Summary
Mitophagy, de selectieve afbraak van mitochondriën, heeft betrokken bij mitochondriale homeostase en in verschillende ziekten bij de mens is gedereguleerd. Handige experimentele methoden voor het meten van de activiteit van de mitophagy zijn echter zeer beperkt. Hier bieden we een gevoelige test voor het meten van de activiteit van de mitophagy met behulp van stroom cytometry.
Abstract
Mitophagy is een proces van selectief verwijderen van beschadigde of onnodige mitochondriën met behulp van autophagy machines. Nauwe banden tussen defect mitophagy en verschillende ziekten bij de mens, met inbegrip van neurodegeneratieve ziekten, kanker en metabole ziekten gevonden. Daarnaast hebben recente studies aangetoond dat mitophagy is betrokken bij normale cellulaire processen, zoals differentiatie en ontwikkeling. Echter, de precieze rol van en de moleculaire mechanismen ten grondslag liggen aan de mitophagy nader moeten worden onderzocht. Daarom is het van cruciaal belang voor het ontwikkelen van een krachtige en handige methode voor het meten van veranderingen in de mitophagy activiteit. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor kwantitatief beoordeling mitophagy activiteit via cytometry van de stroom met behulp van de mitochondriën-gerichte fluorescent proteïne Keima (mt-Keima). Deze stroom cytometry assay kunt analyseren mitophagy activiteit sneller en gevoeliger dan conventionele microscopie of immunoblotting gebaseerde methoden. Dit protocol kan worden toegepast om te analyseren mitophagy activiteit in verschillende celtypen.
Introduction
Mitochondriën zijn organellen die essentieel voor de celproliferatie en fysiologie zijn. Mitochondriën zijn verantwoordelijk voor het genereren van meer dan 80% van de ATP-levering via oxidatieve fosforylatie, en ze bieden ook verschillende metabole tussenproducten voor biosynthese en metabolisme1,2. Naast hun rollen in energievoorziening en metabolisme spelen mitochondriën centrale rol in vele andere belangrijke processen, met inbegrip van reactieve zuurstof soorten (ROS) generatie, de regulering van celdood en intracellulaire Ca2 + dynamiek3 . Wijzigingen in de mitochondriale functie zijn geassocieerd met menselijke ziekten, waaronder kanker, diabetes mellitus en diverse neurodegeneratieve ziekten-4,5. Verhoogde mitochondriale dysfunctie en mitochondriële DNA-mutaties zijn ook gedacht bij te dragen tot de normale veroudering processen6,7,8. Kwaliteitscontrole is daarom een cruciaal punt in de mitochondriën. Mitochondriën zijn hoogdynamische organellen die continu hun vorm tussen langwerpige netwerken en korte, gefragmenteerde vorm kunnen wijzigen. Mitochondriën dynamiek speelt een belangrijke rol bij het handhaven van de functie van mitochondriën, alsmede hun afbraak tot en met mitophagy9.
Mitophagy is een mechanisme waarbij de selectieve afbraak van hele mitochondriën met behulp van de autophagy machines. Mitophagy is het principe mechanisme onderliggende mitochondriale omzet en het verwijderen van beschadigde of disfunctionele mitochondriën. In dit proces, zijn eerste mitochondriën omgeven door een membraan, wat resulteert in de vorming van autophagosomes, die vervolgens met lysosomen voor aantasting van de Hydrolytische9 smelten. Vorige genetische studies in Drosophila hebben gesuggereerd dat twee genen van Parkinson-gerelateerde, PTEN-geïnduceerde putatief kinase 1 (PINK1) (PARK6) en Parkin (PARK2), functioneren in de zelfde traject10,11. Deelrij studies hebben aangetoond dat het PINK1-Parkin-traject verantwoordelijk is voor het elimineren van beschadigde mitochondriën en in dit traject resultaat in disfunctionele mitophagy gebreken en tot ziekten bij de mens12,13 bijdragen kan. Defecten in mitophagy processen hebben onlangs gevonden in verschillende menselijke ziekten, waaronder kanker, hart-en vaatziekten, leverziekten en neurodegeneratieve ziekte 14. Bovendien, hebben recente studies ook aangetoond dat mitophagy is essentieel voor veel fysiologische processen, zoals de immuunrespons15,16,17,18, differentiatie en ontwikkeling ,19, suggereren dat mitophagy kan een actievere rol bij het beheersen van de functies van de cel.
Ondanks de recente bevestiging dat mitophagy een belangrijke rol in zowel kwaliteitscontrole in mitochondriën speelt en ziekten bij de mens, de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de mitophagy blijven slecht begrepen. Hoewel mitophagy-gerelateerde mechanismen zijn systematisch bestudeerd in gist, hebben studies gericht op het verkennen van mitophagy-gerelateerde mechanismen in zoogdiercellen voornamelijk gericht op de PINK1-Parkin-pathway. Eerdere studies hebben vastgesteld dat de PINK1-Parkin-traject primair verantwoordelijk voor het selectief verwijderen van beschadigde mitochondria via mitophagy12,20,21 is. Recente studies hebben echter gemeld dat in sommige modellen, mitophagy zelfs in de afwezigheid van functionele PINK122,-23,24kan worden geactiveerd. Deze resultaten suggereren dat naast de PINK1-Parkin-traject, daar een extra niet-geïdentificeerde traject die mitophagy kunt activeren.
Het ontbreken van een handige methode om te beoordelen van de mitophagy activiteit is een groot obstakel voor het verkennen van de trajecten die mitophagy en haar rol in de pathofysiologische gebeurtenissen regelen. Elektronenmicroscopie is een krachtig hulpmiddel om te visualiseren direct autophagosome-overspoeld mitochondriën. Elektronenmicroscopie heeft echter beperkingen in het kwantificeren van de mitophagy activiteit. Hoewel strategieën die microtubulus-geassocieerde proteïne-1 gebruiken ketting 3 (LC3 licht)-geconjugeerd fluorescerende sondes, zoals GFP-LC3, zijn momenteel de meest gebruikte benaderingen25, de voorbijgaande aard van het signaal LC3 gebaseerde en de hoge mate van vals-positieve signalen beperken de gevoeligheid voor het opsporen van mitophagy in cellen26. Een combinatie van het westelijke bevlekken voor het meten van eiwitten mitochondriaal niveau, de kwantificering van mitochondriaal DNA en fluorescentie microscopie analyse colocalize mitochondriën met autophagosomes of lysosomen zou een goed uitgangspunt voor de beoordeling van mitophagy. Maar aanroepen kwantificering beperkingen en een gebrek aan gemak van bestaande methoden voor nieuwe benaderingen. De invoering van een nieuwe pH-afhankelijke TL proteïne, de mitochondriale doel Keima (mt-Keima), verbeterd sterk de mogelijkheid om te detecteren mitophagy27. Door het smelten van de mitochondriale-targeting opeenvolging van cytochroom c oxidase subeenheid VIII (COX VIII) in Keima, is mt-Keima gericht op de mitochondriale matrix. De grote verschuiving in de excitatie piek van Keima van 440 nm tot 586 nm (overeenkomend met pH 7 en pH 4, respectievelijk) kan worden gebruikt om te beoordelen mitophagy met goede gevoelig in zowel in vitro als in vivo experimenten28,29 . De weerstand van mt-Keima aan de aantasting van de lysosomale veroorzaakt en wat nog belangrijker is, de integratie van het mt-Keima signaal in lysosomen, waardoor het gemakkelijk kwantitatieve meting van mitophagy activiteit. De fluorescentie wijzigen dat in mt-Keima optreedt kan worden geanalyseerd met behulp van beide confocale microscopie of stroom cytometry28,29. Een stroom cytometry gebaseerde methode voor het meten van de activiteit van de mitophagy met behulp van mt-Keima heeft echter niet in detail tot nu toe gekregen.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor een stroom cytometry gebaseerde techniek voor het meten van mitophagy activiteit in cellen met behulp van mt-Keima. Hoewel we hebben hier aangetoond dat stroom cytometry analyse met succes CCCP-geïnduceerde mitophagy gedetecteerd in HeLa cellen uiten Parkin, kan deze techniek worden toegepast op een breed scala aan celtypes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generatie van HeLa cellen uiten mito-Keima (mt-Keima)
-
Voorbereiding van mt-Keima lentivirus
- Jas van een schotel van 100 mm cultuur door toevoeging van 2 mL 0,001% poly-L-lysine /-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en laat gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur staan.
- Verwijder de poly-L-lysine oplossing om met een glazen pipet verbonden met een vacuüm en wassen van de cultuur-schotel door toevoeging van 2 mL 1 x PBS.
- Plaat 1.5 x 106 HEK293T cellen op de gecoate cultuur schotel met 10 mL DMEM met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine, en cultuur van de cellen bij 37 ° C in een CO2 weefselkweek incubator voor één dag.
- Transfect 2 µg mt-Keima lentivirale plasmide29 DNA samen met verpakking Ani (psPAX 2 µg en pVSVG 0,25 µg) met behulp van een transfectiereagens voor 8u volgens de instructies van de fabrikant.
- Verwijder het medium van de transfectie en 8 mL van de verse media toevoegen.
- Het medium met virale deeltjes 48 uur later verzamelen. Cellulaire puin te verwijderen uit de verzamelde media door centrifugeren bij 500 x g gedurende 5 min en hen met een 0,45 µm spuit filter filtert.
Opmerking: Voor langdurig gebruik, aliquots van lentivirale deeltjes maken en opslaan van de monsters bij-80 ° C. Te vermijden dat de virale monsters te bevriezen-ontdooien cycli voor efficiënte virale infectie.
-
HeLa-Parkin cellen met mt-Keima lentivirus infecteren
- Plaat 5 x 104 HeLa cellen uiten Parkin (HeLa-Parkin) in een 60-mm cultuur schotel met 4 mL DMEM met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine bij 37 ° C één dag vóór het oogsten van de mt-Keima lentivirus.
Opmerking: Vanwege het ontbreken van endogene Parkin expressie in HeLa cellen30, de hier gebruikte om meer duidelijk Toon CCCP-geïnduceerde mitophagy HeLa-Parkin-cellen. Deze procedure kan ook worden toegepast op andere primaire of vereeuwigd cellijnen. - Verwijder het groeimedium de volgende dag en voeg 1 mL van mt-Keima lentivirale media. Voeg een extra 2 mL groeimedium met 3 µL van polybrene stockoplossing (8 mg/mL in gedestilleerd water). Incubeer gedurende één dag in een CO2 weefselkweek incubator.
- Verwijder het lentivirale mengsel van mt-Keima de volgende dag en wassen van de cellen tweemaal met 1 x PBS. Voeg 4 mL groeimedium en behandelen van de cellen met 2 µg/mL puromycin voor twee dagen.
- Na twee dagen van puromycin selectie, verwijder het groeimedium, en wassen van de cellen tweemaal met 1 x PBS. Voeg groeimedium, en cultuur van de cellen in een incubator CO2 tot gebruik.
Opmerking: Deze methode kan worden toegepast voor het genereren van cellen die stabiel express mt-Keima, met inbegrip van andere cellijnen en primaire cellen.
- Plaat 5 x 104 HeLa cellen uiten Parkin (HeLa-Parkin) in een 60-mm cultuur schotel met 4 mL DMEM met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine bij 37 ° C één dag vóór het oogsten van de mt-Keima lentivirus.
2. het induceren van mitophagy met behulp van CCCP behandeling en voorbereiding van FACS monsters
- Plaat 5 x 104 HeLa-Parkin cellen uiten van mt-Keima in een 60-mm cultuur schotel met 4 mL DMEM met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine en cultuur ze voor één dag bij 37 ° C in een CO2 weefselkweek incubator.
- Verwijder het groeimedium de volgende dag en voeg 4 mL verse DMEM met 10 µM carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP). Incubeer HeLa-Parkin-mt-Keima cellen in een CO2 weefsel incubator voor 6 uur.
- Verwijder het groeimedium 6 uur later en wassen van de cellen met 2 mL 1 x PBS. Loskoppelen van de cellen door ze te behandelen met trypsine/EDTA-oplossing en inactivering van de trypsine door toe te voegen groeimedium bevattende 10 gewichtspercenten FBS. Breng de cellen in een conische buis 15 mL.
- Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 min.
- Verwijder het groeimedium door aspiratie voorzichtig en resuspendeer de cellen met 1 mL koude 1 x PBS.
- Pipetteer van cellen in de passende FACS buis en plaats deze op het ijs.
Opmerking: Bereiden niet geïnfecteerde HeLa cellen als een negatieve controle.
Opmerking: Cellen zijn haalbare op het ijs gedurende enkele uren, en mt-Keima fluorescentie signalen ook stabiel blijven.
3. FACS analyse van mitophagy
Opmerking: In deze studie, werden cellen geanalyseerd met een cytometer van de stroom voorzien van een laser 405-nm en 561-nm. Cellen werden opgewekt met een violette laser (405 nm) met emissie gedetecteerd bij 610 nm van ± 10 met een BV605 detector en met een geel-groene laser (561 nm) met emissie gelijktijdig op 610 ± 10 nm door een PE-CF594-detector gedetecteerd (Figuur 1).
-
Gating levende cellen
- Schakel de stroom cytometer en computer en inloggen op de analysesoftware.
- Genereer een nieuw experiment of dupliceren van een bestaande experiment. Om op te wekken van cellen met de violet (405 nm) en geel-groen (561 nm) lasers en detecteren van emissie bij 610 ± 10 nm detector, BV605 en PE-CF594 geselecteerd naast voorwaartse scatter (FSC) en kant scatter (SSC) in het venster parameter als vereiste fluorophores.
Opmerking: Alle fluorophores moet worden toegevoegd in een lineaire modus. - Vortex elk monster cel kort te verspreiden van cel aggregaten.
- Plaats de buis met een HeLa-Parkin cel controlemonster die niet is met mt-Keima lentivirus op de steekproef injectie poort besmet en druk op de "run" knop op de cytometer.
- In de plot van de dot van FSC versus SSC, de kruisspanning FSC en SSC om plaatsen van cellen in het midden van de stip plot.
- Tekenen van een P1 poort met behulp van het pictogram van de veelhoek in levende cellen en elimineren dode cellen en cel puin (figuur 2A).
-
Aanpassen van de spanningen voor violet en groene laser
- Plaats de buis met HeLa-Parkin-cellen geïnfecteerd met mt-Keima lentivirus op de monster-injectie poort en druk op de "run" knop op de cytometer.
- In de plot van de dot van BV605 (405 nm) versus SSC, de kruisspanning BV605 zodat HeLa-Parkin cellen uiten van mt-Keima zijn duidelijk te onderscheiden van cellen die niet mt-Keima (figuur 2B uitdrukken doen).
- In de plot van de dot van PE-CF594 (561 nm) versus SSC, de kruisspanning PE-CF594 zodat HeLa-Parkin cellen uiten van mt-Keima duidelijk te onderscheiden van cellen (figuur 2B zijn).
-
Beoordelen van het percentage cellen in mitophagy
- De BV605 ten opzichte van de PE-CF594 dot perceel met behulp van een lineaire schaal te verwerven. Tekenen van een poort met behulp van het pictogram van de veelhoek rond cellen uiten van mt-Keima en elimineren van cellen niet uiten mt-Keima (figuur 3A). De mt-Keima fluorescentie-positieve-celpopulatie wordt aangeduid als de "mt-Keima" poort.
- Maak een andere dot plot van BV605 ten opzichte van de PE-CF594 tonen enige "mt-Keima"-omheinde cellen. In deze dot perceel, tekenen een hek rond onbehandelde mt-Keima-positieve cellen. De activiteit van de basale mitophagy van besturingselement HeLa cellen is laag, en de verhouding van de emissie bij PE-CF594/BV605 is minder dan 1. Dus, deze poort wordt aangeduid als de "lage" poort.
- Tekenen van een andere poort met de bovenstaande regio van de "lage" poort. Deze poort wordt aangeduid als de "hoge" poort omdat het bevat cellen met hoge mitophagy activiteit, dat wil zeggen, cellen met een hoge verhouding van emissie bij PE-CF594/BV605 (figuur 3B).
- Voor de berekening van het percentage cellen in de "hoge" poort, het "Toon bevolking hiërarchie"-menu te selecteren. De "Procent van bovenliggende" (% bovenliggende)-waarde vertegenwoordigt het percentage van de cellen in de "hoge" poort onder de bevolking van de mt-Keima-positief.
- Instellen ten minste 10.000 gebeurtenissen worden geregistreerd in de "mt-Keima" stoppen gate en uitgevoerd elk monster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een voorbeeld van de stroom cytometry analyse van CCCP-geïnduceerde mitophagy in HeLa-Parkin cellen is weergegeven in Figuur 4. Met behulp van de stroom cytometry analyse hierboven beschreven methode, kunnen we een dramatische toename in mitophagic cellen in de "hoge" poort detecteren. Het percentage cellen in de "hoge" poort steeg meer dan 10-fold in vergelijking met onbehandelde cellen (figuur 4A). Deze toename van de activiteit van de mitophagy werd volledig afgeschaft door co behandeling met bafilomycin A (BFA) (figuur 4A en 4B).
Figuur 1 . Schematische weergave van de methode die wordt gebruikt voor het meten van mitophagy met stroom cytometry. De regeling een overzicht van de belangrijkste stappen die nodig zijn om te kwantificeren cellen mitophagy ondergaan door stroom cytometry. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Instellen van stroom cytometer parameters. (A) Gating van levende cellen. Een regio voor levende cellen werd vastgesteld op de FSC versus SSC perceel dode cellen en cel puin te sluiten. (B) aan te passen de 405-nm en 531-nm lasers met behulp van controle HeLa cellen cellen en HeLa waarin mt-Keima. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Berekening van het aantal mitophagic cellen door stroom cytometry. (A) Gating HeLa cellen uiten van mt-Keima. (B) Gating mitophagic cellen en de berekening van het aandeel met het hulpprogramma statistieken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Kwantificering van CCCP-geïnduceerde mitophagy in HeLa cellen door stroom cytometry. (A) HeLa-Parkin cellen uiten van mt-Keima werden behandeld met 10 µM CCCP gedurende 6 uur met of zonder 100 nM bafilomycin A (BFA). Cellen werden geanalyseerd door FACS met behulp van BV605 en PE-CF594-detectoren. (B) cellen met een hoge verhouding van de PE-CF594/BV605 ("hoog") werden geselecteerd, en hun aandeel werd berekend. De resultaten van drie herhaalde experimenten worden uitgezet met standaarddeviaties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we een snelle en gevoelige methode voor het gebruik van stroom cytometry voor het meten van cellulaire mitophagy activiteit in cellen uiten van mt-Keima. Cellen ondergaan van een hoog niveau van mitophagy vertonen een hogere ratio van PE-CF594 (561 nm) / BV605 (405 nm) excitatie. Dus kan mitophagy activiteit worden uitgedrukt als het percentage cellen een hoge verhouding van de 561/405 tentoonstellen. We het percentage van de cellen in het gebied van de "hoge" poort op een perceel van de dot van PE-CF594 berekend (561 nm) versus BV605 (405 nm), en de resultaten toonden aan dat behandeling met CCCP een toename van de mitophagy in HeLa-Parkin cellen veroorzaakt. Wij zijn het er eerder blijk gegeven dat de lentivirus-gemedieerde overexpressie van mt-Keima niet zelf mitochondriale functie of cellulaire fysiologie31 afdoet. Hoewel we laten in onze manuscript zien hebben dat stroom cytometry analyse kan met succes detecteert CCCP-geïnduceerde mitophagy in HeLa cellen uiten Parkin, deze techniek kan worden toegepast op elk type cel na de introductie van de mt-Keima. Eerder toonden wij dat hypoxie-geïnduceerde mitophagy kon worden opgespoord in HeLa cellen zonder ectopische Parkin expressie29. Bovendien, eerdere studies, met inbegrip van ons en die van andere groepen, bleek dat mt-Keima fluorescentie analyse mitophagy in primaire cellen zoals muis embryonale fibroblasten (MEFs detecteren kan) en vereeuwigd cellen zoals de cellen van HeLa, HEK293 en SH-SY5Y 28 , 29 , 32.
Vergeleken met andere testen microscopie- of immunoblotting gebaseerde mitophagy, hebben stroom cytometry testen voordelen zij toestaan dat snelle, reproduceerbare analyses van grote aantallen cellen31. Vandaar dat in microscopie gebaseerde analyses, onderzoeker bias resultaten vervalsen kan, is dit bias niet een probleem bij het gebruik van stroom cytometry testen.
Minder dan 1 x 106 cellen zijn vereist voor stroom cytometry analyse. Bovendien, omdat de analyse van een monster alleen één tot twee minuten duurt, kan tot tientallen monsters worden geanalyseerd binnen één tot twee uur. Bovendien kunnen de stroom cytometry assays verhogingen in mitophagic cellen detecteren met goede vingergevoeligheid. In onze stroom cytometry analyse ontdekte we een 10-fold stijging van de mitophagic cellen na 6 h van behandeling met CCCP.
De kritieke stap voor het analyseren van mitophagy met behulp van stroom cytometry is correct in te stellen de "high" en "laag" poorten te onderscheiden cellen ondergaan van een hoog niveau van mitophagy. Omdat basale mitophagy niveaus kan verschillen, afhankelijk van het celtype, wellicht instellen van de "high" en "laag" poort moeilijk in sommige cellijnen. In dat geval is het handig om een cel van de bedieningsleiding met lage basale mitophagy activiteit zoals HeLa cellen. Daarnaast voor cellen behandeld met een lysosomale remmer zoals chloroquine, kan bafilomycin A worden opgenomen als een lage mitophagy-besturingselement instellen de juiste gating. Hoewel lentivirussen vaak voor de ectopische uitdrukking van interessante eiwitten gebruikt worden, kunnen sommige cellijnen gevoelig voor virusinfectie. Als lentivirus infectie zelf in veranderingen in de celgroei of mitochondriën functie resulteert, moet een andere methode voor mt-Keima expressie worden beschouwd. Het niveau van de expressie van mt-Keima kan ook variëren afhankelijk van het celtype. Als het mt-Keima fluorescentie signaal te zwak of te heterogene is, kunnen alleen de cellen met een sterke mt-Keima fluorescentie signaal worden verzameld met behulp van een cel sorter of mt-Keima cellen opnieuw behandeld met een hogere concentratie van puromycin antibiotica voor meerdere dagen . Het signaal van de mt-Keima van de vrijstaande cellen zijn stabiel, zolang de cellen zijn levensvatbaar, maar we raden het analyseren van de monsters door stroom cytometry zo spoedig mogelijk.
Onze stroom cytometry assay is een krachtige en handige methode voor de analyse van de mitophagy, maar er zijn enkele beperkingen. Ten eerste omdat de cellen moeten worden gescheiden als een enkele celniveau voor stroom cytometry, is deze methode moeilijk toe te passen voor het analyseren van de mitophagy van weefsel of organen zonder te veranderen van de fysiologie. Bovendien, mt-Keima fluorescentie verliest zijn pH-afhankelijke kenmerken na fixatie, en dus moeten alle monsters worden geanalyseerd als levende cellen. Dit resulteert in de beperking van de steekproef opslag hierboven vermeld en een andere beperking bij de toepassing van een extra immunofluorescentie vlek. Deze techniek kan kwantitatief mitophagy activiteit meten, maar het is niet in staat om te controleren van wijzigingen in mitochondriale morfologie of dynamiek, waarvan bekend is dat een belangrijke rol spelen in het proces mitophagy9. Onderzoekers moeten in gedachten houden, de complexiteit en de onbepaald aspecten van mitophagy. Daarom, ter vermijding van mogelijke inschatting, het mitophagy-proces moet worden verder bevestigd door de gecombineerde resultaten van andere gemeenschappelijke mitophagy analysemethoden, met inbegrip van elektronenmicroscopie, mitochondriale eiwit omzet, een vermindering mitochondriaal DNA en fluorescentie microscopie meten de colocalization van de mitochondriën met lysosomen of autophagosomes als eerder beschreven33,34,35. Alle waargenomen toename van mitophagy kan ook verder worden onderzocht via confocale microscopie van cellen uiten van mt-Keima. Mt-Keima wordt mitophagic cellen uitgedrukt in een heldere punctate patroon met een hoge verhouding van 586/440, die kan worden waargenomen onder confocale microscopie28,29.
Gezien zijn vermogen om snel en zorgvuldig detecteren mitophagy, geeft deze stroom cytometry test een eerste-stap-benadering dat zou waardevol voor een scala aan studies. Door het simpelweg het infecteren van cellen met de mt-Keima lentivirus, kunnen veranderingen van mitophagy activiteit gemakkelijk maatregel in elk celtype van de gewenste. In combinatie met de functie van de sorter cel, kunnen cellen met een bepaald niveau van mitophagy activiteit specifiek geïsoleerd en gebruikt bij het bestuderen van de rollen van en regulerende mechanismen ten grondslag liggen aan de mitophagy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door een subsidie uit nationale onderzoek Stichting van Korea (2016R1D1A1B03931949) (J. U.), en door de National Research foundation van Korea (NRF) subsidie gefinancierd door de Korea-government(MSIT) (nr. 2016R1A2B2008887, nr. 2016R1A5A2007009) (tot J.Y .)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| Turbofect | Thermos scientific | R0531 | |
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
| Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP) | Sigma-Aldrich | C2759 | 10 mM |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| EQUIPMENTS | |||
| BD LSRFortessa | BD Bioscience | LSRFortessa | |
| FACSDIVA | BD Bioscience | FACSDIVA (v8.0.1) |
References
- McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), R551-R560 (2006).
- Zorov, D. B., Krasnikov, B. F., Kuzminova, A. E., Vysokikh, M., Zorova, L. D. Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria. Bioscience Reports. Bioscience Reports. 17 (6), 507-520 (1997).
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
- Kang, D., Hamasaki, N. Alterations of mitochondrial DNA in common diseases and disease states: aging, neurodegeneration, heart failure, diabetes, and cancer. Current Medicinal Chemistry. 12 (4), 429-441 (2005).
- Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The mitochondrial basis of aging. Molecular Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
- Wallace, D. C., Brown, M. D., Melov, S., Graham, B., Lott, M. Mitochondrial biology, degenerative diseases and aging. BioFactors. 7 (3), 187-190 (1998).
- Yun, J., Finkel, T.
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
- Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
- Zhu, J., Wang, K. Z., Chu, C. T. After the banquet: Mitochondrial biogenesis, mitophagy, and cell survival. Autophagy. 9 (11), 1663-1676 (2013).
- Um, J. H., Yun, J. Emerging role of mitophagy in human diseases and physiology. BMB Reports. 50 (6), 299-307 (2017).
- Al Rawi, S., et al. Postfertilization autophagy of sperm organelles prevents paternal mitochondrial DNA transmission. Science. 334 (6059), 1144-1147 (2011).
- Kim, M. J., et al. SESN2/sestrin2 suppresses sepsis by inducing mitophagy and inhibiting NLRP3 activation in macrophages. Autophagy. 12 (8), 1272-1291 (2016).
- Kim, M. J., Yoon, J. H., Ryu, J. H. Mitophagy: A balance regulator of NLRP3 inflammasome activation. BMB Reports. 49 (10), 529-535 (2016).
- Sandoval, H., et al. Essential role for Nix in autophagic maturation of erythroid cells. Nature. 454 (7201), 232-235 (2008).
- Sato, M., Sato, K. Degradation of paternal mitochondria by fertilization-triggered autophagy in C. elegans embryos. Science. 334 (6059), 1141-1144 (2011).
- Geisler, S., et al. PINK1/Parkin-mediated mitophagy is dependent on VDAC1 and p62/SQSTM1. Nature Cell Biology. 12 (2), 119-131 (2010).
- Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
- Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
- Kubli, D. A., et al. PINK1 Is dispensable for mitochondrial recruitment of Parkin and activation of mitophagy in cardiac myocytes. PloS One. 10 (6), e0130707 (2015).
- Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
- Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Lee, I. H., Yun, J., Finkel, T. The emerging links between sirtuins and autophagy. Methods in Molecular Biology. 1077, 259-271 (2013).
- Sun, N., et al. Measuring In vivo Mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
- Denison, S. R., et al. Alterations in the common fragile site gene Parkin in ovarian and other cancers. Oncogene. 22 (51), 8370-8378 (2003).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: Basic principles and applications. Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
- Bingol, B., et al. The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy. Nature. 510 (7505), 370-375 (2014).
- Burbulla, L. F., Kruger, R. The use of primary human fibroblasts for monitoring mitochondrial phenotypes in the field of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. 68, e4228 (2012).
- Di Sante, G., Casimiro, M. C., Pestell, T. G., Pestell, R. G. Time-lapse video microscopy for assessment of EYFP-Parkin aggregation as a marker for cellular mitophagy. Journal of Visualized Experiments. 111, e53657 (2016).
- Fang, E. F., et al. In vitro and in vivo detection of mitophagy in human cells, C. Elegans, and mice. Journal of Visualized Experiments. 129, e56301 (2017).
