Summary
Para expandir a capacidade dos laboratórios em todo o mundo para avaliar a elegibilidade de pacientes com câncer de pulmão para tratamento com pembrolizumab, de forma confiável e reproduzível, nós desenvolvemos um ensaio que usa o concentrado de 22 3 anticorpo em um amplamente disponível imuno-histoquímica autostainer, para amostras tanto biópsia e citologia.
Abstract
Pembrolizumab em monoterapia foi aprovado para o tratamento de primeira e segunda linha de pacientes com PD-L1-expressando avançado câncer de pulmão não-pequenas células (NSCLC). Ensaios de expressão PD-L1 com o ensaio diagnóstico complementar de 22 3 PD-L1 imuno-histoquímica (IHC), o que dá uma proporção de tumor partitura (TPS), foi validada no tecido do tumor. Desenvolvemos um otimizado desenvolvido laboratório teste (LDT) que usa o concentrado de 22 3 anticorpo (Ab) em um autostainer IHC amplamente disponível para espécimes de biópsia e citologia. O TPS-PD-L1 foi avaliada com 120 seções emparelhados todo-tumor de tecido e amostras de biópsia e com 70 combinado amostras de biópsia e citologia (lavagens brônquicas, n = 40; derrame pleural, n = 30). O Ab 22 3 que baseado em concentrado LDT mostrou uma alta taxa de concordância entre a biópsia (~ 100%) e citologia espécimes (~ 95%) quando comparado com a expressão de IHC PD-L1 determinado usando o ensaio de 22 3 companheiro de IHC PD-L1 em ambos os TPS corta pontos (≥ 1%, ≥ 50%). A LDT otimizada apresentada aqui, usando o concentrado de Ab 22 3 para determinar a expressão de PD-L1 em ambos os tecidos de tumor e em amostras de citologia, vai expandir a capacidade dos laboratórios em todo o mundo para avaliar a elegibilidade de pacientes com NSCLC para tratamento com pembrolizumab em monoterapia de forma confiável e reprodutível.
Introduction
Ensaios clínicos recentes têm demonstrado a eficácia do pembrolizumab, um humanizado IgG4 kappa isotipo anticorpo monoclonal que bloqueia a interação entre a morte celular programada 1 (PD-1) e seus ligantes, PD-L1 e L2-PD, no tratamento de pacientes com avançado NSCLC1,2,3,4.
Atualmente, pembrolizumab é aprovado para tratamento de NSCLC PD-L1-expressando em ambos os pacientes tratamento-ingénuos com uma expressão de PD-L1 TPS de ≥ 50% e nenhum receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) ou linfoma anaplásico quinase (ALK) tumor genômica de aberrações cromossómicas3 e para previamente tratados pacientes com um TPS-PD-L1 de ≥ 1%1.
Expressão de proteínas de PD-L1 detectado pelo IHC foi amplamente utilizado como um ensaio de biomarcador preditiva das terapias anti-PD-1/PD-L1. Em ensaios clínicos pembrolizumab, PD-L1 TPS obtidos com fixada em formol amostras de tecido (FFPE) parafina foi determinada utilizando o companheiro de IHC PD-L1 22 3 ensaio5. Este ensaio foi aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA) e tem sido a marcação CE na Europa para a determinação do tumor PD-L1 TPS5.
Opções globais adicionais através de instituições para avaliações confiáveis e de alta qualidade da PD-L1 TPS com LDTs que usam o concentrado anticorpo 22 3 são essenciais para apoiar as decisões clínicas feitas a respeito da elegibilidade de pacientes para pembrolizumab tratamento. Um grande número de laboratórios de patologia não tem acesso para o ensaio de IHC PD-L1 22 3 diagnóstico complementar. Portanto, é essencial o desenvolvimento de confiáveis e consistentes LDTs compatíveis com plataformas de autostainer IHC adicionais, amplamente disponíveis.
