Summary
For at udvide laboratorier verden over evne til at vurdere berettigelsen af patienter med lungekræft behandling med pembrolizumab, i en pålidelig og reproducerbar måde, udviklede vi en analyse, der bruger 22C 3 antistof koncentrat på en alment tilgængelig immunhistokemiske autostainer, til både biopsi og cytologi prøver.
Abstract
Pembrolizumab monoterapi er blevet godkendt til første og anden linje behandling af patienter med PD-L1-udtryk for avancerede ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Testning for PD-L1 udtryk med PD-L1 Immunhistokemi (IHC) 22C 3 følgesvend diagnostisk analyse, hvilket giver en tumor andel scorer (TPS), er blevet valideret på tumor væv. Vi udviklet en optimeret laboratorium-udviklet test (LDT), bruger 22C 3 antistof (Ab) koncentrat på et bredt tilgængelige IHC autostainer til biopsi og cytologi prøver. PD-L1 TPS blev evalueret med 120 parrede hele-tumor væv sektioner og biopsi prøver og med 70 parret biopsi og cytologi prøver (bronkial vasker, n = 40; pleural udbrud, n = 30). 22C 3 Ab koncentrat-baserede LDT viste en høj overensstemmelse mellem biopsi (~ 100%) og cytologi (~ 95%) prøver i forhold til PD-L1 IHC udtryk bestemmes ved hjælp af PD-L1 IHC 22C 3 følgesvend assay på begge TPS cut point (≥ 1%, ≥50%). Den optimerede LDT præsenteres her, ved hjælp af 22C 3 Ab koncentrat til at bestemme PD-L1 udtryk i begge tumor væv og cytologi prøver, vil udvide laboratorier verden over evne til at vurdere berettigelsen af patienter med NSCLC for behandling med pembrolizumab monoterapi på en pålidelig og reproducerbar måde.
Introduction
Nylige kliniske forsøg har vist effekt af pembrolizumab, en humaniseret monoklonalt IgG4 kappa isotype antistof, der blokerer interaktion mellem programmeret celledød 1 (PD-1) og dens ligander, PD-L1 og PD-L2, til behandling af patienter med Fremskreden NSCLC1,2,3,4.
I øjeblikket er pembrolizumab godkendt til behandling af PD-L1-udtrykker NSCLC i både behandling-naive patienter med et PD-L1 udtryk TPS ≥50% og ingen epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) eller Anaplastisk lymfom kinase (ALK) genomisk tumor aberrationer3 og for tidligere behandlede patienter med et PD-L1 TPS ≥ 1%1.
PD-L1 protein udtryk opdaget af IHC har været meget anvendt som en intelligent biomarkør assay for anti-PD-1/PD-L1 terapier. I pembrolizumab kliniske forsøg, blev PD-L1 TPS fremstillet med formalin-fast paraffin-embedded (FFPE) vævsprøver bestemt ved hjælp af PD-L1 IHC 22C 3 følgesvend assay5. Denne analyse er blevet godkendt af US Food and Drug Administration (FDA) og er blevet CE-mærket i Europa til bestemmelse af tumor PD-L1 TPS5.
Supplerende globale indstillinger på tværs af institutioner for pålidelig og høj kvalitet evalueringer af PD-L1 TPS med LDTs, som bruger 22C 3 antistof koncentrat er vigtigt at støtte kliniske beslutninger omhandlende patienternes rettigheder for pembrolizumab behandling. Et stort antal patologi laboratorier har ikke adgang til følgesvend diagnostiske PD-L1 IHC 22C 3 assay. Udviklingen af pålidelige og sammenhængende LDTs kompatibel med yderligere, bredt tilgængelige IHC autostainer platforme er derfor afgørende.
