Summary
Mitophagy, 线粒体的选择性降解, 与线粒体稳态有关, 在各种人类疾病中被解除管制。然而, 方便的实验方法测量 mitophagy 活动是非常有限的。在这里, 我们提供了一个敏感的检测 mitophagy 活动使用流式细胞仪。
Abstract
Mitophagy 是一种选择性去除受损或不必要的线粒体使用自噬机械的过程。有缺陷的 mitophagy 和各种人类疾病 (包括神经退行性疾病、癌症和代谢性疾病) 之间存在着密切的联系。此外, 最近的研究表明, mitophagy 参与正常的细胞过程, 如分化和发展。然而, mitophagy 的确切作用和分子机制需要进一步研究。因此, 建立一种稳健、方便的测量 mitophagy 活动变化的方法至关重要。在这里, 我们描述了一个详细的协议, 以定量评估 mitophagy 活动, 通过流式细胞术使用线粒体靶向荧光蛋白 Keima (mt-Keima)。这种流式细胞仪可以比常规显微术或免疫印迹法方法更快速、灵敏地分析 mitophagy 活动。该协议可应用于分析各种细胞类型中的 mitophagy 活动。
Introduction
线粒体是细胞增殖和生理的基本器官。线粒体负责产生超过80% 的 ATP 供应通过氧化磷酸化, 他们也提供了各种代谢中间体的生物合成和新陈代谢1,2。除了它们在能源供应和新陈代谢中的作用, 线粒体在许多其他重要过程中扮演中心角色, 包括活性氧 (ROS) 生成、细胞死亡调节和胞内 Ca2 +动力学3.线粒体功能的改变与人类疾病有关, 包括癌症、糖尿病和各种神经退行性疾病4、5。增加的线粒体功能障碍和线粒体 DNA 突变也被认为有助于正常衰老过程6,7,8。因此, 质量控制是线粒体中的一个关键问题。线粒体是高度动态的细胞器, 可以在拉长的网络和短而零碎的形态之间不断改变它们的形状。线粒体动力学在维持线粒体功能以及通过 mitophagy9的降解过程中起着重要的作用。
Mitophagy 是一种机制, 它涉及利用自噬机械对整个线粒体进行选择性降解。Mitophagy 是线粒体更替和去除受损或功能失调的线粒体的原理机制。在这个过程中, 线粒体首先被膜包围, 导致自噬体的形成, 然后与溶酶体融合水解降解9。以往果蝇的基因研究表明, 两种帕金森病相关基因, PTEN 诱导的激酶 1 (PINK1) (PARK6) 和 PARK2, 功能在同一途径10,11。子序列研究表明, PINK1-Parkin 通路是负责消除受损的线粒体和缺陷的这一途径导致功能失调的 mitophagy, 可能导致人类疾病12,13。最近在各种人类疾病中发现了 mitophagy 过程的缺陷, 包括癌症、心脏病、肝病和神经退行性疾病14。此外, 最近的研究也表明, mitophagy 是关键的许多生理过程, 如分化, 发展和免疫反应15,16,17,18 ,19, 表明 mitophagy 可能在控制细胞功能方面发挥更积极的作用。
尽管最近证实 mitophagy 在线粒体和人类疾病的质量控制中起着重要作用, 但 mitophagy 的分子机制仍然不太清楚。虽然在酵母中系统地研究了 mitophagy 相关的机制, 但旨在探索哺乳动物细胞 mitophagy 相关机制的研究主要集中在 PINK1-Parkin 途径上。以前的研究已经证实, PINK1-Parkin 途径主要负责选择性地去除受损的线粒体通过 mitophagy12,20,21。然而, 最近的研究报告说, 在某些模型中, 即使在没有功能 PINK122、23、24的情况下, mitophagy 也可以被激活。这些结果表明, 除了 PINK1-Parkin 通路, 有一个额外的不明途径, 可以激活 mitophagy。
缺乏一种方便的评估 mitophagy 活动的方法是探索调节 mitophagy 及其在病理生理事件中作用的途径的主要障碍。电子显微术是直接可视化 autophagosome 吞噬的线粒体的有力工具。然而, 电子显微镜在量化 mitophagy 活动方面有局限性。虽然使用微管相关的 protein-1 光链 3 (LC3)-共轭荧光探针 (如 GFP-LC3) 的策略是目前应用最广泛的方法25, LC3-based 信号的瞬态性及其高速率假阳性信号限制了其检测26细胞 mitophagy 的灵敏度。结合西方印迹测量线粒体蛋白水平, 线粒体 DNA 的量化, 和荧光显微分析 colocalize 线粒体与自噬体或溶酶体将是一个很好的方法来评估mitophagy。然而, 量化限制和现有方法的缺乏方便要求采取新的办法。引入一种新的 pH 依赖性荧光蛋白, 线粒体靶 Keima (mt-Keima), 大大提高了检测 mitophagy27的能力。将细胞色素 c 氧化酶亚基 viii (COX viii) 的线粒体靶向序列融合成 Keima, Keima 被定向到线粒体基质。Keima 的励磁峰的大位移从440毫微米到 586 nm (分别对应于 ph 7 和 ph 4) 可以用来评估 mitophagy在体外和体内实验28,29.更重要的是, Keima 对溶酶体降解的抗性导致了 Keima 信号在溶体蛋白中的整合, 使得 mitophagy 活性的定量测量变得容易。在 Keima 中发生的荧光变化可以用共焦显微镜或流式细胞术28,29进行分析。然而, 目前还没有详细提供基于流式细胞仪的测量 mitophagy 活动的方法--Keima。
在这里, 我们描述了一个详细的协议, 以流式细胞术为基础的技术, 以测量细胞 mitophagy 活动, 使用 mt-Keima。虽然我们在这里表明, 流式细胞术分析成功地检测到 CCCP 诱导 mitophagy 在 HeLa 细胞表达, 这一技术可以应用于多种细胞类型。
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Protocol
1. 表达 Keima (mt-Keima) 的 HeLa 细胞的生成
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Keima 慢病毒北疆的制备
- 用2毫升0.001% 聚 l-赖氨酸/磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 涂上100毫米的培养基, 在室温下可以站立5分钟。
- 使用连接到真空的玻璃吸管去除聚 l-赖氨酸溶液, 并通过添加2毫升 1x PBS 来洗涤培养皿。
- 板 1.5 x 106 HEK293T 细胞在涂层培养皿与10毫升的 DMEM 含有10% 的血清和1% 青霉素/链霉素, 并培养细胞在37°c 在一个 CO2组织培养孵化器一天。
- 染2µg 的 mt-Keima 慢病毒载体质粒29 DNA 连同包装脱氧核糖核酸 (psPAX 2 µg 和 pVSVG 0.25 µg) 使用的转染试剂 8 h 根据制造商的指示。
- 去除转染介质, 加入8毫升的新鲜介质。
- 收集含有病毒粒子的介质48小时后。通过离心 500 x g 5 分钟, 从收集的介质中去除细胞碎片, 并用0.45 µm 注射器过滤器进行过滤。
注:为长期使用, 使整除数的慢病毒载体颗粒和储存样品在-80 摄氏度。避免将病毒样本置于冰冻解冻循环中, 以有效地感染病毒。
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Keima 慢病毒北疆感染 HeLa 细胞
- 5 x 104 hela 细胞, 在60毫米的培养皿中表达, 其中4毫升的 DMEM 含有10% 个血清和1% 个青霉素/链霉素, 在37摄氏度前一天 Keima 慢病毒北疆。
注:由于在 hela 细胞中缺乏内源性的 CCCP表达, 在这里使用的 hela 细胞更清楚地显示了 mitophagy。此过程也可应用于其他主要或永生化的细胞系。 - 第二天去除生长介质, 加入1毫升的 Keima 慢病毒载体介质。添加额外的2毫升的生长培养基, 含有3µL 的凝聚胺溶液 (8 毫克/毫升蒸馏水)。在2组织培养孵化器中孵化一天。
- 第二天去掉 Keima 慢病毒载体混合物, 用 1x PBS 清洗两次细胞。添加4毫升的生长培养基, 并治疗细胞与2µg/毫升嘌呤霉素两天。
- 经过两天的嘌呤霉素选择, 去除生长培养基, 并清洗细胞两次与 1x PBS。添加生长培养基, 并培养细胞在 CO2孵化器, 直到使用。
注:该方法可用于生成稳定表达 Keima 的细胞, 包括其他细胞系和主细胞。
