD34 bulunur+ FcγRlo kısmını fare kemik iliği GMPs LKS- CD34 yer alır iken,+ FcγR Merhaba Kesir1. Ancak, bu "Cumhuriyetçi millet partisi" ve "GMP" kesirler çok heterojen bulunmaktadır. Örneğin, "GMP" kesir Ayrıca lineage için kabul edilen granülosit ataları ve monosit ataları1,2içerir. MDP'ler ayrı ayrı CX3CR1 olmak rapor+ Flt3+ CD115+ da CD34 ve FcγR3,4ifade ataları. MDP'ler ortaya çıkmasına neden olan c-Kit (CD117) düzeyi düşük hızlı bildirilmiştir cDC/pDC-üreten ortak DC ataları için (CDP) ve LKS- Kesir5dahil değil.
Monosit bir tek yol (CMP-GMP-MDP-monosit) yolu ile ortaya daha önce kabul edildi. (Monosit ataları, MPs adlı) GMPs tarafından üretilen bu model, monosit olarak kaydedilmiş ataları ile tutarlı2 ve MDP'ler (ortak monosit ataları, cMoPs adlı)6 gibi görünüyor aynı hücre temelinde paylaşılan yüzey marker ifade . Ancak, biz son zamanlarda monosit bağımsız olarak GMPs ve MDP'ler tarafından üretilmektedir gösterdi ve MPs ve cMoPs tek hücreli RNA sıralama7tarafından ayırt başardık.
Weissman "Cumhuriyetçi millet partisi" ve "GMP" perdeleme strateji C57BL/6J fare kemik iliği farklı oligopotent ve myeloid progenitör lineage için kabul edilen alt kümeleri içeren 6 subfractions tanımlamak için değiştirilen. Biz ilk Ly6C ve CD115 boyama oligopotent GMPs, hem de granülosit ataları (GPs) ve monosit ataları (MPs ve ayırmak Şu anda açamayacaklar cMoPs) yalıtım izin verir rapor "GMP" Kesir2 (LKS - CD34+ FcγRMerhaba kapısı; Şekil 1). Daha sonra MDP'ler ağırlıklı olarak "CMP" kesir bulundu gösterdi (LKS- CD34+ FcγRlo kapısı), ayrıca Flt3 içeren+ CD115lo ve Flt3- alt kümeleri7 (resim 1 ). CMP Flt3+ CD115lo kesir GMPs ve MDP'ler evlatlık transfer verimleri. Cumhuriyetçi millet partisi-Flt3- alt CMP-Flt3+ CD115lo hücreler ve GMPs arasındaki ara ürün olarak görünmesini ataları içerir. MDP'ler farklı olarak, hem Cumhuriyetçi millet partisi-Flt3+ CD115lo ve Cumhuriyetçi millet partisi-Flt3- kesirler de megakaryocyte ve eritrosit potansiyel bulunmamaktadır.
Ancak, ister gerçekten oligopotent (nötrofil, sahipÖrneğin, tek tek hücreleri içinde CMP Flt3+ CD115lo kesir vardır ataları "CMP" kesirler içeren şu anda belirsiz olduğuna dikkat etmek önemlidir monosit, DC, megakaryocyte ve eritrosit potansiyel), veya alternatif olarak, CSF'den daha sınırlı lineage potansiyeli olan karışımı kapsayabilir. Deneyleri (methylcellulose kültürleri) oluşturan colony CMP-Flt3+ CD115lo ve Cumhuriyetçi millet partisi-Flt3- kesirler1 hücreler granülosit (nötrofil), eritrosit, monosit ve megakaryocyte potansiyel (et hücreleri) "CMP", içinde olduğu ortaya çıktı ,7, ama DC potansiyeli değerlendirmesi izin vermez. Buna ek olarak, deneyleri oluşturan colony "GMP" Kesir1,2oligopotent GMPs (nötrofil ve monosit potansiyel ile ataları) varlığını gösterdi ve bu son tek hücre tarafından desteklenmektedir transcriptomic analiz8. Bu oligopotent GMPs da diğer granülosit (eozinofil, bazofil ve mast hücreleri) üretmek olup olmadığını şu anda, ancak, bilinmemektedir.
Bu çalışmalar, biz şimdi göstermek dayalı nasıl 7 işaretleri (c-Kit, ani kalp durması-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C ve CD115) yüzey tanımlanmasını ve yalıtılmasını oligopotent ve soy için kabul edilen miyeloid ataları 6 Bu alt kümeleri kullanılabilir. Burada açıklanan protokol vitro kültürü deneyleri (kültür) methylcellulose ya da sıvı, uygulanabilir vivo içinde evlat edinen transfer deneylerde fare ve moleküler analiz (toplu ve tek hücreli RNA sıralama, Western blot, vb).
İletişim kuralı 3 etap oluşur: 1) hazırlanması bir tek hücre süspansiyon kemik iliği hücreleri, 2) zenginleştirme hematopoetik ataları (manyetik aktif hücre sıralama) ve 3) tanıma ve istenirse progenitör alt kümeleri akımını, yalıtım sitometresi (bir çözümleyici veya bir sıralayıcısı uygun şekilde kullanarak). İlk adım kalça kemik iliği hücre izolasyon ve ötenazi farelerin yırtılmalarıteşhis ve diğer yukarıda açıklanan protokoller9' a benzer. Daha sonra örnek farklılaşmış hücreler tüketmek için bir kokteyl hücre yüzey işaretleyicileri, eritrositler, nötrofiller, monosit, lenfositler, vb karşı antikorların kullanarak kök ve progenitör hücreler için zenginleştirilmiştir. Bu, ancak önerilir hafiye-in yaratıcı alt kümelerini en iyi duruma getirme ve progenitör kimlik için gerekli antikor ve akış sitometresi için gereken süre miktarını azaltmak için zorunlu değildir. Soy tükenmesi iletişim kuralı aşağıdaki Magnetic-Activated hücre sıralama (Mac) bir fare Lineage hücre tükenmesi Kit kullanarak açıklar (CD5, CD45R karşı biotinylated antikor içeren (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4 ve Ter-119, artı Anti-biotin lastikteki) ve otomatik bir manyetik ayırıcı. Son adım tanımlamasıdır (ve sıralama, istenirse) akış sitometresi tarafından progenitör alt kümeleri olan. Aşağıda açıklanan antikor paneli (Ayrıca bkz: Tablo 1) bir akış sitometresi (Analyzer'ı veya Sıralayıcı) 4 lazerler ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).
Şekil 1: nötrofil, monosit ve DC ataları ve ayırt etme yolları. Myelopoiesis7 ' nin son zamanlarda gözden geçirilmiş modeli "CMPs" (mavi) ve "GMPs" (yeşil)1 overlaid Weissman gates ile gösterilmektedir. Bu rakam Yáñez vd 20177' den değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Cedars-Sinai Tıp Merkezi tarafından kabul edildi.
1. yalıtım fare kemik iliği ve bir tek hücre süspansiyon hazırlanması
- Kurumsal yönergelere uygun olarak fare ötenazi.
- Sırtında euthanized fareyi getirin ve % 70 etanol (alkol) ile sprey. Keskin, sivri uçlu makas ve cilt legs--dan kaldırmak ve kas ve kemik maruz doğru beden yukarı çekin bir küçük (3-5 mm) kesik ayak bileği düzey kullanarak her hind bacak içinde olun.
- (Kuadriseps, hamstrings, vb) kas kemik yönünü takip makasla çıkararak kemiklerden kaldırın. Kemikleri zarar vermemeye dikkat et.
- Uyluk dan kalça eklem yerinden çıkar ve bağ doku ve kas kemik kesmemeye dikkat bacaklar, ayırmak için kes gitsin.
- Ayak ayak bilekleri yırtılmalarıteşhis dan çıkartacak tarafından kaldırmak, kemikleri steril PBS veya ortam bir tüp içinde yerleştirin ve onları buz doku kültürü odasına taşımak.
Not: Bazı diğer uygulamalar (makrofajlar toplam kemik iliği hücrelerden TüretmeninÖrneğin, ) için kemikleri buz üzerinde bir süre için terk etmek mümkündür, ancak progenitör yalıtım için bir downregülasyon önlemek için mümkün olduğunca hızlı bir şekilde devam etmek önemlidir önemli yüzey işaretleyicileri (özellikle CD115). - Bir Biyogüvenlik kabini, kalan herhangi bir yumuşak doku kağıt mendil ile sürtünme tarafından kemiklerden kaldırın.
Not: steril bir örnek FACS sıralama sonra hücre kültür ve in vivo deneyleri için gerekliyse protokol bir Biyogüvenlik kabini gerçekleştirilmesi gerekiyor. Steril hücreler gerekli değildir eğer, tüm süreç laboratuvarı tezgah üzerinde gerçekleştirilebilir. - Kısaca %70 kemiklerde bırakın onları ve o zaman steril PBS onları yıkamak için dezenfekte alkol.
- Kalça diz ile kesme tarafından yırtılmalarıteşhis ve fibulas ayrı ve fibulas atın.
- Kemikler kapalı uçları keskin makasla kesme.
- Kemikleri beyaz görününceye kadar kemik iliği soğuk steril PBS ile aşağıdaki gibi hasat:
- Her kemik forseps ile kavrama ve bir ucunda kemik mili içine soğuk steril PBS içeren bir 10 mL şırınga bağlı 26 G iğne yerleştirin.
- Kemik 50 mL santrifüj tüpü yukarıda tutun ve 2-5 mL PBS üzerinden kemik kemik iliğini temizlemek.
- Tüm 4 bones fare (2 uyluk ve 2 yırtılmalarıteşhis) başına gelen kemik iliğini.
- Yavaşça yukarı ve aşağı bir hücre süspansiyon oluşturmak için kemik iliği disaggregate için bir 1 mL pipet pipet.
- Bir parça kemik parçaları ortadan kaldırmak ve toplamları, böylece bir tek hücre süspansiyon üreten hücre 30 mikron naylon mesh ile kemik iliği süspansiyon filtre.
- Santrifüj tek hücre süspansiyon 280 x g de 5 dk ve resuspend hücre Pelet steril boyama arabelleği (PBS + %0.5 FBS + 2 mM EDTA), 5 mL (Örneğin, uyluk ve yırtılmalarıteşhis 2 farelerin havuza alınmış hücreler için 10 mL) fare başına arabellek boyama kullanarak.
- 10 μL örnek aliquot al, 10 μL ile karıştırarak Trypan mavi ve yük 10 μL elde edilen Trypan mavi etiketli örnek bir hemasitometre için. Hafif bir mikroskop kullanarak hücreleri saymak.
Not: hücreleri çok güvenilir sayım için konsantre iseniz, Trypan mavi eklemeden önce örnek oranında seyreltin.
2. yaratıcı zenginleştirme manyetik aktif hücre (Mac) sıralama
- Tüm tek hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi (veya çok sayıda hücreler olarak istenen verim elde etmek için gerekli) 280 x g 4° C ve resuspend hücre Pelet 40 yılında 5 min için de 107 hücre başına arabellek (PBS + %0.5 FBS + 2 mM EDTA) boyama μL.
Not: Ayrıca soy tükenmesi Seti üreticisi arabelleğinden MAC'ler kullanmak mümkündür (bkz. Tablo reçetesi) boyama arabellek alternatif olarak. - Soy tükenmesi soy tükenmesi kit ile sağlanan yönergelere göre gerçekleştirin. Malzemeler tablogördüm kit için aşağıdaki yönergeler içindir. Farklı bir kit kullandıysanız, üreticinin yönergeleri izleyin ve 2.3 tutamaçlarından.
- 10 μL biotin-antikor kokteyl başına 107 hücreleri eklemek, pipetting tarafından mix ve 4 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya
- 30 μL eklemek arabellek/MAC'ler boyama tampon başına 107 hücre ve karıştırın.
- 20 μL Anti-biotin lastikteki 107 hücre başına ekleyin. İyice karıştırın ve bir ek 15 dk 4 ° C'de için kuluçkaya
Not: girdap onları hücrelere eklemeden önce lastikteki onlar tamamen dağınık emin olmak için. - 280 x g 5 dk ve resuspend 500 μL boyama arabellek/MAC'ler hücre Pelet arabellek için ilâ 108 hücre, hücre santrifüj kapasitesi, 1 mL 107 hücre başına arabellek/MAC'ler arabellek boyama ekleyin. 10'dan fazla8 hücreler için arabellek/MAC'ler arabellek buna göre boyama sesini çap.
- Otomatik manyetik ayırıcı üretici yönergelerine göre hazırlayın.
- Etiketli hücreleri ayırıcı içeren tüpü yerleştirin ve negatif seçim programı seçin.
- Dede-zenginleştirilmiş lineage negatif (LIN-) hücreleri içeren olumsuz kesir toplamak. Manyetik olarak etiketli soy-pozitif hücreleri içeren olumlu kesir atmak.
- Lin- hücreleri 280 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve hücre Pelet fare (Örneğin, 4 Eğer kemik iliği 2 fareler havuzlu mL) başına arabellek/MAC'ler arabellek boyama 2 ml resuspend.
Not: eritrositler tükenmiş çünkü Pelet şimdi yerine kırmızı beyaz olmalıdır. - 10 μL Lin- hücreleri aliquot al, 10 μL ile karıştırarak Trypan mavi ve yük 10 μL elde edilen Trypan mavi etiketli örnek bir hemasitometre için. Hafif bir mikroskop kullanarak hücreleri saymak.
Not: hücreleri çok güvenilir sayım için konsantre iseniz, Trypan mavi eklemeden önce örnek oranında seyreltin.
3. miyeloid progenitör kimlik ve yalıtım floresans aktif hücre (FACS) sıralama
- Etiket 9 microcentrifuge (1,5 veya 2 mL) tüpler için: 1) hücreleri, 2-8 günahı) hücreleri tek FcγR (CD16/32), karşı antikor fluorophore Birleşik ile lekeli c-Kit, CD34, Flt3 Sca-1 (CD135), Ly6C ve CD115 için voltaj seçimi ve renk tazminat ve 9) örnek hücreleri progenitör kimlik ve sıralama için tüm 7 antikorlar ile lekeli.
- Her kontrol tüpleri (Tüpler 1-8), 100.000 hücreleri ve tüm kalan hücreleri (veya daha az arzu edilirse) örnek tüp (tüp 9) dağıtın.
Not: numune hacmi 1.5-2 mL büyükse, örnek hücreleri 15 mL tüp içine dağıtmak, onları santrifüj kapasitesi ve Pelet (adım 3.3 aşağıda) resuspend ve o zaman microcentrifuge Tube sonraki boyama adımlar için hücreleri transferi gerekli olabilir. - 1500 x g 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi ve denetim tüp granül 100 μL resuspend tampon (PBS + %0.5 FBS + 2 mM EDTA) ve 100 μL örnek tüp Pelet boyama 5 x 106 başına arabellek boyama hücreleri (Örneğin, 1 x 107 hücreler için 200 μL).
- 2 μg/mL anti-CD16/CD32-APC-Cy7 FcγR tek leke tüp ve örnek tüp ekleyin. Yavaşça karıştırın ve 4 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya girdap
Not: Rekabet nedeniyle non-spesifik antikor Fc-aracılı bağlama önlemek için diğer antikorlar eklemeden önce FcγR (CD16/32) antikor örnek hücrelerle leke önemlidir. Hücreleri bir FcγR reaktif engelleme kuluçkaya değil. - Karşılık gelen tek leke tüpler (1 her antikor) ve örnek tüp (tüm 6 antikorlar) diğer antikorlar eklemek: 10 μg/mL c-Kit-Pasifik mavi, 2 μg/mL Sca-1-PE-Cy7, 25 μg/mL CD34-FITC, 10 μg/mL Flt3 APC, 2 μg/mL Ly6C-PerCP-Cy5.5 ve 4 μg/mL CD115-PE. Girdap yavaşça ve 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya
- 900 μL boyama arabelleğe kontrol tüpleri ve 1 mL örnek tüpü 107 hücrelere başına boyama arabellek ekleyin. Senaryo Özeti 5 min için 1.500 x g santrifüj kapasitesi ve tampon boyama içinde hücre Pelet resuspend: denetim tüp başına 200 μL ve 500 μL örnek tüp 25 x 106 hücre başına. Resuspended hücreleri 5 mL FACS tüpler için transfer.
Not: numune hacmi 1.5-2 mL büyükse, bir 15 mL tüp Santrifüjü için hücreleri aktarmak gerekli olabilir. - Üreticinin yönergelerine göre akış sitometresi (Analyzer'ı veya Sıralayıcı) hazırlayın.
- Günahı ve tek gerilimleri ve renk tazminatlar ayarlamak için akış sitometresi ile kontrol hücreleri lekeli çalıştırın.
- Örnek hücreleri çalıştırmak, dede alt kümeleri aşağıda özetlenen ve Şekil2 Özet olarak kapı ve istenirse, ilgili progenitör alt kümeleri yalıtmak için sıralama FACS gerçekleştirmek.
Not: Her progenitör kapısı en az 1000 olayları almak için yaklaşık 200.000 hücreleri elde etmek genellikle gereklidir.- FSC-A (x) ve SSC-A (y ekseni), görüntüleme tüm hücrelerin bir nokta çizim oluşturma ve enkaz ve ölü hücreleri dışlamak için kapı = > "canlı" hücreleri.
- Bir nokta çizim "canlı" hücre FSC-H (x ekseni) ve FSC-W (y ekseni), görüntüleme, oluşturma ve birini dışlamak için kapı = > Canlı/singlet (FSC) kapısı.
- Canlı/singlet bir nokta Arsa (FSC) hücreleri SSC-H (x ekseni) ve SSC-W (y ekseni), görüntüleme, oluşturma ve birini dışlamak için kapı = > Canlı/singlet (FSC) / singlet (SSC) kapısı.
- Canlı/singlet (FSC), bir nokta çizim oluşturma / singlet (SSC) hücreleri, ani kalp durması-1 (x ekseni) ve c-Kit (y ekseni), görüntüleme ve ani kalp durması c-Seti+ -- 1 hücreleri seçmek için kapı = > LKS- hücreleri.
- CD34 görüntüleme LKS- hücrelerinin bir nokta çizim oluşturma (x ekseni) ve FcγR (y ekseni) ve kapı CD34 seçmek için+ FcγRlo hücreleri = > "CMPs" ve CD34+ FcγRMerhaba hücreleri = > "GMPs".
Not: Mümkün olduğunca kapı "CMPs" ve "GMPs" tam olarak önemlidir. O bir yalancı yoğunluğu arsa veya bir dağılım komplo doğru geçişi için kullanmak yararlıdır. - "CMPs" CD115 görüntüleme, bir nokta çizim oluşturma (x ekseni) ve Flt3 (y ekseni) ve kapı seçmek için:
Flt3+ CD115lo hücreleri = > Cumhuriyetçi millet partisi-Flt3+ CD115lo hücreleri,
Flt3- CD115lo hücreleri = > Cumhuriyetçi millet partisi -- Flt3 hücreleri,
Flt3+ CD115Merhaba hücreleri = > MDP'ler. - "GMPs" Ly6C görüntüleme, bir nokta çizim oluşturma (x ekseni) ve FcγR (y ekseni) ve kapı Ly6C seçmek için-hücreleri = > "GMP-Ly6C- hücreleri" ve Ly6C+ hücreleri = > "GMP-Ly6C+ hücreleri".
- "GMP-Ly6C- hücre CD115 görüntüleme", bir nokta çizim oluşturma (x ekseni) ve Flt3 (y ekseni) ve kapı seçmek için:
Flt3- CD115lo hücreleri = > GMPs. - "GMP-Ly6C+ hücre CD115 görüntüleme", bir nokta çizim oluşturma (x ekseni) ve Flt3 (y ekseni) ve kapı seçmek için:
Flt3- CD115lo hücreleri = > GPs,
Flt3- CD115Merhaba hücreleri = > MPs + cMoPs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan iletişim kuralını kullanarak, kalça ve yırtılmalarıteşhis (2 bacaklar) bir C57BL/6J fare (6-8 hafta yaşlı, erkek veya kadın) (kırmızı kan hücreleri veya ~ 50 milyon çekirdekli hücre de dahil olmak üzere) ~ 100 milyon hücre elde etmek mümkündür. 1-2 milyon Lin- hücreleri fare Lin+ hücreleri MAC'ler tükenmesi tarafından ayrılmış olabilir.
Her biri 6 miyeloid progenitör alt kümeleri Lin % ~ 1-4'ü- hücreleri kabul ettiğiniz anlamına gelir. Soy tükenmesi farklılaşmış hücreler tüketen verimli ve ataları ama Lin- kesir için zenginleştirici c-Kit- hücreleri c-Seti+ ataları (Şekil 3A) yanı sıra büyük bir kısmı içerir. Dede FACS sıralama kullanılan sıralayıcısı ayarlarını (Örneğin, en uygun saflık karşı maksimum verim) bağlı olarak değişebilir, ancak genel olarak kesir (Şekil 3B) başına 10.000-40.000 hücreleri elde etmek mümkündür sonra verir. Sonrası sıralama Akış Sitometresi Analizi ortaya çıkarmak > her kesir (Şekil 3 c) saflığı % 95.
Şekil 2: 6 miyeloid progenitör kesirler tanımlaması için strateji geçişi. Gömlek (FSC) -> Canlı Lin- hücreleri aşamalı geçişi (A) -> gömlek (SSC) -> LKS- hücreleri -> CD34+ FcγRlo ("CMP") ve CD34+ FcγRMerhaba ("GMP") kesirler -> 6 myeloid Dede alt kümeleri. (B) özetini yüzey marker ifade tarafından 6 progenitör kesirler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: temsilcisi progenitör verimleri ve saflık. (A) temsilcisi akış sitometresi gösteren c-Kit ve kemik iliği hücreleri tarafından CD11b ifade önce ve sonra soy tükenmesi, ataları (c-Seti+ hücreleri) zenginlik gösteren çizer. (B) sunulan ortalama + 30 deneyler standart sapması her yaratıcı kısmı için hücre üretir. Kemik iliği hücrelerinden 20 fareler her deneme için havuza. (C) temsilcisi akış sitometresi FACS sıralanmış progenitör kesirler saflığı gösteren sonrası sıralama analizinden çizer. Paneli C Yáñez vd 20177' den değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Lazer | Kanal | Filtre | Ayna |
| 405 nm | A. | 670/30 | 635LP |
| B. | 525/50 | 505LP | |
| C. c-Kit-Pasifik mavi | 450/50 | ||
| 488 nm | A. (FSC) | ||
| B. Ly6C-PerCP-Cy5.5 | 710/50 | 690LP | |
| C. CD34-FITC | 525/50 | 505LP | |
| Ö SSC | 488/10 | ||
| 561 nm | A. ani kalp durması-1-PE-Cy7 | 780/40 | 750LP |
| B. | 710/50 | 690LP | |
| C. | 660/20 | 640LP | |
| Ö. | 610/20 | 600LP | |
| E. CD115-PE | 582/15 | ||
| 640 nm | A. FcϒR-APC-Cy7 | 780/60 | 750LP |
| B. | 730/45 | 690LP | |
| C. Flt3-APC | 670/30 |
Tablo 1: Antikor paneli ve akış sitometresi yapılandırma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fare miyeloid progenitör kimlik1 için strateji çoğunluğuna Weissman immunologists için altın standart ve hematologlar yaklaşık 20 yıl olmuştur, ama şimdi "Cumhuriyetçi millet partisi" ve "GMP" kapıları çok heterojen ve daha kesin belirgin Perdeleme stratejileri ihtiyaç vardır. Burada tarif var Protokolü oligopotent ve soy için kabul edilen alt kümeleri belirli miyeloid CSF'den daha kesin miktar ve eşleme myelopoiesis yollar, hem de incelenmesi için C57BL/6J farelerde izin verir moleküler mekanizmalar miyeloid farklılaşma belirli aşamalarında işletim. Dede alt kümeleri, isterseniz, moleküler analizleri için sıralanabilir farklılaşma vb vitro ve in vivo değerlendirilmesi
Protokol genç (6-8 haftalık) kullanılarak geliştirilen C57BL/6J fareler ve hem erkek hem de dişi fareler için uygundur. Biz yaratıcı alt kümeleri büyük farelerde nitelendirmiştir değil. Biz tahmin etme işaretleri yaşlandıkça değişecek, ancak alt kümeleri göreli orantılarını değişebilir. Diğer fare suşları içinde yaratıcı alt kümeleri değerlendirildi var değil.
Transkripsiyon faktörü interferon düzenleyici faktörü 8 (IRF8) tarafından mekanik myeloid hücre kader seçim Yönetmeliği içgörü sağlamak için değiştirilmiş gating stratejimizin ilk uygulama oldu2. IRF8 daha önce GMPs tarafından ifade edilecek rapor (Weissman "GMP" Kesir) ve monosit gen ekspresyonu teşvik, nötrofil gen ekspresyonu bastırmak ve nötrofil apoptosis10teşvik tarafından monosit farklılaşması için gerekli. Bizim değiştirilmiş gating strateji kullanarak, biz IRF8 oligopotent GMPs tarafından ifade değil ancak GPs ve MPs + cMoPs2tarafından ifade edilir gösterdi. Ayrıca, IRF8 oligopotent tarafından GMPs GP ve MP + cMoP hayatta kalma ve farklılaşma yerine lineage için kabul edilen ataları üretimini düzenler gösterdi. Benzer şekilde, biz son zamanlarda değiştirilmiş gating stratejimiz myelopoiesis modeli yeniden tanımlamak için kullanılan ve GMPs ve MDP'ler 2 bağımsız yolları7ile işlevsel olarak farklı inflamatuar monosit üretmek gösterdi.
Soy tükenmesi adım otomatik bir manyetik ayırıcı yerine el ile manyetik ayırıcı kullanılarak gerçekleştirilebilir ve soy tükenmesi de biotinylated lineage marker antikor kokteyl kullanarak akış sitometresi tarafından elde edilebilir ve bir günahı hücreleri seçmek için geçişi ile fluorophore Birleşik Anti-biotin antikor. Soy tükenmesi en farklılaşmış hücreler dışlar ve zaman ve (Yani, antikor birimleri için akış sitometresi, analyzer/sıralayıcısı zaman, azaltır sonraki adımlarla ilgili maliyetleri en aza indirmek c-Seti+ ataları için zenginleştirir vb). Müfettişler olabildiğince verimli beklenen belirli kit için çalıştı soy tükenmesi adım kullanılmış olup olmadığını belirlemek için üreticinin veri sayfasına bakmalıdır. Soy tükenmesi (LIN+) hücreleri Ayrıştırılan çünkü etkili % 100 c-Kit, herhangi bir soy tükenmesi sonra kalan farklılaşmış hücreler (aynı zamanda diğer c-Kit- hücreleri) daha sonra çoğu ifade yoktur değilse ancak, önemli değil Akış Sitometresi çoğunluğuna göre söz konusu. GPs ve MPs hızlı Ly6C ama, Ly6C farklı olarak monosit, yaratıcı Ly6C ifade olduğunu unutmamak önemlidir (muhtemelen farklı bir izoformu) kez soy tükenmesi kitleri dahil Gr-1 antikor tarafından algılanmaz ve böylece GPs ve MPs sonra kalan soy tükenmesi2.
İyi boyama yüzey işaretleri için önemli, ama doğru FcγRlo "CMPs" ve FcγRMerhaba "GMPs" çoğunluğuna izin vermek FcγR için özellikle önemlidir. En iyi fluorophore seçim ve antikor seyreltme iyi ayrılması için önemlidir ve (yaygın olarak kullanılan akış sitometresi için boyama önce) bir FcγR engelleme reaktif gerekir değil var olmak kullanılmış. Ne zaman iyi boyama elde etmek için hızlı bir şekilde çalışmak önemlidir bu yüzden hücreleri 4° C'de veya buz üzerinde uzun süre korunur CD115 downregulated olduğuna dikkat etmek önemlidir. Hücreleri kendi bütünlüğünü korumak için 1-2 saat içinde işleme tavsiye ediyoruz. Canlı hücreler gerekli değildir lekeli hücreleri sabit ve 48 saat içinde satın aldı.
İzole kesirler önemli sayıda ölü hücre içeriyorsa, bu muhtemelen kombinasyonu bir değişiklik gerektiren ancak daha doğru bir şekilde canlı hücreleri, kapı için bir canlılık boya (Örneğin, propidium iyodür) dahil etmek mümkündür fluorochrome-Birleşik antikorlar. İstenirse, hücre sayımları için akış sitometresi örneği için bilinen bir konsantrasyon, sayım boncuk ekleyerek hesaplanır. Sayım boncuk hücrelerden FSC-BIR ve SSC veya onların yüksek floresan yoğunluğu ayırt edilebilir floresan lateks boncuk vardır. Hücre sayıları aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanabilir:
(hücre olaylar sayısı / boncuk olayları sayısı) x (örnek için eklenen boncuk sayısı / μL örnek hacmi) örnek konsantrasyon hücreleri/μL olarak =
Bir geçerli protokol kısıtlamasıdır MPs ve bu ataları, onların gen ekspresyonu ve fonksiyonel özellikleri, vb Örneğin, soruşturma değerlendirilmesi için sadelik cMoPs ayrı tanımlaması izin vermez bir gözlenen artış MP + cMoP numaraları gelişmiş monosit üretimi GMP yolu, MDP yolu veya her ikisi ile oluşup oluşmadığını göstermez. Devam eden çalışmalarda, MPs ve cMoPs ayırt yüzey işaretleyicileri tanımlamak umuyoruz. Bu arada, bu ataları tek hücreli RNA sıralama7 tarafından değerlendirilmesi MPs ve cMoPs göreli orantılarını profil için kullanılabilir.
Tek hücreli RNA sıralama çalışmaları büyük olasılıkla aynı zamanda bazıları farklı olgunlaşma Örneğin, ancak son zamanlarda monosit kaybetmiş GPs Devletler yansıtır bu protokol için açıklanan 6 progenitör kesirler içinde ek heterojenite ortaya çıkaracaktır potansiyel farklılaşma sonraki aşamaya devam etmek için gurur duyuyoruz GPs karşı. "GMP" kesir alt kümeleri ayrıca ataları ile diğer granülosit (eozinofil, bazofil ve mast hücreleri) üretmek için potansiyel içerebilir, ancak bu araştırdık değil. Giriş bölümünde de belirtildiği gibi aynı zamanda olup CMP-Flt3+ CD115lo, CMP-Flt3- ve MDP kesirler gerçekten tahmin edilen oligopotent ataları içeren veya alternatif olarak CSF'den daha fazla karışımı oluşturan şu anda belli değil sınırlı lineage potansiyel ama tek hücreli RNA sıralama bu önemli soru içgörü sağlayabilir.
Şimdi yeni bir yaklaşımdır insan miyeloid ataları alt kümelerine tanımlanması için gerekli. Weissman ve arkadaşları daha önce ("CMPs" ve "GMPs" de dahil olmak üzere) miyeloid insan kemik iliği ve kordon kanı11alt kümelerinden, ama onlar aynı şekilde heterojen. Ne yazık ki, insan ataları stratejileri çoğunluğuna fare tercümesi yüzey marker ifade insan arasında dikkate değer farklılıklar tarafından karmaşıktır ve fare ataları; Örneğin, CD34 ifade fare miyeloid progenitör alt kümeleri sınırlı ama daha geniş hematopoetik kök hücre de dahil olmak üzere insan ataları üzerinde gözlenen. Tek hücreli RNA sıralama çalışmalar ancak, aynı zamanda insan progenitör alt kümeleri ayırmak için aday işaretleri tanımlanmasına izin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu iletişim kuralı bir Amerikan Immunologists Derneği (için AY ve HSG) İmmünoloji dostluk kariyer ve bilim adamı Ödülü'bir para yönetim kurulu, Vali Rejeneratif Tıp Enstitüsü Cedars-Sinai Tıp Merkezi (HSG), kullanılarak geliştirilen Hematoloji (AY için) American Society. Akış Sitometresi çekirdek Cedars-Sinai Tıp Merkezi FACS sıralama ile yardım için teşekkür.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2) | The Jackson Laboratories | Cat#JAX:000664 | |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | Cat#130-090-858 | |
| Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC | BD Biosciences | Cat#553733 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 (FcγR; clone 93) APC-Cy7 | BioLegend | Cat#101327 | |
| Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7 | BioLegend | Cat#108114 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue | BioLegend | Cat#105820 | |
| Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5 | BioLegend | Cat#128012 | |
| Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE | BioLegend | Cat#135506 | |
| Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC | BD Biosciences | Cat#560718 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Thermo Fisher Scientific | Cat#C36950 | |
| AutoMACS Separator | Miltenyi Biotec | N/A | Use the "deplete" program |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | N/A | 5 lasers, 15 colors |
| BD FACS Aria III cell sorter | BD Biosciences | N/A | 5 lasers, 13 colors |
| FlowJo | FlowJo, LLC | https://www.flowjo.com | For further analysis of the .fcs files |
References
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).
- Yáñez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production. Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).
- Auffray, C., et al. CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation. Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 (2006).
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).
- Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).
- Yáñez, A., et al. Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes. Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).
- Olsson, A., et al. Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice. Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).
- Yáñez, A., Goodridge, H. S. Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production. Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