Derudover er der behov for at etablere LDTs ved hjælp af cytologi prøver, der er den eneste eksemplar type ofte tilgængelige fra NSCLC patienter. PD-L1 IHC 22C 3 følgesvend assay er valideret for resektion, core nål biopsier og bronchoscopies kun hvis bronkoskopi udbytter 100 tumorceller. Selv om ovenstående eksempel typer er ofte opnået, cytologi prøver er mere let indsamlet og er den mest almindeligt tilgængelige prøvetypen i nogle institutioner6,7. Men der er i øjeblikket ingen validerede diagnostiske assay tilgængelige for evaluering af PD-L1 udtryk i cytologi prøver; pålidelig LDTs kompatibel med cytologi prøver ønsker yderligere at lette høj kvalitet PD-L1 test.
Derudover ved fastlæggelsen af den kliniske validering af en LDT, bør IHC udføres på samme måde som de tilsvarende klinisk validerede kommercielle test8. For eksempel, bør flere kritiske trin kontrolleres for at opnå det samme signal i serie sektioner såsom antistoftitrering, forbehandling forsinkelser, inkubationstiden og forstærkning systemer9.
Vi har for nylig udviklet en optimeret LDT, der bruger 22C 3 antistof koncentrat til at evaluere PD-L1 udtryk på tumor biopsier og cytologi prøver10,11. Vi fandt en høj overensstemmelse med LDT versus "gold standard" PD-L1 IHC 22C 3 assay10,11. Denne klinisk validerede protokol vil støtte pålidelige, høj kvalitet PD-L1 test på tværs af regioner globalt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer er blevet godkendt af det lokale etiske udvalg (menneskelige videnskabsetisk Komité, Centre Hospitalier Universitaire de Nice/Tumorothèque BB-0033-00025).
Bemærk: Denne protokol reguleres specifikt til brugen af 22C 3 antistof koncentrere sig om et kommercielt tilgængelige automatiserede IHC stainer (kaldet som autostainer her, se Tabel af materialer) for tumor biopsier og cytologi prøver.
1. forberedelse af Tumor vævsprøver
- Fix tumor væv i 10% neutrale bufferet formalin (NBF) i en kassette.
Bemærk: Tumor væv fra proksimale lunge tumorer er generelt fremstillet ved bronkoskopi, udført under moderat sedation af en pulmonologist eller en lunge specialist. For perifere læsioner og diffuse lungesygdom, er en transbronchial eller nål biopsi indiceret. Disse procedurer er normalt gøres i en kirurgi værelse eller intensiv afdeling. - Integrere kassetten i paraffin.
Bemærk: Fiksation opnås ved perfusion eller nedsænkning umiddelbart efter dissektion, og kræver typisk 8-10 h. Fikseringsvæske volumen skal være 15-20 x højere end modellen volumen. Det anbefales ikke at lave biopsi væv i mere end 10 timer, fordi overfixation kan forårsage maskering af antigenet. Fiksering hastighed er omkring 1 mm/h ved stuetemperatur. - Infiltrere den faste vævsprøve med voks i væv processor (Se Tabel af materialer).
Bemærk: Dehydrering er udført i tre alkohol bade med stigende koncentrationer 70%, 85% og 90%. Vand er endelig fjernet af tre endelige absolut alkohol bade. Clearing udføres i tre toluen bade og voks infiltration i hot voksbadene (44-60 ° C). - Integrere væv inde i en støbeform, fyldt med smeltet paraffin (Se Tabel af materialer) og vente på størkning.
- Afsnit paraffin-embedded vævet på en tykkelse på 3 μm på en mikrotom.
- Overførsel paraffin bånd til et positivt ladede mikroskop glas dias (Se Tabel af materialer).
- Tørre dias i 1 timer ved 37 ° C.
Bemærk: Gemme afsnittene væv ved 2 – 8 ° C (foretrukket) eller ved stuetemperatur op til 25 ° C til at bevare antigenicity, og plette inden for 15 d af skæring.
2. forberedelse af cytologi prøver
-
Indsamle bronchiale vask i et konserveringsmiddel løsning (se tabel af materialer).
Bemærk: For dette, standard bronkoskopi teknik der bruges.- Lavage fordelingen af Bronkie skal udtages. Indsamle vask i en ren beholder. Etiket container med patienten 's første og sidste navn, fødselsdato, og prøven kilde.
- Overføre de bronchiale vask til en 50 mL konisk slange og tilsættes 2 g DL-Dithiothreitol pulver (Se Tabel af materialer), vortex røret i 30 min, og derefter centrifugeres den ved 250 x g i 5 min ved stuetemperatur.
- Fjern supernatanten og der tilsættes 10 mL af en slimløsnende løsning (Se Tabel af materiale).
- Ryste prøven i 20 min. ved medium hastighed (niveau 9) og centrifugeres ved 250 x g i 5 min ved stuetemperatur.
- Fjern supernatanten og deponere den celle pellet i indsamling rør indeholdende 10% NBF.
- Tilsæt 4 dråber af en celle blok forberedelse reagens (Se Tabel af materialer) til celle pellet.
- Overføre celle pellet på en kassette, ordne det i 10% NBF, og paraffin-integrere det for cellen blok forberedelse og skæring (Se trin 1.1-1.7).
3. PD-L1 farvning Assay
- Tænd autostainer og computeren.
- Dobbeltklik på autostainer ikon og vælg brugeren.
- Klik på 'Opret etiketten' og derefter på "Protokol".
- Dobbeltklik på 22C 3-protokollen.
Bemærk: Protokollen er først installeret på den autostainer computer ved at klikke på "Opret protokol". Fuld-protokollen er fastsat som supplerende fil 1. - Skrive patientens ID på etiketten, og klik på 'Udskriv'.
- Stick etiketten på diaset.
- Åbn diaset skuffen ved at trykke på knappen i den skuffe, der er blevet valgt.
- Placer det mærkede dias på den thermal afrivningsblok med etiketten vender op- og indad.
- Lukke slide skuffe.
- Fjern hætterne fra dispenserne og indlæse reagenser på reagenser stativer.
- Åbne kølerhjelmen af stainer og placere stativerne på reagenser carrousel og sørg for, at de passer og holde i position.
- Luk hætten.
- Klik på softwaren på det instrument, der skal bruges, og klik på 'Kører'.
- I slutningen af proceduren med IHC, skyl diasset i flere sekunder med vand fra hanen og en dråbe af et rengøringsmiddel.
- Rehydrere dias med et bad af ethanol 100% og en anden bad af ethanol 95% i flere sekunder.
- Placer slide i coverslipping maskinen til en automatiseret lastning af coverslip.
4. fortolkning af PD-L1 farvning
Bemærk: En kvalificeret patolog bør udføre fortolkning af PD-L1 IHC test.
- Vurdere kvaliteten af PD-L1 farvning ved at analysere de positive og negative kontroller før undersøgelsen af patientens modellen.
Bemærk: Resultaterne på patientens modellen er anses for ugyldig, hvis farvning af kontrollerne ikke er acceptabelt. - Bekræfte tilstedeværelsen af et minimum af 100 levedygtige tumorceller under et mikroskop.
Bemærk: Rapporten når patientens modellen har mindre end 100 tumorceller. - På en lav forstørrelse på 4 X, evaluere alle velbevarede positiv og negativ tumor områder.
Bemærk: Ved en lav forstørrelse, delvis membran farvning eller membran farvning af svag intensitet (1 +) kan være svært at genkende. - Score, hel eller delvis cellemembranen farvning.
Bemærk: Cytoplasmatisk farvning har at blive udelukket fra fortolkning. - Beregne TPS ved at vurdere andelen af PD-L1 positive tumorceller i forhold til alle tumorceller findes i områderne velbevarede tumor.
Bemærk: Kun levedygtige tumorceller bør undersøges. Alle andre cellulære elementer, såsom immunceller, nekrotiske celler, normale celler og artefakter, skal udelukkes fra undersøgelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af den procedure, der er præsenteret her, og som er beskrevet i detaljer i gruppens seneste publikationer10,11, var de optimeret LDT klinisk valideret med 120 arkivers FFPE NSCLC biopsi prøver fra patienter, der undergik kirurgisk resektion eller en biopsi på universitetshospitalet Pasteur Nice, mellem marts 2007 og marts 2016. Desuden evaluering af PD-L1 udtryk for cytologi prøver TPS blev evalueret i 70 parrede biopsi vævsprøver og celle blokke, der blev fremstillet af bronkial vasker (n = 40) eller pleural udbrud (n = 30) (indsamlet på Pasteur Universitetshospital, Nice, mellem juli 2014 og November 2016). Alle dias var frisk skåret og farves inden for 24 timer.
Repræsentant farvning mønster med biopsi prøver ved hjælp af 22C 3 antistof koncentrat (LDT), sammenlignet med PD-L1 IHC 22C 3 følgesvend assay (guld standard) er vist i figur 1A og 1B. Bruger en TPS ≥ 1%, 54/120 tilfælde (45%) var PD-L1 positive, mens du bruger en TPS ≥50%, 29/120 sager (24%) blev betragtet som positive for PD-L1.
Intraclass korrelationskoefficienten (ICC) bruges til at måle sammenhængen af TPS score som en kontinuerlig variabel var 99% mellem LDT og guldstandarden. Ved hjælp af begge TPS cut point ≥ 1% og ≥50%, κ noder for interpathologist aftale var lig med 1 LDT-platformen.
Repræsentant farvning mønster med cytologi prøver ved hjælp af 22C 3 antistof koncentrere sig om LDT sammenlignet med PD-L1 IHC 22C 3 kit (guld standard) er vist i figur 1 c og 1 D. Konkordans sats af 70 par af biopsi og cytologi prøver med LDT ved hjælp af enten en af TPS cut point af ≥ 1% og ≥50% var højere end 95%, og den internationale straffedomstol med TPS score som en kontinuerlig variabel var mellem 0,88 og 0,90. Dette fund var konsistent på tværs af hver type cytologi prøve (pleural effusion vs. bronchiale vask) eller tumor histologi (adenocarcinom vs. planocellulært karcinom) med en ICC mellem 0,82 og 0,96. Når man sammenligner PD-L1 TPS 37 (ud af 70) par cytologi prøver med LDT til biopsi prøverne med guldstandarden, konkordans sats ved hjælp af enten ≥ 1% TPS eller ≥50% TPS cut point var mere end 97% og ICC var mellem 0,93 og 0,95.
Figur 1: repræsentant farvning mønster på biopsi og cytologi prøver ved hjælp af 22C 3 antistof koncentrat (LDT), sammenlignet med PD-L1 IHC 22C 3 kit (guldstandarden). (A) dette panel viser PD-L1 IHC 22C 3 analysen anvendes på en tumor biopsi. (B) dette panel viser den optimerede LDT ved hjælp af 22C 3 antistof koncentrat på seriel afsnit fra samme tumor biopsi, som analyseres i panelet A. (C) dette panel viser PD-L1 IHC 22C 3 analysen i en celle blok. (D) dette panel viser den optimerede LDT ved hjælp af 22C 3 antistof koncentrerer seriel afsnit fra samme cellen blok, som analyseres i panelet C. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har valideret en optimeret LDT ved hjælp af 22C 3 PD-L1 antistof koncentrat, ved at sammenligne den med den tilsvarende klinisk validerede kommercielle test10,11. 22C 3 koncentreret antistof-baserede LDT viste en høj overensstemmelse mellem biopsi (~ 100%) og cytologi (~ 95%) prøver i forhold til PD-L1 IHC udtryk bestemmes ved hjælp af PD-L1 IHC 22C 3 assay på både ≥ 1% TPS og ≥50% TPS cut point. Som for nylig anbefalet af den internationale sammenslutning for studiet af lungekræft, PD-L1 positive områder bør være de samme for ca 10 PD-L1 negative prøver, 10 PD-L1 positive prøver og 20 prøver dækker den lineære dynamiske rækkevidde af den klinisk valideret test PD-L1 IHC8. Vi udførte en valideringsundersøgelse på 120 biopsier og 70 cytologi prøver. Samlet set var konkordansen høj, uafhængigt af TPS cutoff for positivitet, typen prøver, eller tumor histologi. Resultaterne præsenteres her er enig med dem i andre tidligere undersøgelser viser en høj konkordansen for både væv og cytologi enheder12,13,14,15.
I denne undersøgelse, alle enheder var fast i 10% NBF. Vi ikke evaluere virkningen af andre fikseringsmidler, mens effekten på PD-L1 farvning af andre ikke-formalin fikseringsmidler, såsom alkohol-baserede fikseringsmidler er i øjeblikket uudforsket. Tilstedeværelsen af immunceller udtrykker PD-L1, især makrofager, fortjener en omhyggelig fortolkning af cytologi enheder. Disse prøver skal evalueres ud fra seriel hæmatoxylin og eosin dias, og i nogle vanskelige tilfælde, supplerende pletter at vurdere immunceller kan udføres for at udelukke enhver misforståelse af PD-L1 udtryk i tumorceller kun.
Denne undersøgelse gælder en række begrænsninger, herunder en retrospektiv analyse på en enkelt institution, og det faktum, at ingen patient blev behandlet med pembrolizumab til at vurdere de kliniske resultater. Derudover præsenteres en mindre begrænsning af LDT her bekymringer den kornede farvnings-mønster, der blev observeret lejlighedsvis når ved hjælp af forstærkning systemer, der kan gøre deres fortolkning sværere. Derudover er immunceller farvning mønster lidt mere intens end den konstaterede med guldstandarden. Uddannelse af patologer er nødvendig for at opnå en korrekt fortolkning af PD-L1 farvning med IHC. 16
I de kliniske omgivelser skal LDTs robusthed vedligeholdes over tid af søger certificering og akkreditering, af følgende standardprocedurer og regelmæssigt deltager i ekstern kvalitet vurdering ordninger8. Garanti for den kliniske prædiktive ydeevne kan sikres kun, når disse forudsætninger er dygtig8.
Protokollen præsenteres her adresser den kritiske behov for PD-L1 LDTs på både biopsi og cytologi prøver når analyseret på et bredt tilgængelige autostainer på tværs af geografiske regioner, der ikke kan være udstyret med guldstandarden assay. LDT præsenteres her, som er optimeret ved hjælp af 22C 3 antistof koncentrat, kan bruges til at evaluere PD-L1 udtryk på både biopsi og cytologi prøver fra NSCLC patienter. Dette vil udvide antallet af laboratorier, der kan tilbyde høj kvalitet PD-L1 test for at identificere patienter med NSCLC, der er berettiget til behandling med pembrolizumab monoterapi, i en pålidelig og reproducerbar måde.
En potentiel fremtidig retning er at vurdere mulighederne for ved hjælp af andre cytologi modellen typer (f.eks.prøver fra fine nål biopsier, bronkoskopi-styrede FNA, endobronchial ultralydsvejledt FNA og bronchiale børster) med 22C 3 antistof koncentrat-baseret LDTs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev sponsoreret af Merck & Co, Inc., Kenilworth, NJ, USA. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NovaPrep HQ1 | Novacyt | NA | Preservative solution for cytology specimens |
| Novaprep® HQ+ B | Novacyt | NA | Mucolytic solution |
| Tissue-Tek VIP 6 | Sakura | 6042 VIP 6 | |
| Tissue-Tek TEC 5 Tissue Embedding Console System | Sakura | 5229 TEC 5 | |
| microscope glass slide SuperFrost Plus | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| DL-Dithiothreitol powder | Sigma-Aldrich | D3801 | |
| Heidolph Multi Reax Vortex Shaker | Thermo Fisher Scientific | 13-889-410 | |
| Shandon Cytoblock | Thermo Fisher Scientific | 7401150 | |
| 22C3 anti-PD-L1 concentrate antibody | Agilent Dako | #M365329 | |
| PD-L1 IHC 22C3 pharmDx | Agilent Dako | SK006 | |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | AS480 | |
| BenchMark ULTRA autostainer | Ventana | #750-600 | |
| OptiView HQ Universal Linker | Ventana | #760-700 | |
| OptiView HRP Multimer | Ventana | #760-700 | |
| OptiView Amplification H2O2 | Ventana | #760-099 | |
| OptiView Amplifier | Ventana | #760-099 | |
| OptiView Amplification Multimer | Ventana | #760-100 | |
| OptiView DAB | Ventana | #760-700 | |
| OptiView Copper | Ventana | #760-700 | |
| Hematoxylin II | Ventana | #790-2208 | |
| Bluing Reagent | Ventana | #760-2037 | |
| Cell Conditioning 1 (CC1) | Ventana | #950-124 | |
| Tissue-Tek Film Coverslipper | Sakura | 4742 |
References
- Garon, E. B., et al. Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 372 (21), 2018-2028 (2015).
- Herbst, R. S., et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial. The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).
- Reck, M., et al. Pembrolizumab versus Chemotherapy for PD-L1-Positive Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1823-1833 (2016).
- Langer, C. J., et al. Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study. The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).
- Buttner, R., et al. Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).
- Folch, E., Costa, D. B., Wright, J., VanderLaan, P. A. Lung cancer diagnosis and staging in the minimally invasive age with increasing demands for tissue analysis. Translational Lung Cancer Research. 4 (4), 392-403 (2015).
- Padmanabhan, V., et al. Improving Adequacy of Small Biopsy and Fine-Needle Aspiration Specimens for Molecular Testing by Next-Generation Sequencing in Patients With Lung Cancer: A Quality Improvement Study at Dartmouth-Hitchcock Medical Center. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 141 (3), 402-409 (2017).
- Tsao, M. S., et al. IASLC ATLAS of PD-L1 Immunohistochemistry Testing in Lung Cancer. , International Association for the Study of Lung Cancer (IASLC) Press. (2017).
- Thunnissen, E., de Langen, A. J., Smit, E. F. PD-L1 IHC in NSCLC with a global and methodological perspective. Lung Cancer. , 102-105 (2017).
- Ilie, M., et al. Use of the 22C3 anti-PD-L1 antibody to determine PD-L1 expression in multiple automated immunohistochemistry platforms. PLoS One. 12 (8), e0183023 (2017).
- Ilie, M., et al. Use of the 22C3 anti-programmed death ligand 1 antibody to determine programmed death ligand 1 expression in cytology samples obtained from non-small cell lung cancer patients. Cancer Cytopathology. 126 (4), 264-274 (2018).
- Skov, B. G., Skov, T. Paired Comparison of PD-L1 Expression on Cytologic and Histologic Specimens From Malignancies in the Lung Assessed With PD-L1 IHC 28-8pharmDx and PD-L1 IHC 22C3pharmDx. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 25 (7), 453-459 (2017).
- Russell-Goldman, E., Kravets, S., Dahlberg, S. E., Sholl, L. M., Vivero, M. Cytologic-histologic correlation of programmed death-ligand 1 immunohistochemistry in lung carcinomas. Cancer Cytopathology. 126 (4), 253-263 (2018).
- Heymann, J. J., et al. PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens. Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).
- Stoy, S. P., Rosen, L., Mueller, J., Murgu, S. Programmed death-ligand 1 testing of lung cancer cytology specimens obtained with bronchoscopy. Cancer Cytopathology. 126 (2), 122-128 (2018).
- Ilie, M., Hofman, P. Reproducibility of PD-L1 assessment in non-small cell lung cancer-know your limits but never stop trying to exceed them. Translational Lung Cancer Research. 6 (Suppl 1), S51-S54 (2017).
