Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolation og fluorescens Imaging for enkelt-partikel genopbygning af Chlamydomonas centrioler

Published: September 21, 2018 doi: 10.3791/58109
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Cell Biology, Sciences III, University of Geneva
* These authors contributed equally

Summary

Vi har udviklet en strategi for at rense og billed et stort antal af centrioler i forskellige orienteringer modtagelig for Super-resolution mikroskopi og enkelt-partikel gennemsnit.

Abstract

Centrioler er store makromolekylære forsamlinger vigtigt for korrekt udførelse af grundlæggende celle biologiske processer såsom celledeling, celle motilitet, eller celle signalering. Grønalger Chlamydomonas reinhardtii har vist sig for at være en indsigtsfuld model i studiet af centriole arkitektur, funktion og protein sammensætning. Trods store fremskridt mod forståelse centriolar arkitektur er en af de aktuelle udfordringer at bestemme den nøjagtige lokalisering af centriolar komponenter inden for strukturel regioner af centriole for bedre at forstå deres rolle i centriole Biogenese. En stor begrænsning ligger i løsningen af Fluorescens mikroskopi, hvilket komplicerer fortolkningen af protein lokalisering i denne organelle med dimensioner tæt på diffraktion grænse. For at tackle dette spørgsmål, leverer vi en metode til at rense og billed et stort antal C. reinhardtii centrioler med forskellige orienteringer bruger Super-resolution mikroskopi. Denne teknik giver mulighed for yderligere behandling af data gennem fluorescerende enkelt-partikel gennemsnit (Fluo-SPA) på grund af det store antal af centrioler erhvervet. Fluo-SPA genererer gennemsnit af farves C. reinhardtii centrioler i forskellige retninger, således at lette lokaliseringen af forskellige proteiner i centriolar subregioner. Vigtigst, kan denne metode anvendes på billedet centrioler fra andre arter eller andre store makromolekylære forsamlinger.

Introduction

Centriole er en evolutionært bevarede organelle, der ligger kernen i centrosome i animalske celler og kan fungere som en basal krop (refereret til som centrioler herefter) til skabelon cilia eller flageller i mange eukaryoter1,2. Som sådan er centrioler afgørende for grundlæggende celle biologiske processer lige fra spindel forsamling til celle signalering. Derfor, defekter i centriole forsamling eller funktion er blevet forbundet med flere menneskelige sygdomme herunder ciliopathies og kræft3.

Centrioler er nine-fold, symmetrisk, mikrotubulus triplet-baserede cylindrisk strukturer der er, typisk ~ 450 nm lang og ~ 250 nm bred4,5,6,7. Konventionelle elektronmikroskopi og cryo-elektron tomografi af centrioler fra forskellige arter har afsløret, at centrioler er polariseret langs deres længdeakse med tre forskellige regioner: en proksimal region, en central kerne og en distal region5 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. vigtigere, hver af disse regioner viser strukturelle særegenheder. Først, lumen af 100 nm-lange proksimale regionen indeholder vejrmølle struktur tilsluttet mikrotubulus triplet gennem knappenålshoved element12. Andet, 300-400 nm-lange centrale region indeholder fiber tætheder i funktionerne lumen og strukturelle langs indersiden af mikrotubuli: den Y-formede linker, C-tubulus hale og A-tubulus stub9. Endelig, 50 – 100 nm distale region udstiller sub distale og distale vedhæng, der omgiver den distale del af centriole5,13.

De sidste to årtier har været præget af opdagelsen af et stigende antal centriolar proteiner, fører til en aktuel vurdering af omkring 100 forskellige proteiner er en del af centriole14,15,16, 17. trods disse fremskridt, den præcise lokalisering af disse proteiner inden for centriole er stadig undvigende, især inden for strukturfondene subregioner. Vigtigere, er tildele en præcis lokalisering til strukturelle regioner af centriole afgørende for en bedre forståelse af deres funktion. I denne henseende, har C. reinhardtii centrioler været medvirkende til begge aspekter af første delimitating de forskellige strukturelle egenskaber langs den cylinder9,18,19, som derefter tilladt forskere til at korrelere lokalisering af en delmængde af proteiner ved hjælp af fluorescerende mikroskopi til en sub strukturelle region. Dette omfatter for eksempel, de proteiner, Bld12p og Bld10p, som Lokaliser i den proksimale region og i strukturen vejrmølle især20,21,22,23. Listen over underkonstruktionen lokaliseret proteiner indeholder også POB15 og POC16, to nye proteiner identificeret ved massespektrometri, dekorere regionen indre centrale kerne af C. reinhardtii centrioler17.

Dette papir giver en fuldstændig beskrivelse af den metode, der er udviklet til at isolere og image C. reinhardtii centrioler for efterfølgende super-resolution mikroskopi og enkelt-partikel gennemsnit. For at nå dette mål, er det vigtigt at afgrænse de tekniske begrænsninger, der skal overvindes. Første, centriole rensning kan påvirke den overordnede arkitektur, med vejrmølle strukturen ofte går tabt under de forskellige trin i isolation9. For det andet, dimensioner af centriole er meget tæt på diffraktion grænse i Optisk mikroskopi. Faktisk, den laterale opløsning, der kan opnås i Konfokal mikroskopi er omkring 200 nm24, svarende til diameteren af centriole, og opløsningen i z-akse er omkring 2-3 x lavere, fører til en anisotrope volumen. For det tredje kunne heterogenitet af antistof mærkning og centriole orientering begrænse tolkningen skulle lokalisere en protein i en bestemt centriolar subregion. Endelig findes centrioler i kun to eksemplarer pr. celle, hvilket gør det vanskeligt at erhverve et stort antal billeder og finde en entydig centriole orientering. For at omgå disse tekniske spørgsmål, udviklede vi en metode, der bygger på anvendelse super-resolution mikroskopi på stort antal isolerede centrioler, at vedtager forskellige retningslinjer. Først vil vi beskrive en protokol for at rense C. reinhardtii centrioler, der gør det muligt for rensning af strukturelt intakt centrioler og procentrioles indeholdende vejrmølle. Derefter vil vi beskrive en trinvis protokol for at koncentrere centrioler på coverslips til billeddannelse af konventionelle eller Super-resolution fluorescerende mikroskopi. Dette vigtige skridt giver mulighed for at øge antallet af centrioler afbildet i flere retninger. Endelig vil vi beskrive en procedure for at udføre enkelt-partikel gennemsnit på data erhvervet på fluorescerende mikroskoper, der letter påvisning af centrioler i forskellige retninger. Helt, denne metode kan anvendes på billedet centrioler fra forskellige arter eller andre store makromolekylære forsamlinger.

