Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Følsomme måling af Mitophagy ved Flow flowcytometri ved hjælp af pH-afhængige fluorescerende Reporter mt-Keima

Published: August 12, 2018 doi: 10.3791/58099
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 3, 1,2
1Peripheral Neuropathy Research Center, College of Medicine, Dong-A University, 2Department of Biochemistry, College of Medicine, Dong-A University, 3Aging Institute, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Mitophagy, selektiv nedbrydningen af mitokondrier, har været impliceret i mitokondrie homøostase og er liberaliseret i forskellige sygdomme hos mennesker. Praktisk eksperimentelle metoder til at måle mitophagy aktiviteten er imidlertid meget begrænset. Her, leverer vi en følsom analyse til måling af mitophagy aktivitet ved hjælp af flowcytometri.

Abstract

Mitophagy er en proces i selektiv fjernelse af beskadigede eller unødvendige mitokondrier ved hjælp af autophagy maskiner. Tætte forbindelser har fundet mellem defekte mitophagy og forskellige sygdomme hos mennesker, herunder neurodegenerative sygdomme, kræft og metaboliske sygdomme. Derudover har nylige undersøgelser vist, at mitophagy er involveret i normal cellulære processer, såsom differentiering og udvikling. Men den præcise rolle og molekylære mekanismer bag mitophagy kræver yderligere undersøgelse. Derfor er det kritisk at udvikle en robust og praktisk metode til at måle ændringer i mitophagy aktivitet. Her beskriver vi en detaljeret protokol til kvantitativt mitophagy virksomhed gennem flowcytometri ved hjælp af mitokondrier-målrettet fluorescerende protein Keima (mt-Keima). Dette flow flowcytometri assay kan analysere mitophagy aktivitet mere hurtigt og fornuftigt end konventionelle mikroskopi - eller immunoblotting-baserede metoder. Denne protokol kan anvendes til at analysere mitophagy aktivitet i forskellige celletyper.

Introduction

Mitokondrier er organelles, der er nødvendige for celledelingen og fysiologi. Mitokondrier er ansvarlig for at generere mere end 80% af ATP levering via oxidativ fosforylering, og de giver også forskellige metaboliske mellemprodukter til biosyntese og metabolisme1,2. Ud over deres rolle i energiforsyningen og metabolisme spille mitokondrier centrale roller i mange andre vigtige processer, herunder reaktive ilt arter (ROS) generation, regulering af celledød og intracellulære Ca2 + dynamics3 . Ændringer i mitokondrie-funktion er blevet forbundet med menneskelige sygdomme, herunder kræft, diabetes mellitus og forskellige neurodegenerative sygdomme4,5. Øget mitokondriel dysfunktion og mitokondriel DNA mutationer er også menes at bidrage til normal aldring processer6,7,8. Kvalitetskontrol er derfor et afgørende spørgsmål i mitokondrierne. Mitokondrier er yderst dynamisk organelles, der løbende kan ændre deres form mellem aflange netværk og korte, fragmenterede form. Mitokondrier dynamics spiller en vigtig rolle i at bevare funktionen af mitokondrier samt deres nedbrydning gennem mitophagy9.

Mitophagy er en mekanisme, der involverer den selektive nedbrydning af hele mitokondrier ved hjælp af autophagy maskiner. Mitophagy er principielt mekanisme underliggende mitokondrie omsætning og fjernelse af beskadigede eller dysfunktionelle mitochondrier. I denne proces, er mitokondrier først omgivet af en membran, som resulterer i dannelsen af autophagosomes, som derefter fusionere med lysosomer for hydrolytisk nedbrydning9. Tidligere genetiske undersøgelser i Drosophila har antydet, at to Parkinsons sygdom-relaterede gener, PT-induceret formodede kinase 1 (PINK1) (PARK6) og Parkin (PARK2), fungerer i den samme vej10,11. Delfølge undersøgelser har vist at PINK1-Parkin pathway er ansvarlig for at fjerne beskadigede mitokondrier og mangler i denne pathway resulterer i dårligt fungerende mitophagy og kan bidrage til menneskelige sygdomme12,13. Defekter i mitophagy processer er for nylig blevet fundet i forskellige menneskelige sygdomme, herunder kræft, hjertesygdomme, leversygdomme og neurodegenerative sygdomme 14. Derudover har nylige undersøgelser også vist, at mitophagy er afgørende for mange fysiologiske processer, som differentiering, udvikling og immunrespons15,16,17,18 ,19, tyder på, at mitophagy kan spille en mere aktiv rolle i at kontrollere cellefunktioner.

