Summary
Mitophagy、ミトコンドリアの選択的分解はミトコンドリアの恒常性に関与しているし、様々 な疾患の緩和します。ただし、mitophagy 活性を測定する便利な実験方法は非常に限られました。ここでは、フローサイトメトリーを用いた mitophagy 活性を測定する敏感な試金を提供します。
Abstract
Mitophagy は、オートファジーの機械を使用して破損または不要なミトコンドリアの選択的除去のプロセスです。つながり不良 mitophagy と神経変性疾患、癌、代謝性疾患など、様々 な人間の病気の発見されています。さらに、最近の研究は、その mitophagy は、差別化と開発など、正常な細胞プロセスに関与しているを示しています。ただしの精密な役割と分子機構 mitophagy さらなる研究が必要です。したがって、mitophagy 活性の変化を測定するための堅牢な便利な方法を開発する重要です。ここでは、ミトコンドリアをターゲットとした蛍光タンパク質桂馬 (mt 桂馬) を用いたフローサイトメトリーによる mitophagy 活性を定量的に評価するための詳しいプロトコルについて述べる。この流れの cytometry の試金より迅速かつ従来顕微鏡または免疫ブロット ベースの方法よりも敏感に mitophagy アクティビティを分析できます。このプロトコルは、種々 の細胞の mitophagy 活動を分析に適用できます。
Introduction
ミトコンドリアは、細胞の増殖、生理学に不可欠な細胞内小器官です。ミトコンドリア酸化的リン酸化による ATP の供給の 80% 以上を生成するために責任があるし、また生合成・代謝1,2の様々 な代謝中間体を提供します。エネルギー供給と代謝における役割、に加えてミトコンドリアは、活性酸素種 (ROS) の生成、細胞死と細胞内 Ca2 +動態3 の規制を含め、他の多くの重要なプロセスで中心的な役割を再生します。.ミトコンドリアの機能の変化は、人間の病気、癌、糖尿病、様々 な神経変性疾患4,5などに関連付けられています。増加したミトコンドリアとミトコンドリア DNA の変異はまた正常な老化プロセス6,7、8に貢献すると思った。したがって、品質管理、ミトコンドリアの重要な問題です。ミトコンドリアは、細長い網と短い、断片化されたフォームの形状を変更することが継続的に非常に動的な細胞内小器官です。ミトコンドリアのダイナミクスは、mitophagy9を通して彼らの劣化と同様、ミトコンドリアの機能を維持する上で重要な役割を果たしています。
Mitophagy は、ミトコンドリア、オートファジーの機械を使用しての選択的分解を含むメカニズムです。Mitophagy は原則機構基礎となるミトコンドリア売り上げ高と損傷した、または機能不全のミトコンドリアの除去です。この過程でミトコンドリア最初オートファゴソームは、加水分解9リソソームと融合し、形成の結果、膜によって囲まれています。ショウジョウバエの遺伝学的研究の前は、2 つを示唆しているパーキンソン病関連遺伝子、PTEN による推定のキナーゼ 1 (PINK1) (PARK6)、同じ経路10,11ではパーキン (PARK2) 機能します。PINK1 パーキン経路はこの経路において機能不全 mitophagy の欠陥しひと疾患12,13に貢献するかもしれないこと、傷害ミトコンドリアの排除する責任が、サブシーケンス研究が示されています。Mitophagy プロセスの欠陥は、がん、心臓病、肝臓病、神経変性疾患14を含む様々 な人間の病気で最近発見されています。さらに、最近の研究はその mitophagy が分化、開発、および免疫応答15,16,17,18 などの多くの生理学的プロセスに重要を示しているも ,19, その mitophagy は細胞機能を制御することでより積極的な役割を果たすことを示唆しています。
Mitophagy ミトコンドリアの両方の品質管理に重要な役割を果たしているし、人間の病気、mitophagy の分子機構が不十分なまま最近の確認にもかかわらず理解されます。Mitophagy 関連の機構は酵母で体系的に研究されている、哺乳類細胞における mitophagy 関連メカニズムの探索を目的とした研究が主に PINK1 パーキン経路に焦点を。前の研究は PINK1 パーキン経路は mitophagy12,20,21を介して傷害ミトコンドリアの除去を主に担当を確立しました。しかし、最近の研究を一部のモデルで mitophagy を機能 PINK122,23,24の不在でも起動できるかを報告しています。これらの結果は PINK1 パーキン経路、そこ mitophagy をアクティブにすることができます追加の正体不明経路に加えてことをお勧めします。
Mitophagy 活動を評価するために便利な方法の不在は、mitophagy と病態生理学的イベントにおけるその役割を調節する経路を探索するための主要な障害です。電子顕微鏡は、オートファゴソームを巻き込んだミトコンドリアを直接可視化する強力なツールです。しかし、電子顕微鏡、mitophagy 活動の定量化における制限です。微小管関連タンパク質 1 を使用して、戦略ライト鎖 3 (LC3) が-、GFP LC3 などの共役蛍光プローブが現在最も広く使用されているアプローチ25、LC3 ベース信号の過渡的な性質とその率が高い偽陽性シグナルは、細胞26で mitophagy を検出する感度を制限します。ミトコンドリア蛋白質のレベル、オートファゴソームとリソソームのミトコンドリアを colocalize するミトコンドリア DNA と蛍光顕微鏡分析の定量化を測定する西部にしみが付く組み合わせが評価するための良い方法になります。mitophagy。ただし、数量制限と既存方法論の利便性の欠如は、新しいアプローチを求めます。新しい pH 依存性蛍光タンパク質、桂馬 (mt 桂馬), ミトコンドリアのターゲットの導入 mitophagy27を検出する能力が大幅改善。桂馬にシトクロム c 酸化酵素サブユニット VIII (コックス VIII) のミトコンドリア ターゲット シーケンスを融合することで mt 桂馬はミトコンドリアのマトリックスに送られます。440 から桂馬の励起ピークの大きなシフト 586 nm (と 4、pH 7 にそれぞれ対応する) ことができる nmの in vitroとin vivo実験28,29 で敏感に良い mitophagy を評価するために利用します。.もっと重要なは、ライソゾームの分解に mt 桂馬の抵抗 mitophagy 活動の簡単な定量的測定を可能にする、リソソームで mt 桂馬信号の統合が発生します。Mt 桂馬で発生した蛍光変更どちら共焦点の顕微鏡を使用して分析することができます。 またはフローサイトメトリー28,29の流れ。ただし、日付を詳しく流れ cytometry ベースの mt 桂馬を使用して mitophagy 活性を測定する方法が指定されていません。
ここでは、流れ cytometry ベースの mitophagy mt 桂馬を用いた細胞の活性を測定する手法のための詳しいプロトコルについて述べる。パーキンを発現 HeLa 細胞で正常に CCCP 誘起 mitophagy が検出されたように流れフローサイトメトリー解析我々 はここで示されているが、この手法はさまざまな種類の細胞に適用できます。
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Protocol
1. 水戸桂馬 (mt 桂馬) を発現 HeLa 細胞の生成
-
Mt 桂馬レンチ ウイルスの作製
- コート 100 mm ディッシュの 0.001% ポリ-L-リジン/リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 2 mL を追加することによって、室温で 5 分間立つことができます。
- 真空に接続されているガラス ピペットを使用してポリ L リジン ソリューションを削除し、2 mL の 1x PBS を追加することによって培養皿を洗ってください。
- コーティングされた文化プレート 1.5 x 106 HEK293T 細胞 10 mL 10 %fbs と 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含む DMEM の皿し、1 日 CO2組織文化のインキュベーターで 37 ° C で培養します。
- Mt 桂馬レンチ ウイルス プラスミド29 DNA の 2 μ g を一緒に包装の Dna (psPAX 2 μ g と pVSVG 0.25 μ g) transfect 製造元の指示に従って 8 h のトランスフェクション試薬を使ってします。
- トランスフェクション メディアを取り出し、新鮮なメディア 8 mL を加えます。
- 48 時間後のウイルス粒子を含むメディアを収集します。5 分 500 × g で遠心分離によって収集されたメディアから細胞の残骸を削除、0.45 μ m のシリンジ フィルターでそれらをフィルタ リングします。
注:長期的な使用は、レンチ ウイルス粒子の因数を作成し、-80 ° C のサンプルを格納効率的なウイルス感染を凍結融解するウイルスのサンプルを服従させることを避けます。
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Mt 桂馬レンチ ウイルスを HeLa パーキン細胞への感染
- プレート 5 x 10 の4の HeLa 細胞 mt 桂馬レンチ ウイルスを収穫する前に 1 日 10 %fbs と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン 37 ° C でを含む DMEM の 4 mL で 60 mm ディッシュにパーキン (hela 細胞・ パーキン) を表現します。
注:ために HeLa 細胞30、もっとはっきりショー CCCP 誘起 mitophagy ここで使用 HeLa パーキン細胞の内因性パーキン式の不在。この手順は、他のプライマリまたは不死化細胞株にも適用できます。 - 次の日の成長培地を削除し、mt 桂馬レンチ ウイルス メディアの 1 つの mL を追加します。Polybrene 原液 (8 mg/mL の蒸留水) の 3 μ L を含んでいる成長媒体の追加 2 mL を追加します。CO2組織文化のインキュベーターで 1 日間インキュベートします。
- 次の日 mt 桂馬レンチ ウイルスの混合物を削除し、1 × PBS で 2 回細胞を洗浄します。成長培地 4 mL を追加し、2 日間 2 μ G/ml ピューロマイシンとセルを扱います。
- ピューロマイシンを選択の 2 日後成長培地を削除し、1x PBS で 2 回細胞を洗浄します。成長媒体を追加し、使用するまで CO2インキュベーターで培養します。
注:このメソッドは、mt 桂馬、他の細胞や細胞などを安定に発現する細胞の生成に適用できます。
- プレート 5 x 10 の4の HeLa 細胞 mt 桂馬レンチ ウイルスを収穫する前に 1 日 10 %fbs と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン 37 ° C でを含む DMEM の 4 mL で 60 mm ディッシュにパーキン (hela 細胞・ パーキン) を表現します。
2. 誘導 mitophagy CCCP 治療を使用および FACS サンプルの準備
- 60 mm 文化で mt 桂馬を表現するプレート 5 × 104 HeLa パーキン セル 4 mL 10 %fbs と 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含む DMEM の皿し、CO2組織文化のインキュベーターで 37 ° C で 1 日それらを文化します。
- 次の日の成長培地を削除し、10 μ M カルボニル シアン m-chlorophenylhydrazone (CCCP) を含む新鮮な DMEM の 4 つの mL を追加します。Hela 細胞パーキン-mt 桂馬セル 6 h の CO2組織インキュベーターで孵化させなさい。
- 培 6 h 後を削除し、2 ml の 1x PBS のセルを洗浄します。/トリプシン EDTA 溶液とそれらを扱うことによって細胞を分離し、10% を含んでいる成長媒体を追加することによって、トリプシンを不活化政府短期証券。15 mL の円錐管にセルを転送します。
- 5 分 500 x g で細胞を遠心します。
- 慎重に吸引により成長培地を取り除き、1 mL の冷 1x PBS で細胞を再懸濁します。
- 適切な FACS チューブにセルを転送し、氷の上に置きます。
注:ネガティブ コントロールとして感染していない HeLa 細胞を準備します。
注:細胞は、いくつかの時間のため氷の上実行可能な mt 桂馬蛍光信号も安定しました。
3. FACS 解析 mitophagy
注: この研究では、細胞が 405 nm と 561 nm レーザー装備流れの cytometer で分析しました。バイオレット レーザーで細胞が興奮した (405 nm) 610 ± 10 nm で検出された BV605 検出器と黄緑色のレーザー発光 (561 nm) 排出量 610 ± 10 nm 同時に PE CF594 検出器によって検出された (図 1)。
-
ライブのゲーティング セル
- 流れの cytometer およびコンピューター、解析ソフトウェアにログインします。
- 新しい実験を生成したり、既存の実験を複製します。菫と細胞を刺激する (405 nm) とイエロー グリーン (561 nm) レーザーし 610 ± 10 nm の探知器で発光を検出、前方散乱 (FSC) と側方散乱 (SSC) パラメーター ウィンドウに必要な蛍光物質としてだけでなく BV605 と PE CF594 を選択します。
注:すべて fluorophores が付いては、線形モードで追加する必要があります。 - 渦セルを分散させるために簡潔に各セルのサンプルを集計します。
- サンプル注入ポートで mt 桂馬レンチ ウイルスで感染していないコントロール HeLa パーキン細胞サンプルを格納チューブを置き、cytometer の"run"ボタンを押します。
- SSC と FSC のドット プロット、ドット プロットの中心にセルを配置する FSC と SSC の電圧を調整します。
- 生きているセルの周囲のポリゴン アイコンを用いた P1 ゲートを描画し、死んだ細胞や細胞の残骸 (図 2 a) を排除します。
-
紫と緑のレーザーの電圧を調整します。
- 含む HeLa パーキン細胞サンプル注入に mt 桂馬レンチ ウイルスに感染しているポートし、cytometer の「実行」ボタンを押してチューブを配置します。
- BV605 のドット プロット (405 nm) 対 SSC、パーキン HeLa 細胞 mt 桂馬 mt 桂馬 (図 2 b) を発現していないコントロール細胞からはっきり顕著である BV605 電圧を調整する。。
- PE CF594 のドット プロット (561 nm) SSC、対 mt 桂馬パーキン HeLa 細胞制御の細胞 (図 2 b) からはっきり顕著である PE CF594 電圧を調整する。。
-
Mitophagy のセルの割合を評価します。
- 対 PE CF594 ドット プロット線形スケールを使用して BV605 を取得します。Mt-桂馬を表現するセルの周囲のポリゴン アイコンを用いたゲートを描画し、mt 桂馬 (図 3 a) を発現していない細胞を排除します。Mt 桂馬蛍光陽性細胞の人口は、「mt 桂馬」ゲートと呼ばれます。
- 唯一「mt 桂馬」を示す PE CF594 対 BV605 のもう一つのドット プロットを作成-セルのゲート。このドット プロットで未処理の mt 桂馬陽性細胞周囲ゲートを描画します。基底の mitophagy 活動制御 HeLa 細胞は低いと PE-CF594/BV605 における排出量の比は 1 未満です。したがって、この門は「低」のゲートと呼ばれます。
- 「低」のゲートの上の領域を含む別のゲートを描画します。この門は、それは PE-CF594/BV605 (図 3 b) における排出量の比率が高い細胞は、高 mitophagy の活動と細胞を含んでいるので「高」のゲートと呼ばれます。
- 「高」のゲートのセルのパーセントを計算するには、「人口階層の表示」メニューを選択します。「% の親」(% 親) 値は、mt 桂馬-肯定的な人口の間で「高」のゲート内のセルの割合を表します。
- 「Mt 桂馬」停止ゲートで記録し、各サンプルを実行する少なくとも 10,000 イベントを設定します。
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Representative Results
パーキン HeLa 細胞における CCCP 誘起 mitophagy の流れのフローサイトメトリー解析の例は図 4に示します。上記フロー フローサイトメトリー分析法を使用すると、「高」のゲートの mitophagic 細胞の劇的な増加を検出できます。「高」のゲートの細胞の割合は、無処理細胞 (図 4 a) と比較して 10 倍以上増加しました。Mitophagy 活動のこの増加はバフィロマイシン A (BFA) (図 4 aおよび4 b) 共同処理によって完全に廃止されました。
図 1.フローサイトメトリーによる mitophagy を測定するために使用法の略図。スキームは、フローサイトメトリーによる細胞 mitophagy の定量化に必要な主な手順について説明します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.流れの cytometer パラメーターを設定します。(A)生きている細胞のゲーティング。生きている細胞の領域を決定対 SSC プロット死んだ細胞や細胞の残骸を除外する FSC。(B)調整制御 hela 細胞を用いた 405 nm と 531 nm レーザー細胞、HeLa 細胞の表現する mt 桂馬。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.フローサイトメトリーによる mitophagic 細胞の割合を計算します。(A)ゲーティング HeLa 細胞 mt 桂馬を表現します。(B)は、ゲーティング mitophagic セル、統計ツールを使用して比率を計算します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.フローサイトメトリーを用いた HeLa 細胞における CCCP 誘起 mitophagy の定量化。(A) mt 桂馬パーキン HeLa 細胞が 10 μ m CCCP 6 h 100 nM バフィロマイシン A (BFA) の有無の扱われました。セルは、BV605 と PE CF594 検出器を用いた FACS によって分析されました。PE-CF594/BV605 比が高い(B)細胞を (「高」) に選ばれ、その割合を計算しましたしました。3 回の繰り返し実験の結果は、標準偏差でプロットされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
フローサイトメトリーを使用して携帯電話 mitophagy mt 桂馬を発現する細胞の活動を測定するための迅速・高感度なメソッドを紹介します。Mitophagy の高レベルを経るセル展示 PE CF594 の増加率 (561 nm)/BV605 (405 nm) 励起。したがって、mitophagy の活動は、561/405 率を示す細胞の割合として表現できます。PE CF594 のドット プロット上の「高」のゲート領域内のセルの割合を計算した (561 nm) 対 BV605 (405 nm)、CCCP と治療がパーキン HeLa 細胞における mitophagy の増加を誘発することの結果。我々 は以前、mt 桂馬のレンチ ウイルスを介した過剰発現自体には影響しませんミトコンドリアの機能や細胞生理学31を示した。原稿を示されているがその流れのフローサイトメトリー解析は、hela 細胞で CCCP 誘起 mitophagy 細胞パーキンを表現する、この手法は、mt 桂馬を導入した後セルの任意の型に適用できますを正常に検出できます。その低酸素状態における mitophagy は異所性パーキン式29なし HeLa 細胞で検出できる以前示した。さらに、先行研究は、私たちと他のグループのそれらを含む mt 桂馬蛍光分析がマウス胚性線維芽細胞 (MEFs) など一次電池で mitophagy を検出できることを示した、SH SY5Y、HEK293、HeLa 細胞などの細胞の不死化28,29,32。
流れの cytometry の試金その他顕微鏡や免疫ブロット mitophagy 試金と比較して、細胞31の大量の急速な再現性のある解析を許可するという利点があります。したがって、顕微鏡ベースの分析では、研究者バイアスが結果を歪曲することができます、一方このバイアス問題ではない、流れの cytometry の試金を使用する場合。
少ない 1 x 10 の6セルはフロー フローサイトメトリー分析に必要です。さらに、サンプルの分析時間はわずか 1 ~ 2 分、ので 1 〜 2 時間以内までサンプルの数十を分析できます。さらに、流れの cytometry の試金は、良好な感度 mitophagic 細胞の増加を検出できます。我々 の流れフローサイトメトリー分析に CCCP 投与の 6 時間後 mitophagic 細胞の 10 倍の増加を検出します。
フローサイトメトリーを使用して mitophagy を分析するための重要なステップは、mitophagy の高レベルを経るセルを区別するために「高」および「低」のゲートを正しく設定することです。基底の mitophagy レベルは、細胞の種類に応じて異なることができます、ので「高」および「低」のゲートの設定はいくつかの細胞株で難しいかもしれません。このような場合に、HeLa 細胞などの低い基底の mitophagy 活動にコントロールのセルの行を含めることをお勧めします。クロロキンなどのライソゾーム阻害剤で細胞、またにバフィロマイシン A を正しいゲートを設定する低 mitophagy コントロールとして含めることができます。レンチが使われています興味深い蛋白質の異所性の表現、いくつかの細胞はウイルス感染しやすいことができます。レンチ ウイルス感染自体は、細胞の増殖やミトコンドリアの機能の変化で結果、別の方法を検討して、mt 桂馬式ください。Mt 桂馬の発現レベルは、細胞の種類に応じて異なります。セルの並べ替えまたは mt 桂馬細胞数日間ピューロマイシン抗生物質の濃度の増加とともに再び使用して強い mt 桂馬蛍光信号のセルだけを収集できる mt 桂馬蛍光信号が弱いまたはあまりにも異種の場合.セルはできるだけ早くフローサイトメトリーによるサンプルの分析をお勧めしますが、実行可能な限り剥離細胞の mt 桂馬信号は安定しています。
私達の流れの cytometry の試金は mitophagy 分析のための堅牢な便利な方法が、いくつかの制限があります。まず、フローサイトメトリー用単一セルのレベルとしてセルを区切る必要があります、ために、このメソッドは生理学を変更することがなく組織または臓器の mitophagy の分析に適用することは困難です。さらに、mt 桂馬蛍光は固定後の pH 依存性の特性を失う、したがって、すべてのサンプルは、生きた細胞分析必要があります。追加免疫蛍光染色にあたって、上記サンプル ストレージの制限および別の制限でこの結果します。この手法は mitophagy 活性を定量的に測定できるがミトコンドリア形態または9mitophagy プロセスで重要な役割を再生する知られているダイナミクスの変化を監視することができません。複雑さと不定の側面 mitophagy の研究者は留意すべき。したがって、可能な誤審を避けるためには、mitophagy プロセス必要がありますさらにによって確認される電子顕微鏡、ミトコンドリア蛋白質の転換の減少など、mitophagy の一般的な解析方法で他の結果を結合しました。ミトコンドリア DNA と蛍光顕微鏡リソソームやとしてオートファゴソームとミトコンドリアの共局在を測定33,34,35は前述。Mitophagy の観察された増加には、mt 桂馬を発現する細胞の共焦点顕微鏡を介してさらに検討できます。Mitophagic 細胞における mt 桂馬は、共焦点顕微鏡28,29の下で観察することができます高 586/440 比明るい点状パターンで表現されます。
迅速かつ敏感に mitophagy を検出する能力を考えると、この流れの cytometry の試金は、様々 な研究に価値がある最初のステップ近似を提供します。によって単に mt 桂馬レンチ ウイルスを細胞に感染、mitophagy 活性の変動が簡単に任意のセル型で測定をすることができます。細胞ソーター機能と組み合わせて、mitophagy アクティビティの特定のレベルで細胞ことができます具体的に分離しての役割と mitophagy の制御機構を研究するために使用します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この仕事を受けました (j. u.) に国立研究財団の韓国 (2016R1D1A1B03931949) からの助成金、韓国 (NRF) 助成金 (J.Y に韓国 government(MSIT) (第 2016R1A2B2008887、第 2016R1A5A2007009) によって資金を供給された研究財団.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| Turbofect | Thermos scientific | R0531 | |
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
| Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP) | Sigma-Aldrich | C2759 | 10 mM |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| EQUIPMENTS | |||
| BD LSRFortessa | BD Bioscience | LSRFortessa | |
| FACSDIVA | BD Bioscience | FACSDIVA (v8.0.1) |
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