Summary
Her, beskriver vi en i situ hybridisering analyse, som gør det muligt for følsom og specifik påvisning af sekvenser så kort som 50 nukleotider med enkelt-nukleotid opløsning på én celle-niveau. Analysen, som kan udføres manuelt eller automatisk, kan aktivere visualisering af splice varianter, korte sekvenser og mutationer inden konteksten væv.
Abstract
Fordi præcision medicin er stærkt afhængigt af den nøjagtige påvisning af biomarkører, er der et stigende behov for standardiseret og robuste teknologier, der måler RNA biomarkører i situ i klinisk prøvemateriale. Mens trummerum og binde assays som RNAseq og kvantitativ RT-PCR aktiverer meget følsomme gen expression målinger, de også kræver RNA udvinding og dermed forhindre værdifulde udtryk analyse i forbindelse morfologiske væv. Den i situ hybridisering (ISH) analysen beskrives her kan registrere RNA target sekvenser så kort som 50 nukleotider på enkelt-nukleotid opløsning og encellede plan. Denne analyse er et supplement til de tidligere udviklede kommercielle assay og gør det muligt for følsom og specifik i situ påvisning af splice varianter, korte mål og punktmutationer i vævet. I denne protokol, var sonder designet til at målrette unikke exon knudepunkter for to klinisk vigtige splice varianter, EGFRvIII og METΔ14. Påvisning af korte mål sekvenser blev demonstreret af specifik påvisning af CDR3 sekvenser af T-celle receptorer α og β i linjen Jurkat T-celle. Også vist er nytten af denne ISH assay for at skelne mellem RNA target sekvenser på enkelt-nukleotid opløsning (punktmutationer) gennem visualisering af EGFR L858R og KRAS G12A enkelt-nukleotid variationer i celle linjerne ved hjælp af automatiserede farvning platforme. Sammenfattende viser protokollen en specialiserede RNA ISH assay, der giver mulighed for påvisning af splice varianter, korte sekvenser og mutationer i stedet for manuel ydeevne og på automatiserede stainers.
Introduction
Høj overførselshastighed transkriptom teknologier såsom microarrays og næste generations RNA sekventering (RNAseq) har eksponentielt forbedret opdagelse af RNA selektionsmarkører med diagnosticering, prognostiske og prædiktive klinisk værdi for forskellige sygdomme herunder kræft1,2. For at fremme brugen af disse biomarkører i præcision medicin, der er en høj behovet for standardiserede og robuste teknologier, der kan måle RNA biomarkører inden konteksten væv af kliniske prøver. Mens etableret bredt trummerum og binde assays som RNAseq og kvantitativ RT-PCR aktiverer meget følsomme gen expression målinger, kræves væv homogenisering og RNA isolering medfører tab i vivo celletype specificitet og morfologiske oplysninger3. Konventionelle i situ RNA påvisning metoder manglende følsomhed og specificitet kræves til pålideligt måle sjældne eller lav-udtrykker RNA biomarkører inden for væv sammenhæng4.
En kommerciel i situ hybridisering (ISH) assay (fx., RNAscope analysen) er en teknologi, der har taget fat på disse udfordringer og muliggør også yderst følsom og specifik visualisering af enkelt RNA molekyler større end 300 nukleotider morfologiske led væv. Denne type af assay bruger en unik oligonukleotid sonde design af ca 6-20 dobbelt-Z sonde par kombineret med en avanceret hybridisering-baseret signal forstærkning5.
Denne undersøgelse beskriver en specialiserede RNA ISH assay, BaseScope, supplerer den tidligere designede kommercielle teknologi, der kan registrere RNA target sekvenser så kort som 50 nukleotider på single nucleotid opløsning. Denne analyse er relevant til nøjagtig påvisning af exon vejkryds, korte mål sekvenser og punktmutationer i konteksten væv (tabel 1) bruger så lidt som en dobbelt-Z sonde par og løser indviklede kompleksiteten af transkriptom. Denne rapport viser komplet assay-protokollen og dens anvendelse i påvisning af splice varianter, CDR3 sekvenser for T-celle receptoren kloner, og enkelt-nukleotid mutationer i FFPE celle linjer og tumor væv.
Protocol
De menneskelige tumor prøver, der indgår i denne undersøgelse var deidentified og erhvervet fra kommercielle kilder i overensstemmelse med de lokale etiske retningslinjer for human forskning.
1. sample, udstyr og reagens
-
FFPE prøveforberedelse
- Væv
- Umiddelbart efter dissektion, lave væv (skåret i blokke af 3 – 4 mm i tykkelse) i 10% neutral-buffered formalin (NBF) i 16-32 timer ved stuetemperatur (RT).
Bemærk: Fiksering tid vil variere afhængigt af vævstype og størrelse. - Vaske prøve med 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og dehydrere ved hjælp af en standard ethanol (EtOH) serie (70% EtOH for 30-60 min, 80% EtOH i 30-60 min., 90% EtOH for 30-60 min, 95% EtOH for 30-60 min, 3 x 100% for EtOH 30-60 min) efterfulgt af xylen.
- Integrere prøven i paraffin bruger standard procedurer6 og trim paraffinblokke som nødvendig for at fjerne overskydende paraffin.
Bemærk: Blokstørrelse varierer afhængigt af væv prøvestørrelse, men en typisk størrelse er 0,75 x 0,75 tommer2 eller mindre.
- Umiddelbart efter dissektion, lave væv (skåret i blokke af 3 – 4 mm i tykkelse) i 10% neutral-buffered formalin (NBF) i 16-32 timer ved stuetemperatur (RT).
- Cellelinjer
- Indsamle og pellet celler efter de anbefalede metoder til de specifikke cellelinie.
- Fix celler i 10% formaldehyd på RT for 24 timer på et rotator.
- Forberede celler som en pellet i forvarmet behandling gel (fx., Histogel). Tillad pellet størkne ved at placere gel-celle pellet på et stykke af parafilm på isen, og lad det sidde i 2-3 min. Submerge gel-celle pellet i 1 x PBS.
- Dehydrere og integrere celle pellets som beskrevet i trin 1.1.1.
- Afsnittet forberedelse
- Skær de indlejrede væv/celler i 5 ± 1 μm sektioner ved hjælp af en mikrotom, montere afsnittene på elektrostatisk klæbende glas lysbilleder og lufttørre dem natten over på RT.
Bemærk: Dias kan opbevares på RT under udtørring i op til 3 måneder. - Objektglassene i et dias rack og bage monteret væv dias i en cirkulerende luft ovn ved 60 ° C i 1 time før du udfører analysen.
Bemærk: Bruge dias med det samme eller gemme dem på RT med desiccants for op til 1 uge. Længere tids opbevaring kan resultere i RNA nedbrydning.
- Skær de indlejrede væv/celler i 5 ± 1 μm sektioner ved hjælp af en mikrotom, montere afsnittene på elektrostatisk klæbende glas lysbilleder og lufttørre dem natten over på RT.
- Væv
-
Udstyr forberedelse
- Indstil hybridisering ovn til 40 ° C. Grundigt våd befugtning papiret og fjerne eventuelle resterende dH2O. indsætte papiret i bakken fugtighed kontrol, og Indsæt skuffen i hybridisering ovnen til prewarm i mindst 30 min før brug.
-
Af reagens
- Fylde to clearing agent retter med 200 mL xylen og fylde to farvning retter med 200 mL af 100% EtOH, som vil blive brugt til deparaffinization af sektioner.
- Forberede 200 mL af kommercielt tilgængelige 1 x mål hentning reagens ved at tilføje 180 mL af dH2O 20 mL 10 x mål hentning reagens. Placer to dias indehavere i en damper. Fyld en diasholderen med 200 mL af 1 x mål hentning reagens og udfylde de andre diasholderen med 200 mL af dH2O. varme begge løsninger i kog ved hjælp af damperen.
- Varm 50 x vaskebuffer til 40 ° C i 10-20 min. forberede 3 L med 1 x vaskebuffer ved fortynding af 60 mL af forvarmet 50 x vaskebuffer med 2,94 L af dH2O.
- I et stinkskab, forberede 50% Gill hæmatoxylin counterstaining løsning ved tilsætning af 100 mL af Gills hæmatoxylin til 100 mL med dH2O. I stinkskab, forberede blånelse reagens (0,02% (w/v) ammoniak vand) ved at tilføje 1,43 mL af 28 – 30% ammoniumhydroxid til 250 mL af dH2O.
- Prewarm target sonder ved 40 ° C i 10 min. før sonden hybridisering og bringe de forstærkende reagenser (AMP 0-6) til RT.
2. RNA In Situ hybridisering Assay
-
Deparaffinization og dehydrering
- Efter bagning som beskrevet i trin 1.1.3.2 (valgfri standsested 1), deparaffinize sektioner i xylen i 5 min. med agitation. Deparaffinize igen i frisk xylen i 5 min. Dehydrate i 100% EtOH i 2 min. med agitation, og Gentag igen i frisk 100% EtOH for 2 min.
- Luft tørre dias i 5 min. ved 60 ° C i en cirkulerende luft ovn eller på RT indtil de er helt tørre (valgfri standsested 2).
-
Prøve pretreatments
- Inkuber sektioner med ~ 4 dråber af klar-til-brug brintoverilte i 10 min på RT for at slukke den endogene peroxidase aktivitet. Dekanteres løsning fra dias og skyl dem to gange med dH2O.
- Inkuber sektioner med 200 mL af target hentning reagens i 15-30 min. ved 100 ° C i en damper.
Bemærk: Inkubationstiden kan variere afhængigt af vævstype. I denne protokol, blev target hentning udført i 15 min. for både tumor prøver og celle pellets. - Dekanteres løsning fra dias, skylles to gange med dH2O, dyppe i 100% EtOH for 3 min og tør dias ved 60 ° C i en cirkulerende luft ovn eller på RT indtil fuldstændig tør.
- Tegn en hydrofobe barriere omkring afsnittet bruge en hydrofobe pen, ca 0,75 x 0,75 tommer2.
Bemærk: Det anbefales ikke at tegne en mindre barriere. For større sektioner skal en større barriere drages. - Lad barrieren tørre helt i 1 min, eller lad natten på RT (valgfri standsested 3).
- Objektglassene i en diasholderen og placere lysbilledholderen i bakken fugtighed kontrol. Tilsæt ~ 4 dråber af Protease III til hvert dias og Inkuber dem i 15-30 min. ved 40 ° C i hybridisering ovnen for protein fordøjelse.
Bemærk: Inkubationstiden kan variere alt efter vævstype. I denne protokol, blev protease fordøjelsen opført for 30 min tumor prøver og 15 min til celle pellets. - Dekanteres løsning fra dias og skyl dem to gange med dH2O.
-
Sonden hybridisering
- Tilsæt ~ 4 dråber af passende klar-til-brug sonde løsning til at dække hele sektionen. Hvis du bruger større sektioner, tilføje ~ 5-6 dråber.
- Krydse sonder i 2 timer ved 40 ° C i hybridisering ovn. Dekanteres løsning fra dias og vask diasene i 200 mL af 1 x vaskebuffer i 2 min på RT med lejlighedsvise agitation. Gentag proceduren vask i dette trin.
-
Signal forstærkning
- Inkuber sektioner med ~ 4 dråber af AMP 0 per dias ved 40 ° C i hybridisering ovnen i 30 min. Decant løsningen og vaske diasene i 200 mL af 1 x vaskebuffer i 2 min på RT med lejlighedsvise agitation. Gentag proceduren vask i dette trin.
- Inkuber sektioner med ~ 4 dråber af AMP 1 pr. dias ved 40 ° C i hybridisering ovnen i 15 min. Decant løsningen og vaske diasene i 200 mL af 1 x vaskebuffer i 2 min på RT med lejlighedsvise agitation. Gentag proceduren for vask.
- Inkuber sektioner med ~ 4 dråber af AMP 2 pr. dias ved 40 ° C i hybridisering ovnen i 30 min. Decant løsningen og vaske diasene i 200 mL af 1 x vaskebuffer i 2 min på RT med lejlighedsvise agitation. Gentag proceduren for vask.
- Inkuber sektioner med ~ 4 dråber af AMP 3 pr. dias ved 40 ° C i hybridisering ovnen i 30 min. Decant løsningen og vaske diasene i 200 mL af 1 x vaskebuffer i 2 min på RT med lejlighedsvise agitation. Gentag proceduren for vask.
- Inkuber sektioner med ~ 4 dråber af AMP 4 per dias ved 40 ° C i hybridisering ovnen i 15 min. Decant løsningen og vaske diasene i 200 mL af 1 x vaskebuffer i 2 min på RT med lejlighedsvise agitation. Gentag proceduren for vask.
- Inkuber sektioner med ~ 4 dråber af AMP 5 pr. slide på RT for 30 min. Decant løsningen og vaske diasene i 200 mL af 1 x vaskebuffer i 2 min på RT med lejlighedsvise agitation. Gentag proceduren for vask.
- Inkuber sektioner med ~ 4 dråber af AMP 6 pr. slide på RT for 15 min. Decant løsningen og vaske diasene i 200 mL af 1 x vaskebuffer i 2 min på RT med lejlighedsvise agitation. Gentag proceduren for vask.
-
Signal detection
- Forberede hurtigt røde farvestof arbejder løsning. For ét dias med en 0,75 x 0,75 tommer2 barriere, tilsættes 2 μL hurtigt røde-B farvestof til 120 μL af hurtige rød-A i en tube og bland godt.
Bemærk: Afhængigt af størrelsen af den hydrofobe barriere og antal dias, mængder af hurtigt røde brugsopløsning vil variere. - Dekanteres den overskydende væske fra dias og tilføje hurtigt røde farvestof arbejder løsning til dias. Glassene inkuberes i 10 min. på RT i bakken med et dække for at undgå lys eksponering.
Bemærk: Brug den hurtigt røde arbejder løsning inden for 5 min af forberedelse, og ikke udsættes for direkte sollys eller UV-lys. - Dekanteres hurtigt røde løsning og skyl dias to gange med vand fra hanen. Objektglassene tilbage i et dias rack.
- Forberede hurtigt røde farvestof arbejder løsning. For ét dias med en 0,75 x 0,75 tommer2 barriere, tilsættes 2 μL hurtigt røde-B farvestof til 120 μL af hurtige rød-A i en tube og bland godt.
-
Counterstaining
- Counterstain væv sektioner med 50% Gill hæmatoxylin løsning for 2 min på RT. Wash dias med vand fra hanen, og Gentag dette flere gange, indtil diasene er klar, mens sektionerne forbliver lilla. Dyp diassene i 0,02% ammoniak vand til blånelse (dyp 2 – 3 gange). Erstatte ammoniak-vandet med vand fra hanen og vaske dias 3 – 5 gange.
-
Skub montering
- Tør dias i en cirkulerende luft ovn ved 60 ° C i 15 min eller på RT indtil fuldstændig tør. Sted 1-2 dråber af montering reagens på hvert dias og sted coverslips over hver sektion. Undgå enhver diffusering af luftbobler. Luft tørre dias i mindst 5 min.
Bemærk: Hurtigt røde substrat er alkohol-følsomme. Ikke dehydrere dias i alkohol.
- Tør dias i en cirkulerende luft ovn ved 60 ° C i 15 min eller på RT indtil fuldstændig tør. Sted 1-2 dråber af montering reagens på hvert dias og sted coverslips over hver sektion. Undgå enhver diffusering af luftbobler. Luft tørre dias i mindst 5 min.
-
Visualisering
- Observere dias under et mikroskop for standard brightfield.
Representative Results
I situ hybridisering assay arbejdsprocessen:
Arbejdsprocessen er afbildet i figur 1 og består af fire dele: permeabilization af celler eller væv med target hentning og protease løsninger, hybridisering af sonder til target RNA, signal forstærkning, og visualisering af signalet. Signalet kan også kvantificeres ved hjælp af digital billedbehandling softwaresystemer eller i en semi-kvantitative måde på grundlag af antallet af prikker per celle. Manuel proceduren beskrevet i figur 2 er også blevet fuldt automatiseret i kommercielle auto-farvning systemer.
Repræsentative farvning for exon junction påvisning (EGFRvIII splice variant): EGFRvIII er en variant af epidermal vækstfaktor receptor, der hidrører fra en i-frame genomisk sletning af exons 2 til 7, fører til constitutively aktive muterede signalering7 . Analysen blev brugt til at identificere EGFRvIII status i FFPE glioblastom (GBM) tumor prøver. Enkelt dobbelt-Z sonder var designet til at spænde exon knudepunkter for at afsløre enten WT, mutant, eller begge udskrifter (figur 3A). WT EGFR sonder span knudepunkter enten exons 1 og 2 (E1/E2) eller exons 7 og 8 (E7/E8), mens EGFRvIII-specifikke sonder strækker sig over krydset af exons 1 og 8 (E1/E8). En fælles sonde, der strækker sig over krydset af exons 8 og 9 (E8/E9) blev også brugt til at registrere samlede EGFR (både WT og EGFRvIII udskrifter). Alle sonder blev derefter brugt til at bestemme EGFR status i FFPE GBM prøver. De to repræsentative eksempler vist i figur 3B blev taget fra en større undersøgelse. EGFR status blev bekræftet af en uafhængig metode, RT-PCR. Begge WT sonder opdaget signal i begge prøver, der angiver, at de to stikprøver express WT EGFR (figur 3B). Mutant sonden viste imidlertid kun signal detektion i EGFRvIII + prøven, bekræfter, at dette eksempel er faktisk positivt for EGFRvIII varianten (figur 3B, venstre paneler). Omvendt afsløre mutant sonden ikke signal i EGFRvIII-stikprøven (figur 3B, rigtige paneler). Taget sammen, viser disse resultater, at exon junction assay kan identificere EGFRvIII status i GBM FFPE tumor prøver.
Repræsentant farvning for korte mål:
Den CDR3 eller supplerende afgørende område 3, er en meget varierende domæne i T-celle receptorer. Typisk, CDR3 sekvensen er ganske kort; for eksempel, CDR3 α og β sekvenser fra linjen Jurkat T-celle er 51 og 48 nukleotider i længde, henholdsvis (figur 4A). For at identificere de specifikke CDR sekvenser udtrykt i Jurkat celler, antisense sonder til CDR3 α og β, der er udtrykt i Jurkat T-celle linje blev genereret, ud over forstand sonder til CDR3 α og β, således at tjene som negativ kontrol sonder. Alle sonder blev derefter testet i FFPE-rede Jurkat celler med analysen. Robust farvning blev observeret med anti-sense sonder til begge CDR3 α og β i Jurkat celler, mens følelse sonder fundet lidt eller ingen signal (figur 4B). Disse resultater viser kort mål assay evne til at skelne mellem meget variabel men korte CDR sekvenser for T-celle receptoren kloner.
Repræsentant farvning for punkt mutation EGFR L858R:
Punkt mutation sonder blev udviklet for at opdage enkelt nucleotid variationer og små indrykninger eller sletninger (INDELs) i forbindelse med tumor. Fig. 5A viser evne til i situ påvisning af punkt mutation EGFR L858R (2573T > G). To sonder var designet: en til at opdage L858R muteret EGFR sekvens, og en anden til at opdage EGFR L858 WT sekvens. Begge sonder blev testet i to FFPE forberedt cellelinjer: H2229, som kun udtrykker EGFR L858 WT; og H1975, som er heterozygous for EGFR L858R mutation. L858R mutant sonden fundet signal kun i H1975-cellelinie, men ikke i H2229 cellelinje. Men WT sonden fundet signal i begge cellelinjer. Tilsvarende figur 5B visualiserer i situ påvisning af punkt mutation KRAS G12A (35 G > C). To sonder var designet til at detektere KRAS G12A MT og KRAS G12 WT sekvenserne og derefter testet på den HuT78 celle (der kun udtrykker KRAS G12 WT) og den SW116 cellelinje (som er heterozygous for KRAS G12A mutation). Mens KRAS G12 WT sonden fundet signal i begge cellelinjer, påvist KRAS G12A sonde kun signal i linjen SW116 celle. Taget sammen, viser disse data den tekniske formåen af punkt mutation analysen til at opdage enkelt nucleotid polymorfier i forbindelse med celler og væv.
Repræsentant farvning for automatiseret i situ -assay:
Automatiseret assays giver mulighed for et større antal prøver til at køre mere pålideligt, minimere Inter bruger variabilitet og hands-on tid og generere konsekvent reproducerbare resultater. Derfor, en automatiseret version af analysen blev udviklet. For at demonstrere automatiseret farvning med denne analyse, blev detektion af splice variant METΔ14 undersøgt. Denne variant er resultatet af exon 14 i markedsøkonomisk genet bliver sprunget over under pre-mRNA-splicing, hvilket fører til konstituerende aktivering og muterede transformation af markedsøkonomisk behandling receptor8,9. Ægprodukters specifikt METΔ14 variant, to exon afkørsel sonder var designet: en, der strækker sig over krydset af exons 13 og 15 (E13/E15) til at registrere METΔ14 variant udskrift, og en anden, der strækker sig over krydset af exons 14 og 15 (E14/E15) til at registrere WT MØDTE udskrift (figur 6A). Begge sonder blev derefter testet i 2 FFPE forberedt cellelinjer: H596, som udtrykker METΔ14 varianten, og A549, der udtrykker genet WT mødtes. Begge sonder viste gensidigt eksklusive udtryk mønstre, med E13/E15 sonden kun afsløre signal i H596 celler og E14/E15 sonden kun afsløre signal i A549 celler (tal 6B og 6 C). Endelig, sonden for dapB viste ingen signal, der angiver ingen baggrund signal (tal 6B og 6 C). Samlet, disse data viser specifik påvisning af markedsøkonomisk variant METΔ14 i situ udnytter den automatiserede BaseScope assay.
Figur 1 : Assay arbejdsprocessen. Arbejdsgangen består af 4 hovedtrin: forbehandling til permeabilize celler eller væv, sonde hybridisering til target RNA, signal forstærkning, og signal detektion af visualisering under brightfield eller fluorescerende mikroskop. Enkelte prikker kan kvantificeres ved hjælp af et digitalt billede analyse platform. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Illustration af den manuelle assay protokol. Hele analysen kan være afsluttet i 9 h. forbehandling tider kan variere afhængigt af vævstype, så anbefales det at konsultere tillæg A i brugermanualen til væv forbehandling anbefalinger vedrørende inkubationstiden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Repræsentant billeder af exon junction påvisning. (A) vist her er exon organisation for EGFR WT og EGFRvIII udskrifter og en skematisk skildrer dobbelt-Z exon afkørsel sonder, der straddle krydset til påvisning af EGFR WT eller EGFRvIII. (B) exon junction analyse blev udført på to FFPE glioblastom prøver ved hjælp af sonder i (A), samt en positiv kontrol sonde, POLR2A og negativ kontrol sonde, dapB. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Repræsentant billeder af korte mål sekvens påvisning. (A) vist her er CDR3 sekvenser i Jurkat celler. Sekvens i sort er en flankerende fælles sekvens og sekvensen i rød er unikke til enten CDR3α eller CDR3β. Enkelt dobbelt-Z kort mål sekvens sonder var designet mod disse sekvenser. (B) kort mål analyse blev udført på Jurkat celler udarbejdet som en FFPE celle pellet ved hjælp af antisense eller følelse sonder målretning sekvenser i (A), og dapB blev brugt som en negativ kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Repræsentant billeder af punkt mutation påvisning. (A) analysen blev udført på H2229 celler (homozygot for EGFR L858) og H1975 celler (heterozygous for EGFR L858R mutation) tilberedt som en FFPE celle pellet ved hjælp af enkelt dobbelt-Z punkt mutation sonder målretning EGFR L858 WT sekvens eller EGFR L858R muteret sekvens. (B) punkt mutation analyse blev udført på HuT78 celler (homozygot for KRAS G12A) og SW116 celler (heterozygous for KRAS G12A mutation) tilberedt som en FFPE celle pellet ved hjælp af enkelt dobbelt-Z punkt mutation sonder målretning KRAS G12 WT sekvens eller KRAS G12A muteret sekvens. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Repræsentant billeder af automatiserede farvning med exon junction assay. (A) vist her er exon organisation for MØDTE WT og METΔ14 udskrifter og en skematisk skildrer enkelt dobbelt-Z exon junction sonder, der straddle krydset for at afsløre MØDTE WT eller METΔ14. (B) og (C) automatiseret exon junction analyse blev udført på H596 celler (udtrykker METΔ14) og A549 celler (udtrykker MØDTE WT) tilberedt som en FFPE celle pellet ved hjælp af sonder i (A), såvel som negativ kontrol sonde dapB. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Exon Junction | Kort sekvens | Punkt Mutation |
| Splejse variant/isoform | Sekvenser mellem 50 og 300 nt | Punkt mutation |
| Cirkulært RNA (circRNA) | Stærkt homologe sekvenser | Korte indel |
| Gen fusion | CDR3 sekvens for TCR kloner | Gen redigering |
| Gen knockout (KO) | Pre-miRNA | |
| Små nucleolar RNA (snoRNA) | ||
| Gen redigering |
Tabel 1: programmer af den i situ assay. Der er 3 hovedkategorier for anvendelser af dette assay: exon junction, korte mål sekvens og punkt mutation. I hver kolonne er nogle specifikke applikationseksempler for hver kategori.
Discussion
I denne betænkning, blev roman ISH assay protokollen og dens ansøgninger drøftet i detaljer. Analysen giver mulighed for direkte visualisering af exon vejkryds, kort-mål og meget homologe sekvenser og punktmutationer i forbindelse med væv. Analysen er baseret på RNAscope teknologi5 og er derfor i stand til at enkelt molekyle påvisning. Men på grund af en avanceret forstærkning system, signalet kan påvises med sonder, der indeholder så lidt som en dobbelt-Z par eller med en target skabelon længde på kun 50 nukleotider. Fordi sonderne kan være så kort som en enkelt dobbelt-Z i længde, dette giver mulighed for påvisning af exon vejkryds, kort-mål og meget homologe sekvenser og punktmutationer (tabel 1).
For vellykket præstation af analysen er der flere tekniske anbefalinger. Først, væv bør fastsættes i frisk 10% neutral-buffered formalin (NBF) ved stuetemperatur for 16 – 32 h10. Underfixation (< 16 h) eller overfixation (> 32 h) vil forringe ydeevnen af analysen og kan kræve yderligere optimering. For det andet for at sikre optimal kontrol af temperatur og fugtighed, som er nødvendige for robust sonde hybridisering og signal forstærkning, bør diasset processing system og hybridisering ovn anvendes til protokollen trin 2.3 til 5 (protease forbehandling, sonde hybridisering, signal forstærkning, og signal detektion). Tredje, overskydende resterende buffere skal være ordentligt dekanterede før hvert trin i hele protokollen (men ikke så meget, at sektionerne væv tørre ud). Hvis diasene tørre ud, vil betydelige ikke-specifikke signal udvikle. Fjerde, alt efter vævstype, forbehandling optimering kan være nødvendigt. Bruger den forkerte protease eller udfører for en suboptimal tidsrum kan resultere i under - eller slut - digestion og påvirker negativt signalet. Endelig er det vigtigt at kører altid positive og negative kontroller med test-sonder. Negativ kontrol sonder sikre at der ikke er nogen baggrund signal, og positiv kontrol sonder sikre, at analysen har været gjort korrekt og at RNA kvalitet i stikprøven er optimal for at fortolke testresultater sonde. Hvis der ikke er noget signal med positiv kontrol sonde, så RNA kvalitet i stikprøven er sandsynligt suboptimal og et signal kan ikke ses med test sonden.
Ud over de manuelle assay blev evnen til at udføre analysen på automatiserede stainers også vist (figur 6). Denne automatiserede ISH analyse giver et højt signal / støj-forhold og er gældende for de samme anvendelser som vist i tabel 1; men fordelene ved en automatiseret analyse omfatter standardisering af analysen betingelser, minimering af Inter bruger variabilitet og hands-on tid, og ydelse til high throughput screening af vævsprøver på en pålidelig måde.
Mens Immunhistokemi (IHC) og qRT-PCR giver mulighed for påvisning af splice varianter (især EGFRvIII), i FFPE kliniske prøver, disse teknikker kan mangle de nødvendige specificitet og giver ikke indblik i den rumlige opløsning af splice variant, udtryk, henholdsvis11,12. En vigtig fordel af analysen i denne protokol er dens yderst følsom og specifik visualisering af splice knudepunkter samtidig bevare forbindelse morfologiske væv. Her, blev den assay evne til præcist målrettede unikke exon knudepunkter for flere splice varianter, herunder EGFRvIII og METΔ14, demonstreret (tallene 3 og 6). Derudover har analysen vist sig at opdage splice variant AR-V7 i prostata cancer, flere isoformer af ErbB4 i hjernen, og bekræftelse af knockout af cirkulært RNA Cdr1as i mus hjernen3,13,14.
Kort mål sekvens afsløring af dette ISH assay giver mulighed for visualisering af RNA sekvenser så kort som 50 nukleotider i længde, som påvist ved påvisning af CDR3 sekvenser stammer fra Jurkat celler (figur 3). Analysen kan også registrere gensekvenser, der er stærkt homologe til andre familiemedlemmer eller arter, som det fremgår af Revêchon mfl., der anvendes korte mål assay til påvisning af menneskelige progerin udtrykt i mus subkutane hvidt fedtvæv15. Derudover kan små nucleolar RNA (snoRNA), CRISPR-medieret gen redigering og forløber-mikroRNA være fundne i situ kort mål assay. Mere nylig, Fu et al. kombineret denne ISH assay med IHC at identificere præcis celler i nethinden udtryk for pre-miRNA mir125b16.
Mutation profilering i tumorer er kritisk for at studere progression af tumorer og udvikle målrettede behandlinger. Mens mutation profilanalyse kan opnås via høj overførselshastighed sekventering, kan denne teknologi fuldt adresse intratumoral heterogenitet eller link genetiske ændringer med cellulære morfologi17,18. Påvisning af punktmutationer ved hjælp af denne ISH assay tillader sondring af RNA target sekvenser med en enkelt-base opløsning, som validerede ved påvisning af EGFR L858R og KRAS G12A enkelt nucleotid variationer i cellelinjer (figur 5). Derudover bruges Baker et al. punkt mutation analysen for at målrette flere mutationer i BRAF, KRAS og PIK3CA onkogener i kolorektal cancer18. De var i stand til at identificere og kortlægge rumligt sjældne mutant subclones af tumorceller, i sidste ende viser hvordan de bidrager til intra-tumor heterogenitet.
Sammenfattende er der udarbejdet en specialiserede RNA ISH assay. Denne metode giver mulighed for påvisning af splice varianter, korte sekvenser og mutationer i situ. Det er følsomme, specifikke, målbare og smidig ydeevne både af manuelle metoder og på automatiserede stainers.
Disclosures
Alle forfattere er ansat af avancerede celle Diagnostics, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HybEZ Oven (110 or 220 VAC) or HybEZ II Oven (110 or 220V) | ACD | 310010 or 310013 (HybEZ™), 321710 or 321720 (HybEZ™ II) | |
| HybEZ Humidity Control Tray (with lid) | ACD | 310012 | |
| ACD EZ-Batch Slide Rack (20 slide capacity) 1 rack 310017 | ACD | 310017 | |
| HybEZ Humidifying Paper | ACD | 310015 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen (required) | Vector Laboratory | H-4000 | |
| SuperFrost Plus Slides (required) | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 10% neutral-buffered formalin (NBF) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Paraffin wax | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Microtome | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Gill’s Hematoxylin I | American Master Tech Scientific/MLS | HXGHE1LT | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Xylene | Fisher Scientific/MLS | X3P-1GAL | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Tissue-Tek Vertical 24 Slide Rack | American Master Tech Scientific/MLS | LWSRA24 | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Tissue-Tek Staining Dishes | American Master Tech Scientific/MLS | LWT4457EA | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Tissue-Tek Clearing Agent Dishes, xylene resistant | American Master Tech Scientific/MLS | LWT4456EA | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| 100% alcohol (EtOH) | American Master Tech Scientific/MLS | ALREACS | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| VectaMount Permanent Mounting Medium (required) | Vector Labs | H-5000 | |
| Cover Glass, 24 mm x 50 mm | Fisher Scientific/MLS | 12-545-F | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Ammonium hydroxide, 28–30% | Sigma-Aldrich/MLS | 320145-500mL | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Carboy (>3L) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Oster Steamer Model 5712, Black and Decker Steamer HS3000, or the Braun Multiquick FS 20 Steamer | / | / | |
