Summary
Para ampliar la capacidad de los laboratorios en todo el mundo para evaluar la elegibilidad de los pacientes con cáncer de pulmón para el tratamiento con pembrolizumab, de una manera confiable y reproducible, hemos desarrollado un análisis que utiliza el concentrado 22 3 anticuerpo ampliamente disponible immunohistochemical autostainer, para muestras de biopsia y citología.
Abstract
Pembrolizumab monoterapia ha sido aprobado para el tratamiento de primera y segunda línea de pacientes con PD-L1-expresando avanzado cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP). Pruebas para la expresión de PD-L1 con el ensayo diagnóstico PD-L1 immunohistochemistry (IHC) 22 3 acompañante, que da una proporción de tumor puntuación (TPS), ha sido validado en tejido tumoral. Hemos desarrollado una optimizado desarrollado por el laboratorio prueba (LDT) que utiliza el concentrado 22 3 anticuerpo (Ab) en un autostainer IHC ampliamente disponible para las muestras de biopsia y citología. El TPS PD-L1 fue evaluado con 120 secciones de pares todo tumor del tejido y las muestras de biopsia y con 70 emparejado muestras de biopsia y citología (lavado bronquial, n = 40; derrames pleurales, n = 30). El 22 3 que LDT basada en concentrado mostró una alta tasa de concordancia entre (~ 100%) la biopsia y citología de muestras (~ 95%) en comparación con la expresión de PD-L1 IHC determinada mediante el ensayo del compañero 3 22 PD-L1 IHC en ambos TPS cortar puntos (≥1%, ≥ 50%). La LDT optimizada presentada aquí, usando el concentrado de Ab 22 3 para determinar la expresión de PD-L1 en tanto tejido del tumor y en muestras de citología, ampliará la capacidad de los laboratorios en todo el mundo para evaluar la elegibilidad de los pacientes con NSCLC para tratamiento con monoterapia de pembrolizumab de una manera confiable y reproducible.
Introduction
Recientes ensayos clínicos han demostrado la eficacia de la pembrolizumab, un humanizado IgG4 kappa isotipo anticuerpo monoclonal que bloquea la interacción entre la muerte celular programada 1 (PD-1) y sus ligandos, PD-L1 y PD-L2, en el tratamiento de pacientes con 2,1,de avanzado NSCLC del3,4.
Actualmente, pembrolizumab está aprobada para el tratamiento de NSCLC PD-L1-expresión en ambos pacientes de tratamiento con una expresión de PD-L1 TPS de ≥50% y no del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) o aberraciones de genomic tumor linfoma anaplásico kinasa (ALK)3 y para previamente tratado a pacientes con un TPS de PD-L1 de ≥1%1.
PD-L1 expresión de la proteína detectada por IHC ha sido ampliamente utilizada como un ensayo de biomarcadores predictivos para las terapias anti-PD-1/PD-L1. En ensayos clínicos de pembrolizumab, el TPS de PD-L1 obtenidos con muestras de tejido de formalina-fijo de parafina-encajado (FFPE) se determinó utilizando la PD-L1 IHC 3 22 compañero ensayo5. Este ensayo ha sido aprobado por la US Food y Drug Administration (FDA) y ha marcado CE en Europa para la determinación del tumor TPS PD-L15.
Adicionales opciones globales a través de las instituciones para las evaluaciones confiables y de alta calidad de los TPS de PD-L1 con LDTs que utilizan el concentrado 22 3 anticuerpo son esenciales para apoyar las decisiones clínicas sobre paciente elegibilidad para pembrolizumab tratamiento. Un gran número de laboratorios de patología no tienen acceso al ensayo de PD-L1 IHC 3 22 diagnóstico de compañero. Por lo tanto, es esencial el desarrollo de LDTs confiables y coherentes compatibles con plataformas de reactivos autostainer IHC adicionales, ampliamente disponibles.