- 5 x 104 hela 细胞, 在60毫米的培养皿中表达, 其中4毫升的 DMEM 含有10% 个血清和1% 个青霉素/链霉素, 在37摄氏度前一天 Keima 慢病毒北疆。
2. 诱导 mitophagy 使用 CCCP 处理和制备外地药物管制样品
- 板 5 x 104 HeLa 细胞表达 mt-Keima 在60毫米培养皿与4毫升的 DMEM 含有10% 个血清和1% 青霉素/链霉素和培养他们一天在37°c 在 CO2组织培养孵化器。
- 第二天去除生长培养基, 加入4毫升新鲜 DMEM, 含10µM 羰基氰化腙 (CCCP)。在 CO2组织孵化器中孵育 HeLa-Keima 细胞, 6 小时。
- 去除生长培养基6小时后, 用2毫升 1x PBS 冲洗细胞。用胰蛋白酶/EDTA 溶液将细胞分离, 加入含有10% 血清的生长培养基, 使胰蛋白酶钝化。将细胞转移到15毫升锥形管中。
- 离心细胞在 500 x g 5 分钟。
- 通过吸入和并用重悬1毫升冷 1x PBS 的细胞, 小心地去除生长培养基。
- 将细胞转换成适当的流式管, 放在冰上。
注:准备未感染的 HeLa 细胞作为阴性对照。
注:细胞在冰上存活数小时, Keima 荧光信号也保持稳定。
3. mitophagy 的资产管制分析
注: 在本研究中, 用 405 nm 和 561 nm 激光的流式细胞仪对单元进行分析。细胞兴奋与紫激光 (405 nm) 与发射检测到 610, 10 毫微米与一个 BV605 探测器, 并与黄绿色激光 (561 nm) 与发射检测 610 @ 10 nm 由一个 PE-CF594 探测器同时 (图 1)。
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浇细胞
- 打开流式细胞仪和计算机, 登录分析软件。
- 生成新的实验或复制现有的实验。要激发细胞与紫罗兰 (405 毫微米) 和黄绿色 (561 nm) 激光器和检测发射在 610 @ 10 nm 探测器, 选择 BV605 和 PE-CF594, 除了在参数窗口中的正散射 (FSC) 和侧散射 (SSC), 根据需要显影。
注:应在线性模式中添加所有显影。 - 涡旋每个细胞样品以分散细胞团聚体。
- 将包含控制的 Keima 细胞样本的管放置在取样端口上, 不感染 mt-慢病毒北疆, 并按下 "运行" 按钮。
- 在 fsc 与 ssc 的点图中, 调整 fsc 和 ssc 电压, 将单元格放在点图的中心。
- 使用围绕活细胞的多边形图标绘制一个 P1 门, 并消除死细胞和细胞碎片 (图 2A)。
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调节紫、绿激光器的电压
- 将含有 Keima 慢病毒北疆感染的 HeLa 细胞的导管放置在样品注射口, 然后按下 "运行" 按钮。
- 在 BV605 (405 nm) 与 SSC 的点图中, 调整 BV605 电压, 使表达 mt-Keima 的 HeLa 细胞明显有别于不表达 mt-Keima 的控制单元 (图 2B)。
- 在 PE-CF594 (561 nm) 与 SSC 的点图中, 调整 PE-CF594 电压, 使表达 mt-Keima 的 HeLa 细胞明显有别于控制细胞 (图 2B)。
-
评估 mitophagy 中细胞的百分比
- 利用线性尺度获取 BV605 与 PE-CF594 点图。用多边形图标在表达 mt-Keima 的细胞周围画一个门, 消除没有表达 mt-Keima 的细胞 (图 3A)。Keima 荧光阳性细胞群称为 "mt-Keima" 门。
- 创建另一个点图 BV605 vs PE-CF594 只显示 "mt-Keima"-门控细胞。在这个点图中, 在未经处理的 mt-Keima 阳性细胞周围画一扇门。控制 HeLa 细胞的基底 mitophagy 活性低, PE-CF594/BV605 的发射率小于1。因此, 这个门被称为 "低" 门。
- 绘制另一个包含 "低" 门区域的门。这个门被称为 "高" 门, 因为它包含高 mitophagy 活动的细胞, 即在 PE-CF594/BV605 中发射率高的细胞 (图 3B)。
- 要计算 "高" 门中单元格的百分比, 请选择 "显示人口层次结构" 菜单。"父百分比" (%Parent) 值表示 mt-Keima 阳性人群中 "高" 门中细胞的百分比。