Trods de seneste bekræftelse af, at mitophagy spiller en vigtig rolle i begge kvalitetskontrol i mitokondrierne og sygdom hos mennesker, de molekylære mekanismer bag mitophagy forbliver dårligt forstået. Selv om mitophagy-relaterede mekanismer er blevet systematisk undersøgt i gær, har studier med henblik på at udforske mitophagy-relaterede mekanismer i pattedyrceller primært fokuseret på PINK1-Parkin pathway. Tidligere undersøgelser har godtgjort, at PINK1-Parkin pathway er hovedansvarlig for den selektive fjernelse af beskadiget mitokondrier via mitophagy12,20,21. Men de seneste undersøgelser har rapporteret, at i nogle modeller kan aktiveres mitophagy selv i mangel af funktionelle PINK122,23,24. Disse resultater tyder på, ud over PINK1-Parkin pathway, der en yderligere uidentificerede pathway, der kan aktivere mitophagy.

Fraværet af en praktisk metode til at vurdere mitophagy aktivitet er en væsentlig hindring for at udforske de stier, der regulerer mitophagy og dens rolle i patofysiologiske begivenheder. Elektronmikroskopi er et kraftfuldt værktøj til direkte visualisere autophagosome-opslugte mitokondrier. Elektronmikroskopi har imidlertid begrænsninger i kvantificere mitophagy aktivitet. Selv om strategier, der bruger mikrotubulus-forbundet protein-1 lys kæde 3 (LC3)-konjugeret fluorescerende sonder, som normal god landbrugspraksis-LC3, er i øjeblikket den mest udbredte tilgange25, den forbigående karakter af LC3-baseret signal og dets høje sats af falsk-positive signaler begrænse sin følsomhed for påvisning af mitophagy i cellerne26. En kombination af western blotting for at måle mitokondrie protein niveau, kvantificering af mitokondrie-DNA, og Fluorescens mikroskopi analyse til colocalize mitokondrier med enten autophagosomes eller lysosomer ville være en god tilgang til at vurdere mitophagy. Dog kræver kvantificering begrænsninger og mangel på bekvemmelighed af eksisterende metoder nye tilgange. Indførelsen af en ny pH-afhængige fluorescerende proteiner, mitokondrie målet Keima (mt-Keima), i høj grad forbedret evne til at detektere mitophagy27. Af sammensmeltning af mitokondrie-targeting sekvens af cytokrom c oxidase subunit VIII (COX VIII) i Keima, er mt-Keima rettet mod mitokondriets matrix. De store skift i excitation peak Keima fra 440 nm til 586 nm (svarende til pH 7 og pH 4, henholdsvis) kan udnyttes til at vurdere mitophagy med gode nænsomt i både in vitro- og i vivo eksperimenter28,29 . Endnu vigtigere, forårsager modstanden i mt-Keima til lysosomale forringelse integration af signalet fra mt-Keima i lysosomer, giver mulighed for nem kvantitativ måling af mitophagy aktivitet. Fluorescens ændringen, der opstår i mt-Keima kan analyseres ved hjælp af enten Konfokal mikroskopi eller flow flowcytometri28,29. En flow flowcytometri-baserede metode til at måle mitophagy aktiviteten ved hjælp af mt-Keima har imidlertid ikke ydet i detaljer til dato.

Her beskriver vi en detaljeret protokol for en flow flowcytometri-baserede teknik til at måle mitophagy aktiviteten i celler ved hjælp af mt-Keima. Selv om vi har her vist, at analysen af handelsstrømmen flowcytometri held opdaget CCCP-induceret mitophagy i HeLa celler udtrykte parkerin, kan denne teknik anvendes til en lang række celletyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. generation af HeLa celler udtrykker mito-Keima (mt-Keima)