Por otra parte, es necesario establecer LDTs utilizando muestras citológicas que son el tipo de muestra sólo disponible con frecuencia en pacientes de CPCNP. El ensayo del compañero PD-L1 IHC 3 22 está validado para resecciones, biopsias de aguja de núcleo y estructura sólo si la broncoscopía rinde 100 células del tumor. Aunque con frecuencia se obtienen los tipos anteriores de la muestra, muestras citológicas son recogidas más fácilmente y el tipo de muestra más comúnmente disponibles en algunas instituciones6,7. Sin embargo, existe actualmente ningún ensayo diagnóstico validado para la evaluación de la expresión de PD-L1 en muestras de citología; confiables LDTs compatibles con muestras citológicas facilitaría aún más calidad PD-L1 prueba.
Además, al establecer la validación clínica de un LDT, la IHC debe realizarse de una manera similar a la correspondiente prueba comercial clínicamente validado8. Por ejemplo, varios pasos críticos deben ser verificadas para obtener la misma señal en secciones seriadas como titulación de anticuerpos, retrasos del tratamiento previo, tiempo de incubación y sistemas de amplificación9.
Recientemente desarrollamos un LDT optimizado que utiliza el concentrado 22 3 anticuerpos para evaluar la expresión de PD-L1 en biopsias del tumor y las muestras de citología10,11. Se encontró una alta concordancia con la LDT versus el "gold standard" PD-L1 IHC 3 22 ensayo10,11. Este protocolo clínico validado apoyo confiable y de alta calidad PD-L1 prueba en todas las regiones a nivel mundial.
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Protocol
Todos los procedimientos han sido aprobados por el Comité de ética local (Comité de ética de investigación humana, Centre Hospitalier Universitaire de Niza/Tumorothèque BB-0033-00025).
Nota: Este protocolo está ajustado específicamente para el uso del concentrado 22 3 anticuerpo en un stainer IHC automatizado disponible en el mercado (conocido como autostainer aquí, ver la Tabla de materiales) para muestras de citología y biopsias del tumor.
1. preparación de las muestras de tejido del Tumor
- Fijar el tejido del tumor en 10% formalina neutra tamponada (NBF) en un cassette.
Nota: Tejido tumoral de tumores pulmonares proximales generalmente es obtenido por broncoscopia, realizada bajo sedación moderada por un neumólogo o especialista del pulmón. Para las lesiones periféricas y enfermedad pulmonar difusa, se indica una biopsia transbronquial o una aguja. Estos procedimientos generalmente se realizan en un quirófano o unidad de cuidados intensivos. - Insertar el cassette en parafina.
Nota: Fijación puede lograrse mediante perfusión o inmersión inmediatamente después de la disección y requiere típicamente 8 a 10 h. El volumen de fijador debe ser superior al volumen de muestra de 15 – 20 x. No se recomienda para fijar el tejido de la biopsia por más de 10 horas, porque overfixation puede enmascarar el antígeno. La velocidad de fijación es cerca de 1 mm por hora a temperatura ambiente. - Infiltrarse en la muestra de tejido fijo con cera en el procesador de tejido (véase Tabla de materiales).
Nota: La deshidratación se realiza en tres baños de alcohol con el aumento de las concentraciones de 70%, 85% y 90%. Finalmente se extrae el agua por tres baños de alcohol absoluto final. La limpieza se realiza en los tres baños de tolueno y la infiltración de cera en baños de cera caliente (44 a 60 ° C). - Incrustar el tejido dentro de un molde con parafina fundida (véase Tabla de materiales) y espere hasta solidificación.
- Sección del tejido parafina-encajado en un grosor de 3 μm en un micrótomo.
- Transferencia de la cinta de parafina a un vidrio de microscopio positivamente cargado Deslice (véase Tabla de materiales).
- Seque el portaobjetos durante 1 h a 37 ° C.
Nota: Almacenar las secciones de tejido a 2 – 8 ° C (preferidos) o a temperatura ambiente hasta 25 ° C para preservar la antigenicidad y la mancha dentro de 15 d de seccionamiento.
2. preparación de muestras de citología
-
Recoger bronquiales lavados en una solución conservante (véase tabla de materiales).
Nota: Para esto, se utiliza técnica de broncoscopia estándar.- Lavado la distribución del bronquio a ser muestreado. Recoger el lavado en un recipiente limpio. Etiqueta el recipiente con el paciente y de primer apellido, fecha de nacimiento y origen de la muestra.
- Transferir el líquido de lavado bronquial de un tubo cónico de 50 mL y añadir 2 g de DL-Ditiotreitol polvo (véase Tabla de materiales), vortex el tubo durante 30 minutos y luego lo Centrifugue a 250 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Quite el sobrenadante y añadir 10 mL de una solución de mucolítica (véase Tabla de materiales).
- Agitar la muestra durante 20 min a velocidad media (nivel 9) y centrifugar a 250 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Quite el sobrenadante y el precipitado de células de depósito en tubos que contengan 10% NBF.
- Añadir 4 gotas de un reactivo de preparación del bloque de célula (véase Tabla de materiales) para el sedimento celulares.
- Transferir el precipitado de células en una casete, lo fija en el 10% NBF y parafina-embed para celular bloque preparación y seccionamiento (ver pasos 1.1 – 1.7).
3. ensayo de tinción PD-L1
- Encienda el autostainer y el ordenador.
- Haga doble clic en el icono del autostainer y elija el usuario.
- Haga clic en 'Crear etiqueta' y luego en 'Protocolo'.
- Haga doble clic en el protocolo de 22 3.
Nota: El protocolo está instalado primero en computadora del autostainer haciendo clic en ' crear protocolo '. El protocolo completo se proporciona como archivo adicional 1. - Escriba el ID del paciente en la etiqueta y haga clic en 'Imprimir'.
- Pegar la etiqueta de la diapositiva.
- Abra el cajón diapositiva pulsando en el botón de la gaveta que se ha elegido.
- Colocar el portaobjetos rotulado en la almohadilla térmica con la etiqueta hacia arriba y hacia adentro.
- Cierre el cajón deslizante.
- Retire las tapas de los depósitos y los reactivos en los estantes de los reactivos de la carga.
- Abra el capó del filtro y coloque las parrillas en el carrusel de los reactivos, asegurándose de que ajuste y sostenga en posición.
- Cierre la cubierta.
- En el software, haga clic en el instrumento que se utilizará y haga clic en 'Ejecutar'.
- Al final del procedimiento IHC, enjuagar el portaobjetos durante varios segundos con agua y una gota de una solución de limpieza.
- Rehidratar la diapositiva con un baño de etanol 100% y un segundo baño de etanol 95% durante varios segundos.
- Colocar el portaobjetos en la máquina de cubreobjetos para una carga automatizada del cubreobjetos.
4. interpretación de la tinción de PD-L1
Nota: Un patólogo cualificado debe realizar la interpretación de la prueba IHC PD-L1.
- Evaluar la calidad de la tinción de PD-L1 mediante el análisis de los controles positivos y negativos antes de la examinación del espécimen del paciente.
Nota: Los resultados obtenidos en la muestra del paciente se consideran válidos si la tinción de los controles no es aceptable. - Confirmar la presencia de un mínimo de 100 células viables del tumor bajo un microscopio.
Nota: El informe cuando el espécimen del paciente tiene menos de 100 células del tumor. - En una ampliación baja de 4 X, evaluar todas las áreas de tumor bien conservado de positivos y negativos.
Nota: En una ampliación baja, membrana parcial la coloración o la coloración de la membrana de intensidad débil (1 +) puede ser difícil de reconocer. - Puntuación parcial o completa de la célula tinción de membrana.
Nota: La tinción citoplasmática tiene que excluirse de la interpretación. - Calcular el TPS determinando la proporción de las células del tumor positivo PD-L1 en relación a todas las células del tumor presentes en las áreas de tumor bien conservado.
Nota: Sólo las células del tumor viable deben ser examinadas. Otros elementos celulares, como las células inmunitarias, células necróticas, las células normales y artefactos, tienen que ser excluidas de la exploración.
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Representative Results
Utilizando el procedimiento presentado aquí y como se describe en detalle en recientes publicaciones10,11 de este grupo, LDT optimizada fue validada clínicamente con 120 archivo FFPE NSCLC biopsia las muestras de pacientes sometidos a cirugía resección o una biopsia en el Hospital Universitario de Pasteur, Niza, entre marzo de 2007 y marzo de 2016. Por otra parte, para la evaluación de la expresión de PD-L1 de muestras citológicas, TPS se evaluó en 70 muestras de biopsia de tejido pareadas y los bloques de celdas que se prepararon de lavado bronquial (n = 40) o derrame pleural (n = 30) (recogido en el Pasteur Hospital Universitario, agradable, entre julio de 2014 y de 2016 de noviembre). Todas las diapositivas fueron recién cortadas y manchadas dentro de 24 horas.
Un representante de patrón con biopsia muestras utilizando el concentrado de 22 3 anticuerpo (LDT), en comparación con el ensayo del compañero de PD-L1 IHC 3 22 (gold estándar) se muestran en la figura 1A y 1Bde coloración. Usando un TPS de ≥1%, 54/120 casos (45%) fueron PD-L1 positivo, mientras que usa un TPS de ≥50%, 29/120 casos (24%) se consideraron positivos para PD-L1.
El coeficiente de correlación intraclase (ICC) utilizado para medir la correlación de la puntuación de TPS como una variable continua fue 99% entre el LDT y el estándar de oro. Con ambos el TPS corte puntos de ≥1% y ≥ 50%, los resultados de κ de acuerdo interpathologist iguales a 1 dentro de la plataforma LDT.
Un representante de manchas patrón con citología de muestras utilizando el anticuerpo 22 3 concentran en la LDT en comparación con el kit de PD-L1 IHC 3 22 (gold estándar) se muestra en la figura 1C y 1D. La tasa de concordancia de 70 pares de muestras de biopsia y la citología con la LDT utilizando uno de los TPS de corte puntos de ≥1% y ≥50% fue superior a 95% y la Corte Penal Internacional mediante la puntuación de TPS como una variable continua entre 0,88 y 0.90. Este hallazgo fue consistente a través de cada tipo de muestra de citología (derrame pleural vs. lavado bronquial) o histología del tumor (adenocarcinoma vs. carcinoma de células escamosas) con un ICC entre 0,82 y 0,96. Al comparar el TPS PD-L1 de 37 (de 70) pares de muestras de citología con el LDT a las muestras de biopsia con el patrón oro, la tasa de concordancia utilizando el ≥1% TPS o el ≥50% TPS punto de corte fue mayor al 97% y la Corte Penal Internacional fue entre 0.93 y 0.95.
Figura 1: Representante manchas patrón en muestras de biopsia y citología mediante el concentrado 22 3 anticuerpo (LDT), en comparación con el IHC PD-L1 kit 22 3 (patrón oro). (A) este panel muestra el ensayo de PD-L1 IHC 3 22 usado en una biopsia del tumor. (B) este panel muestra el LDT optimizada usando el concentrado anticuerpo 22 3 secciones seriales de la biopsia del tumor mismo ya analizados en el grupo A. (C) este panel muestra el análisis de PD-L1 IHC 3 de 22 en un bloque de la célula. (D) este panel muestra el LDT optimizada usando el anticuerpo 22 3 concentrarse en las secciones seriales del mismo bloque de la célula ya analizados en el panel C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hemos validado una LDT optimizado usando el concentrado de anticuerpo 22 3 PD-L1, comparando con el validados clínicamente prueba comercial correspondiente10,11. 3 22 concentrados basados en anticuerpos LDT mostró una alta tasa de concordancia entre (~ 100%) la biopsia y muestras citológicas (~ 95%) en comparación con la expresión de PD-L1 IHC determinada usando el análisis de PD-L1 IHC 3 de 22 en ≥1% TPS y el ≥50% TPS puntos de corte. Como recientemente recomendada por la Asociación Internacional para el estudio de cáncer de pulmón, las zonas positivas de PD-L1 deben ser el mismo para aproximadamente 10 muestras negativas de PD-L1 10 PD-L1 muestras positivas y 20 muestras que cubren el rango dinámico lineal de la validado clínicamente IHC PD-L1 prueba8. Realizamos un estudio de validación en 70 muestras de citología y biopsias de 120. En general, la concordancia fue alta, independientemente de los TPS de corte para la positividad, el tipo de muestras, o la histología del tumor. Los resultados aquí presentados son de acuerdo con los de otros estudios previos que muestran una alta tasa de concordancia para tejido y citología de muestras12,13,14,15.
En este estudio, todos los especímenes fueron fijados en 10% NBF. No evaluamos el impacto de otros fijadores, mientras que el efecto sobre PD-L1 tinción de otros fijadores no formol como fijadores a base de alcohol es en la actualidad inexplorados. La presencia de células inmunes expresan PD-L1, particularmente macrófagos, garantiza una interpretación cuidadosa de las muestras de citología. Estas muestras deben ser evaluadas con referencia a la serie hematoxylin y diapositivas eosina y, en algunos casos difíciles, pueden realizarse para excluir cualquier interpretación de la expresión de PD-L1 en células del tumor sólo manchas complementarias para evaluar las células inmunes.
Este estudio tiene varias limitaciones, incluyendo un análisis retrospectivo en una sola institución y el hecho de que ningún paciente fue tratado con pembrolizumab para evaluar el resultado clínico. Además, una menor limitación de la LDT presentamos inquietudes el patrón de tinción granular que se observó ocasionalmente al usar sistemas de amplificación, que pueden hacer más difícil su interpretación. Por otra parte, el patrón de coloración de las células inmunes es algo más intenso que el observado con el patrón oro. La formación de patólogos es necesaria para obtener una correcta interpretación de PD-L1 tinción con IHC. 16
En el ajuste clínico, la robustez de LDTs debe ser mantenidas en el tiempo mediante la búsqueda de certificación y acreditación, por los siguientes procedimientos normalizados de trabajo y participando regularmente en de esquemas de evaluación externa de la calidad8. La garantía del rendimiento predictivo clínico puede garantizarse sólo cuando estas condiciones son logradas8.
El protocolo había presentado aquí direcciones la necesidad crítica de LDTs PD-L1 en muestras de biopsia y citología cuando se analizan en un autostainer ampliamente disponible a través de regiones geográficas que no pueden ser equipadas con el ensayo estándar de oro. La LDT presentada aquí, que se ha optimizado usando el concentrado 22 3 anticuerpos, puede utilizarse para evaluar la expresión de PD-L1 en muestras de biopsia y citología en pacientes de CPCNP. Esto ampliará significativamente el número de laboratorios que puede ofrecer alta calidad PD-L1 prueba para identificar a pacientes con NSCLC que son elegibles para tratamiento con monoterapia de pembrolizumab, de una manera confiable y reproducible.
Una potencial futura dirección es evaluar la viabilidad de la utilización de otros tipos de muestras de citología (p. ej., muestras de biopsias de aguja fina, FNA dirigido de broncoscopia, endobronquial guiada por ultrasonido FNA y cepillos bronquiales) con anticuerpo 22 3 basada en concentrado LDTs.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue patrocinado por Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA. Los patrocinadores no desempeñó ningún papel en el diseño del estudio recolección de datos y análisis, publicación y preparación del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NovaPrep HQ1 | Novacyt | NA | Preservative solution for cytology specimens |
| Novaprep® HQ+ B | Novacyt | NA | Mucolytic solution |
| Tissue-Tek VIP 6 | Sakura | 6042 VIP 6 | |
| Tissue-Tek TEC 5 Tissue Embedding Console System | Sakura | 5229 TEC 5 | |
| microscope glass slide SuperFrost Plus | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| DL-Dithiothreitol powder | Sigma-Aldrich | D3801 | |
| Heidolph Multi Reax Vortex Shaker | Thermo Fisher Scientific | 13-889-410 | |
| Shandon Cytoblock | Thermo Fisher Scientific | 7401150 | |
| 22C3 anti-PD-L1 concentrate antibody | Agilent Dako | #M365329 | |
| PD-L1 IHC 22C3 pharmDx | Agilent Dako | SK006 | |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | AS480 | |
| BenchMark ULTRA autostainer | Ventana | #750-600 | |
| OptiView HQ Universal Linker | Ventana | #760-700 | |
| OptiView HRP Multimer | Ventana | #760-700 | |
| OptiView Amplification H2O2 | Ventana | #760-099 | |
| OptiView Amplifier | Ventana | #760-099 | |
| OptiView Amplification Multimer | Ventana | #760-100 | |
| OptiView DAB | Ventana | #760-700 | |
| OptiView Copper | Ventana | #760-700 | |
| Hematoxylin II | Ventana | #790-2208 | |
| Bluing Reagent | Ventana | #760-2037 | |
| Cell Conditioning 1 (CC1) | Ventana | #950-124 | |
| Tissue-Tek Film Coverslipper | Sakura | 4742 |
References
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