- 设置至少1万事件记录在 "mt-Keima" 停止门和运行每个样本。
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Representative Results
如图 4所示, CCCP 诱导的 mitophagy 细胞的流式细胞术分析。应用上述流式细胞仪分析方法, 可以检测出 "高" 门 mitophagic 细胞的急剧增加。与未经处理的控制细胞相比, "高" 门细胞的百分比增加了10倍以上 (图 4A)。mitophagy 活动的增加完全被取消了与 bafilomycin A (论坛) 的合作 (图 4A和4B)。
图 1.用流式细胞仪测量 mitophagy 的方法的原理图表示法.该方案概述了用流式细胞仪量化 mitophagy 细胞的主要步骤。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.设置流式细胞仪参数。(A)对活细胞进行门控。在 FSC 和 SSC 图中确定了一个活细胞区域, 以排除死细胞和细胞碎片。(B)使用控制 hela 细胞和 Keima 表达的 hela 细胞, 调整 405 nm 和 531 nm 激光器。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3.用流式细胞仪计算 mitophagic 细胞的比例。(A) Keima 表达的 HeLa 细胞。(B)使用统计工具对 mitophagic 细胞进行浇口和计算比例。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4.流式细胞仪定量测定 HeLa 细胞中 CCCP 诱导的 mitophagy。(A)表达 mt-Keima 的 HeLa 细胞以10µM CCCP 为6小时, 有或不 100 nM bafilomycin A (博鳌)。用 BV605 和 PE-CF594 检测器对细胞进行了分析。(B)选择了高 PE-CF594/BV605 比的细胞 ("高"), 计算了它们的比例。用标准偏差绘制了三次重复实验结果。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在这里, 我们提出了一个快速和灵敏的方法, 使用流式细胞仪来测量细胞 mitophagy 活动在表达 mt Keima。接受高水平 mitophagy 的细胞表现为 PE-CF594 (561 nm)/BV605 (405 nm) 激发的比例增加。因此, mitophagy 活动可以表示为高561/405 比例的细胞百分比。我们计算了 PE-CF594 (561 nm) 与 BV605 (405 nm) 的斑点图中 "高" 门区域内细胞的百分比, 结果表明 CCCP 的治疗导致了 HeLa 细胞 mitophagy 的增加。我们以前证明, 慢病毒北疆介导的 mt Keima 的过度表达并不影响线粒体功能或细胞生理学31。虽然我们的手稿显示, 流式细胞术分析可以成功地检测 CCCP 诱导的 mitophagy 在 HeLa 细胞表达, 这一技术可以应用于任何类型的细胞后引入 mt-Keima。我们以前表明, 缺氧诱发 mitophagy 可以发现在 HeLa 细胞没有异位的29。此外, 以往的研究, 包括我们的和其他组, 表明, mt-Keima 荧光分析可以检测 mitophagy 的主要细胞, 如小鼠胚胎成纤维细胞 (MEFs) 和永生化细胞, 如 HeLa, HEK293 和 SH-SY5Y 细胞28,29,32。
与其他基于显微或免疫印迹法的 mitophagy 检测方法相比, 流式细胞仪检测具有一定的优势, 可以快速、重现性地分析大量细胞31。因此, 在显微镜下的分析中, 研究者的偏倚会扭曲结果, 这种偏倚在使用流式细胞仪检测时不是问题。
流式细胞术分析需要少于 1 x 106细胞。另外, 由于样品的分析只需要一到两分钟, 最多可以在一到两个小时内进行分析。此外, 流式细胞仪检测 mitophagic 细胞的增加具有良好的灵敏度。在我们的流式细胞术分析中, 我们发现在 CCCP 治疗6小时后, mitophagic 细胞增加了10倍。
用流式细胞仪分析 mitophagy 的关键步骤是正确设置 "高" 和 "低" 门, 以区分处于高水平 mitophagy 的细胞。由于基底 mitophagy 水平可以不同, 取决于细胞类型, 设置 "高" 和 "低" 门可能是困难的一些细胞系。在这种情况下, 它有助于包括一个低基底 mitophagy 活动, 如 HeLa 细胞的控制细胞线。此外, 对于用溶酶抑制剂 (如氯喹) 治疗的细胞, bafilomycin a 可以作为低 mitophagy 控制来设置正确的门控。虽然慢病毒通常用于异位表达的有趣的蛋白质, 一些细胞系可能容易感染病毒。如果慢病毒北疆感染本身导致细胞生长或线粒体功能的变化, 应考虑另一种方法 Keima 表达。Keima 的表达水平也会因细胞类型而异。如果 mt-Keima 荧光信号太弱或太不均匀, 只有具有强 mt Keima 荧光信号的细胞可以使用细胞分拣器或 mt-Keima 细胞再用更高浓度的嘌呤霉素抗生素处理数天.Keima 信号的分离细胞是稳定的, 只要细胞是可行的, 但我们建议通过流式细胞术尽快分析样品。
流式细胞仪检测是一种稳健、方便的 mitophagy 分析方法, 但存在一定的局限性。首先, 由于细胞在流式细胞术中应分离为单细胞水平, 因此很难在不改变生理变化的情况下对组织或器官的 mitophagy 进行分析。此外, Keima 荧光在固定后失去了 pH 依赖性的特性, 因此应将所有样品作为活细胞进行分析。这就导致了上面提到的样本存储的限制, 以及在应用额外的免疫荧光染色时的另一个限制。这种技术可以定量地测量 mitophagy 活动, 但它无法监测线粒体形态学或动力学的变化, 这在 mitophagy 过程9中起着重要的作用。研究人员应该牢记 mitophagy 的复杂性和不确定的方面。因此, 为了避免可能的误判, mitophagy 过程应进一步证实, 其他共同的 mitophagy 分析方法的综合结果, 包括电子显微学, 线粒体蛋白周转, 减少线粒体 DNA 和荧光显微镜测量线粒体定位的溶酶体或自噬体, 如前所述33,34,35。任何观察到的 mitophagy 的增加, 也可以通过共聚焦显微镜的细胞表达 mt-Keima 进一步检查。在 mitophagic 细胞中, mt-Keima 表达在一个明亮的点状模式, 高586/440 的比例, 可以观察到共焦显微镜28,29。
由于它能够快速、灵敏地检测 mitophagy, 这种流式细胞仪检测提供了一步逼近, 对各种研究都有价值。通过简单地用 mt-Keima 慢病毒北疆感染细胞, mitophagy 活动的变化可以很容易地在任何期望的细胞类型中测量。结合细胞分选功能, 具有特定水平的 mitophagy 活动细胞可以被具体隔离, 并用于研究 mitophagy 的作用和调控机制。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了韩国国家研究基金会 (2016R1D1A1B03931949) (j.u.) 和韩国政府 (MSIT) (2016R1A2B2008887, 2016R1A5A2007009) 资助的韩国国家研究基金会 (NRF) 赠款的支持。.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| Turbofect | Thermos scientific | R0531 | |
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
| Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP) | Sigma-Aldrich | C2759 | 10 mM |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| EQUIPMENTS | |||
| BD LSRFortessa | BD Bioscience | LSRFortessa | |
| FACSDIVA | BD Bioscience | FACSDIVA (v8.0.1) |
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