Summary
Mitophagy, selektiv nedbrytning av mitokondrier, har varit inblandad i mitokondriell homeostas och är avreglerade i olika mänskliga sjukdomar. Bekväm experimentella metoder för att mäta mitophagy aktivitet är dock mycket begränsade. Här ger vi en känslig analys för att mäta mitophagy aktivitet med hjälp av flödescytometri.
Abstract
Mitophagy är en process av selektiv borttagning av skadad eller onödiga mitokondrier med autofagi maskiner. Nära förbindelser har hittats mellan defekta mitophagy och olika sjukdomar, inklusive cancer, neurodegenerativa sjukdomar och metabola sjukdomar. Nya studier har dessutom visat att mitophagy är inblandad i normala cellulära processer, såsom differentiering och utveckling. De exakta roll och molekylära mekanismer bakom mitophagy kräver dock ytterligare studier. Därför är det viktigt att utveckla en robust och bekväm metod för att mäta förändringar i mitophagy verksamhet. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att kvantitativt bedöma mitophagy aktivitet genom flödescytometri använder mitokondrierna-riktade fluorescerande proteinet Keima (mt-Keima). Detta flöde flödescytometri assay kan analysera mitophagy aktivitet snabbare och känsligt än konventionella mikroskopi - eller immunoblotting-baserade metoder. Detta protokoll kan användas för att analysera mitophagy aktivitet i olika celltyper.
Introduction
Mitokondrierna är organeller som är nödvändiga för cellproliferation och fysiologi. Mitokondrierna är ansvarig för att generera mer än 80% av ATP leverans via oxidativ fosforylering, och de ger också olika metaboliska intermediärer för biosyntes och metabolism1,2. Förutom sina roller i energiförsörjningen och metabolism spelar mitokondrierna centrala roller i många andra viktiga processer, inklusive reaktivt syre arter (ROS) generation, regleringen av celldöd och intracellulära Ca2 + dynamics3 . Förändringar i mitokondriefunktion har förknippats med mänskliga sjukdomar, inklusive cancer, diabetes mellitus och olika neurodegenerativa sjukdomar4,5. Ökad mitokondriell dysfunktion och mitokondrie DNA-mutationer är också tänkt att bidra till normalt åldrande processer6,7,8. Kvalitetskontroll är därför en avgörande fråga i mitokondrierna. Mitokondrierna är högdynamiska organeller som kontinuerligt kan ändra sin form mellan långsträckt nätverk och kort, fragmenterade form. Mitokondrier dynamics spelar en viktig roll i att upprätthålla funktionen av mitokondrier samt deras nedbrytning genom mitophagy9.
Mitophagy är en mekanism som innebär selektiv nedbrytning av hela mitokondrier med autofagi maskiner. Mitophagy är principen mekanism underliggande mitokondriell omsättningen och avlägsnande av skadad eller dysfunktionella mitokondrier. I denna process är mitokondrierna först omgivna av ett membran, vilket resulterar i bildandet av autophagosomes, som sedan säkring med lysosomer för Hydrolytisk nedbrytning9. Tidigare genetiska studier i Drosophila har föreslagit att två Parkinsons sjukdom-relaterade gener, PTEN-inducerad förmodad kinase 1 (PINK1) (PARK6) och Parkin (PARK2), funktion i samma väg10,11. Kompletteringssystem studier har visat att PINK1-Parkin smittvägen är ansvarig för att eliminera skadade mitokondrier och defekter i detta utbildningsavsnitt resultat i dysfunktionella mitophagy och kan bidra till mänskliga sjukdomar12,13. Defekter i mitophagy processer har nyligen hittats i olika mänskliga sjukdomar, inklusive cancer, hjärtsjukdomar, leversjukdomar och neurodegenerativa sjukdomen 14. Dessutom har senaste studier också visat att mitophagy är avgörande för många fysiologiska processer, såsom differentiering, utveckling och immunsvar15,16,17,18 ,19, vilket tyder på att mitophagy kan spela en mer aktiv roll i att kontrollera cellfunktioner.
Trots senaste bekräftelse på att mitophagy spelar en viktig roll i både kvalitetskontroll i mitokondrier och mänskliga sjukdomar, de molekylära mekanismerna bakom mitophagy förblir dåligt förstått. Även om mitophagy-relaterade mekanismer har studerats systematiskt i jäst, har studier som syftar till att utforska mitophagy-relaterade mekanismer i däggdjursceller främst fokuserat på PINK1-Parkin vägen. Tidigare studier har fastställt att PINK1-Parkin smittvägen är primärt ansvarig för selektiv avlägsnande av skadade mitokondrier via mitophagy12,20,21. Senare studier har dock rapporterat att mitophagy i vissa modeller kan aktiveras även i avsaknad av den funktionella PINK122,23,24. Dessa resultat tyder på att förutom PINK1-Parkin vägen, där en ytterligare oidentifierade väg kan aktivera mitophagy.
Avsaknaden av en bekväm metod för att bedöma mitophagy verksamhet är ett stort hinder för att utforska de vägar som reglerar mitophagy och dess roll i patofysiologiska händelser. Elektronmikroskopi är ett kraftfullt verktyg att direkt visualisera autophagosome-uppslukade mitokondrier. Elektronmikroskopi har dock limitationsin kvantifiera mitophagy aktivitet. Även om strategier som använder mikrotubulära-associerade protein-1 ljus kedja 3 (LC3)-konjugerade fluorescerande sonder, såsom GFP-LC3, är för närvarande den mest använda metoder25, LC3-baserade signalen övergående karaktär och dess höga andelen falskt positiva signaler begränsa dess känslighet för att upptäcka mitophagy i celler26. En kombination av western blotting för att mäta mitokondriell proteinnivå, kvantifiering av mitokondrie-DNA och fluorescence mikroskopi analys colocalize mitokondrier med antingen autophagosomes eller lysosomer skulle vara en bra metod för att bedöma mitophagy. Emellertid, kvantifiering begränsningar och brist på bekvämligheten av befintliga metoder kräver nya strategier. Införandet av ett nytt pH-beroende fluorescerande protein, mitokondriell målet Keima (mt-Keima), förbättrad kraftigt förmåga att upptäcka mitophagy27. Genom att smälta mitokondrie-targeting sekvensen av cytokrom c oxidas subenhet VIII (COX VIII) in Keima, är mt-Keima riktad till mitokondriell matrisen. Den excitation peak av Keima stora förskjutningen från 440 nm till 586 nm (motsvarande pH 7 pH 4, respektive) kan användas för att bedöma mitophagy med bra känsligt i både in vitro- och in-vivo experiment28,29 . Viktigare, orsakar motståndet av mt-Keima till lysosomal nedbrytning integration av mt-Keima signalen i lysosomer, vilket möjliggör enkel kvantitativa mätningen av mitophagy aktivitet. Fluorescens förändring som sker i mt-Keima kan analyseras med hjälp antingen konfokalmikroskopi eller flow flödescytometri28,29. Ett flöde flödescytometri-baserad metod för att mäta mitophagy aktivitet med mt-Keima har dock inte lämnats i detalj hittills.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för ett flöde flödescytometri-baserad teknik för att mäta mitophagy aktivitet i celler med mt-Keima. Även om vi har här visat att flödescytometri Flödesanalys framgångsrikt upptäckt CCCP-inducerad mitophagy i HeLa celler uttrycker Parkin, kan denna teknik tillämpas på en mängd olika celltyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generering av HeLa celler uttrycker mito-Keima (mt-Keima)
-
Beredning av mt-Keima lentivirus
- Täck en 100 mm kultur maträtt genom att lägga till 2 mL av 0,001% poly-L-lysin/fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och låt det stå 5 minuter i rumstemperatur.
- Ta bort den poly-L-lysin lösningen med glas pipett ansluten till ett vakuum och tvätta kultur skålen genom att tillsätta 2 mL 1 x PBS.
- Plattan 1,5 x 106 HEK293T celler på bestruket kulturen skålen med 10 mL DMEM innehållande 10% FBS och 1% penicillin/streptomycin och odla cellerna vid 37 ° C i en CO2 vävnadsodling inkubator för en dag.
- Transfect 2 µg i mt-Keima lentiviral plasmid29 DNA tillsammans med förpackning DNAs (psPAX 2 µg och pVSVG 0,25 µg) med en transfection reagens för 8 h enligt tillverkarens anvisningar.
- Ta bort transfection media och tillsätt 8 mL färsk media.
- Samla i mediet som innehåller viruspartiklarna 48 h senare. Ta bort cellulära skräp från insamlade media genom centrifugering vid 500 x g i 5 min och filtrera dem med 0,45 µm spruta filter.
Obs: För långvarig användning, göra alikvoter av lentiviral partiklar och lagra proverna vid-80 ° C. Undvik att utsätta viral proverna för att frysning-tining cykler för effektiv viral infektion.
-
Infektera HeLa-Parkin celler med mt-Keima lentivirus
- Tallrik 5 x 104 HeLa celler uttrycker Parkin (HeLa-Parkin) i en 60 mm kultur maträtt med 4 mL DMEM innehållande 10% FBS och 1% penicillin/streptomycin vid 37 ° C en dag före skörd av mt-Keima lentivirus.
Obs: På grund av avsaknaden av endogena Parkin uttryck i HeLa celler30, HeLa-Parkin cellerna används här för att mer tydligt visa CCCP-inducerad mitophagy. Detta förfarande kan också tillämpas på andra primära eller förevigade cellinjer. - Ta bort odlingsmedium nästa dag och tillsätt 1 mL av mt-Keima lentiviral media. Lägga till en ytterligare 2 mL odlingsmedium som innehåller 3 µL av polybrene stamlösning (8 mg/mL i destillerat vatten). Inkubera i en dag i en CO2 vävnadsodling inkubator.
- Ta bort mt-Keima lentiviral blandningen nästa dag och tvätta cellerna två gånger med 1 x PBS. Tillsätt 4 mL odlingsmedium och behandla cellerna med 2 µg/mL puromycin för två dagar.
- Efter två dagar av puromycin val, ta bort odlingsmedium och tvätta cellerna två gånger med 1 x PBS. Lägg odlingsmedium och odla cellerna i en CO2 inkubator fram till användning.
Obs: Denna metod kan användas för att generera celler som stabilt uttrycker mt-Keima, inklusive andra cellinjer och primära celler.
- Tallrik 5 x 104 HeLa celler uttrycker Parkin (HeLa-Parkin) i en 60 mm kultur maträtt med 4 mL DMEM innehållande 10% FBS och 1% penicillin/streptomycin vid 37 ° C en dag före skörd av mt-Keima lentivirus.
2. förmå mitophagy med CCCP behandling och förbereda FACS prover
- Tallrik 5 x 104 HeLa-Parkin celler som uttrycker mt-Keima i en 60 mm kultur skålen med 4 mL DMEM innehållande 10% FBS och 1% penicillin/streptomycin och kultur dem för en dag vid 37 ° C i en CO2 vävnadsodling inkubator.
- Ta bort odlingsmedium nästa dag och Lägg 4 mL färsk DMEM innehållande 10 µM karbonyl cyanid m-chlorophenylhydrazone (CCCP). Inkubera HeLa-Parkin-mt-Keima celler i en CO2 vävnad inkubator för 6 h.
- Ta bort odlingsmedium 6 h senare och tvätta cellerna med 2 mL 1 x PBS. Lossa cellerna genom att behandla dem med trypsin/EDTA-lösning och inaktivera trypsin genom att lägga till odlingsmedium som innehåller 10% FBS. Överföra cellerna i en 15 mL koniska rör.
- Centrifugera cellerna vid 500 x g i 5 min.
- Försiktigt bort odlingsmedium genom aspiration och resuspendera cellerna med 1 mL kallt 1 x PBS.
- Överföra celler i lämpliga FACS röret och placera den på is.
Obs: Förbereda oinfekterade HeLa cells som en negativ kontroll.
Obs: Cellerna är livskraftig på is i flera timmar, och mt-Keima fluorescens signaler också förbli stabila.
3. FACS analys av mitophagy
Obs: I denna studie analyserades celler med en flödescytometer utrustad med en 405-nm och 561-nm laser. Cellerna var glada med en violett laser (405 nm) med utsläpp upptäckts vid 610 ± 10 nm med en BV605 detektor och en gul-grön laser (561 nm) med utsläpp upptäckts vid 610 ± 10 nm med en PE-CF594 detektor samtidigt (figur 1).
-
Gating levande celler
- Slå på flödescytometer och dator och logga in på programvaran analys.
- Generera ett nytt experiment eller duplicera ett befintligt experiment. Att excitera celler med violett (405 nm) och gul-grön (561 nm) lasrar och upptäcka utsläpp på 610 ± 10 nm detektor, Välj BV605 och PE-CF594 förutom framåt scatter (FSC) och side scatter (SSC) i parameterfönstret som krävs fluorophores.
Obs: Alla fluorophores bör läggas till i ett linjärt läge. - Vortex varje cell prov kort att skingra cell aggregat.
- Placera röret som innehåller HeLa-Parkin cell kontrollprov som inte är infekterade med mt-Keima lentivirus på prov injektionsport och tryck på knappen ”Kör” på cytometer.
- Dot tomten av FSC kontra SSC, justera FSC och SSC spänningen för att placera celler i mitten av dot tomten.
- Rita en P1 grind med ikonen Polygon runt levande celler och eliminera döda celler och cellfragment (figur 2A).
-
Justera spänningar för Violetta och grön laser
- Placera röret som innehåller HeLa-Parkin celler infekterade med mt-Keima lentivirus på prov injektion port och tryck på knappen ”Kör” på cytometer.
- I dot handlingen i BV605 (405 nm) kontra SSC, justera BV605 spänningen så att HeLa-Parkin celler som uttrycker mt-Keima är klart skiljas från kontroll-celler som inte uttrycker mt-Keima (figur 2B).
- I dot handlingen i PE-CF594 (561 nm) kontra SSC, justera PE-CF594 spänningen så att HeLa-Parkin celler som uttrycker mt-Keima är klart skiljas från kontroll celler (figur 2B).
-
Bedöma andelen celler i mitophagy
- Förvärva BV605 kontra PE-CF594 dot tomt använder en linjär skala. Rita en grind med ikonen Polygon runt celler som uttrycker mt-Keima, och eliminera celler som inte uttrycker mt-Keima (figur 3A). Mt-Keima fluorescens-positiv cell befolkningen benämns stadsporten ”mt-Keima”.
- Skapa en annan dot handling av BV605 kontra PE-CF594 visar bara ”mt-Keima”-gated celler. I denna punkt tomt, rita en grind runt obehandlad mt-Keima-positiva celler. Basala mitophagy aktiviteten av kontroll HeLa celler är låg, och förhållandet mellan utsläpp på PE-CF594/BV605 är mindre än 1. Således, denna grind benämns som ”låg” grinden.
- Rita en annan gate som innehåller ovanstående regionen av utfärda utegångsförbud för ”låg”. Denna grind benämns som ”hög” porten eftersom det innehåller celler med hög mitophagy aktivitet, det vill säga celler med en hög andel av utsläpp på PE-CF594/BV605 (figur 3B).
- För att beräkna procentandelen av celler i utfärda utegångsförbud för ”hög”, Välj menyn ”Visa befolkningen hierarki”. ”Procent av förälder” (% förälder) värdet representerar procentandelen av celler i ”hög” grinden av mt-Keima-positiva befolkningen.
- Ange minst 10.000 händelser för att spela in i ”mt-Keima” stoppa porten och kör varje prov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett exempel på flöde flödescytometri analysen av CCCP-inducerad mitophagy i HeLa-Parkin celler visas i figur 4. Med flöde flödescytometri analysmetoden som beskrivs ovan, kan vi upptäcka en dramatisk ökning i mitophagic celler i utfärda utegångsförbud för ”hög”. Procentandelen av celler i utfärda utegångsförbud för ”hög” ökade mer än 10 gånger jämfört med obehandlad kontroll celler (figur 4A). Denna ökning av mitophagy aktivitet avskaffades helt genom samtidig behandling med bafilomycin A (BFA) (figur 4A och 4B).
Figur 1 . Schematisk representation av den metod som används för att mäta mitophagy med flödescytometri. Systemet beskrivs de viktigaste stegen för att kvantifiera celler som genomgår mitophagy av flödescytometri. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Ställa in flödet cytometer parametrar. (A) Gating av levande celler. En region för levande celler fastställdes på FSC kontra SSC tomt att utesluta döda celler och cellfragment. (B) justera 405-nm och 531-nm lasrar använda kontrollen HeLa celler celler och HeLa uttrycker mt-Keima. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Beräkning av andelen mitophagic celler av flödescytometri. (A) Gating HeLa celler uttrycker mt-Keima. (B) Gating mitophagic celler och beräkningen av den andelen som använder verktyget statistik. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Kvantifiering av CCCP-inducerad mitophagy i HeLa celler av flödescytometri. (A) HeLa-Parkin celler som uttrycker mt-Keima behandlades med 10 µM CCCP för 6 h med eller utan 100 nM bafilomycin A (BFA). Celler analyserades av FACS med BV605 och PE-CF594 detektorer. (B) celler med högt PE-CF594/BV605 förhållande valdes ut (”hög”), och deras andel har beräknats. Resultaten av tre upprepade experiment är ritade med standardavvikelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi en snabb och känslig metod för att mäta cellulär mitophagy aktivitet i celler som uttrycker mt-Keima med flödescytometri. Celler som genomgår en hög nivå av mitophagy uppvisar en ökad förhållandet mellan PE-CF594 (561 nm) / BV605 (405 nm) excitation. Således kan mitophagy aktivitet uttryckas som andelen celler uppvisar en hög baserat på 561/405. Vi beräknas andelen celler i regionen ”hög” gate på en dot tomt på PE-CF594 (561 nm) kontra BV605 (405 nm), och resultaten visade att behandling med CCCP inducerad ökning av mitophagy i HeLa-Parkin celler. Vi har tidigare visat att den lentivirus-medierad överuttryck av mt-Keima inte själv påverkar mitokondriefunktion eller cellulär fysiologi31. Även om vi har visat vår egenhändiga att flödescytometri Flödesanalys kan framgångsrikt identifiera CCCP-inducerad mitophagy i HeLa celler uttrycker Parkin, denna teknik kan tillämpas på någon typ av cell efter införande av mt-Keima. Vi visade tidigare att hypoxi-inducerad mitophagy kunde detekteras i HeLa celler utan ektopisk Parkin uttryck29. Dessutom tidigare studier, inklusive vår och de av andra grupper, visade att mt-Keima fluorescens analys kan identifiera mitophagy i primära celler mus embryonala fibroblaster (MEFs) och förevigade celler såsom HeLa, HEK293 och SH-SY5Y celler 28 , 29 , 32.
Jämfört med andra mikroskopi- eller immunoblotting-baserade mitophagy-analyser, har flöde flödescytometri analyser fördelar i att de tillåter snabba och reproducerbara analyser av ett stort antal celler31. Därför medan i mikroskopi-baserade analyser, kan forskare partiskhet snedvrida resultaten, är denna bias inte ett problem när du använder flöde flödescytometri analyser.
Färre än 1 x 106 celler krävs för flödescytometri Flödesanalys. Eftersom en analys av ett prov tar endast en till två minuter, kan dessutom upp till dussintals prover analyseras inom en till två timmar. Flöde flödescytometri analyser kan dessutom upptäcka ökar i mitophagic celler med bra känslighet. I vår Flödesanalys flödescytometri upptäckte vi en 10-faldig ökning av mitophagic celler efter 6 h behandling med CCCP.
Det kritiska steget för att analysera mitophagy med hjälp av flödescytometri är att inställda ”high” och ”låg” grindarna för att skilja celler som genomgår en hög nivå av mitophagy. Eftersom basala mitophagy nivåer kan vara olika beroende på cellen, kan inställning ”high” och ”låg” grinden vara svårt i vissa cellinjer. I ett sådant fall är det bra att inkludera en kontroll cellinje med låga basala mitophagy aktivitet exempelvis HeLa cells. Dessutom för celler behandlas med en lysosomala hämmare såsom klorokin, kan bafilomycin A ingå som en låg mitophagy kontroll för att ställa in de rätta gating. Även lentiviruses används vanligen av ektopisk uttryck för intressant proteiner, kan vissa cellinjer vara mottagliga för infektion. Om lentivirus infektionen resulterar i förändringar i cellernas tillväxt eller mitokondrier funktion, bör en annan metod övervägas för mt-Keima uttryck. Uttryck kan mt-Keima också variera beroende på celltyp. Om mt-Keima fluorescens signalen är för svag eller alltför heterogena, kan endast celler med en stark mt-Keima fluorescens signal samlas in med hjälp av en cell sorterare eller mt-Keima celler behandlas igen med en högre koncentration av puromycin antibiotika i flera dagar . Mt-Keima signalen av fristående cellerna är stabila så länge cellerna är livskraftiga, men vi rekommenderar att analysera proverna av flödescytometri så snabbt som möjligt.
Vårt flöde flödescytometri analysen är en robust och bekväm metod för mitophagy analys, men det finns vissa begränsningar. Först, eftersom cellerna bör avskiljas som en enda cellnivå för flödescytometri, denna metod är svåra att tillämpa för att analysera mitophagy av vävnad eller organ utan att ändra fysiologi. Dessutom mt-Keima fluorescens förlorar dess pH-beroende egenskaper efter fixering och således alla prover bör analyseras som levande celler. Detta resulterar i begränsning av förvaringen nämns ovan och en annan begränsning vid tillämpningen av en ytterligare immunofluorescens fläcken. Denna teknik kan mäta mitophagy aktivitet kvantitativt, men det inte går att övervaka förändringar i mitokondriell morfologi eller dynamik, som är känd för att spela viktiga roller i den mitophagy process9. Forskare bör ha i åtanke de komplexitet och obestämd aspekterna av mitophagy. Därför, för att undvika möjliga felbedömning, mitophagy processen bör ytterligare bekräftas av de kombinerade resultaten av andra gemensamma mitophagy analysmetoder, inklusive elektronmikroskopi, mitokondriell protein omsättningen, en minskning mitokondrie-DNA, och fluorescensmikroskopi mäta av colocalization av mitokondrier med lysosomer eller autophagosomes som beskrivs tidigare33,34,35. Alla observerade ökningen av mitophagy kan också granskas ytterligare via konfokalmikroskopi av celler som uttrycker mt-Keima. I mitophagic celler uttrycks mt-Keima i ett ljusa punktuell mönster med högt 586/440 förhållande som kan observeras under konfokalmikroskopi28,29.
Med tanke på dess förmåga att snabbt och känsligt upptäcka mitophagy, ger denna flöde flödescytometri analys en första steget tillnärmning som skulle vara värdefullt att en mängd studier. Genom att helt enkelt infektera celler med den mt-Keima lentivirus, kan ändringar av mitophagy verksamhet vara enkelt åtgärd i någon önskad celltyp. I kombination med funktionen cell sorterare, kan celler med en viss nivå av mitophagy verksamhet vara specifikt isolerade och används för att studera de roller och regulatoriska mekanismerna bakom mitophagy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett stipendium från National Research Foundation of Korea (2016R1D1A1B03931949) (till J. U.), och av National Research foundation av Korea (NRF) bidrag finansieras av den Korea government(MSIT) (nr 2016R1A2B2008887, nr 2016R1A5A2007009) (till J.Y .)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| Turbofect | Thermos scientific | R0531 | |
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
| Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP) | Sigma-Aldrich | C2759 | 10 mM |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| EQUIPMENTS | |||
| BD LSRFortessa | BD Bioscience | LSRFortessa | |
| FACSDIVA | BD Bioscience | FACSDIVA (v8.0.1) |
References
- McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), R551-R560 (2006).
- Zorov, D. B., Krasnikov, B. F., Kuzminova, A. E., Vysokikh, M., Zorova, L. D. Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria. Bioscience Reports. Bioscience Reports. 17 (6), 507-520 (1997).
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
- Kang, D., Hamasaki, N. Alterations of mitochondrial DNA in common diseases and disease states: aging, neurodegeneration, heart failure, diabetes, and cancer. Current Medicinal Chemistry. 12 (4), 429-441 (2005).
- Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The mitochondrial basis of aging. Molecular Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
- Wallace, D. C., Brown, M. D., Melov, S., Graham, B., Lott, M. Mitochondrial biology, degenerative diseases and aging. BioFactors. 7 (3), 187-190 (1998).
- Yun, J., Finkel, T.
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
- Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
- Zhu, J., Wang, K. Z., Chu, C. T. After the banquet: Mitochondrial biogenesis, mitophagy, and cell survival. Autophagy. 9 (11), 1663-1676 (2013).
- Um, J. H., Yun, J. Emerging role of mitophagy in human diseases and physiology. BMB Reports. 50 (6), 299-307 (2017).
- Al Rawi, S., et al. Postfertilization autophagy of sperm organelles prevents paternal mitochondrial DNA transmission. Science. 334 (6059), 1144-1147 (2011).
- Kim, M. J., et al. SESN2/sestrin2 suppresses sepsis by inducing mitophagy and inhibiting NLRP3 activation in macrophages. Autophagy. 12 (8), 1272-1291 (2016).
- Kim, M. J., Yoon, J. H., Ryu, J. H. Mitophagy: A balance regulator of NLRP3 inflammasome activation. BMB Reports. 49 (10), 529-535 (2016).
- Sandoval, H., et al. Essential role for Nix in autophagic maturation of erythroid cells. Nature. 454 (7201), 232-235 (2008).
- Sato, M., Sato, K. Degradation of paternal mitochondria by fertilization-triggered autophagy in C. elegans embryos. Science. 334 (6059), 1141-1144 (2011).
- Geisler, S., et al. PINK1/Parkin-mediated mitophagy is dependent on VDAC1 and p62/SQSTM1. Nature Cell Biology. 12 (2), 119-131 (2010).
- Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
- Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
- Kubli, D. A., et al. PINK1 Is dispensable for mitochondrial recruitment of Parkin and activation of mitophagy in cardiac myocytes. PloS One. 10 (6), e0130707 (2015).
- Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
- Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Lee, I. H., Yun, J., Finkel, T. The emerging links between sirtuins and autophagy. Methods in Molecular Biology. 1077, 259-271 (2013).
- Sun, N., et al. Measuring In vivo Mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
- Denison, S. R., et al. Alterations in the common fragile site gene Parkin in ovarian and other cancers. Oncogene. 22 (51), 8370-8378 (2003).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: Basic principles and applications. Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
- Bingol, B., et al. The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy. Nature. 510 (7505), 370-375 (2014).
- Burbulla, L. F., Kruger, R. The use of primary human fibroblasts for monitoring mitochondrial phenotypes in the field of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. 68, e4228 (2012).
- Di Sante, G., Casimiro, M. C., Pestell, T. G., Pestell, R. G. Time-lapse video microscopy for assessment of EYFP-Parkin aggregation as a marker for cellular mitophagy. Journal of Visualized Experiments. 111, e53657 (2016).
- Fang, E. F., et al. In vitro and in vivo detection of mitophagy in human cells, C. Elegans, and mice. Journal of Visualized Experiments. 129, e56301 (2017).