| Digital thermometer | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Water bath or incubator, capable of holding temperature at 40 +/– 1 °C | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Pipettors and tips, 1–1,000 μL | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Distilled water | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Tubes (various sizes) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Fume hood | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Graduated cylinder | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Parafilm | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Paper towel or absorbent paper | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Microcentrifuge | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Microscope and accessories | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Drying oven, capable of holding temperature at 60 +/– 1 °C | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Formaldehyde | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Histogel | Fisher Scientific/MLS | 22-110-678 | |
| BaseScope Reagent Kit - RED | Advanced Cell Diagnostics | 322900 | |
| BaseScope Hs-EGFR-E1E2 | Advanced Cell Diagnostics | 701701 | |
| BaseScope Hs-EGFR-E1E8 | Advanced Cell Diagnostics | 701711 | |
| BaseScope Hs-EGFR-E7E8 | Advanced Cell Diagnostics | 701721 | |
| BaseScope Hs-EGFR-E8E9 | Advanced Cell Diagnostics | 701731 | |
| BaseScope Hs-MET-E14E15 | Advanced Cell Diagnostics | 701811 | |
| BaseScope Hs-MET-E13E15 | Advanced Cell Diagnostics | 701801 | |
| BaseScope Hs-KRAS-G12A | Advanced Cell Diagnostics | 705491 | |
| BaseScope Hs-KRAS-G12-nt35WT | Advanced Cell Diagnostics | 705531 | |
| BaseScope Hs-EGFR-L858R | Advanced Cell Diagnostics | 705451 | |
| BaseScope Hs-EGFR-L858WT | Advanced Cell Diagnostics | 705461 | |
| BaseScope Control Probe Pack Human | Advanced Cell Diagnostics | 322975 |
References
- Bolha, L., Ravnik-Glavač, M., Glavač, D. Circular RNAs: Biogenesis, Function, and a Role as Possible Cancer Biomarkers. International Journal of Genomics. 2017, 6218353 (2017).
- Yamada, A., Yu, P., Lin, W., Okugawa, Y., Boland, C. R., Goel, A. A RNA-Sequencing approach for the identification of novel long non-coding RNA biomarkers in colorectal cancer. Scientific Reports. 8 (1), 575 (2018).
- Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution. Molecular Neurobiology. , Epub ahead of print (2017).
- Mahmood, R., Mason, I. In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections. Methods in Molecular Biology. 461, 675-686 (2008).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Paraffin processing of tissue. Protocols Online. , Available from: https://www.protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2016).
- An, Z., Aksoy, O., Zheng, T., Fan, Q. W., Weiss, W. A. Epidermal growth factor receptor and EGFRvIII in glioblastoma: signaling pathways and targeted therapies. Oncogene. , Epub ahead of print (2018).
- Frampton, G. M., et al. Activation of MET via diverse exon 14 splicing alterations occurs in multiple tumor types and confers clinical sensitivity to MET inhibitors. Cancer Discovery. 5 (8), 850-859 (2015).
- Awad, M. M., et al. MET Exon 14 Mutations in Non-Small-Cell Lung Cancer Are Associated With Advanced Age and Stage-Dependent MET Genomic Amplification and c-Met Overexpression. Journal of Clinical Oncology. 34 (7), 721-730 (2016).
- Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 134 (6), 907-922 (2010).
- Gan, H. K., Cvrljevic, A. N., Johns, T. G. The epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII): where wild things are altered. Federation of European Biochemical Societies Journal. 280 (21), 5350-5370 (2013).
- Wheeler, S. E., Egloff, A. M., Wang, L., James, C. D., Hammerman, P. S., Grandis, J. R. Challenges in EGFRvIII detection in head and neck squamous cell carcinoma. Public Library of Science One. 10 (2), e0117781 (2015).
- Zhu, Y., et al. Novel Junction-specific and Quantifiable In Situ Detection of AR-V7 and its Clinical Correlates in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer. European Urology. , Epub ahead of print (2017).
- Piwecka, M., et al. Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function. Science. , Epub ahead of print (2017).
- Revêchon, G., et al. Rare progerin-expressing preadipocytes and adipocytes contribute to tissue depletion over time. Scientific Reports. 7 (1), 4405 (2017).
- Fu, Y., et al. Functional ectopic neuritogenesis by retinal rod bipolar cells is regulated by miR-125b-5p during retinal remodeling in RCS rats. Scientific Reports. 7 (1), 1011 (2017).
- Yates, L. R., et al. Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing. Nature Medicine. 21 (7), 751-759 (2015).
- Baker, A. M., et al. Robust RNA-based in situ mutation detection delineates colorectal cancer subclonal evolution. Nature Communications. 8 (1), 1998 (2017).