Protocol

1. medier forberedelse til C. reinhardtii kultur og Centriole Isolation

  1. Forberedelse af medier til kultur C. reinhardtii celler
    Bemærk: Nedenstående trin beskriver fremstilling af stamopløsninger til 1 x TAP (Tris-acetat fosfat) medium.
    1. Forberede en fosfat buffer (pH 7), ved at blande 250 mL 1 M K2HPO4 (174,2 g K2HPO4 suppleres til 1 L med destilleret vand) med ~ 170 mL 1 M KH2PO4 (136.09 g af KH2PO4 i 1 L). Justere blandingen for at nå frem til pH 7.
    2. Forberede løsning en (40 x) ved at blande 96,8 g af Tris, 40 mL af fosfat buffer (pH 7) og 40 mL eddikesyre, og justere løsningen til 1 L med destilleret vand.
    3. Forberede løsning B (40 x) ved hjælp af 16 g NH4Cl, 2 g CaCl2og 4 g MgSO4. Vær omhyggelig med at opløse CaCl2 i destilleret vand separat før du føjer det til de andre komponenter. Justere løsning til 1 L med destilleret vand.
    4. Forberede Hutnerss sporstoffer buffer25 som følger.
      1. For 1 L af buffer, opløse hver sammensatte i den angivne mængde vand: EDTA dinatrium salt (50 g i 250 mL), ZnSO4.7H2O (22 g i 100 mL), H3BO3 (11,4 g i 200 mL), frihedsbevægelse2.4h2O (5.06 g i 50 mL) , CoCl2.6H2O (1.61 g i 50 mL), CuSO4.5H2O (1.57 g i 50 mL), (NH4) 6Mo7O24.4h2O (1,10 g i 50 mL) og FeSO4.7H2O (4,99 g i 50 mL).
        Bemærk: EDTA bør opløses i kogende vand og FeSO4 bør være forberedt sidst at undgå oxidation.
      2. Bland alle løsninger undtagen EDTA og bring i kog. Derefter tilsættes EDTA, og løsningen skal bliver grønne. Efter opløse alt, cool løsning til 70 ° C. Ved denne temperatur, tilsaettes 85 mL hot 20% KOH løsning (20 g i 100 mL). Justere løsning til 1 L med destilleret vand ved stuetemperatur (RT).
      3. Kolben tilsaettes en bomuld plug og lad opløsningen henstår 1 eller 2 uger, ryster det 1 x en dag. Løsningen skulle oprindeligt være grøn og Drej lilla, forlader en rust-brun bundfald; Fjern bundfaldet med filtrerpapir, indtil løsningen er klar. Fryse delprøver og opbevares ved-20 ° C.
    5. Forberede 1 x TAP medium at vokse C. reinhardtii celler ved at blande de følgende komponenter: 25 mL af opløsning A (40 x) og 25 mL af opløsning B (40 x) med 1 mL af Hutnerss sporstoffer buffer25og justere blandingen til 1 L med destilleret vand. Sterilisere blandingen ved hjælp af en 0,4 µm filter.
  2. Media forberedelse til centriole rensning
    1. Forberede en deflagellation buffer bruger 5% saccharose i 10 mM HEPES (pH 7) på en endelige mængden af 500 mL justeret med destilleret vand.
    2. Forberede 250 mL 0,5 M eddikesyre.
    3. Forberede 250 mL af en 1 M K-rør stamopløsning (pH 7,2) af første tilføje 50 mL H2O til rør pulveret opløses, derefter tilføje 10 N KOH indtil løsningen begynder at blive klar. Titreres til pH 7,2 med 10 N og 1 N KOH og justere løsningen på en endelige rumfang 250 mL med H2O.
    4. Forberede 5 saccharose løsninger (w/w) som følger.
      Bemærk: Alle saccharose løsninger skal være filtreret efter oploesning ved hjælp af en 0,4 µm filter sat i en sprøjte. Bemærk at de 60% og 70% saccharose løsninger er vanskeligt at solubilize og anbringes i et vandbad, pre varmet på 60 ° C til lette oploesning. Mix hver 10 min indtil saccharose er helt opløst.
      1. At forberede 25% saccharose, afvejes 25 g saccharose og justere vægt på 100 g ved at tilføje 10 mM K-rør (pH 7,2).
      2. At forberede 60% saccharose, vejer 60 g saccharose og justere vægt 100 g med 10 mM K-rør (pH 7,2).
      3. Forberede saccharose gradient saccharose løsninger. Forberede 40% saccharose ved vejer 40 g saccharose og justere løsning til 100 g med 10 mM K-rør (pH 7,2). På samme måde, forberede 50% (w/w) og 70% (w/w) saccharose.
      4. Gemme løsninger ved-20 ° C. Vær omhyggelig med at resuspend saccharose løsninger ordentligt efter optøning.
    5. Forberede 100 mL lysisbuffer ved at blande 1 mM HEPES (pH 7), 0,5 mM MgCl2, og 1% NP-40 og holde det ved 4 ° C. Altid forberede denne buffer frisk på dagen af forsøget. Tilføje anti-protease tabletter på dagen for centriole isolationen.
    6. Forberede 1 x fosfat buffer saltvand (PBS) (pH 7,4) ved at blande 8 g NaCl, 2 g af KCl, 1.44 g Na2HPO4og 0,24 g KH2PO4 i 800 mL destilleret H2O. Juster pH til 7.4 med HCl. Bring volumen af blandingen til 1 L med destilleret H2O.

2. isolering af C. reinhardtii centrioler

Bemærk: Se figur 1.

  1. Kultur og udvidelse af C. reinhardtii celler
    1. Om aftenen på dag 1, podes en cw15 - stamme fra en solid plade i en kultur Erlenmeyer-kolbe, som indeholder 10 mL af 1 x TAP. Vokse celler under hvide fluorescerende lys (60 µE/m2s) for 2-3 dage ved 23 ° C.
    2. På dag 3, fortyndes kultur 10 x (til 100 mL) i 1 x tryk og dyrke celler under lys for 2-3 dage ved 23 ° C.
    3. Dag 6, fortyndes kultur 10 x 1 x tryk til at opnå 1 L af kultur. Vokse celler under lys ved 23 ° C, indtil kulturen når en mørk grøn farve, der angiver en omtrentlig celle tæthed af ~ 1 x 107 celler/mL26 (dag 9-10).
  2. Rensning af C. reinhardtii centrioler
    1. Der centrifugeres cw15 - cellerne på 600 x g i 10 min. i 50 mL konisk rør. Vaske pellet af celler 1 x med 50 mL af 1 x PBS og spinde det ved 600 x g i 10 min. Resuspend pellet i 100 mL stuetemperatur deflagellation buffer med en pipette.
    2. Deflagellate celler med en pH chok af langsomt tilføje dråber af 0,5 M eddikesyre til et slut-pH på 4,5-4.7 på en magnetomrører, og der inkuberes cellerne for 2 min. tilsættes langsomt dråber 1 N KOH at genoprette pH 7.0.
    3. Der centrifugeres celler på 600 x g i 10 min. til at fjerne enhver fritliggende flageller. Fjern supernatanten og gemme pelleten på is. Vaske pellet 2 x med 50 mL af 1 x PBS forkølede ved 4 ° C. Derefter, dreje pellet ved 600 x g i 10 min. ved 4 ° C.
    4. Resuspenderes i 30 mL PBS, 1 x og langsomt indlæse suspension på en 25%-saccharose pude af 20 mL uden blanding (figur 1B).
    5. Spin ved 600 x g i 15 min. ved 4 ° C for at fjerne de resterende flageller i supernatanten; cellerne spredes i 25% saccharose (figur 1C). Hold kun de dårligste 20 mL (rød pil, figur 1C) ved omhyggeligt sugning supernatanten ved hjælp af en betjent sug.
    6. Vask de resterende 20 mL ved tilsætning af 20 mL koldt 1 x PBS. Spin prøve på 600 x g i 10 min. ved 4 ° C. Resuspenderes i 10 mL koldt 1 x PBS (ved 4 ° C). Sikre, at der er ingen klumper så den følgende lysis hits alle cellerne på én gang.
    7. Overføre den resuspenderede pellet til en ny 250 mL flaske. Der tilsættes 100 mL lysisbuffer suppleret med 5.000 enheder af DNase til cellerne. Det er vigtigt at tilføje lysisbuffer til cellerne, og ikke anden vej rundt. Inkuber blandingen i 1 time ved 4 ° C og bland det forsigtigt af invertere flaske hver 15 min uden at danne nogen bobler.
    8. Der centrifugeres i lysed celler ved 600 x g i 10 min. ved 4 ° C i et 50 mL konisk rør til at fjerne enhver celle debris. Hvis lysis er udført korrekt, celle pellet bør være hvid (fig. 1D). Indsamle supernatanten med en pipette og indlæse det på en 30 mL runde-nederste rør indeholdende et 60%-saccharose pude, placeret på is. Derefter, dreje røret på 10.000 x g i 30 min. ved 4 ° C.
      Bemærk: Flere runde-nederste rør (Tabel af materialer) kan være nødvendig, afhængigt af mængden af supernatanten.
    9. Opsug den supernatanten op til 1 mL ovenfor saccharose pude. Bemærk den gule grænseflade mellem de resterende supernatanten 1 mL og 2 mL af saccharose pude. Forsigtigt blandes saccharose og de resterende supernatanten med cut P1000 spids. Gør ikke vortex på dette trin; ellers, procentrioles kan være tabt på dette stadium. Samle alle saccharose puder og gemme dem på is.
    10. Forberede en 40% - 70% saccharose forløb i en tyndvægget 38,5 mL polypropylen rør ved forsigtigt tilsætning af 3 mL af 70% saccharose (ved 4 ° C), efterfulgt af 3 mL 50%, og endelig 3 mL af 40% saccharose. Indlæse de poolede grænseflader på 40% - 70% saccharose gradient; gør dette langsomt, fordi den kolde saccharose er meget tyktflydende. Balance rør med 10 mM K-PIPES buffer (pH 7,2) og centrifugeres dem ved 68,320 x g (f.eks.med en SW32Ti rotor) for 1 timer og 15 min ved 4 ° C.
    11. Indsamle 12 x 500 µL brøker ved 4 ° C ved at gøre et hul i bunden af røret med en 0,8 mm nål uden at forstyrre de forskellige saccharose lag. Med et snit P200 pipette tip, forberede yderligere 10 µL delprøver fra hver fraktion, der skal bruges for de følgende immunfluorescens. Snap-fryse af brøkdele i flydende kvælstof.
      Bemærk: Isolerede centrioler kan analyseres ved elektronmikroskopi at sikre, at den samlede ultrastruktur af centrioler bevares.

3. kvantificering af isolerede centrioler på Coverslips: centrifugering og immunfluorescens

Bemærk: Se figur 2.

  1. Forberedelse af rør og coverslips
    1. Bruge 1 glas runde-nederste rør (15 mL) per fraktion til at analysere de centriolar fraktioner (12 rør i alt).
    2. Sætte en brugerdefineret coverslip støtte adapter (kaldet adapter herefter) ind i runde-nederste rør. Placer en steril 12 mm coverslip ind i runde-nederste rør.
      Bemærk: Vi brugt her 12 mm coverslips, men protokollen kan tilpasses til 18 mm coverslips ved hjælp af 30 ml runde-nederste rør.
    3. Der tilsættes 5 ml af pre afkølede 10 mM K-rør (pH 7,2) ved 4 ° C. Sørg for, at coverslip ikke er flydende og forbliver ned på adapteren. Sted rør på is.
  2. Centrifugering af centrioler
    1. Fortynd hver 10 µL fraktion med 100 µL koldt 10 mm K-rør (pH 7,2). Resuspend fortynding godt indtil den fuldstændige forsvinden af saccharose (fig. 2A). Læg hver fortyndet fraktion i en runde-nederste rør.
    2. Spin tube på 10.000 x g i 10 min. (f.eks.med en JS-13.1 swingende spand rotor) ved 4 ° C.
    3. Genskab coverslip ved at indsætte en håndlavet hooked enhed i hullet i den slidsede kant af adapteren og løft forsigtigt.
      Bemærk: Håndlavede hooked enheden kan gøres med sprøjte nål manuelt hooked og støbt på en hjemmelavet stick (tal 2B-2D).
    4. Efter at have nået toppen af den runde-nederste rør, fælde kanten af adapter med en behandsket finger og fjerne coverslip med pincet. Vær omhyggelig med at huske, hvilken side af coverslip indeholder centrioler. Gå videre til at behandle coverslips for immunfluorescens.
  3. Immunfluorescens farvning og imaging af isoleret C. reinhardtii centrioler
    Bemærk: Se figur 2.
    1. Forberede materiale til immunofluorescens farvning som følger.
      1. Forberede en cover-glas farvning rack i en krystal polystyren transmission lab boks (60 mm, længde 50 mm i bredden af 43 mm i højden). Fyld den med 100% methanol og opbevar den ved-20 ° C.
      2. Forberede et fugtigt kammer. For dette, samle den fugtkammer ved at placere en vand-fugtet væv sammen med indvendigt kanter af en firkant petriskål (figur 2E). Tilføje et stykke af laboratoriet forsegling wrap (Se Tabel af materialer) til midten af petriskålen som antistof blander vil blive placeret under immunofluorescens procedure (trin 3.3.2–3.3.3). Dække låg og fugtigt kammer med aluminiumsfolie at beskytte den mod lyset.
    2. Immunostain de isolerede centrioler som følger.
      1. Lave coverslips med centrioler direkte efter centrifugering (trin 3.2.4) ved at inkubere dem i 5 min i boksen fyldt med-20 ° C methanol (trin 3.3.1.1).
      2. Fjern coverslips med pincet og læg dem i en gennemsigtig laboratorium boks (Se Tabel af materialer) fyldt med 50 mL af 1 x PBS og vaske dem i 5 min ved stuetemperatur.
      3. Med pipette udtages 60 µL af primære antistof mix [primære antistoffer fortyndet i 1% bovint serumalbumin (BSA) og 0,05% Tween-20 i PBS] på stykket af laboratoriet forsegling wrap i fugtigt kammer. Omhyggeligt lægge coverslips på toppen af antistof mix med centrioler direkte ud mod henlægge. Inkubér coverslips for 45 min med primære antistoffer.
        Bemærk: De primære antistoffer, der blev brugt til at generere de repræsentative resultater er kanin polyklonale Bld12 (1: 300) og mus α-tubulin (DM1A) (1: 300).
      4. Fjerne coverslips og vaske dem i 5 min i 1 x PBS, som beskrevet i trin 3.3.2.2. Inkubér coverslips for 45 min med sekundære antistoffer i PBS, som indeholder 1% BSA og 0,05% Tween-20.
        Bemærk: De sekundære antistoffer, der blev brugt til at generere de repræsentative resultater er ged anti-mus koblet til Alexa 488 (1:1, 000) og ged anti-kanin koblet til Alexa 568 (1:1, 000).
      5. Fjerne coverslips og vaske dem i 5 min i 1 x PBS, som beskrevet i trin 3.3.2.2.
    3. Montere en coverslips på et glas dias ved at tilføje 3 µL af montering medium på diaset og omhyggeligt placere coverslips på toppen (centrioler vender montering medium). Forsegle coverslip kanten med neglelak.
    4. Billede af isolerede centrioler på en Konfokal mikroskop på en 63 X olie mål med en N.A. 1.4 mens anvendelse deconvolution27 (Se Tabel af materialer).
      Bemærk: Her følgende indstillinger blev brugt: 500-545 nm for Alexa 488 og 580-635 nm for Alexa 568.

4. koncentrationen af centrioler på midten af Coverslips

Bemærk: Se figur 3.

  1. Materielle forberedelse
    1. Forberede en 15 mL runde-bunden glasrør på is, en brugerdefineret coverslip støtte adapter (kaldet adapter herefter .stl fil leveres som supplerende fil 1), en brugerdefineret koncentrator (.stl fil som supplerende fil 2) og 10 mM K-rør (pH 7.2) ved 4 ° C.
    2. Forberede poly-D-lysin (PDL)-belagt coverslips. Fortyndet 10 x 1 mg/mL PDL stamopløsningen med H2O. Første, vask coverslips med 70% EtOH, Fjern ethanol, og lad coverslips tørre. Pels coverslips med PDL og Inkuber dem i 30 min. ved stuetemperatur. Vask coverslips 3 x med vand og lad dem tørre.
      Bemærk: Pels coverslips med PDL at øge antallet af isolerede centrioler knyttet til coverslips.
  2. Centrifugering
    1. Placer en steril 12 mm coverslip ind på den forsænkede, nederst koncentrators, holde PDL frakke med forsiden nedad. Cap coverslip ved at placere adapteren direkte på toppen. Invertere runde-nederste rør og Placer det over koncentrator, coverslip og adapter.
    2. Forsigtigt skubbe ensemblet med pincet, indtil den når bunden af den runde-nederste rør, og vend røret. Tilføje 10 mM K-PIPES buffer (pH 7,2) til den runde-nederste rør, indtil det kommer til toppen af koncentratoren. Sørg for, at der ikke er nogen bobler i den centrale cylinder med koncentratoren.
    3. Forsigtigt tilføje 100 µL af 10 mM K-PIPES buffer (pH 7.2) til en alikvot del indeholdende beriget centriole fraktion og blandes grundigt volumen.
    4. Fjern 100 µL af 10 mM K-PIPES buffer (pH 7,2) fra byens hule koncentratoren og tilsæt 100 µL af den berigede centriolar fraktion i 10 mM K-PIPES buffer (pH 7,2) til byens hule koncentrator, pasning, at indholdet forbliver i den hule center.
    5. Der centrifugeres ved 10.000 x g i 10 min. (f.eks.med en JS-13.1 swingende spand rotor) i en pre afkølede centrifugeres ved 4 ° C.
    6. Fjerne koncentratoren med pincet.
    7. Genskab coverslip ved at indsætte en håndlavet hooked enhed i hullet i den slidsede kant af adapteren og løft forsigtigt. Efter at have nået toppen af den runde-nederste rør, fælde kanten af adapter med en behandsket finger og fjerne coverslip med pincet. Vær omhyggelig med at huske, hvilken side af coverslip indeholder centrioler. Gå videre til at behandle coverslips for immunfluorescens.
      Bemærk: Håndlavede hooked enheden kan gøres med en sprøjte nål manuelt hooked og støbt på en hjemmelavet stick (Tal 2B-D).
    8. Udføre fiksering og immunfluorescens farvning af koncentreret centrioler som gjort i skridt 3.3.2–3.3.4.

5. enkelt-partikel gennemsnit

Bemærk: Se figur 4.

  1. Imaging for enkelt-partikel gennemsnit
    1. Montere en coverslip på et dias ved hjælp af en regelmæssig anti-fading montering medium. Udføre struktureret belysning mikroskopi (2D SIM) billeddannelse ved hjælp af en CFI Apochromat JOHANNAS mål (100 X, NA 1,49, WD 0,12 mm) og en back belyste EM CCD kamera.
      Bemærk: Erhvervelse tid blev sat til 100 ms på et kamera, læse ud af 3 MHz. En 2,5 X linse blev brugt til SIM-billeddannelse.
      Bemærk: Datasættet præsenteres her var erhvervet på et 3D-SIM mikroskop (Se Tabel af materialer).
    2. Billede centrioler ved at erhverve en stor stak billeder bestående af den samlede centriole signal, ved at konfigurere den øverste og nederste position af Z-stakken ovenfor og nedenfor centriole signal, henholdsvis. Fortsæt til projekt stakken og udføre enkelt-partikel gennemsnit pr. trin 5.2 og 5.3.
  2. Projektion af en stak
    1. Åbn billedstak med ImageJ. Klik derefter på 'Image → stakke → Z projekt'. Angive typen projektion somMax intensitet'.
    2. Invertere billedet ved at klikke på 'redigere → inverter'. Gem den fremskrivning, der genereres (.tif format).
  3. Enkelt-partikel justering med Scipion
    1. Oprette et nyt projekt i Scipion ved at trykke på røde 'Opret projekt' knappen øverst på siden. På venstre panel, skal du dobbeltklikke på 'import → Importer micrographs'.
    2. Fylde de 'filer bibliotek' og 'mønster ' felter ifølge data bibliotek og navne. Holde standardparametrene. Klik på 'Udfør'.
    3. Dobbeltklik på 'Partikler → pluk → xmipp3 - manual picking (trin 1)'. Klik på forstørrelsesglasikonet tæt på feltet 'Input micrographs' og vælg de importerede micrographs trin 5.3.1. Klik på 'Udfør'.
    4. Vælg partikler fra de forskellige micrographs ved at klikke på dem i det nyåbnede vindue. Når du er færdig med alle Mikrograf, klik på den røde knap '+ koordinerer'.
    5. Dobbeltklik på 'Partikler → ekstrakt → xmipp3 - ekstrakt partikler'. Klik på forstørrelsesglasikonet tæt på feltet 'Input koordinater' og vælg de plukkede koordinater fra trin 5.3.4. Udfyld 'Boks partikelstørrelse (px)' efter partikler dimensioner. I fanen 'Forbehandl' indstille Afstøvende: ingen (det kan skabe artefakter); Invertere kontrast: ingen (sorte partikler, hvid baggrund); Fase flipping: Nej (knyttet til CTF korrektion); Normalisér: Ja.
    6. Klik på 'Udfør'. Når jobbet er gjort, kontrollere de udpakkede partikler ved at markere boksen job (grænser bliver tykkere) og klik på 'analysere resultater (nederst til venstre i hovedmenuen).
    7. Dobbeltklik på '2D → Juster → xmipp3 - Juster med cl2d'. Klik på forstørrelsesglasikonet tæt på feltet 'Input partikler' og vælg de udpakkede partikler fra trin 5.3.5. Brug ikke en referenceafbildning. Klik på 'Udfør'.
    8. Dobbeltklik på ' 2D → Juster → flere → xmipp3 - anvende justering 2d'. Klik på forstørrelsesglasikonet tæt på feltet 'Input partikler' og vælg de justeret partikler fra trin 5.3.7.
    9. Klik på 'Udfør' som i trin 5.3.6. Resultaterne kan kontrolleres ved at klikke på 'Analysere resultater' efter udvælgelsen af boksen job.
    10. Dobbeltklik på 'Partikler → maske → xmipp3 - anvende 2d maske'.
    11. Klik på forstørrelsesglasikonet tæt på feltet 'Input partikler' og vælg de justeret partikler fra trin 5.3.9. 'Maske kilde' er indstillet til 'Geometri'. Derefter skal du indstille parametrene i masken som maske type: cirkulær; Radius (px): Leder du efter en partikel (en centriole) uden noget omkring det, klik på den 'tryllestav ' ikonet til venstre, der åbner et vindue for at hjælpe med at finde den perfekte værdi; Skift Center: Nej (hvis partiklen er perfekt centreret) eller Ja (hvis partiklen er flyttet); X-center offset: ifølge partikel holdning; Y-center offset: ifølge partikel holdning. Klik på 'Udfør'.
    12. Brug knappen ' analysere resultater ' til at kontrollere hvis masken anvendes korrekt. Hvis ikke, skal du højreklikke på 'Anvend maske 2d' job og vælge 'Rediger'. Ændre parametrene for maske (størrelse og/eller Skift) og Kør det igen med "Udfør" knap.
    13. Dobbeltklik på '2D → klassificere → xmipp3 - cl2d'.
    14. Klik på forstørrelsesglasikonet tæt på feltet 'Input partikler' og vælg de maskerede partikler fra trin 5.3.11. Antallet af klasser bør være at opnå ca 50 partikler pr. klasse. Klik på 'Udfør'.
    15. Tjek resultaterne ved at klikke på knappen ' analysere resultater ' . I det åbnede vindue, skal du klikke på øjeikonet lige ved siden af "Hvad at vise" .
    16. Det nye vindue giver mulighed for inspektion af de genererede klasser ved at vælge 'Classes2D' i menuen 'Blok' . Kontrollere indholdet af hver klasse ved at vælge 'Class00N_Particles' i den samme menu. Inspicere hver klasse for at identificere hvilke indeholder kun dårlige partikler. Gå tilbage til visningen 'Classes2D' og vælg klasser med god partikler ved at klikke på hver. Det er muligt at vælge flere klasser ved at holde 'Ctrl' tasten nede under udvælgelsen.
    17. Når alle klasser med god partikler er valgt, klik på '+ partikler' til at oprette en delmængde med disse partikler.
    18. Vælg et par sæt af klasser, der repræsenterer forskellige orienteringer af partikler i det samme vindue. Opret en ny delmængde ved at klikke på "+ gennemsnit".
    19. For hver orientering/gennemsnit valgt, gøre som følger.
      1. Dobbeltklik på '2D → Juster → xmipp3 - Juster med cl2d'.
      2. Klik på forstørrelsesglasikonet tæt på feltet 'Input partikler' og vælge de gode partikler fra skridt 5.3.17. Angiv 'Brug en referenceafbildning' til 'Ja'. Klik på forstørrelsesglasikonet tæt på feltet 'Reference billede' og klik på hvid pil venstre til den 'Oprette undersæt' job fra trin 5.3.18 og Vælg billede til at bruge den som reference. Dobbeltklik på et objekt for at åbne det i et separat vindue og check hvilket objekt det er. Klik på 'Udfør'.
      3. Dobbeltklik på ' 2D → Juster → flere → xmipp3 - anvende justering 2d'. Klik på forstørrelsesglasikonet tæt på feltet 'Input partikler' og vælg de justeret partikler fra skridt 5.3.19.2.
      4. Klik på 'Udfør'.
      5. Check resultatet af justeringen ('Analysere resultater '); det vil vise de justeret partikler og gennemsnittet af disse partikler.
      6. Hvis gennemsnittet er god og partikler er alle orienteret ens, gemme gennemsnittet ved at klikke på ' avancerede → ImageJ' og gemme billedet med ImageJ.
      7. Hvis gennemsnitlige kan forbedres, vælge alle de billeder, der er godt orienteret og oprette en ny undergruppe med knappen '+ partikler' . Gentage trin 5.3.19.1–5.3.19.4, indtil delmængden er renset (alle dårlige partikler fjernes). Hver gang er justeringen udført (trin 5.3.19.2), referencen angives til den sidste genererede gennemsnit (fra iteration til iteration, de gennemsnitlige kvalitet stigninger).

Representative Results

C. reinhardtii Centriole Isolation:
For at isolere centrioler, cw15- C. reinhardtii celler blev dyrket i flydende kultur i flere dage under lys og efterfølgende pelleted ved centrifugering ved 600 x g i 10 min. Pelleted celler blev vasket 1 x med PBS og resuspenderet i en deflagellation buffer forud for deflagellation ved at udføre en pH chok ved hjælp af 0,5 M eddikesyre til et slut-pH på 4,5-4.7 for 2 min(figur 1). Tilføjelse af 1 N KOH blev brugt til at genoprette pH 7.0. For at adskille fritliggende flageller fra celle organer, blev deflagellated celler først centrifugeres for at fjerne hovedparten af flageller. Bundfaldet blev så vasket 2 x med PBS og genopslemmes i 30 mL PBS forud for lastning det langsomt på en 25%-saccharose pude (figur 1B). Røret blev spundet på 600 x g i 15 min. ved 4 ° C til at fjerne de fleste af de fritliggende flageller. Efter centrifugering, celle organer blev spredt i saccharose pude (figur 1C) og inddrives ved at fjerne den ca. 30 mL af supernatanten (indtil den røde pil i figur 1C). Den resulterende 20 mL af vasket celler blev derefter genopslemmes i 20 mL koldt PBS og centrifugeres ved 600 x g i 10 min. Næste, supernatanten blev kasseret, og cellerne var helt genopslemmes i 10 mL PBS. Cellerne blev overført til en 250 mL flaske og lysisbuffer blev føjet til de resuspenderede celler på én gang. DNase blev føjet til lysis og inkuberes i 1 time ved 4 ° C. Efter centrifugering skridt til at fjerne celle debris (se den hvide pellet i figur 1D), supernatanten blev indsamlet og omhyggeligt læsset på en 2 mL 60%-saccharose pude inden centrifugering ved 10.000 x g i 30 min. ved 4 ° C. Bemærk, at for 100 mL lysis, 8 rør på 15 mL blev brugt til at udføre dette trin, svarende til 12,5 mL lysisbuffer indlæst på 2 mL af saccharose pr. rør. Efter centrifugering, de fleste af supernatanten blev fjernet op til 1 mL over puden. Resterende supernatanten 1 mL blev derefter indsamlet med 2 mL pude og derefter blandes og samles for at opnå en endelige mængden af 24 mL. Poolen blev derefter læsset på en 40% - 50%-, 70%-saccharose gradient og spundet på 68,320 x g i 1 h og 15 min. ved 4 ° C. Endelig, de isolerede centrioler blev indsamlet ved at gøre et hul i den nederste del af centrifugering røret ved hjælp af en nål og dråberne blev indsamlet i 12 x 500 µL fraktioner. På grund af den høje koncentration af de forskellige saccharose, drop dannet meget langsomt i begyndelsen (70% saccharose) og så mere hurtigt (40% saccharose).

Immunfluorescens af isolerede centrioler
For at vurdere kvaliteten af proceduren isolation, blev 10 µL af hver indsamlet gradient fraktion derefter centrifugeres på en coverslip ved hjælp af en coverslip støtte adapter (figur 2A-2D). Vigtigere, for at fjerne sikkert coverslip, en brugerdefineret hooked enhed var designet (figur 2B). Næste, coverslips blev analyseret ved immunfluorescens. Antistoffer mod CrSAS-6(Bld12p) blev brugt i denne undersøgelse til at indikere tilstedeværelsen af vejrmølle struktur og α-tubulin (DMA1) til at fremhæve den centriolar væg. Ved at tælle antallet af centrioler, der var positive for både CrSAS-6 og α-tubulin per synsfelt og derefter beregning af det samlede antal centrioler pr. brøker, var det muligt at fastslå, hvilke fraktioner var beriget til isolerede centrioler ( Figur 2F-2 H). Interessant, var 6 fraktioner beriget til centrioler (figur 2F og 2 G, brøker #1 – 6), med et højdepunkt for brøkdel #3, mens de sidste fraktioner var ikke, som angiver, at rensning arbejdede. Bemærk, at i denne særlige eksperiment, 95% af de samlede centrioler var positiv for CrSAS-6 og α-tubulin i brøkdel #3. Dette indikerer, at mest isolerede centrioler beholdt deres vejrmøller. Hvis ingen berigelse af centrioler er iagttaget i de første brøkdele, isolation procedure virkede ikke og bør gentages. Bemærk at nogle flagellaternes stykker kan iagttages for det meste i brøker centrioler.

Næste, hvis du vil beregne det samlede antal centrioler pr. µL, antallet af centriole pr. synsfelt skal ganges med forholdet som præsenteret i figur 2H. Det resulterende tal skal divideres derefter med omfanget af den brøk, der anvendes for immunofluorescens for at få antallet af centrioler pr. µL. I denne særlige isolation procedure indeholdt den mest beriget brøkdel omkring 37 centrioler for et område med 0.00846 mm2 (med et synsfelt på 92 x 92 µm2). Overfladen af afsnittet tube var 7,5 mm radius med et samlet areal på 176 mm2. Tilsvarende forholdet blev derefter 176/0.00846 = 20,803.8, så alt 769,740 centrioler (37 x 20, 803.8) i 10 µL. Derfor blev antallet af centrioler i 1 µL 76,974.

Koncentrationen af isolerede centrioler på Coverslips:
Øge antallet af centrioler pr. felt øger chancen for påvisning af utvetydig centriole orientering, samt øge chancen for at afsløre ens retningslinjer, der kan bruges til yderligere partikel gennemsnit procedurer. Som centrioler fra de koncentrerede fraktioner er stadig sparsomme på coverslip, udviklet vi en centrifugering tilbehør for at koncentrere centrioler i midten af coverslip (fig. 3A) opkaldt en koncentrator. Bemærk, at en .stl fil med de præcise foranstaltninger for 3D-udskrivning er forsynet med dette håndskrift.

Først, en coverslip af 12 mm var monteret på koncentrator (fig. 3B). Adapteren var anbragt oven på coverslip og runde-nederste rør blev omvendt og placeret over den forsamlede adapter og koncentrator. Runde-nederste rør blev derefter forsigtigt omvendt, således at indlæsning af prøven (protokol trin 4.2). Centrioler blev derefter centrifugeres ved 10.000 x g i 10 min. ved 4 ° C. Efter at centrioler underkastes immunofluorescens og farves CrSAS-6/Bld12p og α-tubulin (figur 3 c-3E). Vigtigere, uden koncentrator, blev ca. 30 centrioler set per synsfelt (figur 3C), mens 183 centrioler blev set per synsfelt, når koncentratoren, der blev brugt (figur 3D-3F). Bemærk at centrioler dækkede kun en disk af 4 mm i diameter i midten af coverslip. Dette resultat viser, at koncentration trin virker og giver mulighed for en 6-fold berigelse af centrioler i et defineret område af coverslips, således lette deres registrering og billeddannelse.

Fluorescerende enkelt-partikel gennemsnit af isolerede C. reinhardtii centrioler:
Her, ved hjælp af SIM-mikroskopi, der kan nå en opløsning på omkring 120 nm, centrioler farvet for monoglutamylated tubulin (GT335, figur 4), en tubulin ændring findes i centriolar mikrotubuli, blev afbildet24. C. reinhardtii centrioler er omkring 500 nm lang, altid parvis, og ofte fundet med forbundet, nyligt duplikeret probasal organer (refereret til som procentrioles herefter) og tværstribede mikrotubulus-associerede fibre19. Derfor, denne endelige samling var ca. 1 µm store. Af denne grund, og for at billedet centrioler i deres helhed, anbefaler vi erhverve en Z-stack på de isolerede centrioler.

Her, efter overtagelsen, blev en endelige billede genereret ved at udføre en maksimal intensitet projektion ved hjælp af ImageJ28 (billedet/stabler/Z projekt/max intensitet projektion, fig. 4B). En enkelt-partikel analyse ved hjælp af cryo-electron microscopy software blev udført for at gøre klasser af centrioler med lignende retningslinjer fra sådanne billeder, og derefter i gennemsnit blev udført. For at gøre det, var billedfarve først omvendt for at bedre visualisere objekter (fig. 4C). Centrioler blev plukket manuelt i en box centreret over hver partikel ved hjælp af den frit tilgængelige Scipion software29 der integrerer flere elektronmikroskopi software-programmer såsom Xmipp3 (figur 4D). Bemærk, at størrelsen på boksen skal defineres af brugeren. Her, kasser med 50 x 50 pixel for pixelstørrelse af 31.84 nm blev brugt. Næste, alle partikler blev udvundet (figur 4E) og justeret ved hjælp af Xmipp3 (fig. 4F). Næste, en cirkulær maske på 12 pixel i radius blev anvendt for at isolere hvert centriole fra centriolar-par (fig. 4G). Partiklerne blev derefter klassificeret, ved hjælp af Xmipp3, til at generere flere gennemsnit. Kun blev homogen klasse gennemsnit holdt, hvilket betyder, at partikler, der afviger fra de klasse gennemsnit udelukkede manuelt. Dette skridt blev gentaget for at generere en næsten perfekt gennemsnit for hver valgte orientering. Efter fem gentagelser, to klasser af gennemsnit blev genereret: en top Se fra 63 objekter (figur 4H) og en side udsigt fra 98 partikler (figur 4jeg) af monoglutamylated centrioler. Dimensioner af objektet blev bestemt ved at måle afstanden mellem toppene af intensitet plot profil langs monoglutamylation signal.

Vigtigere, længden af sideudsyn klasse gennemsnit er 260 nm med en diameter på 250 nm, sammenlignes med det målte monoglutamylated tubulin signal, som blev vist til at lokalisere en region af 286 ± 33 nm længde i kernen af centriole17.

Figure 1
Figur 1 : Rensning af C. reinhardtii centrioler. (A) Dette er en skematisk gengivelse af hvert trin fører til isolation af C. reinhardtii centrioler. Det omfatter repræsentative trin af før-protokollen (B) og (C) efter centrifugering på 25%-saccharose gradient. Den røde pil i panelet C angiver den mindste volumen at holde efter centrifugering. (D) dette panel viser den hvide pellet mængden celler efter centrifugering. Den sorte pil angiver pelleten. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 2
Figur 2 : Centrifugering set-up til at udføre immunofluorescens på isoleret centrioler. (A) 10 µL af hver indsamlet fraktion er fortyndet først i 100 µL af 10 mM K-rør (pH 7,2). (B) Dette er en skematisk fremstilling af centrifugering enheder, som omfatter en 15 mL runde-nederste rør, en 12 mm coverslip, en adapter til coverslip, og en skræddersyet hooked enhed til at inddrive coverslip efter centrifugering. Paneler C og D viser tegninger forklarer hvor hen til genoprette coverslip efter centrifugering. (C) sted værktøjet hooked ind i hullet i den slidsede kant af adapteren og (D) træk forsigtigt. (E) disse er billeder af fugtkammer kræves for at udføre immunofluorescens billeddannelse. Pilen angiver 12 mm coverslip. (F) disse er repræsentative Konfokal billeder på 63 X (zoome 2) af gradient fraktioner #1-8, indsamlet under proceduren rensning og farves CrSAS-6 (rød) og α-tubulin (grøn). Mellemværker svarer til regionen angivet med en hvid boks i visningerne lavere forstørrelse. Skalalinjen = 10 µm. (G) Dette er en graf, der repræsenterer antallet af centrioler positive for både CrSAS-6 og α-tubulin per synsfelt i hver fraktion. Bemærk berigelsen i fraktioner #1-6. Det gennemsnitlige antal centrioler pr. felt i hver fraktion: #1 = 16,3 ± 4.7, #2 = 24.0 ± 4,6, #3 = 37.0 ± 17,0, #4 = 23,3 ± 11.4, #5 = 14.3 ± 2.1, #6 = 13,7 ± 9.3, #7 = 2,7 ± 1,2, #8 = 1,0 ± 0,0, #9 = 1,0 ± 0,0, #10 = 0.0 ± 0,0, #11 = 0,3 ± 0,6, #12 = 0.0 ± 0,0. For hver fraktion, blev 3 tilfældige felter afbildet. Bemærk, at når tælle de mest beriget brøkdel #3, fandt vi, at 95% af centrioler er positiv for CrSAS-6 og α-tubulin (n = 205 centrioler). (H) A forholdet mellem antallet af centrioler i det målte område af micrographs bruges til at beregne det samlede antal af centrioler i området i røret. Centriole antal pr. µL kan beregnes ud fra 10 µL oprindeligt centrifugeres fraktioner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 3
Figur 3 : Isolerede centrioler er centrifugeres ved hjælp af koncentratorer. (A) dette panel viser centrifugering enheder skulle koncentrere centrioler på coverslips før immunofluorescens, herunder en 15 mL runde-nederste rør, en koncentrator, en 12 mm coverslip og en støtte adapter apparater. (B) dette panel viser de skridt til at samle centrifugering enhed. Paneler C-E viser Konfokal billeder af centrioler farves til CrSAS-6 (rød) og α-tubulin (grøn) (C) uden eller (D-E) med koncentratoren. Mellemværker svarer til regionen angivet med en hvid boks i visningerne lavere forstørrelse. Skalalinjen er 10 µm. Bemærk at centrioler er beriget i midten af coverslip (den prikkede linje repræsenterer grænsen af det koncentrerede område). (F) dette diagram repræsenterer antallet af centrioler per synsfelt uden og med koncentratoren. Fem tilfældige felter synspunkt blev analyseret. Det gennemsnitlige antal centrioler er, uden koncentrator, 29.8 ± 2.9, og med koncentrator, 182.6 ± 11,5, P < 0,0001. Den statistiske signifikans blev vurderet af en uparret t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Enkelt-partikel gennemsnit på isolerede C. reinhardtii centrioler. (A) dette panel viser Z stak billeder af centrioler farves med GT335 og anskaffes ved hjælp af en SIM mikroskop. (B) disse paneler viser en maksimal intensitet Z projektion af de stablede billeder. Skalalinjen = 1 µm. (C) disse paneler viser et repræsentativt billede med en inverteret kontrast. Indsatsen repræsenterer en zoom-i at visualisere centrioler bedre. (D) disse paneler Vis partiklen plukke. Indsatsen angiver, hvordan partikler blev plukket. (E) det er eksempler på 5 udvundet partikler. (F) dette panel viser partikler efter justering. (G) dette panel viser partikler efter anvender en maske. Paneler H og jeg viser to klasse gennemsnit: (H) en top view (63 partikler) og (jeg) en sideudsigt (98 partikler). Dobbelt pilene angiver dimensionerne af GT335 signal. Skalalinjen = 250 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Supplerende fil 1. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Discussion

En af udfordringerne i biologi er at dechifrere det nøjagtige lokalisering af proteiner i en arkitektonisk kontekst. Centriole er en ideel struktur at anvende disse metoder, som dens arkitektur er blevet undersøgt ved hjælp af cryo-elektron tomografi, afslørende interessante ultrastrukturelle træk langs dens længde. På grund af sine dimensioner tæt på opløsning grænse i Optisk mikroskopi, er det imidlertid vanskeligt at lokalisere netop et protein ved immunfluorescens til en strukturel underregion af centriole ved hjælp af konventionelle mikroskoper30.

Opløsning i Optisk mikroskopi er begrænset af diffraktion af lys, der giver nogenlunde, lateral maksimal opløsning på 200 nm i Optisk mikroskopi24. Denne begrænsning har imidlertid været omgås ved en af de store gennembrud i de sidste 20 år i Optisk mikroskopi: opfindelsen af super-resolution metoder. Disse tilgange kan billedet over diffraktion grænser på forskellige beslutninger: 120 nm for SIM, omkring 50 nm for stimuleret emission udtynding (STED) og 20 – 40 nm for enkelt-molekyle lokalisering mikroskopi (SMLM)24. Med disse nye udviklinger super-resolution mikroskopi er de strukturelle subregioner af centriole opnåelige. I praksis er det imidlertid stadig vanskeligt at præcist bestemme lokalisering af et protein til et strukturelt element til hovedårsagen til, at de modne centrioler findes i kun 2 eksemplarer pr. celle og har tilfældige retningslinjer, hvilket gør fortolkningen af lokalisering vanskeligt. Derfor, blev en protokol, der oprettet som gør det muligt for forskere at billede af super-resolution et stort antal centrioler, øge chancen for at observere ikke-tvetydige retningslinjer. Vigtigere, da denne metode er baseret på brugen af isolerede centrioler, vi leverer en metode til at rense intakt C. reinhardtii centrioler, der indeholder modne centrioler og procentrioles.

Endelig, på grund af vifte af centriole retningslinjer, der kan være afbildet med denne protokol, enkelt-partikel analyse kan anvendes ved hjælp af elektronmikroskopi software. Dette resulterer i generation af gennemsnitlige klasser af centrioler i en bestemt retning. Vigtigere, kan disse fremkomne 2D-billeder derefter bruges til at vurdere lokalisering af et specifikt protein langs centriole. Denne metode kan anvendes på billeder med dual-farve Super-opløsning, og en farve kan bruges til at afsløre centriole skelettet (fx, tubulin), mens anden farven kan henføres til en specifik centriolar protein. Ved at fratrække de gennemsnit opnået med én farve eller to farver, bliver det lettere at registrere et protein langs centriole (proksimale, central eller distale). Bemærk at de to kanaler skal justeres nøjagtigt for at undgå eventuelle vildledende fortolkninger. Derudover vil gennemsnit af top synspunkter hjælpe dechifrere hvis et protein lokaliserer inde centriolar lumen, langs en mikrotubulus væg, eller uden for centriole.

Denne metode har fordelen at fastslå lokalisering af specifikke proteiner, der kunne være svært at lokalisere ellers på grund af heterogene mærkning. Bemærk, at andre metoder til at kortlægge proteiner inden for centrioler er beskrevet korrelationsmaalinger 3D-SIM/SMLM med, for eksempel vurdering af de specifikke retningslinjer for centrioler ved at bestemme de elliptiske profil af en markør, der danner en torus omkring den centriole af SIM-billeddannelse. Med denne parameter, er det muligt at lokalisere protein med en præcision på 4 – 5 nm30. Bemærk også, at den beskrevne metode her bruger isolerede centrioler med intakt procentrioles, et tegn på, at centriole arkitekturen er sandsynligvis i vid udstrækning bevaret. Men vi kan ikke udelukke der nogle arkitektoniske træk er forstyrret under rensningen, såsom centriole diameteren varierer med koncentrationen af divalent kationer, som forstærkes med isolering af den menneskelige centrosome5.

En af de kritiske trin i protokollen præsenteres her er at få tilstrækkelig koncentreret isolerede centrioler i forskellige orienteringer imødekommenhed over for Fluo-SPA. Det gør du ved først sikre renheden og effektiviteten af proceduren centriole isolation. En lav koncentration af isolerede centrioler vil forhindre korrekt imaging og yderligere billedbehandling. Til dette formål leverer vi en metode til at berige antallet af centrioler per synsfelt. Afhængigt af antallet af centrioler i den brøk, der anvendes, skal lydstyrken indlæst i koncentratoren, der justeres, med en maksimal volumen på 250 µL.

Vigtigst, er denne metode blevet udviklet til en cellevæg minus cw15-C. reinhardtii celler. I denne stamme, skrøbelighed af cellevæggen giver mulighed for en ordentlig lysering af celler og dermed, befrielsen af dens indhold. Denne protokol er ikke effektive for wild-type C. reinhardtii celler, som cellevæggen forhindrer en ordentlig lysering. Alternative strategier såsom sonikering eller en præ-inkubation af celler med autolysin, et enzym, der kan forringe cellevæg31, skulle sættes på plads til at ændre cellevæg før isolation protokollen præsenteres her.

Denne opsætning kan bruges med forskellige typer mikroskoper, lige fra konventionelle Konfokal mikroskoper til høj overførselshastighed dedikeret super-resolution mikroskoper. Bemærk, at når du laver SMLM, en speciel buffer er nødvendig for korrekt imaging og således et kammer, der er tilpasset til en 12 mm coverslip med buffer oven på coverslip skal bruges. Efterfølgende billedbehandling vil blive udført med inverterede mikroskoper. Hvis mikroskop set-up ikke tillader en 12 mm coverslip, kan protokollen præsenteres her anvendes på 18 mm coverslips ved hjælp af et 30 mL runde-nederste rør og en modificeret adapter og koncentrator. Det er også vigtigt at Bemærk at kvaliteten af den endelige genopbygning i SMLM vil afhænge af kvaliteten af farvning og af det primære antistof bruges som metode til fiksering.

I sammendrag leverer vi en metode, der kan anvendes til billede talrige centrioler efterfulgt af Fluo-SPA, vil generere gennemsnit af centrioler i forskellige retninger, hvilket bidrager til at lokalisere centriolar protein med præcision. Vigtigst, kan denne metode anvendes mere generelt isolerede centrioler fra andre arter, andre organeller eller store makromolekylære forsamlinger. Endelig stikprøve forberedelse tilgang præsenteres her, kombineret med nylige udvikling af algoritmer for enkelt-partikel analyse af fluorescerende SMLM data32, kunne åbne yderligere forbedring i den molekylære kartografi af store makromolekylære assemblies.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takke Pierre Gönczy og BioImaging & optik Platform (BIOP) på École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), Lausanne, Schweiz, hvor SIM-billederne af centrioler blev erhvervet. Nikolai Klena og Davide Gambarotto er støttet af det Europæiske Forskningsråd (ERC) start Grant (StG) 715289 (ACCENT) og Maeva Le Guennec, Paul Guichard og Virginie Hamel af Swiss National Science Foundation (SNSF) PP00P3_157517. Susanne Borgers understøttes af Geneves Universitet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse monoclonal anti-apha tubulin (clone DM1A) Abcam ab7291  dilution 1:300
DNaseI Roche 10104159001
12 mm coverslips Roth YX03.1
18 mm coverslips Roth LH23.1
K2HPO4 Fluka 60355
KH2PO4 Fluka 60230
Tris base Biosolve Chimie SARL 0020092391BS
acetic acid Carlo Erba Reagents 524520
NH4Cl Sigma A-4514
CaCl2 Sigma C-7902
MgSO4 Sigma 63140-500G-F
steritop filter Millipore SCGPT05RE
sucrose Sigma S7903-1KG
HEPES AppliChem PanReac A3724,0250
PIPES Sigma P6757-500G
MgCl2 ACROS ORGANICS 197530010
NP-40 AppliChem PanReac A1694,0250
Round-bottom (Kimble) tubes 15 mL Fisherscientific 09-500-34
Round-bottom (Kimble) tubes 30 mL Fisherscientific 09-500-37
cover glass staining rack Thomas scientific 8542E40
crystal polystyrene transmission lab box FISHERS 11712944
Methanol VWR 20864.32
BSA Roche 10735086001
Triton X100 Roth 3051.3
goat anti-mouse coupled to Alexa 488  invitrogen A11029 dilution 1:1,000
goat anti-rabbit coupled to Alexa 568 invitrogen A11036 dilution 1:1,000
mounting medium abcam ab188804
Tube, thinwall polypropylene Beckman Coulter 326823
Poly-D-Lysine 1 mg/mL SIGMA  A-003-E
Mouse monoclonal anti-Polyglutamylation modification mAb (GT335) Adipogen AG-20B-0020 dilution 1:1,000
glycerol mounting medium with DAPI and DABCO Abcam ab188804
50 mL conical tubes Falcon 14-432-22
Eppendorf 5810R centrifuge Eppendorf 5811000622
Beckman JS-13.1 swinging bucket rotor Beckman Coulter 346963
Beckman SW 32Ti rotor Beckman Coulter 369694
parafilm Bemis  13-374-10
Leica TCS SP8 with Hyvolution mode Leica 
OSRAM L18W/954 LUMILUX  Luxe Daylight/ OSRAM
Whatman filter paper Sigma  WHA1001325
CrSAS-6/Bld12 antibody dilution 1:300 (Hamel el al., 2014)
Scipion http://scipion.i2pc.es/
EM CCD camera (Andor iXON DU897) Andor

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bornens, M. The centrosome in cells and organisms. Science. 335 (6067), 422-426 (2012).
  2. Nigg, E. A., Holland, A. J. Once and only once: mechanisms of centriole duplication and their deregulation in disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 297-312 (2018).
  3. Nigg, E. A., Raff, J. W. Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease. Cell. 139 (4), 663-678 (2009).
  4. Gönczy, P. Towards a molecular architecture of centriole assembly. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (7), 425-435 (2012).
  5. Paintrand, M., Moudjou, M., Delacroix, H., Bornens, M. Centrosome organization and centriole architecture: their sensitivity to divalent cations. Journal of Structural Biology. 108 (2), 107-128 (1992).
  6. Winey, M., O'Toole, E. Centriole structure. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).
  7. Dippell, R. V. The development of basal bodies in paramecium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 461 (1968).
  8. Allen, R. D. The morphogenesis of basal bodies and accessory structures of the cortex of the ciliated protozoan Tetrahymena pyriformis. The Journal of Cell Biology. 40 (3), 716-733 (1969).
  9. Li, S., Fernandez, J. -J., Marshall, W. F., Agard, D. A. Three-dimensional structure of basal body triplet revealed by electron cryo-tomography. The EMBO Journal. 31 (3), 552-562 (2012).
  10. Guichard, P., Chrétien, D., Marco, S., Tassin, A. -M. Procentriole assembly revealed by cryo-electron tomography. The EMBO Journal. 29 (9), 1565-1572 (2010).
  11. Guichard, P., et al. Native architecture of the centriole proximal region reveals features underlying its 9-fold radial symmetry. Current Biology. 23 (17), 1620-1628 (2013).
  12. Hirono, M. Cartwheel assembly. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).
  13. Bornens, M., Paintrand, M., Berges, J., Marty, M. C., Karsenti, E. Structural and chemical characterization of isolated centrosomes. Cell Motility and the Cytoskeleton. 8 (3), 238-249 (1987).
  14. Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R., Marshall, W. F. Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes. Current Biology. 15 (12), 1090-1098 (2005).
  15. Kilburn, C. L., et al. New Tetrahymena basal body protein components identify basal body domain structure. The Journal of Cell Biology. 178 (6), 905-912 (2007).
  16. Bauer, M., Cubizolles, F., Schmidt, A., Nigg, E. A Quantitative analysis of human centrosome architecture by targeted proteomics and fluorescence imaging. The EMBO Journal. 35 (19), 1-15 (2016).
  17. Hamel, V., et al. Identification of Chlamydomonas Central Core Centriolar Proteins Reveals a Role for Human WDR90 in Ciliogenesis. Current Biology. 27 (16), 2486-2498 (2017).
  18. Cavalier-Smith, T. basal body and flagellar development during the vegetative cell cycle and the sexual cycle of Chlamydomonas reinhardii. Journal of Cell Science. 16 (3), 529 (1974).
  19. Geimer, S., Melkonian, M. The ultrastructure of the Chlamydomonas reinhardtii basal apparatus: identification of an early marker of radial asymmetry inherent in the basal body. Journal of Cell Science. 117, Pt 13 2663-2674 (2004).
  20. Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole. Current Biology. 17 (24), 2169-2174 (2007).
  21. Hamel, V., et al. Correlative multicolor 3D SIM and STORM microscopy. Biomedical Optics Express. 5 (10), 3326 (2014).
  22. Guichard, P., et al. Cell-free reconstitution reveals centriole cartwheel assembly mechanisms. Nature Communications. 8, 14813 (2017).
  23. Hiraki, M., Nakazawa, Y., Kamiya, R., Hirono, M. Bld10p constitutes the cartwheel-spoke tip and stabilizes the 9-fold symmetry of the centriole. Current Biology. 17 (20), 1778-1783 (2007).
  24. Sahl, S. J., Hell, S. W., Jakobs, S. Fluorescence nanoscopy in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (11), 685-701 (2017).
  25. Hutner, S. H., Provasoli, L., Schatz, A., Haskins, C. P. Some Approaches to the Study of the Role of Metals in the Metabolism of Microorganisms. Proceedings of the American Philosophical Society. 94 (2), 152-170 (1950).
  26. Keller, L. C., Marshall, W. F. Isolation and proteomic analysis of chlamydomonas centrioles. Methods in Molecular Biology. 432 (1), 289-300 (2008).
  27. Borlinghaus, R. T., Kappel, C. HyVolution-the smart path to confocal super-resolution. Nature Methods. 13 (3), (2016).
  28. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  29. de la Rosa-Trevín, J. M., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  30. Gartenmann, L., et al. A combined 3D-SIM/SMLM approach allows centriole proteins to be localized with a precision of ∼4-5 nm. Current Biology. 27 (19), 1054-1055 (2017).
  31. Jaenicke, L., Kuhne, W., Spessert, R., Wahle, U., Waffenschmidt, S. Cell-wall lytic enzymes (autolysins) of Chlamydomonas reinhardtii are (hydroxy)proline-specific proteases. European Journal of Biochemistry. 170 (1-2), 485-491 (1987).
  32. Salas, D., et al. Angular reconstitution-based 3D reconstructions of nanomolecular structures from superresolution light-microscopy images. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9273-9278 (2017).

Tags

Biologi sag 139 centrioler basal krop Fluorescens mikroskopi organelle isolation enkelt-partikel gennemsnit Chlamydomonas reinhardtii super-resolution mikroskopi
Isolation og fluorescens Imaging for enkelt-partikel genopbygning af <em>Chlamydomonas</em> centrioler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klena, N., Gambarotto, D., Le… More

Klena, N., Gambarotto, D., Le Guennec, M., Borgers, S., Guichard, P., Hamel, V. Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles. J. Vis. Exp. (139), e58109, doi:10.3791/58109 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter