Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Følsom måling av Mitophagy av Flow cytometri ved hjelp av pH-avhengig fluorescerende Reporter mt-Keima

Published: August 12, 2018 doi: 10.3791/58099
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 3, 1,2
1Peripheral Neuropathy Research Center, College of Medicine, Dong-A University, 2Department of Biochemistry, College of Medicine, Dong-A University, 3Aging Institute, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Mitophagy, selektiv nedbrytning av mitokondriene, har vært innblandet i mitokondrie homeostase og er deregulert i ulike menneskelige sykdommer. Men er praktisk eksperimentelle metoder for måling av mitophagy aktivitet svært begrenset. Her gir vi en følsom analysen for å måle mitophagy aktivitet ved hjelp av flowcytometri.

Abstract

Mitophagy er en prosess av selektive fjerning av skadet eller unødvendige mitokondrier bruker autophagy maskiner. Nære bånd er funnet mellom defekt mitophagy og ulike menneskelige sykdommer, inkludert nevrodegenerative sykdommer, kreft og metabolske sykdommer. I tillegg har studier vist at mitophagy er involvert i normal cellulære prosesser, som differensiering og utvikling. Men krever nøyaktig rolle og molekylære mekanismer underliggende mitophagy videre studier. Derfor er det avgjørende å utvikle en robust og praktisk metode for å måle endringer i mitophagy aktivitet. Her beskriver vi en detaljert protokoll for kvantitativt vurdere mitophagy aktivitet gjennom flowcytometri bruker mitokondrier målrettede fluorescerende protein Keima (mt-Keima). Denne flyten cytometri analysen kan analysere mitophagy aktivitet mer raskt og følsomt enn konvensjonelle mikroskopi - eller immunoblotting-baserte metoder. Denne protokollen kan brukes for å analysere mitophagy aktivitet i ulike celletyper.

Introduction

Mitokondrier er organelles som er viktig for celle spredning og fysiologi. Mitokondrier er ansvarlig for å generere mer enn 80% av ATP forsyning via oxidative fosforylering, og de tilbyr også ulike metabolske mellomprodukter for biosyntesen og metabolisme1,2. I tillegg til sine roller i energiforsyning og metabolisme spille mitokondrier sentrale roller i mange andre viktige prosesser, inkludert reaktive oksygen arter (ROS) generasjon, regulering av celledød og intracellulær Ca2 + dynamics3 . Endringer i mitokondrie funksjonen har vært forbundet med menneskelige sykdommer, inkludert kreft, diabetes mellitus og forskjellige nevrodegenerative sykdommer4,5. Økt mitokondrie dysfunksjon og Mitokondrielt DNA mutasjoner er også tenkt å bidra til normal aldring prosesser6,7,8. Kvalitetskontroll er derfor et viktig spørsmål i mitokondrier. Mitokondrier er svært dynamisk organelles som kan kontinuerlig endrer form mellom langstrakt nettverk og kort, fragmenterte form. Mitokondrier dynamics spiller en viktig rolle i å opprettholde funksjonen av mitokondrier samt deres fornedrelse til mitophagy9.

Mitophagy er en mekanisme som involverer selektiv nedbrytning av hele mitokondrier bruker autophagy maskiner. Mitophagy er prinsippet mekanisme underliggende mitokondrie omsetningen og fjerning av skadet eller dysfunksjonelle mitokondriene. I denne prosessen omgitt mitokondrier først av en membran, som resulterer i dannelsen av autophagosomes, som så smelter med lysosomer for hydrolytisk fornedrelse9. Tidligere genetiske studier i Drosophila har antydet at to Parkinsons sykdom-relaterte gener, PTEN-indusert antatte kinase 1 (PINK1) (PARK6) og Parkin (PARK2), i samme veien10,11. Rekkefølge studier har vist at PINK1-Parkin veien er ansvarlig for å fjerne skadet mitokondrier og mangler i denne veien resultatet i dysfunksjonelle mitophagy og kan bidra til menneskelige sykdommer12,13. Feil i mitophagy prosesser har nylig blitt funnet i ulike menneskelige sykdommer, inkludert kreft, hjertesykdommer, leversykdommer og nevrodegenerative sykdommer 14. I tillegg har studier også vist at mitophagy er kritisk til mange fysiologiske prosesser, for eksempel differensiering og utvikling av immunrespons15,16,17,18 ,19, antyder at mitophagy kan spille en mer aktiv rolle i å kontrollere celle funksjoner.

Til tross for siste bekreftelse at mitophagy spiller en viktig rolle i begge kvalitetskontroll i mitokondrier og menneskelig sykdom, molekylære mekanismer underliggende mitophagy fortsatt dårlig forstått. Selv om mitophagy-relaterte mekanismer har studert systematisk i gjær, fokusert studier for å utforske mitophagy-relaterte mekanismer i pattedyrceller hovedsakelig på PINK1-Parkin veien. Tidligere undersøkelser har vist at PINK1-Parkin veien er primært ansvarlig for selektiv fjerning av skadet mitokondrier via mitophagy12,20,21. Men har studier rapportert at i enkelte modeller kan mitophagy aktiveres selv i fravær av funksjonelle PINK122,23,24. Disse resultatene tyder på at i tillegg til PINK1-Parkin veien, der en ekstra uidentifisert veien som kan aktivere mitophagy.

Fraværet av en praktisk metode for å vurdere mitophagy aktivitet er en stor utfordring for å utforske veiene som regulerer mitophagy og dens rolle i patofysiologiske hendelser. Elektronmikroskop er et kraftig verktøy for å visualisere direkte autophagosome-omsluttet mitokondrier. Men har elektronmikroskop begrensninger i kvantifisere mitophagy aktivitet. Selv om strategier som bruker microtubule-assosiert protein-1 lys kjeden 3 (LC3)-konjugert fluorescerende sonder, for eksempel GFP-LC3, er de mest brukte tilnærminger25, forbigående natur LC3-baserte signalet og sin høyt antall falske positive signaler begrense sin følsomhet for å oppdage mitophagy i cellene26. En kombinasjon av vestlige blotting for å måle mitokondrie protein nivå, kvantifisering av Mitokondrielt DNA og fluorescens mikroskopi analyse colocalize mitokondrier autophagosomes eller lysosomer ville være en god tilnærming for å vurdere mitophagy. Imidlertid ringe kvantifisering begrensninger og mangel på bekvemmeligheten av eksisterende metoder for nye tilnærminger. Innføringen av en ny pH-avhengig fluorescerende protein, mitokondrie målet Keima (mt-Keima), forbedret evne til å oppdage mitophagy27. Kombinerer mitokondrie målretting sekvensen av cytochrome c oksidase delenhet VIII (COX VIII) i Keima, er mt-Keima rettet mot mitokondrie matrix. Stort skifte i eksitasjon toppen av Keima fra 440 nm 586 nm (tilsvarende pH 7 og pH 4, henholdsvis) kan brukes til å vurdere mitophagy med gode varsomt i både i vitro og vivo eksperimenter28,29 . Enda viktigere, forårsaker motstanden av mt-Keima til lysosomale fornedrelse integrering av mt-Keima signalet i lysosomer, muliggjør enkel kvantitativ måling av mitophagy aktivitet. Fluorescens endringen som oppstår i mt-Keima kan analyseres ved hjelp av enten AC confocal mikroskopi eller flow cytometri28,29. Men er en flyt cytometri-basert metode for å måle mitophagy aktivitet ved hjelp av mt-Keima ikke angitt i detalj ennå.

Her beskriver vi en detaljert protokoll for en flyt cytometri-basert metode for å måle mitophagy aktivitet i celler ved hjelp av mt-Keima. Selv om vi har vist her at flyt cytometri analyse ble oppdaget CCCP-indusert mitophagy i HeLa celler uttrykke Parkin, kan denne teknikken brukes til en rekke celletyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. generasjon HeLa celler uttrykke mito-Keima (mt-Keima)

  1. Utarbeidelse av mt-Keima lentivirus
    1. Coat en 100 mm kultur parabol ved å legge til 2 mL 0,001% poly-L-lysin/fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) og la den stå i 5 minutter ved romtemperatur.
    2. Fjerne poly-L-lysine løsning ved hjelp av en glass pipette koblet til et vakuum og vask kultur parabol ved å legge til 2 mL 1 x PBS.
    3. Plate 1,5 x 106 HEK293T på bestrøket kultur parabol med 10 mL av DMEM som inneholder 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin og kultur cellene på 37 ° C i en CO2 vev kultur inkubator for en dag.
    4. Transfect 2 µg mt-Keima lentiviral plasmider29 DNA med emballasje DNAs (psPAX 2 µg og pVSVG 0,25 µg) bruker en transfection reagens for 8t i henhold til produsentens instruksjoner.
    5. Fjern transfection media og legge 8 mL av fersk media.
    6. Samle mediet som inneholder virus partikler 48 timer senere. Fjern mobilnettet rusk fra samlet media med sentrifugering på 500 x g i 5 min og filtrere dem med en 0.45-µm sprøyte filter.
      Merk: For langsiktig bruk, gjør dele lentiviral partikler og lagre prøver på-80 ° C. Unngå å utsette viral prøvene å fryse-opptining for effektiv virusinfeksjon.
  2. Infisere HeLa-Parkin celler med mt-Keima lentivirus
    1. Plate 5 x 104 HeLa celler uttrykke Parkin (HeLa-Parkin) i 60 mm kultur parabol med 4 mL DMEM inneholder 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin på 37 ° C en dag før høsting mt-Keima-lentivirus.
      Merk: På grunn av fravær av endogene Parkin uttrykk i HeLa celler30HeLa-Parkin cellene som brukes her til mer tydelig viser CCCP-indusert mitophagy. Denne fremgangsmåten kan også brukes til andre primære eller udødeliggjort linjer.
    2. Fjern vekstmediet neste dag og tilsett 1 mL av mt-Keima lentiviral media. Legge til en ekstra 2 mL vekstmediet som inneholder 3 µL polybrene lager løsning (8 mg/mL i destillert vann). Inkuber for en dag i en CO2 vev kultur inkubator.
    3. Fjerne mt-Keima lentiviral blandingen neste dag og vask cellene to ganger med 1 x PBS. Legg 4 mL oppblomstringen medium og behandle cellene med 2 µg/mL puromycin for to dager.
    4. Etter to dager med puromycin utvalg, fjerne vekstmediet, og vask cellene to ganger med 1 x PBS. Legg oppblomstringen medium, og kultur cellene i en CO2 inkubator før bruk.
      Merk: Denne metoden kan brukes for å generere celler som uttrykker stabilt mt-Keima, inkludert andre linjer og en primær celler.

2. inducing mitophagy bruke CCCP behandling og forberede FACS prøver

  1. Plate 5 x 104 jakten-Parkin celler uttrykke mt-Keima i en 60 mm kultur parabol med 4 mL DMEM inneholder 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin og kultur dem for en dag på 37 ° C i en CO2 vev kultur inkubator.
  2. Fjern vekstmediet neste dag og legge 4 mL av fersk DMEM som inneholder 10 µM karbonyl cyanid m-chlorophenylhydrazone (CCCP). Inkuber HeLa-Parkin-mt-Keima celler i en CO2 vev inkubator 6 h.
  3. Fjerne vekstmediet 6 h senere og vask cellene med 2 mL 1 x PBS. Koble cellene ved å behandle dem med trypsin/EDTA løsning og deaktivere trypsin ved å legge til vekstmediet som inneholder 10% FBS. Overføre cellene til en 15-mL konisk rør.
  4. Sentrifuge cellene på 500 x g i 5 min.
  5. Nøye fjerne vekstmediet av aspirasjon og resuspend cellene med 1 mL kaldt 1 x PBS.
  6. Overføre celler inn i passende FACS røret og plassere den på is.
    Merk: Forberede infisert HeLa celler som en negativ kontroll.
    Merk: Cellene er levedyktig på isen i flere timer, og mt-Keima fluorescens signaler også forbli stabile.

3. FACS analyse av mitophagy

Merk: I denne studien celler ble analysert med en flyt cytometer utstyrt med en 405-nm og 561-nm laser. Celler var begeistret med en fiolett laser (405 nm) med utslipp oppdaget på 610 ± 10 nm med en BV605 detektor og en gul-grønn laser (561 nm) med utslipp oppdaget på 610 ± 10 nm av en PE-CF594 detektor samtidig (figur 1).

  1. Gating lever celler
    1. Slå på strømmen cytometer og datamaskinen og logge analyseprogramvare.
    2. Generere et nytt eksperiment eller kopiere et eksisterende eksperiment. Å opphisse celler med violet (405 nm) og gul-grønn (561 nm) lasere og oppdage utslipp på 610 ± 10 nm detektor, velge BV605 og PE-CF594 i tillegg til fremover xy (FSC) og siden xy (SSC) i vinduet parameteren som kreves fluorophores.
      Merk: Alle fluorophores skal legges i en lineær modus.
    3. Vortex hver celle prøve kort å spre celle samler.
    4. Sett røret som inneholder en kontroll HeLa-Parkin celle utvalg som ikke er infisert med mt-Keima lentivirus på eksempel injeksjon porten og trykk på "Kjør"-knappen på cytometer.
    5. I dot plottet av FSC versus SSC, justere FSC og SSC spenning for å plassere cellene i midten av prikken tomten.
    6. Tegne en P1 gate bruke ikonet Polygon rundt lever celler og fjerne døde celler og celle rusk (figur 2A).
  2. Justere spenninger for fiolett og grønn laser
    1. Sett røret som inneholder HeLa-Parkin celler infisert med mt-Keima lentivirus på eksempel injeksjon port og trykk på "Kjør-knappen på cytometer.
    2. I dot plottet av BV605 (405 nm) versus SSC, justere BV605 spenningen slik at HeLa-Parkin celler uttrykke mt-Keima er klart adskilte fra kontroll celler som ikke uttrykker mt-Keima (figur 2B).
    3. I dot plottet av PE-CF594 (561 nm) versus SSC, justere spenningen som PE-CF594 slik at HeLa-Parkin celler uttrykke mt-Keima er klart adskilte fra kontroll celler (figur 2B).
  3. Vurdere andelen celler i mitophagy
    1. Erverve BV605 versus PE-CF594 dot plott med en lineær skala. Tegne en gate bruke ikonet Polygon rundt celler som uttrykker mt-Keima og eliminere celler ikke uttrykke mt-Keima (figur 3A). Mt-Keima fluorescens-positive celle befolkningen er referert til som "mt-Keima" porten.
    2. Opprette en annen dot tomt BV605 versus PE-CF594 viser bare "mt-Keima"-gated celler. I denne dot tomten, tegne en gate rundt ubehandlet mt-Keima-positiv cellene. Den basale mitophagy aktiviteten kontroll HeLa celler er lav, og utslipp på PE-CF594/BV605 er mindre enn 1. Derfor er denne porten referert til som "lav" porten.
    3. Tegne en annen gate som inneholder over regionen av "lavt" gate. Denne porten er referert til som "høy" porten fordi den inneholder celler med høy mitophagy aktivitet, det vil si celler med en høy andel av utslipp på PE-CF594/BV605 (figur 3B).
    4. For å beregne prosentdelen av celler i "høy" porten, velg "Vis befolkningen hierarki"-menyen. "Prosent av foreldre" (% overordnede) verdien representerer prosentandelen av celler i "høy" porten befolkningen mt-Keima-positive.
    5. Angi minst 10.000 hendelser registreres i "mt-Keima" stopper porten og kjøre hver prøve.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et eksempel på flyt cytometri analyse av CCCP-indusert mitophagy i jakten-Parkin celler vises i Figur 4. Bruke flyt cytometri analyse metoden beskrevet ovenfor, kan vi oppdage en dramatisk økning i mitophagic celler i "høy" porten. Prosentandelen av celler i "høy" porten ble økt mer enn 10-fold sammenlignet med ubehandlet kontroll celler (figur 4A). Denne økningen i mitophagy aktivitet var helt avskaffet av co behandling med bafilomycin A (Uteksaminert) (figur 4A og 4B).

Figure 1
Figur 1 . Skjematisk fremstilling av metoden brukes til å måle mitophagy med flowcytometri. Ordningen beskriver de viktigste trinnene nødvendig å kvantifisere cellene gjennomgår mitophagy av flowcytometri. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Angi flyten cytometer parametere. (A) Gating levende celler. Et område for levende celler var fast bestemt på FSC versus SSC tomten ekskludere døde celler og celle rusk. (B) justere 405-nm og 531-nm lasere kontrollen HeLa celler celler og HeLa uttrykke mt-Keima. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Beregning av andelen mitophagic celler av flowcytometri. (A) Gating HeLa celler uttrykke mt-Keima. (B) Gating mitophagic celler og beregne andelen bruke statistikkverktøyet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Kvantifisering av CCCP-indusert mitophagy i HeLa celler av flowcytometri. (A) HeLa-Parkin celler uttrykke mt-Keima ble behandlet med 10 µM CCCP 6 h med eller uten 100 nM bafilomycin A (Uteksaminert). Cellene ble analysert av FACS bruker BV605 og PE-CF594 detektorer. (B) celler med en høy PE-CF594/BV605 ble valgt ("høy"), og deres andel ble beregnet. Resultatene av tre gjentatte eksperimenter tegnes med standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her presenterer vi en raskere og følsom metode for å bruke flowcytometri til å måle mobilnettet mitophagy aktivitet i celler som uttrykker mt-Keima. Cellene gjennomgår høy mitophagy viser en økt andelen PE-CF594 (561 nm) / BV605 (405 nm) eksitasjon. Dermed kan mitophagy aktivitet uttrykkes som en prosentandel av celler viser høy 561/405 forholdet. Vi beregnet prosentandelen av celler i regionen "høy" porten på dot tomten av PE-CF594 (561 nm) kontra BV605 (405 nm), og resultatene viste at behandling med CCCP indusert en økning i mitophagy i jakten-Parkin celler. Vi viste tidligere at den lentivirus-mediert overuttrykte mt-Keima selv ikke påvirker mitokondrie funksjon eller cellular fysiologi31. Selv om vi har vist i våre manuskript kan som flyt cytometri analyse oppdage CCCP-indusert mitophagy i HeLa celler uttrykke Parkin, denne teknikken kan brukes til alle typer celle etter innføring av mt-Keima. Vi viste tidligere at hypoksi-indusert mitophagy ble oppdaget i HeLa celler uten ektopisk Parkin uttrykk29. I tillegg tidligere studier, inkludert vår og de andre grupper, viste at mt-Keima fluorescens analyse kan oppdage mitophagy i primære celler som mus embryonale fibroblaster (MEFs) og udødeliggjort celler som HeLa og HEK293 SH-SY5Y celler 28 , 29 , 32.

Sammenlignet med andre mikroskopi- eller immunoblotting-baserte mitophagy analyser, har flyt cytometri analyser fordeler ved at de tillater rask, reproduserbare analyser av store antall celler31. Derfor, mens i mikroskopi-baserte analyser, forsker skjevhet kan forvrenge resultatene, denne skjevhet er ikke et problem når du bruker flyt cytometri analyser.

Færre enn 1 x 106 celler kreves for flyt cytometri analyse. Fordi analyse av et utvalg tar bare ett til to minutter, kan i tillegg opptil dusinvis av eksempler analyseres innen en til to timer. Videre kan flyt cytometri analyser oppdage øker i mitophagic celler med god følsomhet. I vår flyt cytometri analyse oppdaget vi en 10 ganger økning i mitophagic celler etter 6 h behandling med CCCP.

Det kritiske trinnet for å analysere mitophagy med flowcytometri er å angi "høy" og "lav" portene riktig for å skille cellene gjennomgår høy mitophagy. Basale mitophagy nivåer kan være forskjellig avhengig av hvilken celle, kan angi "høy" og "lav" porten være vanskelig i noen linjer. I slike tilfeller er det nyttig å inkludere en kontroll celle linje med lav basale mitophagy aktivitet som HeLa celler. I tillegg til cellene behandlet med en lysosomale inhibitor som chloroquine, kan bafilomycin A inkluderes som en lav mitophagy til å definere den riktige gating. Selv om lentiviruses brukte for ektopisk uttrykk for interessant proteiner, kan noen linjer være utsatt for smitte. Hvis lentivirus infeksjon selv resulterer i endringer i cellevekst eller mitokondrier funksjon, anses en annen metode for mt-Keima uttrykk. Hvilket uttrykk mt-Keima kan også variere avhengig av celle type. Hvis mt-Keima fluorescens signalet for svak eller for heterogene, kan bare cellene med en sterk mt-Keima fluorescens signal samles ved hjelp av cellen sortering eller mt-Keima-cellene behandlet igjen med en høyere konsentrasjon av puromycin antibiotika i flere dager . Mt-Keima signalet frittliggende cellene er stabile så lenge cellene er levedyktig, men vi anbefaler analysere prøvene av flowcytometri så raskt som mulig.

Analysen vår flyt-cytometri er en robust og praktisk metode for mitophagy analyse, men det er noen begrensninger. Først fordi cellene skal skilles som en enkelt celle for flowcytometri, er denne metoden vanskelig å bruke for å analysere mitophagy vev eller organer uten å endre fysiologi. I tillegg mt-Keima fluorescens mister egenskapene pH-avhengig etter fiksering, og dermed alle prøvene skal analyseres som lever celler. Dette resulterer i begrensning av prøven lagring nevnt ovenfor og en annen begrensning når du bruker en ekstra immunofluorescence flekken. Denne teknikken kan måle mitophagy aktivitet kvantitativt, men ikke kan overvåke endringer i mitokondrie morfologi eller dynamikk, som er kjent for å spille viktige roller i mitophagy prosessen9. Forskere bør huske på kompleksiteten og ubestemt aspekter av mitophagy. Derfor, for å unngå mulig feilvurdering, mitophagy prosessen må bekreftes av kombinerte resultatene av andre felles mitophagy analyse metoder, inkludert elektronmikroskop, mitokondrie protein omsetning, en reduksjon i Mitokondrielt DNA, og fluorescens mikroskopi måle colocalization av mitokondrier lysosomer eller autophagosomes som beskrevet tidligere33,34,35. Noen observerte økning av mitophagy kan også være videre undersøkt via AC confocal mikroskopi celler uttrykke mt-Keima. Mitophagic celler uttrykkes mt-Keima i et lys vises punctate mønster med en høy 586/440 som kan observeres under AC confocal mikroskopi28,29.

Gitt sin evne til å raskt og følsomt oppdage mitophagy, gir denne flyten cytometri analysen et første trinn tilnærming som ville være verdifulle for en rekke studier. Ved å bare infisere celler med mt-Keima-lentivirus, kan endringer av mitophagy aktivitet være lett mål i en ønsket celle type. I kombinasjon med funksjonen celle sorter, kan celler med et bestemt nivå av mitophagy aktivitet spesielt isolert og brukes å studere roller og regulatoriske mekanismene bak mitophagy.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Research Foundation av Korea (2016R1D1A1B03931949) (å J. U.), og av National Research foundation av Korea (NRF) stipend finansiert av Korea-government(MSIT) (nr. 2016R1A2B2008887, nr. 2016R1A5A2007009) (til J.Y .)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
poly-L-lysine Sigma-Aldrich P2636
FBS GIBCO 16000-044
penicillin/streptomycin wellgene LS202-02
PBS Hyclone SH30013.02
HEK293T ATCC CRL-3216
DMEM GIBCO 12800-082
OPTI-MEM  GIBCO 31985-070
Turbofect Thermos scientific R0531
0.45 μm syringe filter sartorius 16555
HeLa ATCC CCL-2
polybrene Sigma-Aldrich H9268 8 mg/ml
puromycin Sigma-Aldrich P8833 2 mg/ml 
Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP) Sigma-Aldrich C2759 10 mM
trypsin-EDTA wellgene LS015-01
EQUIPMENTS
BD LSRFortessa BD Bioscience LSRFortessa
FACSDIVA BD Bioscience FACSDIVA (v8.0.1)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), R551-R560 (2006).
  2. Zorov, D. B., Krasnikov, B. F., Kuzminova, A. E., Vysokikh, M., Zorova, L. D. Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria. Bioscience Reports. Bioscience Reports. 17 (6), 507-520 (1997).
  3. Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
  4. Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
  5. Kang, D., Hamasaki, N. Alterations of mitochondrial DNA in common diseases and disease states: aging, neurodegeneration, heart failure, diabetes, and cancer. Current Medicinal Chemistry. 12 (4), 429-441 (2005).
  6. Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The mitochondrial basis of aging. Molecular Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
  7. Wallace, D. C., Brown, M. D., Melov, S., Graham, B., Lott, M. Mitochondrial biology, degenerative diseases and aging. BioFactors. 7 (3), 187-190 (1998).
  8. Yun, J., Finkel, T. Mitohormesis. Cell Metabolism. 19 (5), 757-766 (2014).
  9. Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
  10. Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
  11. Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
  12. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
  13. Zhu, J., Wang, K. Z., Chu, C. T. After the banquet: Mitochondrial biogenesis, mitophagy, and cell survival. Autophagy. 9 (11), 1663-1676 (2013).
  14. Um, J. H., Yun, J. Emerging role of mitophagy in human diseases and physiology. BMB Reports. 50 (6), 299-307 (2017).
  15. Al Rawi, S., et al. Postfertilization autophagy of sperm organelles prevents paternal mitochondrial DNA transmission. Science. 334 (6059), 1144-1147 (2011).
  16. Kim, M. J., et al. SESN2/sestrin2 suppresses sepsis by inducing mitophagy and inhibiting NLRP3 activation in macrophages. Autophagy. 12 (8), 1272-1291 (2016).
  17. Kim, M. J., Yoon, J. H., Ryu, J. H. Mitophagy: A balance regulator of NLRP3 inflammasome activation. BMB Reports. 49 (10), 529-535 (2016).
  18. Sandoval, H., et al. Essential role for Nix in autophagic maturation of erythroid cells. Nature. 454 (7201), 232-235 (2008).
  19. Sato, M., Sato, K. Degradation of paternal mitochondria by fertilization-triggered autophagy in C. elegans embryos. Science. 334 (6059), 1141-1144 (2011).
  20. Geisler, S., et al. PINK1/Parkin-mediated mitophagy is dependent on VDAC1 and p62/SQSTM1. Nature Cell Biology. 12 (2), 119-131 (2010).
  21. Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
  22. Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
  23. Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
  24. Kubli, D. A., et al. PINK1 Is dispensable for mitochondrial recruitment of Parkin and activation of mitophagy in cardiac myocytes. PloS One. 10 (6), e0130707 (2015).
  25. Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
  26. Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
  27. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  28. Lee, I. H., Yun, J., Finkel, T. The emerging links between sirtuins and autophagy. Methods in Molecular Biology. 1077, 259-271 (2013).
  29. Sun, N., et al. Measuring In vivo Mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
  30. Denison, S. R., et al. Alterations in the common fragile site gene Parkin in ovarian and other cancers. Oncogene. 22 (51), 8370-8378 (2003).
  31. Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: Basic principles and applications. Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
  32. Bingol, B., et al. The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy. Nature. 510 (7505), 370-375 (2014).
  33. Burbulla, L. F., Kruger, R. The use of primary human fibroblasts for monitoring mitochondrial phenotypes in the field of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. 68, e4228 (2012).
  34. Di Sante, G., Casimiro, M. C., Pestell, T. G., Pestell, R. G. Time-lapse video microscopy for assessment of EYFP-Parkin aggregation as a marker for cellular mitophagy. Journal of Visualized Experiments. 111, e53657 (2016).
  35. Fang, E. F., et al. In vitro and in vivo detection of mitophagy in human cells, C. Elegans, and mice. Journal of Visualized Experiments. 129, e56301 (2017).

Tags

Biologi problemet 138 Mitophagy mitokondrier mt-Keima flowcytometri fluorescerende protein pH-avhengig sonde
Følsom måling av Mitophagy av Flow cytometri ved hjelp av pH-avhengig fluorescerende Reporter mt-Keima
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Um, J. H., Kim, Y. Y., Finkel, T.,… More

Um, J. H., Kim, Y. Y., Finkel, T., Yun, J. Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima. J. Vis. Exp. (138), e58099, doi:10.3791/58099 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter