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Chemistry

एक तेजी से Bioorthogonal प्रतिक्रिया के माध्यम से एंटीबॉडी-ड्रग Conjugates की पीढ़ी के लिए एक गैर-विहित अमीनो एसिड की आनुवंशिक एंकोडिंग

Published: September 14, 2018 doi: 10.3791/58066
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1
1Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology

Summary

एंटीबॉडी में lysine के व्युत्पंन एक cyclopropene शामिल साइट की अनुमति देता है, tetrazine असर अणुओं के विशिष्ट, तेजी से और कुशल संपर्क एंटीबॉडी-दवा conjugates उत्पंन करने के लिए ।

Abstract

एंटीबॉडी-ड्रग conjugates (ADCs) नैदानिक अभ्यास में आजकल इस्तेमाल किया एंटीबॉडी विभिंन पदों पर विषाक्त पदार्थों की एक अलग संख्या से जुड़े अणुओं के मिश्रण हैं । नैदानिक अध्ययन से पता चला है कि इन पारंपरिक ADCs के चिकित्सीय सूचकांक विषाक्त पदार्थों के साइट विशेष संबंध द्वारा सुधार किया जा सकता है । हालांकि, वर्तमान दृष्टिकोण सजातीय ADCs उत्पादन करने के लिए कई सीमाएं हैं, जैसे कि कम प्रोटीन अभिव्यक्ति और धीमी प्रतिक्रिया कैनेटीक्स । इस प्रोटोकॉल में हम वर्णन कैसे स्थापित करने के लिए एक अभिव्यक्ति प्रणाली को शामिल करने के लिए एक cyclopropene व्युत्पंन lysine (CypK) एंटीबॉडी में आनुवंशिक कोड के विस्तार का उपयोग कर । इस मिनिमल bioorthogonal संभाल एक व्युत्क्रम मांग Diels-Alder cycloaddition के माध्यम से tetrazine डेरिवेटिव के तेजी से विकार की अनुमति देता है । यहां अभिव्यक्ति प्रणाली की रिपोर्ट सतही उत्पादन और भारी श्रृंखला में से प्रत्येक में trastuzumab असर CypK के शोधन सक्षम बनाता है । हम बताते है कि कैसे विष को एंटीबॉडी लिंक करने के लिए monomethyl auristatin ई और hydrophobic इंटरेक्शन क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा immunoconjugate की विशेषताएं । अंत में, हम dihydropyridazine विकार से उत्पंन लिंकेज के मानव सीरम में स्थिरता का आकलन करने के लिए और HER2 रिसेप्टर के उच्च स्तर के साथ स्तन कैंसर कोशिकाओं के लिए ADC के चयनात्मक cytotoxicity परीक्षण करने के लिए परख का वर्णन.

Introduction

एंटीबॉडी-औषध conjugates (ADCs) के selectivity से जुडा है और छोटे साइटोटोक्सिक अणुओं की शक्ति । सबसे ADCs उद्देश्य दवाओं है कि डीएनए या microtubule बहुलकीकरण कैंसर कोशिकाओं को प्रभावित लक्ष्यीकरण द्वारा पारंपरिक कीमोथेरेपी के दुष्प्रभाव कम करने के लिए1। पहली पीढ़ी के खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) द्वारा अनुमोदित ADCs lysines और cysteines, जो कम pharmacokinetic गुण2के साथ विभिंन पदों पर संशोधित अणुओं के मिश्रण उत्पंन के संशोधन पर भरोसा करते हैं । इसके विपरीत, साइट विशेष विकार दवाओं के एंटीबॉडी के लिए सुधार चिकित्सकीय indeces3,4के साथ यौगिकों उत्पंन कर सकते हैं । सजातीय ADCs उत्पादन की चुनौती का पता करने की मांग, कई चुनिंदा रासायनिक और एंजाइमी संशोधनों1,5रिपोर्ट किया गया है । हालांकि, वर्तमान तरीके एंटीबॉडी पर केवल कुछ स्थिति लक्षित कर सकते हैं, कम प्रोटीन अभिव्यक्ति से पीड़ित, कम स्थिरता के साथ लिंक प्रदान, या धीमी और कम उपज प्रतिक्रियाओं पर भरोसा करते हैं ।

गैर का निगमन-विहित अमीनो एसिड (ncAA) आनुवंशिक कोड के विस्तार के माध्यम से सक्षम बनाता है साइट-प्रोटीन में bioorthogonal प्रतिक्रियाशील समूहों की एक बहुतायत की विशिष्ट अधिष्ठापन, संभावित अंय उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों की सीमाओं पर काबू पाने ADCs. एक लक्ष्य (stop) codon के जवाब में ncaas एंकोडिंग aminoacyl पर निर्भर करता है-tRNA synthetase/tRNA जोड़े कि ओर्थोगोनल जोड़े कि विहित अमीनो एसिड6को शामिल करने के लिए अंतर्जात हैं । कई ncaas एंटीबॉडी में शामिल किया गया है ADCs उत्पंन करते हैं । तथापि, अधिकांश चिकित्सीय औषध विकार में आवेदनों के लिए विभिन्न देयताओं से पीड़ित हैं. पी-acetylphenylalanine (pAcF)7,8 पूरी तरह से bioorthogonal नहीं है, कम पीएच (४.५) और लंबी प्रतिक्रिया समय (> ६० एच) की आवश्यकता है, जबकि azides जैसे पी-azidophenylalanine (pAzF)7,9,10, पी-azidomethylphenylalanine (pAMF)11, और lysine (AzK)12,13 के एक azide व्युत्पंन सेल14में कम हो सकता है, और तांबे उत्प्रेरित Huisgen cycloadditions के लिए इस्तेमाल ऑक्सीडेटिव नुकसान पैदा कर सकता है 15.

हालांकि ट्रांस cyclooctene (TCO), cyclooctyne (एससीओ) और bicyclo [6.1.0] nonene (BCN) पर आधारित वैकल्पिक ncaas हाल ही में जैव इमेजिंग प्रयोजनों के लिए एक एंटीबॉडी में इनकोडिंग गया है, अभिव्यक्ति प्रणाली बहुत कम पैदावार से ग्रस्त है (०.५ mg/L)16. इसके अलावा, cyclooctenes और cyclooctynes बड़े और hydrophobic हैंडल हैं जो एकत्रीकरण के लिए एडीसी की संवेदनशीलता को बढ़ा सकते हैं-एडीसी पेलोड परंपरागत रूप से hydrophobic हैं और लिंकर के भौतिक गुणों को काफी दिखाया गया है प्रभाव फार्माकोकाइनेटिक्स और चिकित्सीय सूचकांक17। इसके विपरीत, 1, 3-disubstitued cyclopropenes छोटे प्रतिक्रियाशील समूह है कि प्रोटीन संरचना और physichochemical गुण18में ंयूनतम परिवर्तन का कारण होना चाहिए रहे हैं । Cyclopropenes चुनिंदा और तेजी से एक व्युत्क्रम इलेक्ट्रॉन के माध्यम से tetrazines के साथ प्रतिक्रिया-मांग Diels-Alder cycloaddition19। इस प्रोटोकॉल में हम lysine के व्युत्पंन का उपयोग करें (CypK, आंकड़ा 1b) एक मिथाइल-cyclopropene है कि कम steric बाधा से बड़ा तनावपूर्ण संतृप्त चक्र से प्रभावित है और एक प्रतिक्रिया की दर 1-30 एम के क्रम में लगातार है असर-1s -1 जलीय मीडिया में18,20।

हमने हाल ही में बताया कैसे एंटीबॉडी में CypK को शामिल करने के लिए इस ंयूनतम bioorthogonal tetrazine के साथ संभाल-21अणुओं असर द्वारा ADCs उत्पंन करते हैं । यहाँ हम सबसे चुनौतीपूर्ण चरणों पर जोर देने के साथ और अधिक विस्तार में ADC तैयारी प्रक्रिया का वर्णन. CypK के शामिल एक pyrrolysyl-tRNA synthetase (PylRS)/tRNA कूए (PylT) जोड़ीएक एंबर codon भारी श्रृंखला (कोर्ट)22में पेश करने के लिए जवाब में का उपयोग करने का निर्देश दिया है । यहाँ हम क्षणिक अभिकर्मक के लिए दो plasmids का उपयोग करें (आंकड़ा 1a), एक एंटीबॉडी की भारी श्रृंखला एन्कोडिंग और अन्य एक प्रकाश श्रृंखला एन्कोडिंग (नियंत्रण रेखा), दोनों PylRS/PylT कैसेट युक्त. वैकल्पिक रूप से, उच्च एंटीबॉडी पैदावार सक्षम करता है एक स्थिर कक्ष रेखा से अधिक श्रमसाध्य प्रक्रिया21के माध्यम से उत्पन्न किया जा सकता है ।

aforementioned अभिव्यक्ति प्रणालियों चिकित्सीय विरोधी HER2 immunoglobulin 1 (IgG1) trastuzumab CypK के साथ जंगली प्रकार एंटीबॉडी के समान स्तर पर उत्पादन कर सकते हैं । हम भारी श्रृंखला के ncAA (HC-118TAG) सांकेतिक शब्दों में बदलना करने पर CH1 डोमेन की पहली स्थिति का चयन किया । इस ADCs23 में सबसे अधिक संशोधित साइट है और एचसी-११८ (यूरोपीय संघ क्रमांकन) के रूप में जाना जाता है, लेकिन यह भी एचसी-१२१ (अनुक्रम स्थिति) और hc-११४ (Kabat क्रमांकन)24के रूप में भेजा गया है । चूंकि यह स्थिति सभी IgG1s भर में संरक्षित है, इन अभिव्यक्ति प्रणालियों सबसे चिकित्सीय एंटीबॉडी के लिए उत्तरदायी होना चाहिए.

हम trastuzumab (CypK)2 शो आसानी से एक hydrophobic बातचीत कॉलम (FPLC-HIC) के साथ तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा पीछा प्रोटीन द्वारा शुद्ध किया जा सकता है । बाद में एंटीबॉडी covalently 3 ज के भीतर जुड़ा हुआ है microtubule बहुलकीकरण अवरोध करनेवाला monomethyl auristatin E (MMAE), जो एफडीए अनुमोदित ADC Adcetris में प्रयोग किया जाता है. यहां हम एक benzyl-tetrazine MMAE के व्युत्पंन का उपयोग करें (tetrazine-vcMMAE) एक glutarate स्पेसर और एक वैलिन-citrulline-labile एक पीaminobenzylalcohol स्व-immolative इकाई के बाद घटक शामिल एक linker के साथ; इस लिंकर Cathepsin बी द्वारा lysosome में ADC के internalization विष25के स्ट्रेस्ड रिलीज में जिसके परिणामस्वरूप से सट गया है. प्रतिक्रिया का व्यापक दायरा दिखाने के लिए एंटीबॉडी को fluorophore tetramethylrhodamine (तमृ) से भी जोड़ा गया है । हम बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS) के लिए युग्मित तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा संयुग्मी की पहचान को सत्यापित करने के लिए और एक क्रोमैटोग्राफी बातचीत कॉलम (hydrophobic-HPLC) के साथ उच्च प्रदर्शन तरल HIC का उपयोग कर दवा के लिए एंटीबॉडी अनुपात (डार) की गणना करने के लिए कैसे समझाओ .

एंटीबॉडी प्रदर्शन के लक्षण वर्णन के भाग के रूप में, हम का वर्णन कैसे मानव सीरम में dihydropyridazine लिंकेज की स्थिरता का परीक्षण करने के लिए । यह पैरामीटर trastuzumab-तमृ में अधिक आसानी से मूल्यांकन किया जाता है क्योंकि यह एक साधारण एलिसा द्वारा quantified जा सकता है और परिणामों की व्याख्या को trastuzumab (MMAE)2के टीज़ labile घटक द्वारा जटिल नहीं है । अंत में, selectivity और trastuzumab की शक्ति (MMAE)2 HER2 के विभिन्न स्तरों व्यक्त सेल लाइनों में ADC के cytoxicity की तुलना द्वारा मूल्यांकन किया गया है. यह परख भी ADC स्थिरता के एक कार्यात्मक सबूत प्रदान करता है जब मानव सीरम में immunoconjugateing के बाद प्रदर्शन किया ।

Protocol

1. उत्पादन और एंटीबॉडी की विशेषताएं

  1. एंटीबॉडी व्यक्त
    1. २५० मिलीलीटर की कुप्पी में HEK सस्पेंशन कोशिकाओं की एक शीशी, जिसमें ५० मिलीलीटर की अभिव्यक्ति मध्यम से पूरक है १०० इकाइयों/एमएल पेनिसिलिन, १०० µ g/एमएल streptomycin, और २५० एनजी/एमएल amphotericin बी. कोशिकाओं के साथ ३७ ° c पर रखें 8% सह2 के साथ humidified में सुसज्जित १२५ rpm पर एक शेखर के साथ । कक्षों को 0.3-0.5 x 106 कक्षों/एमएल (हर 2-3 दिन) के लिए विभाजित कम से transfecting पहले 2 बार ।
    2. जब घनत्व २.५ x 106 कोशिकाओं/एमएल (2-3 दिन बंटवारे के बाद) तक पहुंच गया है, १०० mM CypK का एक ताजा समाधान तैयार करते हैं । इस प्रयोजन के लिए, CypK के ६४ मिलीग्राम वजन, ०.१ सोडियम हीड्राकसीड की २.५ मिलीलीटर जोड़ने, भंवर, नीचे स्पिन सभी undissolved कणों और sonicate ठीक करने के लिए ।
    3. CypK के २.५ मिलीलीटर जोड़ें (१०० मिमी में ०.१ एम NaOH) के लिए ४२.५ मिलीलीटर की अभिव्यक्ति मध्यम एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक । अच्छी तरह से मिक्स, ०.१ एम एचसीएल के २५० µ एल जोड़ें, और एक ०.२२ µm फिल्टर का उपयोग कर निष्फल ।
    4. कम सीरम मध्यम के साथ एचसी और LC pKym1 plasmids21 से २.५ मिलीलीटर के µ जी पतला । एक अलग ट्यूब में, कम सीरम माध्यम के साथ २.५ मिलीलीटर के लिए अभिकर्मक रिएजेंट के १३५ µ एल पतला ।
    5. समाधान तैयार करने के बाद पांच मिनट, plasmids और अभिकर्मक रिएजेंट समाधान और 20 मिनट के लिए मशीन डीएनए और अभिकर्मक रिएजेंट के बीच परिसर के गठन की अनुमति मिश्रण ।
    6. इस बीच में, ५०० एक्स जी में 5 मिनट के लिए लक्ष्य घनत्व पर १२५,०००,००० कोशिकाओं के केंद्रापसारक, CypK युक्त अभिव्यक्ति माध्यम के साथ resuspend और डीएनए-अभिकर्मक एजेंट मिश्रण जोड़ें । CypK खरीदा जा सकता है या संश्लेषित के रूप में पहले18की सूचना दी ।
    7. 20 घंटे के लिए कोशिकाओं को मशीनिंग के बाद, अभिकर्मक एजेंट बढ़ाने किट में शामिल की २५० µ एल जोड़ें ।
    8. CypK के अलावा supernatant 6-7 दिनों से फसल एंटीबॉडी (अभिव्यक्ति के दौरान मध्यम की कोई परिवर्तन की आवश्यकता है).
      * वैकल्पिक रूप से, उच्च और अधिक सुसंगत पैदावार प्राप्त करने के लिए, एक स्थिर सेल-लाइन Oller-Salvia एट अल में वर्णित के रूप में उत्पंन किया जा सकता है । २०१८21. इस मामले में, trastuzumab (CypK)2 अभिव्यक्ति माध्यम में CypK 5 मिमी के अलावा बस द्वारा व्यक्त किया जाता है ।
  2. एंटीबॉडी को शुद्ध
    1. ३००० x g पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं के केंद्रापसारक
    2. supernatant को ०.४५ या ०.२२ µm फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर करें । यदि फ़िल्टर occluded हो जाता है, तो इसे एक नए के लिए बदलें और फ़िल्टरिंग जारी रखें । यदि यह केवल कुछ मिलीलीटर के बाद होता है, ७००० एक्स जी में एक अतिरिक्त 15 मिनट के लिए supernatant केंद्रापसारक
    3. एक खाली क्रोमैटोग्राफी कॉलम में प्रोटीन एक राल (2 मिलीलीटर/supernatant के 100 मिलीलीटर) जोड़ें और मनका धोने बफर के कम से कम 5 संस्करणों के साथ राल equilibrate (०.१ एम सोडियम फॉस्फेट, १५० mM NaCl) ।
    4. २ ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में supernatant भाजित और 5x मनका धोने बफर (०.५ एम सोडियम फॉस्फेट, १५० mM NaCl) पूर्व equilibrated प्रोटीन एक राल के बाद जोड़ें । supernatant में एंटीबॉडी को नीचे खींचने के लिए कमरे के तापमान पर 3 घंटे के लिए एक रोलर पर शंकु ट्यूब रखें ।
      वैकल्पिक रूप से: के साथ कॉलम पर supernatant जोड़ें कम से डबल राल की मात्रा की सिफारिश की और के माध्यम से प्रवाह की अनुमति । सुनिश्चित करें कि वहां एसडीएस द्वारा supernatant में छोड़ दिया एंटीबॉडी की एक महत्वपूर्ण राशि-पृष्ठ नहीं है । अगर वहां है, elute राल के माध्यम से supernatant एक बार फिर से ।
    5. स्थानांतरण प्रोटीन एक कॉलम में supernatant के साथ एक राल और तरल के माध्यम से प्रवाह के लिए अनुमति देते हैं ।
    6. धोने बफर के 25 मिलीलीटर जोड़ें (या कम से कम 10 राल मात्रा) और के माध्यम से प्रवाह करने की अनुमति ।
    7. Elute ०.१ एम सोडियम साइट्रेट के 4 मिलीलीटर के साथ एंटीबॉडी, पीएच 3, 1 एम फॉस्फेट बफर, १५० mM NaCl के 1 मिलीलीटर पर ।
    8. पंजाब के 10 मिलीलीटर के साथ एंटीबॉडी पतला, केंद्रापसारक निस्पंदन द्वारा 0.5-1 मिलीलीटर के लिए ध्यान केंद्रित है, और विनिमय बफर पंजाबियों के साथ तीन बार ।
    9. FPLC द्वारा नमूने शुद्ध ०.५ मिलीलीटर के प्रवाह के साथ एक butyl HIC कॉलम का उपयोग कर/मिनट और कम नमक बफर के 30 मिनट में 0-100% ढाल (५० mM सोडियम फॉस्फेट पीएच ७.०, 20% isopropanol) में उच्च नमक बफर (१.५ मीटर (NH4)2तो4, ५० मिमी सोडियम फॉस्फेट पीएच ७.० , 5% isopropanol) । सभी भागों लीजिए और २८० एनएम पर रेफरेंस की निगरानी । उपज और शुद्धता को अधिकतम करने के लिए २.४ में वर्णित शर्तों के तहत छोटी मात्रा (< 1 mg) को HPLC-HIC से शुद्ध किया जा सकता है ।
    10. पूल भागों है कि एंटीबॉडी होते हैं, उंहें पंजाबियों के साथ ंयूनतम 4 मिलीलीटर से पतला, उंहें केंद्रापसारक निस्पंदन और विनिमय बफर द्वारा ध्यान केंद्रित तीन बार पंजाबियों के साथ ।
  3. एंटीबॉडी को बढ़ाता है
    1. एक सूक्ष्म मात्रा spectrophotometer का उपयोग कर २८० एनएम पर अवशोषक को मापने के द्वारा एक अनुमानित एकाग्रता प्राप्त करें ।
    2. एक सटीक माप की आवश्यकता है, तो मानव IgGs को मापने के लिए एक एलिसा किट का उपयोग करें । किसी न किसी अनुमान के लिए, का उपयोग करें एसडीएस-पृष्ठ के साथ एक Coomassie-आधारित दाग निम्नानुसार:
      1. कमजोर द्वारा मानकों को तैयार छह बार दो गुना एक trastuzumab मानक quantified एलिसा द्वारा 1 मिलीग्राम/
      2. मानकों और लगभग ०.२५ मिलीग्राम/एमएल पर लोड बफर को कम करने में नमूने उबाल लें ।
      3. उंहें एक 4-12% बीआईएस-Tris एसडीएस में भागो एमईएस-एसडीएस बफर और एक Coomassie आधारित डाई के साथ दाग का उपयोग कर पृष्ठ । अंत में प्रकाश या भारी श्रृंखला ImageJ का उपयोग करने के लिए इसी बैंड के रंग घनत्व को मापने और मानक वक्र में नमूनों से संकेत लगाना ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर एंटीबॉडी स्टोर ।

2. संयुग्मी एंटीबॉडी और ADC विशेषताएं

  1. tetrazine-असर अणु के साथ एंटीबॉडी संयुग्मी
    1. tetrazine के 10 दाढ़ समकक्ष पतला-vcMMAE (4 µ एल, dimethyl sulfoxide में ३.४ मिमी (DMSO)) µ के 20 acetonitrile एल और एक छोटे शंकु ट्यूब (जैसे,पीसीआर ट्यूब) में पंजाब के ७६ µ एल के साथ ।
    2. जोड़ें 1 दाढ़ trastuzumab के समकक्ष (CypK)2 (१०० µ एल, 2 मिलीग्राम/पंजाब में एमएल), अच्छी तरह से मिश्रण, और कमरे के तापमान पर 3 ज के लिए प्रतिक्रिया करने की अनुमति (25 ° c) trastuzumab (MMAE)2फार्म के लिए ।
      नोट: tetrazine-5-तमृ जैसे अन्य अणुओं को इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके tetrazine-vcMMAE के बजाय एंटीबॉडी से जोड़ा जा सकता है ।
  2. एडीसी को शुद्ध
    1. पूर्व equilibrate के निर्माता के निर्देशों का पालन के साथ एक आकार अपवर्जन स्पिन कॉलम ।
    2. स्पिन कॉलम पर प्रतिक्रिया की पूरी मात्रा जोड़ें और 1 मिनट के लिए १५०० x g पर केंद्रापसारक ।
  3. ADC मात्रा और एसडीएस द्वारा संयुग्मी का विश्लेषण-पृष्ठ
    1. 1.3.2 में वर्णित के रूप में ADC बढ़ाता है । मानक वक्र के लिए गैर संशोधित एंटीबॉडी का उपयोग कर एक एसडीएस-पृष्ठ पर प्रकाश श्रृंखला के रंग घनत्व को मापने के द्वारा ।
    2. भारी श्रृंखला थोड़ा विकार पर आणविक वजन में वृद्धि दिखा स्थानांतरित कर दिया जाना चाहिए ।
      नोट: एंटीबॉडी trastuzumab (तमृ)2में जैसे एक fluorophore के साथ संशोधित किया गया है, तो केवल भारी श्रृंखला के लिए इसी बैंड धुंधला होने से पहले जेल प्रतिदीप्ति में दिखाना चाहिए.
  4. HPLC द्वारा संयुग्मी का विश्लेषण-HIC
    1. Equilibrate HPLC-HIC कॉलम के साथ १००% बफर एक (१.५ मीटर (NH4)2तो4, ५० mM सोडियम फॉस्फेट पीएच ७.०, 5% isopropanol) 5 मिनट के लिए ।
    2. मिश्रण 15 µ एल (६७ pmol) के एक 1 मिलीग्राम/एमएल समाधान की 15 µ एल के साथ एक शीशी में 2x बफर a के trastuzumab (CypK) 2 । फिर HPLC में एक 10 µ एल इंजेक्शन प्रोग्राम ।
    3. Elute में एक isocratic 1 मिलीलीटर/१००% बफर के साथ एक 1 मिनट के लिए एक 15 मिनट के लिए एक बफर बी में से 0% (५० mM सोडियम फॉस्फेट पीएच ७.०, 20% isopropanol २८० एनएम पर रेफरेंस की निगरानी करें ।
    4. प्रत्येक प्रजाति के लिए इसी चोटी को एकीकृत करने और निम्नलिखित समीकरण में आने वाले क्षेत्रों का उपयोग करके डार की गणना:
      DAR = (1x trastuzumab (MMAE) + 2x trastuzumab (MMAE)2)
      /(trastuzumab (MMAE)0 + trastuzumab (MMAE)1 + trastuzumab (MMAE)2)
      trastuzumab (CypK)2 के लिए अपेक्षित अवधारण समय 7.5-8.0 मिनट है, trastuzumab (CypK, MMAE) के लिए 9.1-9.6 मिनट है, और trastuzumab (MMAE)2 के लिए 10.5-9.0 मिनट है ।
  5. नियंत्रण रेखा से संयुग्मी का विश्लेषण-MS
    1. Deglycosylate 30 µ एल के 1 मिलीग्राम/एमएल एडीसी और २५० PNGase एफ इकाइयों का उपयोग करने में गैर-कम से कम 6 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर संशोधित एंटीबॉडी ।
    2. Elute एंटीबॉडी में जन स्पेक्ट्रोमीटर में एक C4 1-5 µm १.० x १०० mm कॉलम 2% की एक 20 मिनट ढाल का उपयोग कर पानी में ८०% acetonitrile । 150v की एक शंकु वोल्टेज के साथ सकारात्मक आयन मोड में 350-4000 के एक एम/जेड श्रेणी से अधिक डेटा प्राप्त ।
    3. Deconvolute उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर रॉ डेटा । संशोधित और संशोधित एंटीबॉडी के बीच द्रव्यमान में अंतर की गणना ।

3. Trastuzumab में Dihydropyridazine लिंकेज की परख स्थिरता (तमृ) सीरम में2

  1. बाँझ शर्तों के तहत एक ०.२२ माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर सीरम फ़िल्टर. आप जोड़ सकते हैं १०० इकाइयों/एमएल पेनिसिलिन, और १०० μg/एमएल streptomycin ।
  2. एक ९६-पानी के साथ अच्छी तरह से प्लेट के बाहरी कुओं भरें । केंद्रीय कुओं में, तपसिल ९० µ एल में मिश्रण 1 मिलीग्राम/एमएल trastuzumab (तमृ)2 के 10 µ एल के साथ एक अंतिम एकाग्रता पर पंजाब में ०.१ मिलीग्राम/ एक मशीन में प्लेट प्लेस ३७ ° c और 4-5% CO2पर आर्द्रता के साथ संतृप्त ।
  3. हर 24 घंटे भर में 5 दिन, एक अच्छी तरह से प्लास्टिक मिश्रण करने के लिए, एक 5 µ एल aliquot ले, फ्लैश-तरल नाइट्रोजन के साथ फ्रीज, और दुकान पर-८० ° c ।
  4. एक बार सभी नमूनों एकत्र किया गया है, गल aliquots और विश्लेषण के रूप में एक अप्रत्यक्ष एलिसा का उपयोग पहले के रूप में कुछ संशोधनों के साथ12 की सूचना:
    1. कोट 4 डिग्री सेल्सियस पर ०.२५ µ जी/एमएल HER2 के साथ रात भर एक ९६-अच्छी तरह से थाली । अंय सभी कदम कमरे के तापमान पर प्रदर्शन कर रहे हैं ।
    2. अगले दिन पर, पंजाब ०.०५% के बीच (पंजाबियों-टी) और 1 एच के लिए 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन के साथ ब्लॉक के साथ 5 बार धो लें ।
    3. धो और 2 ज के लिए पंजाब में 1:10000 कमजोर पड़ने पर नमूनों की मशीन ।
    4. धोने और एक विरोधी तमृ एंटीबॉडी में माउस में उठाया 1:2000 कमजोर पड़ने में पंजाब-1 एच के लिए ०.५% BSA के साथ टी ।
    5. धोने और एक विरोधी माउस एचआरपी संयुग्मी 1:1000 में पंजाब-टी ०.५% BSA के साथ 1 ज के लिए ।
    6. TMB जोड़ें और 5-10 मिनट प्रतिक्रिया की अनुमति देते हैं ।
    7. बंद करो प्रतिक्रिया के साथ ५० µ एल एच2तो4 1 M और उपाय अवशोषक पर ४५० एनएम । घटाना पृष्ठभूमि ५७० एनएम पर मापा ।
    8. नमूनों से मानक कमजोर पड़ने और लगाना माप के लिए एक 4-पैरामीटर रसद प्रतिगमन वक्र फिट ।
      नोट: trastuzumab की स्थिरता (MMAE)2 एक वाणिज्यिक एलिसा किट के लिए ADC की एकाग्रता को मापने के लिए ३.३ में वर्णित परख बदलकर एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है ।

4. ADC के Cytotoxicity का आकलन

नोट: इस प्रोटोकॉल पर आधारित है पहले की रिपोर्ट परख23,26 कुछ संशोधनों के साथ ।

  1. गल SK-BR-3 और MCF-7 कोशिकाओं और उन्हें पूरा माध्यम से p25 कुप्पी में बसने के लिए अनुमति देते हैं, यानी DMEM 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम, १०० इकाइयों/एमएल पेनिसिलिन और १०० µ g/एमएल streptomycin के साथ पूरक ।
  2. 80-90% संगम पर कोशिकाओं को विभाजित (हर 3-4 दिन) से कम 2 बार पहले परख ।
  3. दो दिन पूर्व परख कर एक ९६ के बाहरी कुओं को पानी के साथ अच्छी तरह से प्लेट में भरें । फिर ०.५ mM EDTA में ०.०५% trypsin के साथ कोशिकाओं को लिफ्ट, २५० एक्स जी में 3 मिनट के लिए, नए माध्यम और बीज १०० में ३००० कोशिकाओं में resuspend µ एल प्रति (खाली) अच्छी तरह से ९६ में अच्छी तरह से प्लेटें ।
  4. दो दिन कोशिकाओं को बोने के बाद, पूर्ण माध्यम में ०.१% DMSO के साथ तपसिल में सभी नमूनों के 10 धारावाहिक कमजोर पड़ने की तैयारी करें. निम्नलिखित नमूनों और नियंत्रणों पर विचार करें: trastuzumab (MMAE)2, trastuzumab (CypK)2, trastuzumab वाइल्ड टाइप, tetrazine-vcMMAE और MMAE ।
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से और ३७ डिग्री सेल्सियस और 4-5% सह2पर 5 दिनों के लिए मशीन में प्रत्येक नमूने के १०० µ एल जोड़ें ।
  6. 5 दिन पर, माप सेल व्यवहार्यता । इस अंत करने के लिए, एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं और लाइसे जारी एटीपी उपाय । ०.१% DMSO के साथ इलाज कक्षों को नियंत्रित करने के संबंध में संकेत का प्रतिशत प्लॉट करें ।
    नोट: ADCs सीरम में 5 दिनों के लिए और cytotoxicity कार्यात्मक स्थिरता साबित करने के लिए परख के लिए मशीन किया जा सकता है ।
    सावधानी: MMAE अत्यधिक विषाक्त है । इसलिए दस्ताने और चश्मे का उपयोग करें जब MMAE डेरिवेटिव हैंडलिंग । यदि आप अपने प्रयोग में एक नियंत्रण के रूप में unmodifiedd का उपयोग करें, जब आप DMSO में शेयर समाधान तैयार करते हैं, एक धुएं हुड के अंदर ठोस उत्पाद संभाल ।

Representative Results

रिपोर्ट क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणाली (चित्र 1a) पैदावार 22 ± 2 trastuzumab की मिलीग्राम (CypK)2 संस्कृति माध्यम के प्रति लीटर, जो जंगली प्रकार के 2/3 का प्रतिनिधित्व करता है एंटीबॉडी एक ही शर्तों (चित्रा 1c) के तहत उत्पादित । स्थिर सेल लाइन 31 ± 2 mg/L21तक इस उपज को बढ़ा सकते हैं ।

Trastuzumab (CypK)2 tetrazine के साथ संयुग्मित किया जा सकता है-vcMMAE, जो पैदावार अर्ध सजातीय Trastuzumab (MMAE)2 में 3 ज के भीतर 25 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 2) । इस cytotoxin के उच् hydrophobicity में 10% acetonitrile की अतिरिक् त आवश् यकता होती है जब प्रति CypK विष के 5 या अधिक दाढ़ समकक्ष का प्रयोग किया जाता है । वैकल्पिक रूप से, cycloaddition भी acetonitrile (चित्रा 2c) बिना tetrazine-vcMMAE के 2 समकक्ष का उपयोग कर 20 एच के भीतर पूरा हो गया है. Trastuzumab (CypK)2 25 डिग्री सेल्सियस से कम 2 ज के भीतर tetrazine-तमृ के साथ प्रतिक्रिया करता है और 3-6 एच की आवश्यकता है जब तापमान 4 डिग्री सेल्सियस (आंकड़ा 3सी) में कमी आई है ।

trastuzumab के लिए अपेक्षित डार (MMAE)2 HPLC द्वारा मापा-HIC १.९ (चित्रा 2 बी) है । शिखर शुरू में ८.० मिनट में वर्णलेख में मनाया unconjugated एंटीबॉडी (डार 0) का प्रतिनिधित्व करता है और पूरी तरह से गायब हो जाना चाहिए जब प्रतिक्रिया पूरा हो गया है । DAR के साथ प्रजातियों 1-9.6 मिनट पर elutes और 3 ज के बाद एक क्षेत्र < 10% होना चाहिए; और डार 2 के साथ लक्ष्य उत्पाद एक उंमीद क्षेत्र > ९०% के साथ 10.5-6.0 के एक प्रतिधारण समय है । गतिशीलता बदलाव और एसडीएस में प्रतिदीप्ति-पेज जैल तमृ (चित्र 3 बी) के शामिल होने की पुष्टि करता है और immunoconjugates की पहचान LC-MS (चित्रा 2d-ए और चित्रा 3d) द्वारा सत्यापित है ।

trastuzumab की मशीन (तमृ)2 मानव सीरम में 5 दिनों के लिए और एलिसा द्वारा अनुवर्ती विश्लेषण की पुष्टि करता है कि पेलोड एंटीबॉडी (चित्रा 4b) से जुड़ा रहता है । cytotoxicity परख के बारे में, trastuzumab (MMAE)2 से पता चलता है SK-BR-3 (HER2 उच्च) स्तन कैंसर की कोशिकाओं में उच्च शक्ति, एक आधा अधिक प्रभावी एकाग्रता के साथ (ईसी५०) की ५५ ± 10 बजे (चित्रा 4d) । Trastuzumab (MMAE)2 मानव सीरम (चित्रा 4c) में मशीन के 5 दिनों के बाद cytotoxicity रखता है । इसके विपरीत, जब ADC MCF पर परख है-7 (HER2 कम) चुनाव आयोग५० २००-गुना कम (चित्रा 4d) है । जंगली प्रकार एंटीबॉडी, trastuzumab (CypK)2 और tetrazine-vcMMAE बहुत कम विषाक्तता दिखाने (आंकड़े 4d और 4e), जबकि MMAE उच्च गैर दोनों सेल लाइनों (चित्रा cytotoxicity) में चयनात्मक 4e प्रदर्शित करता है ।

Figure 1
चित्र 1: परिवर्तनीय अभिव्यक्ति प्रणाली । A. HEK293 कोशिकाओं में क्षणिक अभिकर्मक के लिए प्रयुक्त plasmids के प्रासंगिक क्षेत्र. सीएमवी: cytomegalovirus प्रवर्तक, WPRE: Woodchuck हेपेटाइटिस वायरस Posttranscriptional विनियामक तत्व, PylT: pyrrolysyl tRNA, U6: विशिष्ट प्रवर्तक, PylRS: pyrrolysil tRNA synthetase, > और <: प्रतिलेखन की दिशा । B. Nε-[((2-methylcycloprop-2-en-1-yl) methoxy) carbonyl]-L-lysine (CypK). C. अभिव्यक्ति की पैदावार जंगली प्रकार (WT) trastuzumab और trastuzumab (CypK)2 के रूप में एक पश्चिमी दाग में मापा प्रोटीन के बाद एक शुद्धि । त्रुटि पट्टियां जैविक triplicates के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । यह आंकड़ा Oller-Salvia एट अल से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । २०१८21. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: विकार of trastuzumab (CypK)2 with tetrazine-vcMMAE. A. प्रतिलोम इलेक्ट्रॉन-मांग Diels-एंटीबॉडी में CypK अवशेषों के बीच Alder cycloaddition और tetrazine के व्युत्पंन MMAE । रिएक्टिंग समूहों को लाल रंग में हाइलाइट किया जाता है, पी-aminobenzylalcohol को हरा और नीले रंग में वैलिन-citrulline dipeptide दर्शाया गया है । ख. HPLC-HIC chromatograms के विकार की प्रगति दिखाते हुए एंटीबॉडी. C. १.९ की अधिकतम डार के संबंध में रूपांतरण की डिग्री अलग एजेंट सांद्रता का उपयोग कर । डी-ई. पूर्ण लंबाई एंटीबॉडी के Deconvoluted मास स्पेक्ट्रा से पहले और विकार के बाद । Trastuzumab (CypK)2 स्थिर सेल लाइन का उपयोग कर प्राप्त किया गया था । यह आंकड़ा Oller-Salvia एट अल से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । २०१८21. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: विकार of trastuzumab (CypK)2 with tetrazine-तमृ. A. प्रतिलोम इलेक्ट्रॉन-मांग Diels-एंटीबॉडी में CypK अवशेषों के बीच Alder cycloaddition और tetrazine के व्युत्पंन तमृ । B. एसडीएस-पृष्ठ जैल गतिशीलता बदलाव दिखा और में जेल प्रतिदीप्ति तमृ के विकार से उत्पंन । C. विकार कैनेटीक्स दो अलग तापमान पर । D. Deconvoluted मास स्पेक्ट्रम ऑफ trastuzumab (तमृ)2. Trastuzumab (CypK)2 स्थिर सेल लाइन का उपयोग कर प्राप्त किया गया था । यह आंकड़ा Oller-Salvia एट अल से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । २०१८21. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: सीरम में स्थिरता और trastuzumab conjugates की cytotoxicity. A. कार्टून एक internalizing ADC में वांछित सुविधाओं पर प्रकाश डाला. B. trastuzumab के स्थायित्व (तमृ)2 मानव सीरम में एलिसा के रूप में मापा । C. सेल व्यवहार्यता trastuzumab के साथ परख (MMAE)2 मानव सीरम में 5 दिनों के बाद (+ सीरम, काला). एक नियंत्रण का नमूना बजाय सीरम (-सीरम, लाल) के पंजाब में मशीन एक ही परख में शामिल किया गया था । घ. हौसले से पतला एंटीबॉडी नमूनों के साथ सेल व्यवहार्यता परख । ई. हौसले से पतला MMAE डेरिवेटिव के साथ सेल व्यवहार्यता परख । त्रुटि पट्टियां 3 स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य की मानक त्रुटि दर्शाती हैं । यह आंकड़ा Oller-Salvia एट अल से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । २०१८21. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

इस प्रोटोकॉल में वर्णित trastuzumab (CypK)2 का उत्पादन करने के लिए क्षणिक अभिव्यक्ति प्रक्रिया सरल है और उच्च मॉड्यूलरता के लिए अनुमति देता है । प्राप्त पैदावार एक अकादमिक स्थापित करने में उंमीद लोगों के भीतर है27 और स्थिर सेल लाइनों को आगे उत्पादन21उपज को बढ़ावा देने के उत्पंन किया जा सकता है । अभिव्यक्ति के दौरान, 5 मिमी से कम CypK की सांद्रता कम ncAA निगमन में परिणाम हो सकता है, और अधिक मात्रा सेल विकास को प्रभावित और एंटीबॉडी पैदावार कम हो सकती है. एक मुक्त एमिनो एसिड के रूप में CypK कम पानी घुलनशीलता है, इस प्रकार यह पहले ०.१ मीटर NaOH में १०० mM पर भंग किया जाना चाहिए और फिर संस्कृति माध्यम में जोड़ा । मीडियम में कमजोर CypK के बाद और इसे कोशिकाओं से जोड़ने से पहले, एचसीएल और फिल्टर को निष्फल करने के साथ मीडियम को बेअसर करना अहम है. बाद में, इस प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट अभिकर्मक रिएजेंट का उपयोग कर और निर्माता द्वारा अनुशंसित मशीन समय के बाद एक उच्च उपज अभिव्यक्ति के लिए महत्वपूर्ण है । मानव एंटीबॉडी के क्षणिक अभिव्यक्ति पर अधिक जानकारी के लिए, पाठक अंय प्रकाशित प्रोटोकॉल31,३२के लिए भेजा है ।

जब एंटीबॉडी शुद्ध है, प्रोटीन की एक उच्च अधिक एक राल के रूप में सुनिश्चित करने के लिए पूर्ण एंटीबॉडी supernatant से नीचे खींचने के संकेत की आवश्यकता है । आदेश में रेफरेंस के दौरान trastuzumab की वर्षा को रोकने के लिए, यह उच्च बफरिंग क्षमता के साथ एक समाधान का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है, पंजाबियों के साथ तुरंत पतला और अत्यधिक एकाग्रता से बचने बफर मुद्रा । हमेशा एंटीबॉडी रखें < 5 mg/

tetrazine-vcMMAE के साथ trastuzumab (CypK)2 के विकार bioorthogonal के लिए अन्य ADCs हैंडल के साथ रिपोर्ट की तुलना में तेजी से है । इसके अलावा, इस cycladdition बहुत हल्के स्थितियों के तहत होता है: कमरे के तापमान या कम और शारीरिक पीएच । यह acetonitrile के साथ reactants के DMSO स्टॉक समाधानों को पतला करने के लिए महत्वपूर्ण है जो पहले पंजाब और एंटीबॉडी के अलावा; अंयथा tetrazine डेरिवेटिव वेग होगा । Acetonitrile केवल MMAE और तमृ के उच्च hydrophobicity के कारण आवश्यक है, लेकिन कम hydrophobic अणुओं एक सह विलायक के अलावा की जरूरत नहीं हो सकती है । वैकल्पिक रूप से, tetrazine-vcMMAE को बिना acetonitrile के संयुग्मित जा सकता है और 20 ज के भीतर दाढ़-tetrazine के केवल 2 vcMMAE समकक्ष । विष की यह छोटी राशि ADC के निर्माण की लागत में पर्याप्त कमी को शामिल कर सकता है जब वर्तमान ncAA-आधारित प्रौद्योगिकियों की तुलना में. 4 ° c पर संरक्षित करते समय Trastuzumab (CypK)2 पूरी तरह से 4 महीने के लिए प्रतिक्रियाशील है ।

HPLC-HIC डार का सही निर्धारण सक्षम बनाता है के बाद से MMAE अत्यधिक hydrophobic है और 0, 1 और 2 विषाक्त पदार्थों के साथ एंटीबॉडी conjugates को इसी चोटियों का एक उत्कृष्ट संकल्प प्रदान करता है । १३.७ मिनट के आसपास unreact-vcMMAE elutes और २८० एनएम पर पता चला है । इस तकनीक उच्च शुद्धता के साथ एक प्रारंभिक सामग्री की आवश्यकता है । इसके अलावा, यह BCN जैसे अंय tetrazine-प्रतिक्रियाशील अणुओं के साथ प्रतिक्रिया बुझाने के लिए अनुशंसित नहीं है-ओह, क्योंकि वे प्रतिधारण समय और चोटियों के आकार को बदल सकते हैं । यह आवश्यक है कि नमूने के नमक एकाग्रता ढाल के शुरू में एक मोबाइल चरण में एक मैच के क्रम में एक अच्छा जुदाई प्राप्त करने के लिए, खासकर अगर अधिक से अधिक 10-20 µ एल इंजेक्शन हैं ।

LC-MS विश्लेषण के बारे में, एंटीबॉडी नमूनों की deglycosylation कच्चे स्पेक्ट्रम के deconvolution पर एक एकल चोटी प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । कुल एंटीबॉडी और ADC मास की शुद्धता साधन के callibration के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. इसलिए, आदेश में संशोधन के लिए बड़े पैमाने पर गणना करने के लिए, ADC के लिए प्राप्त एक से unmodified एंटीबॉडी के लिए प्राप्त जन घटाना. आधुनिक उच्च संकल्प जन स्पेक्ट्रोमीटर 1:10000 नीचे एक रिश्तेदार त्रुटि प्रदान करना चाहिए । हालांकि LC-MS भी विभिंन प्रजातियों के बीच अनुपात की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इस मूल्य आमतौर पर एक अनुमान है क्योंकि संशोधन उत्पंन प्रजातियों की ionization क्षमता को प्रभावित कर सकता है और अशुद्धियों की कम मात्रा का पता नहीं किया जा सकता है ।

ADCs में लिंकर की स्थिरता महत्वपूर्ण है क्योंकि उच्च विषाक्तता और कम प्रभावकारिता में दवा परिणामों के समयपूर्व जारी; मुक्त cytotoxin नुकसान स्वस्थ ऊतकों और नग्न एंटीबॉडी रोगग्रस्त कोशिकाओं पर लक्ष्य बंधन साइटों के लिए सशस्त्र एक के साथ प्रतिस्पर्धा । 5% है, जो स्थिरता परख की परिवर्तनशीलता के भीतर है के नीचे एक रिलीज की उंमीद की जानी चाहिए ।

अंत में, trastuzumab (MMAE)2 के रूप में एक ADC लक्ष्यीकरण HER2 के selectivity SK-BR-3 कोशिकाओं में cytotoxicity की तुलना द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता (HER2 उच्च) और MCF-7 कोशिकाओं (HER2 कम) बाद एक्सप्रेस 15 गुना से कम HER2 रिसेप्टर्स पूर्व28 . immunoconjugate एक कोशिका व्यवहार्यता में परिणाम की उंमीद है कम परिमाण के 2 आदेश SK-BR-3 में कम जब MCF-7 की तुलना में । चुनाव आयोग५० SK-BR-3 में दो अंक nanomolar रेंज में होना चाहिए इस एडीसी29,30की उच्च शक्ति को दर्शाती है । संशोधित एंटीबॉडी, या तो trastuzumab (MMAE)2 या trastuzumab, इस परख में कोई विषाक्तता दिखाना चाहिए । Tetrazine-vcMMAE एक प्रभाव ADC से कम परिमाण के 3 आदेश होना चाहिए के बाद से linker peptidomimetic विष की गतिविधि को हटा. इसके विपरीत, क्योंकि MMAE सेल झिल्ली30रिस करने में सक्षम है, यह ADC करने के लिए एक समान विषाक्तता है, लेकिन HER2 उच्च और HER2 कम सेल लाइनों के बीच कोई भेदभाव प्रदर्शित करना चाहिए. इसके अलावा, यदि इस परख एक 5 के बाद किया जाता है सीरम में एडीसी के दिन की मशीन, यह लिंकर की स्थिरता का एक कार्यात्मक सबूत प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: विष की एक रिलीज के लिए या तो में एडीसी दक्षता में कमी का परिणाम होगा SK-BR-3 अगर MMAE पी के साथ जारी किया गया था लिंकर की कला या selectivity में कमी अगर लिंकर एक स्ट्रेस्ड फैशन में सट गया था ।

ADC प्रौद्योगिकी यहां वर्णित कुशल और साइट-IgG1s में lysine के व्युत्पंन एक cyclopropene के विशिष्ट शामिल करने की अनुमति देता है । एक सतही शुद्धि के बाद, एंटीबॉडी तेजी से tetrazine युक्त अणुओं के साथ संयुग्मित जा सकता है, समरूप उत्पादों उपज । छोटे आकार और cyclopropene ंयूनतम संभाल के उच्च जेट के कारण, इस विधि sterically बाधा पेलोड के विकार सक्षम होना चाहिए । परिणामस्वरूप immunoconjugates सीरम में स्थिर रहे है और अत्यधिक शक्तिशाली और चयनात्मक हैं । कुल मिलाकर, CypK चिकित्सा या निदान में इस्तेमाल किया जा करने के लिए एंटीबॉडी और अन्य प्रोटीन conjugates के लिए एक तेजी से, साइट विशेष और स्थिर bioorthogonal लिंकेज सक्षम बनाता है.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को मेडिकल रिसर्च काउंसिल, यूके ने सपोर्ट किया था । शास-एस. एक EMBO फैलोशिप (ATLF 158-2016) रखती है और समर्थन के लिए एच पेल्हम और J.W. चिन के लिए आभारी है, और जी वतनी, सी. डब्ल्यू. मॉर्गन, और ओ Perisic मदद और सलाह के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expi293F ThermoFisher Scientific A14527 HEK suspension cells
Expi293 Expression Medium ThermoFisher Scientific A1435101 Expression medium
Antibiotic-antimycotic ThermoFisher Scientific 15240062 Penicillin-streptomycin-amphotericin B
125mL Polycarbonate Erlenmeyer Flask with Vent Cap Corning 431143 Shake flasks
Brunswick S41i incubator Eppendorf S41I230011 CO2 incubator with a shaker
Sodium hydroxide 4 mol/l (4 N) in aqueous solution VWR 191373M
Cyclopropene lysine Sichem SC-8017 In this study it was synthesized as described by Elliot et al. 2014
Steriflip-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, gamma irradiated Merck Millipore SCGP00525
Opti-MEM, Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific 31985070 Reduced serum medium
ExpiFectamine 293 Transfection Kit ThermoFisher Scientific A14525 Transfection reagent
5810 R centrifuge Eppendorf 5811000460
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized Merck Millipore SLGP033RS
Protein A resin Sino Biological 10600-P07E-RN-25
Poly-Prep Chromatography Columns, Pkg of 50 Bio-Rad 7311550 Polypropylene chromatography column
Econo-Column Funnel Bio-Rad 7310003
Sodium citrate Fluka 71635
ÄKTA explorer FPLC GE Healthcare
HiTrap HIC Selection Kit GE Healthcare 28-4110-07 Includes HiTrap 1 mL Butyl HP
Ammonium sulfate VWR 2133.296
Isopropanol Honywell 34863-2.5L
Dymethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418-50ML
Tetrazine-vcMMAE ChemPartner - Costum synthesized
Tetrazine-5-TAMRA Jena Bioscience CLK-017-05
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel 1.0mm x 10 well ThermoFisherScientific NP0321BOX
Xcell SureLock Mini-Cell ThermoFisherScientific EI0001
UltiMate 3000 HPLC ThermoFisherScientific
Thermo Scientific MAbPac, HIC-20, 4.6 x 100 mm, 5 µm ThermoFisherScientific 088553
PNGase F New England BioLabs P0704S
NanoAcquity Waters
C4 BEH 1-5 µm 1.0 x 100 mm UPLC column  Waters
96-well microplates for cell culture ThermoFisherScientific 156545
Human serum Sigma-Aldrich H4522-20mL
CO2 incubator Panasonic
HER2 ECD Sino Biological 10004-HCCH
Anti-TAMRA Abcam an171120
Anti-mouse HRP Santa Cruz sc-2005
TMB BioLengend 421101
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 84727-500ML
PHERAstar FS BMG Labtech Plate reader
DMEM Sigma-Aldrich D5671-500ML
SK-BR-3 ATCC HTB-30
MCF-7 ATCC HTB-22
CellTiterGlo 2.0 Assay Promega G9242 Cell viability assay based on the measurement of ATP released after cell lysis. The output signal is luminscence.
Monomethyl Auristatin E Cayman Chemical 16267
NanoDrop 2000 ThermoFisherScientific Microvolume spectrophotometer
Human IgG ELISA Quantificaiton Set Bethyl E80-104
MaxEnt1 in MassLynx Waters Software application for mass spectrum deconvolution
IntantBlue Expedeon ISB1L Coomassie-based stain
Intact MMAE-ADC ELISA Kit (Sandwich Assay) Epitope Diagnostics, Inc. KTR 782
Tube 50 mL, 114x28mm, PP Sarstedt 62.547.254 Conical tube
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWL Merck UFC905024 Centrifugal filtration concentrator (after protein A pull down)
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWL Merck UFC805024 Centrifugal filtration concentrators (after FPLC or HPLC purification)
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL ThermoFisherScientific 89882 Size exclusion spin columns
Tube PCR 0.2ml Flat Cap Thistle Scientific Ltd AX-PCR-02-C-CS PCR tubes
Nunc MaxiSorpª flat-bottom ThermoFisherScientific 44-2404-21 Plates for ELISA

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एक तेजी से Bioorthogonal प्रतिक्रिया के माध्यम से एंटीबॉडी-ड्रग Conjugates की पीढ़ी के लिए एक गैर-विहित अमीनो एसिड की आनुवंशिक एंकोडिंग
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Oller-Salvia, B. Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction. J. Vis. Exp. (139), e58066, doi:10.3791/58066 (2018).

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