Além disso, há uma necessidade de estabelecer LDTs usando amostras de citologia que são o único espécime tipo frequentemente disponível a partir de pacientes NSCLC. O ensaio de companheiro de IHC PD-L1 22 3 é validado para ressecções, biopsias de agulha e broncofibroscopias somente se a broncoscopia produz 100 células de tumor. Embora os tipos de amostra acima são frequentemente obtidos, amostras de citologia são mais facilmente coletadas e são o tipo de amostra mais comumente disponíveis em algumas instituições6,7. No entanto, não há atualmente nenhum ensaio validado de diagnóstico disponíveis para a avaliação da expressão PD-L1 em amostras de citologia; LDTs confiáveis compatíveis com amostras de citologia iria facilitar ainda mais o teste de PD-L1 de alta qualidade.
Além disso, ao estabelecer a validação clínica de uma LDT, o IHC deve ser realizada de forma semelhante ao correspondente clinicamente validado teste comercial8. Por exemplo, várias etapas críticas devem ser verificadas para obter o mesmo sinal em seções seriais como titulação de anticorpos, atrasos de pré-tratamento, tempo de incubação e de sistemas de amplificação9.
Recentemente desenvolvemos uma LDT otimizada que usa o concentrado de 22 3 anticorpo para avaliar a expressão de PD-L1 no tumor biópsias e citologia amostras10,11. Encontramos uma alta concordância com a LDT contra o "padrão ouro" PD-L1 IHC 22 3 ensaio10,11. Este protocolo clinicamente validado oferecerá suporte confiável e de alta qualidade PD-L1 testes globalmente em todas as regiões.
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Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de ética local (Comitê de ética de pesquisa humana, Centre Hospitalier Universitaire de Nice/Tumorothèque BB-0033-00025).
Nota: Este protocolo é ajustado especificamente para o uso do anticorpo 22 3 concentrado em um stainer IHC automatizado disponível comercialmente (referido como autostainer aqui, consulte a Tabela de materiais) para amostras de citologia e biópsias de tumor.
1. preparação de amostras de tecido do Tumor
- Fixar o tecido do tumor em neutro tamponado formol a 10% (NBF) em uma gaveta.
Nota: Tecido de Tumor de tumores de pulmão proximal é geralmente obtido por broncoscopia, realizada sob sedação moderada por um pneumologista, ou especialista de pulmão. Para lesões periféricas e doença pulmonar difusa, é indicada uma biópsia transbrônquica ou agulha. Esses procedimentos são geralmente feitos em uma sala de cirurgia ou unidade de cuidados intensivos. - Incorpore a gaveta em parafina.
Nota: Fixação pode ser alcançada por perfusão ou imersão imediatamente após a dissecação e normalmente requer 8 – 10 h. O volume de fixador deve ser de 15 – 20 x maior do que o volume de amostra. Não é aconselhável fixar tecido de biópsia para mais de 10 h, porque overfixation podem causar mascaramento do antígeno. A velocidade de fixação é de cerca de 1 mm/h à temperatura ambiente. - Infiltrar-se a amostra de tecido fixo com cera no processador de tecidos (ver Tabela de materiais).
Nota: A desidratação é realizada em três banhos de álcool com o aumento da concentração de 70%, 85% e 90%. Água é finalmente removida por três banhos de álcool final do absoluto. A compensação é realizada em três banhos de tolueno e a infiltração de cera em banhos de cera quente (44-60 ° C). - Incorporar o tecido no interior de um molde cheio de parafina derretida (ver Tabela de materiais) e aguarde a solidificação.
- Secção do tecido parafina em uma espessura de 3 μm em um micrótomo.
- Transferência da faixa de opções de parafina para um vidro de microscópio carregados positivamente deslize (ver Tabela de materiais).
- Secar o slide para 1 h a 37 ° C.
Nota: Guarde as seções de tecido a 2 – 8 ° C (preferida) ou à temperatura ambiente até 25 ° C para preservar a antigenicidade e mancha dentro d 15 de seccionamento.
2. preparação das amostras de citologia
-
Coletar Lavagem brônquica em uma solução conservante (ver tabela de materiais).
Nota: Para isso, técnica de broncoscopia padrão é usada.- A distribuição do brônquio a amostrar de lavagem. Recolha a lavagem em um recipiente limpo. Rótulo do recipiente com o paciente do primeiro e último nome, data de nascimento e fonte do espécime.
- Transferir as águas de lavagem brônquicas para um tubo cónico de 50 mL e adicionar 2 g de DL-ditiotreitol pó (ver Tabela de materiais), vórtice do tubo por 30 min e então ele Centrifugue a 250 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
- Remover o sobrenadante e adicionar 10 mL de uma solução mucolítico (ver Tabela de Material).
- Agitar a amostra por 20 min em velocidade média (nível 9) e centrifuga-lo a 250 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
- Remover o sobrenadante e depositar o centrifugado em tubos de coleção contendo 10% NBF.
- Adicione 4 gotas de um eritrócito de preparação de bloco (ver Tabela de materiais) para o centrifugado.
- Transferir o centrifugado para uma gaveta, corrigi-lo em 10% NBF e parafina-incorporá-lo para a preparação de bloco celular e seccionamento (ver passos 1.1 – 1.7).
3. ensaio de coloração PD-L1
- Ligue a autostainer e o computador.
- Clique duas vezes no ícone autostainer e escolher o usuário.
- Clique em 'Criar rótulo' e no 'Protocolo'.
- Clique duas vezes no protocolo 22 3.
Nota: O protocolo primeiro está instalado no computador a autostainer clicando em ' criar protocolo '. O protocolo completo é fornecido como arquivo suplementar 1. - Escreva o ID do paciente no rótulo e clique em 'Imprimir'.
- Manter o rótulo do slide.
- Abra a gaveta slide pressionando no botão da gaveta que foi escolhido.
- Coloque o slide rotulado a almofada térmica com a etiqueta voltada para cima e para dentro.
- Feche a gaveta do slide.
- Remova as tampas dos dispensadores e carregar os reagentes nas prateleiras dos reagentes.
- Abra o capô do corante e coloque os racks no carrossel dos reagentes, certificando-se que eles se encaixam e segure na posição.
- Feche o capô.
- Sobre o software, clique no instrumento que será usado e clique em 'Executar'.
- No final do procedimento de IHC, enxágue o slide por alguns segundos com água da torneira e uma gota de uma solução de limpeza.
- Re-hidratar o slide com um banho de etanol 100% e um segundo banho de etanol a 95% por alguns segundos.
- Coloque o slide dentro da máquina de lamínula para um carregamento automatizado da lamela.
4. interpretação da coloração PD-L1
Nota: Uma patologista qualificada deve realizar a interpretação do teste de IHC PD-L1.
- Avalie a qualidade da manchar o PD-L1, analisando os controles positivos e negativos antes do exame da amostra do paciente.
Nota: Os resultados obtidos na amostra do paciente são considerados inválidos se a coloração dos controles não é aceitável. - Confirme a presença de um mínimo de 100 células de tumor viável sob um microscópio.
Observação: Relatório quando a amostra do paciente tem menos de 100 células de tumor. - Em uma baixa ampliação de 4x, avalie todas as áreas do tumor bem preservado de positivo e negativo.
Nota: Em uma ampliação baixa, coloração parcial da membrana ou membrana coloração de intensidade fraca (1 +) pode ser difícil de reconhecer. - Pontuação de coloração parcial ou total da membrana celular.
Nota: A coloração citoplasmática tem de ser excluída da interpretação. - Calcule o TPS, avaliando a proporção de células de tumor positivo PD-L1 em relação a todas as células do tumor presentes nas áreas tumor bem preservada.
Nota: Somente as células do tumor viável devem ser examinadas. Todos os outros elementos celulares, como células do sistema imunológico, células necróticas, células normais e artefatos, tem que ser excluídos do exame.
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Representative Results
Usando o procedimento apresentado aqui e conforme descrito em detalhes no recentes publicações10,11 deste grupo, LDT otimizado foi clinicamente validado com 120 amostras de biópsia FFPE NSCLC arquivamento de pacientes submetidos à cirurgia ressecção ou uma biópsia no Hospital Universitário Pasteur, Nice, entre março de 2007 e março de 2016. Além disso, para a avaliação da expressão de PD-L1 de amostras de citologia, TPS foi avaliada em 70 amostras de biópsia de tecido emparelhados e blocos de células que foram preparados a partir de lavagens brônquicas (n = 40) ou derrame pleural (n = 30) (coletados no Pasteur Hospital Universitário, legal, entre julho de 2014 e de 2016 de novembro). Todos os slides foram recém cortados e manchados dentro de 24 horas.
Um representante de coloração padrão com biópsia espécimes usando o concentrado de 22 3 anticorpo (LDT), comparado com o ensaio de companheiro de IHC PD-L1 22 3 (padrão ouro) são mostrados na figura 1A e 1B. Usando um TPS de ≥ 1%, casos de 54/120 (45%) foram PD-L1 positiva, enquanto usando um TPS de ≥ 50%, 29/120 casos (24%) foram considerados positivos para PD-L1.
O coeficiente de correlação intraclasse (ICC) usado para medir a correlação da nota de TPS como uma variável contínua foi 99% entre a LDT e o padrão-ouro. Usando ambos os TPS corte pontos de ≥ 1% e ≥ 50%, as pontuações κ para interpathologist acordo foram iguais a 1, dentro da plataforma LDT.
Um representante de coloração padrão com citologia amostras utilizando o anticorpo 22 3 concentrem a LDT comparada com o kit de IHC PD-L1 22 3 (padrão ouro) é mostrado na Figura 1 e 1 D. A taxa de concordância de 70 pares de amostras de biópsia e citologia com a LDT usando qualquer um dos TPS cortar pontos de ≥ 1% e ≥ 50% foi superior a 95% e o ICC usando a pontuação de TPS como uma variável contínua foi entre 0,88 e 0,90. Esse achado foi consistente em cada tipo de amostra de citologia (derrame pleural vs. Lavagem brônquica) ou histologia do tumor (adenocarcinoma vs. carcinoma de células escamosas) com um ICC entre 0,82 e 0,96. Ao comparar o TPS-PD-L1 de 37 (de 70) pares de amostras de citologia com a LDT para as amostras de biópsia com o padrão-ouro, a taxa de concordância usando o ≥ 1% TPS ou o ≥ 50% TPS ponto de corte foi maior que 97% e a ICC foi entre 0,93 e 0,95.
Figura 1: representante coloração padrão em espécimes de biópsia e citologia usando o concentrado de 22 3 anticorpo (LDT), em comparação com o PD-L1 IHC kit 22 3 (padrão ouro). (A), este painel mostra o ensaio de IHC PD-L1 22 3 usado em uma biópsia do tumor. (B) este painel mostra a LDT otimizada usando o anticorpo 22 3 concentrado no seriais seções da biópsia de tumor mesmo que analisados no painel A. (C), este painel mostra o ensaio de IHC PD-L1 22 3 em um bloco de celas. (D) este painel mostra a LDT otimizada usando o anticorpo 22 3 concentrar-se em seções seriais do mesmo bloco como analisados no painel C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Podemos ter validado uma LDT otimizada usando o concentrado de anticorpo 22 3 PD-L1, comparando-a com o correspondente clinicamente validado teste comercial10,11. 3 a 22 concentrado LDT baseados em anticorpo que mostrou uma alta taxa de concordância entre a biópsia (~ 100%) e amostras de citologia (~ 95%) quando comparado com a expressão de IHC PD-L1 determinada usando o ensaio de IHC PD-L1 22 3 ≥ 1% TPS e o ≥ 50% TPS cortar pontos. Como recentemente recomendada pela Associação Internacional para o estudo de câncer de pulmão, as áreas de PD-L1 positivas devem ser o mesmo para aproximadamente 10 amostras negativas de PD-L1, 10 amostras positivas de PD-L1 e 20 amostras cobrindo a gama dinâmica linear da clinicamente validado PD-L1 IHC teste8. Realizamos um estudo de validação em 120 biópsias e 70 amostras de citologia. No geral, a concordância foi alta, independentemente do TPS corte de positividade, o tipo de amostras, ou da histologia do tumor. Os resultados aqui apresentados estão de acordo com os de outros estudos anteriores, mostrando uma alta taxa de concordância para tanto tecido citologia espécimes12,13,e14,15.
Neste estudo, todos os espécimes foram fixados em 10% NBF. Nós não avaliar o impacto de outros fixadores, enquanto o efeito na coloração de PD-L1 de outros fixadores formalina-não como fixadores à base de álcool é atualmente inexploradas. A presença de células do sistema imunológico expressando PD-L1, especialmente os macrófagos, garante uma interpretação cuidadosa dos espécimes citologia. Estas amostras devem ser avaliadas com referência a série hematoxilina e eosina deslize, e, em alguns casos difíceis, manchas complementares para avaliar as células imunes podem ser realizadas para excluir qualquer má interpretação da expressão em células tumorais só PD-L1.
Este estudo contém uma série de limitações, incluindo uma análise retrospectiva em uma única instituição e o fato de que nenhum paciente foi tratado com pembrolizumab para avaliar os resultados clínicos. Além disso, uma limitação menor da LDT apresentou aqui preocupações o padrão de coloração granular que observou-se ocasionalmente quando usando sistemas de amplificação, que podem tornar mais difícil a sua interpretação. Além disso, o padrão de coloração de células do sistema imunológico é um pouco mais intenso do que a observada com o padrão-ouro. O treinamento de patologistas é necessário obter uma interpretação correta de PD-L1 coloração com IHC. 16
Na prática clínica, a robustez de LDTs precisa ser mantida ao longo do tempo à procura de certificação e acreditação, pelos seguintes procedimentos habituais de funcionamento e participando regularmente de esquemas de avaliação externa qualidade8. A garantia do desempenho clínico preditivo pode ser assegurada somente quando estes pré-requisitos são realizados8.
O protocolo apresentado aqui endereços a necessidade crítica de PD-L1 LDTs em amostras tanto biópsia e citologia, quando analisados em um autostainer amplamente disponível em todas as regiões geográficas que não podem ser equipadas com o ensaio de padrão-ouro. A LDT apresentada aqui, que foi otimizada usando o concentrado anticorpo 22 3, pode ser usada para avaliar a expressão de PD-L1 em ambos biópsia e citologia amostras de pacientes NSCLC. Isso expandirá significativamente o número de laboratórios que pode oferecer alta qualidade PD-L1, testes para identificar pacientes com NSCLC que são elegíveis para tratamento com monoterapia de pembrolizumab, de forma confiável e reprodutível.
Uma direção futura potencial é avaliar a viabilidade do uso de outros tipos de amostra de citologia (por exemplo, amostras de biópsias de agulha fina, guiada por broncoscopia FNA, endobrônquica guiada por ultra-som FNA e escovas brônquicas) com anticorpo 22 3 baseado em concentrado LDTs.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi patrocinado pela Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA. Os financiadores não desempenharam nenhum papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NovaPrep HQ1 | Novacyt | NA | Preservative solution for cytology specimens |
| Novaprep® HQ+ B | Novacyt | NA | Mucolytic solution |
| Tissue-Tek VIP 6 | Sakura | 6042 VIP 6 | |
| Tissue-Tek TEC 5 Tissue Embedding Console System | Sakura | 5229 TEC 5 | |
| microscope glass slide SuperFrost Plus | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| DL-Dithiothreitol powder | Sigma-Aldrich | D3801 | |
| Heidolph Multi Reax Vortex Shaker | Thermo Fisher Scientific | 13-889-410 | |
| Shandon Cytoblock | Thermo Fisher Scientific | 7401150 | |
| 22C3 anti-PD-L1 concentrate antibody | Agilent Dako | #M365329 | |
| PD-L1 IHC 22C3 pharmDx | Agilent Dako | SK006 | |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | AS480 | |
| BenchMark ULTRA autostainer | Ventana | #750-600 | |
| OptiView HQ Universal Linker | Ventana | #760-700 | |
| OptiView HRP Multimer | Ventana | #760-700 | |
| OptiView Amplification H2O2 | Ventana | #760-099 | |
| OptiView Amplifier | Ventana | #760-099 | |
| OptiView Amplification Multimer | Ventana | #760-100 | |
| OptiView DAB | Ventana | #760-700 | |
| OptiView Copper | Ventana | #760-700 | |
| Hematoxylin II | Ventana | #790-2208 | |
| Bluing Reagent | Ventana | #760-2037 | |
| Cell Conditioning 1 (CC1) | Ventana | #950-124 | |
| Tissue-Tek Film Coverslipper | Sakura | 4742 |
References
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