  1. Forberedelse af mt-Keima lentivirus
    1. Coat en 100-mm kultur parabol ved tilsætning 2 mL af 0,001% poly-L-lysin/fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og lad det stå i 5 min ved stuetemperatur.
    2. Fjerne den poly-L-lysin løsning ved hjælp af et glas pipette tilsluttet en vacuum og vaske kultur parabol ved tilsætning 2 mL 1 x PBS.
    3. Plade 1,5 x 106 HEK293T celler på den coatede kultur fad med 10 mL af DMEM indeholdende 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin og kultur celler ved 37 ° C i en CO2 vævskultur inkubator for en dag.
    4. Transfect 2 µg af mt-Keima lentiviral plasmid29 DNA sammen med emballage DNAs (psPAX 2 µg og pVSVG 0,25 µg) ved hjælp af en Transfektion reagens for 8 h ifølge producentens anvisninger.
    5. Fjern Transfektion medier og tilsæt 8 mL frisk medier.
    6. Indsamle medier indeholdende viruspartikler 48 timer senere. Fjerne cellular vragdele fra de indsamlede medier ved centrifugering ved 500 x g i 5 min og filtrere dem med et 0,45 µm sprøjte filter.
      Bemærk: For lang tids brug, gøre delprøver af lentiviral partikler og gemme prøver på-80 ° C. Undgå at udsætte de virale prøver for at fryse-tø cykler til effektiv viral infektion.
  2. Inficere HeLa-Parkin celler med mt-Keima lentivirus
    1. Plade 5 x 104 HeLa celler udtrykte parkerin (HeLa-Parkin) i en 60-mm kultur fad med 4 mL af DMEM indeholdende 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin ved 37 ° C én dag før høst mt-Keima lentivirus.
      Bemærk: På grund af manglen endogene Parkin udtryk i HeLa celler30, HeLa-Parkin celler bruges her til at mere tydeligt Vis CCCP-induceret mitophagy. Denne procedure kan også anvendes til andre primære eller udødeliggjort cellelinjer.
    2. Fjerne vækstmediet næste dag og der tilsættes 1 mL af mt-Keima lentiviral medier. Tilføje en yderligere 2 mL af vækstmediet indeholdende 3 µL af polybrene stamopløsning (8 mg/mL i destilleret vand). Der inkuberes i en dag i en CO2 vævskultur inkubator.
    3. Fjerne mt-Keima lentiviral blandingen næste dag og cellerne vaskes to gange med 1 x PBS. Der tilsættes 4 mL af vækstmediet og behandle celler med 2 µg/mL puromycin for to dage.
    4. Efter to dage med puromycin udvalg, fjerne vækstmediet, og cellerne vaskes to gange med 1 x PBS. Tilføje vækstmediet, og kultur celler i en CO2 inkubator indtil brug.
      Bemærk: Denne metode kan anvendes til at generere celler, der stabilt express mt-Keima, herunder andre cellelinjer og primærelementer.

2. inducerende mitophagy ved hjælp af CCCP behandling og FACS prøver

  1. Plade 5 x 104 HeLa-Parkin celler udtrykker mt-Keima i en 60-mm kultur fad med 4 mL af DMEM indeholdende 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin og kultur dem for en dag ved 37 ° C i en CO2 vævskultur inkubator.
  2. Fjerne vækstmediet næste dag og der tilsættes 4 mL frisk DMEM indeholdende 10 µM carbonyl cyanid m-chlorophenylhydrazone (CCCP). Inkuber HeLa-Parkin-mt-Keima celler i en CO2 væv inkubator for 6 h.
  3. Fjerne vækstmediet 6 h senere og cellerne vaskes med 2 mL 1 x PBS. Frigør cellerne ved at behandle dem med trypsin/EDTA-oploesning og inaktivere trypsin ved at tilføje vækstmediet indeholdende 10% FBS. Overføre cellerne i en 15 mL konisk slange.
  4. Der centrifugeres celler på 500 x g i 5 min.
  5. Forsigtigt fjerne vækstmediet ved aspiration og resuspend celler med 1 mL koldt 1 x PBS.
  6. Overfør celler ind i passende FACS røret og anbringes på is.
    Bemærk: Forberede uinficeret HeLa celler som en negativ kontrol.
    Bemærk: Celler er levedygtige på is i flere timer, og mt-Keima fluorescens signaler også forblive stabil.

3. FACS analyse af mitophagy

Bemærk: I denne undersøgelse, celler blev analyseret med et flow Flowcytometret udstyret med en 405-nm og 561-nm laser. Celler var begejstrede med et violet laser (405 nm) med emission registreres på 610 ± 10 nm med en BV605 detektor og en gul-grøn laser (561 nm) med emission registreres på 610 ± 10 nm af en PE-CF594 detektor samtidigt (figur 1).

  1. Gating levende celler
    1. Tænd for strømmen forskellige og computeren og logge ind på den analyse programmel.
    2. Generere et nyt eksperiment eller duplikere en eksisterende eksperiment. At ophidse celler med violette (405 nm) og gul-grøn (561 nm) lasere og opdage emission på 610 ± 10 nm detektor, vælge BV605 og PE-CF594 ud over forward scatter (FSC) og side scatter (SSC) i vinduet parameter som krævede fluorophores.
      Bemærk: Alle fluorophores skal tilføjes i en lineær funktion.
    3. Vortex hver celle prøve kort at sprede celle aggregater.
    4. Placer røret indeholder en HeLa-Parkin celle kontrolprøve, der ikke er inficeret med mt-Keima lentivirus på prøve injektion port og tryk på knappen "run" på forskellige.
    5. Dot plot af FSC versus SSC, Juster FSC og SSC spændingen for at placere celler i midten af dot plot.
    6. Tegne en P1 gate ved hjælp af ikonet Polygon omkring levende celler og fjerne døde celler og celle debris (figur 2A).
  2. Justere spændinger til violet og grøn laser
    1. Sted rør indeholdende HeLa-Parkin celler inficeret med mt-Keima lentivirus på prøve injektion port og tryk på knappen "run" på forskellige.
    2. I dot plot af BV605 (405 nm) versus SSC, justere BV605 spænding, så at HeLa-Parkin celler udtrykker mt-Keima er klart adskilt fra kontrol celler, der ikke udtrykke mt-Keima (figur 2B).
    3. I dot plot af PE-CF594 (561 nm) versus SSC, justere PE-CF594 spænding, så at HeLa-Parkin celler udtrykker mt-Keima er klart adskilt fra kontrol celler (figur 2B).
  3. Vurdere procentdelen af celler i mitophagy
    1. Erhverve BV605 versus PE-CF594 dot plot ved hjælp af en lineær skala. Tegne en port ved hjælp af ikonet Polygon omkring celler, der udtrykker mt-Keima, og fjerne celler ikke udtrykker mt-Keima (figur 3A). Mt-Keima fluorescens-positive celle befolkning er benævnt "mt-Keima" gate.
    2. Oprette en anden dot plot af BV605 versus PE-CF594 viser kun "mt-Keima"-gated celler. I denne dot plot, tegne en gate omkring ubehandlet mt-Keima-positive celler. Basal mitophagy aktivitet af kontrol HeLa celler er lav, og forholdet mellem emission på PE-CF594/BV605 er mindre end 1. Således, denne port er nævnt som den "lave" gate.
    3. Tegne en anden gate indeholdende regionen ovenfor i den "lave" gate. Denne port omtales som de "høje" gate fordi det indeholder celler med høj mitophagy aktivitet, dvs celler med en høj andel af emission på PE-CF594/BV605 (figur 3B).
    4. For at beregne procentdelen af celler i den "høje" gate, skal du vælge menuen "Vis befolkningen hierarki". Værdien "Procent af overordnet" (% forælder) repræsenterer procentdelen af celler i den "høje" gate befolkningen mt-Keima-positive.
    5. Sæt mindst 10.000 begivenheder til at registrere i "mt-Keima" stop gate og køre hver prøve.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et eksempel på flow flowcytometri analyse af CCCP-induceret mitophagy i HeLa-Parkin celler er vist i figur 4. Ved hjælp af den flow flowcytometri analysemetode, der er beskrevet ovenfor, kan vi opdage en dramatisk stigning i mitophagic celler i den "høje" gate. Procentdelen af celler i den "høje" gate var steget mere end 10-fold sammenlignet med ubehandlet kontrol celler (figur 4A). Denne stigning i mitophagy aktivitet blev helt afskaffet af co behandling med bafilomycin A (BFA) (figur 4A og 4B).

Figure 1
Figur 1 . Skematisk fremstilling af den metode, der bruges til at måle mitophagy med flowcytometri. Ordningen skitserer de vigtigste trin nødvendigt at kvantificere celler gennemgår mitophagy ved flowcytometri. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Indstilling flow forskellige parametre. (A) Gating af levende celler. En region for levende celler blev fastsat på FSC versus SSC plot at udelukke døde celler og celle debris. (B) justering 405-nm og 531-nm lasere bruge kontrol HeLa celler celler og HeLa udtrykker mt-Keima. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Beregningen af andelen af mitophagic celler ved flowcytometri. (A) Gating HeLa celler udtrykker mt-Keima. (B) Gating mitophagic celler og beregningen af andelen ved hjælp af værktøjet statistik. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . Kvantificering af CCCP-induceret mitophagy i HeLa celler ved flowcytometri. (A) HeLa-Parkin celler udtrykker mt-Keima blev behandlet med 10 µM CCCP for 6 h med eller uden 100 nM bafilomycin A (BFA). Celler blev analyseret af FACS ved hjælp af BV605 og PE-CF594 detektorer. (B) celler med en høj PE-CF594/BV605 ratio blev valgt ("høj"), og deres andel blev beregnet. Resultaterne af tre gentagne eksperimenter er afbildet med standardafvigelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi præsenterer her, en hurtig og følsom metode for at bruge flowcytometri at måle cellulære mitophagy aktivitet i celler, der udtrykker mt-Keima. Celler under en høj grad af mitophagy udviser en øget ratio af PE-CF594 (561 nm) / BV605 (405 nm) excitation. Mitophagy aktivitet kan således udtrykkes som procentdelen af cellerne, udstiller høj 561/405 forholdet. Vi beregnet procentdelen af celler i regionen "høj" gate på en prik plot af PE-CF594 (561 nm) versus BV605 (405 nm), og resultaterne viste, at behandling med CCCP induceret en stigning i mitophagy i HeLa-Parkin celler. Vi viste tidligere at lentivirus-medieret overekspression af mt-Keima ikke selv påvirker mitokondrie-funktion eller cellulær fysiologi31. Selv om vi har vist i vores manuskript at flow flowcytometri analyse kan med succes afsløre CCCP-induceret mitophagy i HeLa celler udtrykker Parkin, denne teknik kan anvendes på enhver form for celle efter at indføre mt-Keima. Tidligere viste vi, at hypoxi-induceret mitophagy kunne påvises i HeLa celler uden ektopisk Parkin udtryk29. Derudover tidligere undersøgelser, herunder vores og de andre grupper, viste, at mt-Keima fluorescens analyse kan afsløre mitophagy i primærelementer såsom mus embryonale fibroblaster (MEFs) og udødeliggjort celler som HeLa, HEK293 og SH-SY5Y celler 28 , 29 , 32.

Sammenlignet med andre mikroskopi- eller immunoblotting-baserede mitophagy assays, har flow flowcytometri assays fordele, idet de giver mulighed for hurtig, reproducerbare analyser af et stort antal celler31. Derfor boer i mikroskopi-baserede analyser, forsker bias kan fordreje resultater, er denne bias ikke et problem når du bruger flow flowcytometri assays.

Færre end 1 x 106 celler er nødvendige for flow flowcytometri analyse. Hertil kommer, fordi analyse af en prøve tager kun to minutter, kan op til snesevis af prøver analyseres indenfor en til to timer. Derudover kan flow flowcytometri assays registrere stigninger i mitophagic celler med god følsomhed. I vores analyse af handelsstrømmen flowcytometri opdaget vi en 10-fold stigning i mitophagic celler efter 6 h af behandling med CCCP.

Den afgørende skridt til at analysere mitophagy ved hjælp af flowcytometri er at sætte de "høje" og "lav" gates korrekt for at skelne celler undergår en høj grad af mitophagy. Fordi basal mitophagy niveauer kan være anderledes afhængigt af hvilken celle, kan indstilling "høj" og "lav" porten være svært i nogle cellelinjer. I sådanne tilfælde er det nyttigt at medtage en kontrol cellelinie med lav basal mitophagy aktivitet såsom HeLa celler. Derudover til celler behandles med en lysosomale hæmmer såsom chloroquin, kan bafilomycin A indgå som et lavt mitophagy kontrolelement til at oprette de korrekte gating. Selv om lentiviruses er almindeligt anvendt til Ektopisk udtryk for interessante proteiner, kan nogle cellelinjer være modtagelige for virusinfektion. Hvis lentivirus infektionen i sig selv resulterer i ændringer i cellevækst eller mitokondrier funktion, betragtes som en anden metode til mt-Keima udtryk. Udtryk niveauet af mt-Keima kan også variere afhængigt af celletype. Hvis mt-Keima fluorescens signalet er for svagt eller for heterogen, kan kun celler med en stærk mt-Keima fluorescens signal indsamles ved hjælp af en celle Diassortering eller mt-Keima celler behandles igen med en højere koncentration af puromycin antibiotika i flere dage . Mt-Keima signal af de fritliggende celler er stabil, så længe cellerne er levedygtige, men vi anbefaler analysere prøverne ved flowcytometri så hurtigt som muligt.

Vores flow flowcytometri assay er en robust og praktisk metode til mitophagy analyse, men der er visse begrænsninger. Først, fordi cellerne skal adskilles som en enkelt celle niveau til flowcytometri, denne metode er vanskelig at anvende til at analysere mitophagy af væv eller organer uden at ændre fysiologi. Derudover mt-Keima fluorescens mister dets pH-afhængige egenskaber efter fiksering, og dermed alle prøverne skal analyseres som levende celler. Dette resulterer i begrænsning af prøven opbevaring nævnt ovenfor og en anden begrænsning, når du anvender en ekstra immunofluorescens pletten. Denne teknik kan måle mitophagy aktiviteten kvantitativt, men er ikke i stand til at overvåge ændringer i mitokondrie morfologi eller dynamik, som er kendt for at spille en vigtig rolle i mitophagy proces9. Forskere burde holde inde indre kompleksitet og ubestemt aspekter af mitophagy. Derfor, for at undgå mulige fejlvurdering, mitophagy processen bør yderligere bekræftes ved kombineret resultaterne af andre fælles mitophagy analysemetoder, herunder elektronmikroskopi, mitokondrie protein omsætning, en reduktion i mitokondrie-DNA og Fluorescens mikroskopi måling colocalization af mitochondrier med lysosomer eller autophagosomes som beskrevet tidligere33,34,35. Enhver observeret stigning af mitophagy kan også undersøges yderligere via Konfokal mikroskopi af celler, der udtrykker mt-Keima. I mitophagic celler, er mt-Keima udtrykt i en lyse punktformet mønster med en høj 586/440 ratio, som kan overholdes under konfokalmikroskopi28,29.

Grund af dens evne til hurtigt og præcist afsløre mitophagy, giver dette flow flowcytometri analyse et første skridt tilnærmelse, der ville være værdifuldt at en lang række undersøgelser. Ved at blot inficere celler med mt-Keima lentivirus, kan ændringer af mitophagy aktivitet være let foranstaltning i enhver ønskede celletype. I kombination med funktionen celle sorteringsanlæg, kan celler med et specifikt niveau for mitophagy aktivitet specifikt isoleret og bruges til at studere de roller og reguleringsmekanismer underliggende mitophagy.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Research Foundation i Korea (2016R1D1A1B03931949) (til J. U.) og af Grundforskningsfond af Korea (NRF) tilskud finansieret af Korea government(MSIT) (nr. 2016R1A2B2008887, nr. 2016R1A5A2007009) (til J.Y .)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
poly-L-lysine Sigma-Aldrich P2636
FBS GIBCO 16000-044
penicillin/streptomycin wellgene LS202-02
PBS Hyclone SH30013.02
HEK293T ATCC CRL-3216
DMEM GIBCO 12800-082
OPTI-MEM  GIBCO 31985-070
Turbofect Thermos scientific R0531
0.45 μm syringe filter sartorius 16555
HeLa ATCC CCL-2
polybrene Sigma-Aldrich H9268 8 mg/ml
puromycin Sigma-Aldrich P8833 2 mg/ml 
Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP) Sigma-Aldrich C2759 10 mM
trypsin-EDTA wellgene LS015-01
EQUIPMENTS
BD LSRFortessa BD Bioscience LSRFortessa
FACSDIVA BD Bioscience FACSDIVA (v8.0.1)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), R551-R560 (2006).
  2. Zorov, D. B., Krasnikov, B. F., Kuzminova, A. E., Vysokikh, M., Zorova, L. D. Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria. Bioscience Reports. Bioscience Reports. 17 (6), 507-520 (1997).
  3. Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
  4. Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
  5. Kang, D., Hamasaki, N. Alterations of mitochondrial DNA in common diseases and disease states: aging, neurodegeneration, heart failure, diabetes, and cancer. Current Medicinal Chemistry. 12 (4), 429-441 (2005).
  6. Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The mitochondrial basis of aging. Molecular Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
  7. Wallace, D. C., Brown, M. D., Melov, S., Graham, B., Lott, M. Mitochondrial biology, degenerative diseases and aging. BioFactors. 7 (3), 187-190 (1998).
  8. Yun, J., Finkel, T. Mitohormesis. Cell Metabolism. 19 (5), 757-766 (2014).
  9. Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
  10. Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
  11. Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
  12. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
  13. Zhu, J., Wang, K. Z., Chu, C. T. After the banquet: Mitochondrial biogenesis, mitophagy, and cell survival. Autophagy. 9 (11), 1663-1676 (2013).
  14. Um, J. H., Yun, J. Emerging role of mitophagy in human diseases and physiology. BMB Reports. 50 (6), 299-307 (2017).
  15. Al Rawi, S., et al. Postfertilization autophagy of sperm organelles prevents paternal mitochondrial DNA transmission. Science. 334 (6059), 1144-1147 (2011).
  16. Kim, M. J., et al. SESN2/sestrin2 suppresses sepsis by inducing mitophagy and inhibiting NLRP3 activation in macrophages. Autophagy. 12 (8), 1272-1291 (2016).
  17. Kim, M. J., Yoon, J. H., Ryu, J. H. Mitophagy: A balance regulator of NLRP3 inflammasome activation. BMB Reports. 49 (10), 529-535 (2016).
  18. Sandoval, H., et al. Essential role for Nix in autophagic maturation of erythroid cells. Nature. 454 (7201), 232-235 (2008).
  19. Sato, M., Sato, K. Degradation of paternal mitochondria by fertilization-triggered autophagy in C. elegans embryos. Science. 334 (6059), 1141-1144 (2011).
  20. Geisler, S., et al. PINK1/Parkin-mediated mitophagy is dependent on VDAC1 and p62/SQSTM1. Nature Cell Biology. 12 (2), 119-131 (2010).
  21. Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
  22. Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
  23. Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
  24. Kubli, D. A., et al. PINK1 Is dispensable for mitochondrial recruitment of Parkin and activation of mitophagy in cardiac myocytes. PloS One. 10 (6), e0130707 (2015).
  25. Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
  26. Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
  27. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  28. Lee, I. H., Yun, J., Finkel, T. The emerging links between sirtuins and autophagy. Methods in Molecular Biology. 1077, 259-271 (2013).
  29. Sun, N., et al. Measuring In vivo Mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
  30. Denison, S. R., et al. Alterations in the common fragile site gene Parkin in ovarian and other cancers. Oncogene. 22 (51), 8370-8378 (2003).
  31. Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: Basic principles and applications. Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
  32. Bingol, B., et al. The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy. Nature. 510 (7505), 370-375 (2014).
  33. Burbulla, L. F., Kruger, R. The use of primary human fibroblasts for monitoring mitochondrial phenotypes in the field of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. 68, e4228 (2012).
  34. Di Sante, G., Casimiro, M. C., Pestell, T. G., Pestell, R. G. Time-lapse video microscopy for assessment of EYFP-Parkin aggregation as a marker for cellular mitophagy. Journal of Visualized Experiments. 111, e53657 (2016).
  35. Fang, E. F., et al. In vitro and in vivo detection of mitophagy in human cells, C. Elegans, and mice. Journal of Visualized Experiments. 129, e56301 (2017).

Tags

Biologi spørgsmålet 138 Mitophagy mitokondrier mt-Keima flowcytometri fluorescerende proteiner pH-afhængige sonde
Følsomme måling af Mitophagy ved Flow flowcytometri ved hjælp af pH-afhængige fluorescerende Reporter mt-Keima
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Um, J. H., Kim, Y. Y., Finkel, T.,… More

Um, J. H., Kim, Y. Y., Finkel, T., Yun, J. Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima. J. Vis. Exp. (138), e58099, doi:10.3791/58099 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter