Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolasjon og fluorescens Imaging for Single-partikkel rekonstruksjon av Chlamydomonas Centrioles

Published: September 21, 2018 doi: 10.3791/58109
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Cell Biology, Sciences III, University of Geneva
* These authors contributed equally

Summary

Vi har utviklet en strategi for å rense og bilde et stort antall centrioles i forskjellige retninger mottakelig for super-oppløsning mikroskopi og enkelt-partikkel snitt.

Abstract

Centrioles er store macromolecular samlinger viktig for riktig gjennomføring av grunnleggende celle biologiske prosesser som celledeling, celle motilitet eller celle signalisering. Grønn algene Chlamydomonas reinhardtii har vist seg for å være en innsiktsfull modell i studiet av centriole arkitektur, funksjon og protein komposisjon. Til tross for store fremskritt mot forståelse centriolar arkitektur er en i aktuelle utfordringer å bestemme den nøyaktige lokaliseringen av centriolar komponenter i strukturelle deler av centriole for å bedre forstå deres rolle i centriole biogenesis. En stor begrensning ligger i oppløsningen til fluorescens mikroskopi, kompliserer tolkningen av protein lokalisering i denne organelle med dimensjoner nær Diffraksjon grensen. For å takle dette spørsmålet, gir vi en metode for å rense og bilde et stort antall C. reinhardtii centrioles med forskjellige retninger med super-oppløsning mikroskopi. Denne teknikken kan videre behandling gjennom fluorescerende single-partikkel gjennomsnitt (Fluo-SPA) på grunn av det store antallet centrioles kjøpt. Fluo-SPA genererer gjennomsnitt av farget C. reinhardtii centrioles i forskjellige retninger, dermed tilrettelegge lokalisering av forskjellige proteinene i centriolar regioner. Viktigere, kan denne metoden brukes på bildet centrioles fra andre arter eller andre store macromolecular samlinger.

Introduction

Centriole er et evolusjonært bevarte organelle som ligger i kjernen av centrosome i dyreceller og kan fungere som en basal kropp (referert til som centrioles heretter) mal flimmerhårene eller flagella i mange eukaryoter1,2. Slik er centrioles kritiske for grunnleggende celle biologiske prosesser fra spindelen montering til celle signalisering. Derfor er mangler i centriole samling eller funksjonen forbundet med flere menneskelige patologi inkludert ciliopathies og kreft3.

Centrioles er nine-fold, symmetrisk, microtubule trilling-baserte sylindriske strukturer som er vanligvis ~ 450 nm lang og ~ 250 nm bred4,5,6,7. Konvensjonelle elektronmikroskop og cryo-elektron tomografi av centrioles fra ulike arter har avdekket at centrioles er polarisert langs deres lange aksen med tre forskjellige områder: et proksimale område, en sentral kjerne og en distale regionen5 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. viktigst, hver av disse områdene viser strukturelle funksjoner. Først inneholder lumen i 100 nm lange proksimale regionen cartwheel strukturen koblet til microtubule trilling gjennom pinhead element12. Andre 300-400 nm lange sentrale regionen inneholder fibrøs tettheter i funksjonene lumen og strukturelle langs indre ansiktet de piskehale som henger: Y-formet linker, C-tubule halen og A-tubule spire9. Til slutt, 50-100 nm distale regionen utstillinger sub distale og distale vedheng som omgir den distale del av centriole5,13.

De to siste tiårene har vært preget av oppdagelsen av et økende antall centriolar proteiner, fører til en gjeldende estimering av 100 distinkt proteiner blir en del av centriole14,15,16, 17. til tross for disse fremskrittene den nøyaktige lokaliseringen av disse proteinene i centriole forblir unnvikende, spesielt innen strukturelle regioner. Viktigere, er tilordne en nøyaktig lokalisering til strukturelle deler av centriole avgjørende for en bedre forståelse av deres funksjon. I denne forbindelse har C. reinhardtii centrioles vært medvirkende i begge sider av første delimitating forskjellige strukturfunksjonene langs sylinder9,18,19, som deretter lot forskere å korrelere lokalisering av et delsett av proteiner med fluorescerende mikroskopi en sub strukturelle regionen. Dette omfatter for eksempel proteiner Bld12p og Bld10p, som Lokaliser den proksimale regionen og cartwheel strukturen spesielt20,21,22,23. Listen over underkonstruksjonen lokalisert proteiner inkluderer også POB15 og POC16, to nye proteiner identifisert av massespektrometri som dekorerer regionen indre sentrale kjernen C. reinhardtii centrioles17.

Dette dokumentet gir en fullstendig beskrivelse av metoden utviklet for å isolere og image C. reinhardtii centrioles for påfølgende super-oppløsning mikroskopi og enkelt-partikkel snitt. For å oppnå dette målet, er det viktig å avgrense de tekniske begrensningene som må overvinnes. Først kan centriole rensing påvirke den generelle arkitekturen, med cartwheel struktur ofte blir tapt i de ulike trinnene i isolasjon9. Dernest er centriole svært nær Diffraksjon grensen i optisk mikroskopi. Lateral oppløsningen som kan oppnås i AC confocal mikroskopi er faktisk rundt 200 nm24, lik diameteren på centriole og oppløsningen i z-aksen er om 2-3 x lavere, fører til en Anisotrop volum. For det tredje, heterogenitet antistoff merking og centriole orientering kan begrense tolkningen trengs for å lokalisere et protein i en bestemt centriolar regionen. Endelig finnes centrioles i bare to eksemplarer per celle, gjør det vanskelig å få et stort antall bilder og finne en entydig centriole retning. For å omgå disse tekniske problemer, utviklet vi en metode som baserer seg på bruk av super-oppløsning mikroskopi på et stort antall isolerte centrioles som vedta ulike retninger. Først vil vi beskrive en protokoll for å rense C. reinhardtii centrioles som rensing av strukturelt intakt centrioles og procentrioles som inneholder cartwheel. Deretter vil vi beskrive en trinnvis protokoll for å fokusere på centrioles på coverslips for avbildning av konvensjonelle eller fluorescerende super-oppløsning mikroskopi. Dette viktig skritt kan øke antall centrioles fotografert i flere retninger. Til slutt vil vi beskrive en prosedyre for å utføre single-partikkel snitt på informasjon innhentet ved fluorescerende mikroskop som forenkler gjenkjenning av centrioles i forskjellige retninger. Helt, kan denne metoden brukes på bildet centrioles fra ulike arter eller andre store macromolecular samlinger.

Protocol

1. Media forberedelse C. reinhardtii kultur og isolering av Centriole

  1. Utarbeidelse av media kultur C. reinhardtii celler
    Merk: Trinnene beskriver utarbeidelse av lager løsninger for 1 x trykk (Tris-acetate fosfat) medium.
    1. Forberede en fosfatbuffer (pH 7), ved å blande 250 mL 1 M K2HPO4 (174.2 g K2HPO4 sammen til 1 L med destillert vann) med ~ 170 mL 1 M KH2PO4 (136.09 g KH2PO4 1 l). Justere blandingen til å nå pH 7.
    2. Forberede løsning en (40 x) ved å blande 96.8 g Tris, 40 mL fosfatbuffer (pH 7) og 40 mL av eddiksyre, og justere løsningen 1 L med destillert vann.
    3. Forberede løsning B (40 x) med 16 g NH4Cl, 2 g av CaCl2og 4 g MgSO4. Pass på å oppløse CaCl2 i destillert vann separat før det legges til andre komponenter. Justere løsningen 1 L med destillert vann.
    4. Forberede Hutners sporstoffer buffer25 som følger.
      1. For 1 L buffer, oppløse hver sammensatte i det angitte volumet av vann: EDTA disodium salt (50 g i 250 mL), ZnSO4.7H2O (22 g i 100 mL), H3BO3 (11.4 g i 200 mL), MnCl2.4H2O (5.06 g i 50 mL) , CoCl2.6H2O (1.61 g i 50 mL), CuSO4.5H2O (1,57 g i 50 mL), (NH4) 6Mo7O24.4H2O (1,10 g i 50 mL) og FeSO4.7H2O (4.99 g i 50 mL).
        Merk: EDTA skal oppløses i kokende vann, og den FeSO4 bør være forberedt sist å unngå oksidering.
      2. Bland alle løsninger unntatt EDTA sammen og kok. Deretter legger EDTA, og løsningen bør bli grønn. Etter oppløsende alt, kult løsningen på 70 ° C. Ved denne temperaturen, legger du til 85 mL av varm 20% KOH løsning (20 g i 100 mL). Justere løsningen 1 L med destillert vann ved romtemperatur (RT).
      3. Legge til en bomull plugg kolbe og la løsningen står for 1 eller 2 uker, riste den 1 x en dag. Løsningen bør først bli grønt og deretter slå lilla, forlate en rust-brun bunnfall; fjerne det bunnfall bruke filter papir til løsningen er klart. Fryse dele og lagre på 20 ° C.
    5. Forberede 1 x trykk medium å vokse C. reinhardtii celler ved å blande følgende komponenter: 25 mL løsning en (40 x) og 25 mL løsning B (40 x) med 1 mL av Hutners sporstoffer buffer25, og justere blandingen til 1 L med destillert vann. Sterilisere blandingen bruke filtere 0,4 µm.
  2. Media forberedelse til centriole rensing
    1. Klargjør en deflagellation buffer med 5% sukrose i 10 mM HEPES (pH 7) på et endelig antall 500 mL justert med destillert vann.
    2. Forberede 250 mL 0,5 M eddiksyre.
    3. Forberede 250 mL av en 1 M K-rør lagerløsning (pH 7.2) ved første legge 50 mL av H2O å oppløse rør pulver, så legger 10 N KOH til løsningen begynner å bli klar. Sjarmere til pH 7.2 med 10 N og 1 N KOH og justere løsningen på et endelig antall 250 mL med H2O.
    4. Forberede 5 sukrose løsninger (w/w) som følger.
      Merk: Alle sukrose løsninger må filtreres etter solubilization bruke filtere 0,4 µm koblet til en sprøyte. Merk at 60% og 70% sukrose løsningene er vanskelig å solubilize og plasseres i et vannbad pre varmet på 60 ° C å lette solubilization. Bland hvert 10 min før sukrose er fullstendig oppløst.
      1. For å forberede 25% sukrose, veier 25 g av sukrose og justere vekt på 100 g ved å legge 10 mM K-rør (pH 7.2).
      2. For å forberede 60% sukrose, veie 60 g av sukrose og justere vekt på 100 g med 10 mM K-rør (pH 7.2).
      3. Forberede sukrose løsninger sukrose graderingen. Forberede 40% sukrose ved veier 40 g av sukrose og justere løsningen på 100 g med 10 mM K-rør (pH 7.2). Tilsvarende forberede 50% (w/w) og 70% (w/w) sukrose.
      4. Lagre løsninger på 20 ° C. Pass resuspend sukrose løsningene riktig etter tining.
    5. Forberede 100 mL lyseringsbuffer av miksing 1 mM HEPES (pH 7), 0,5 mM MgCl2, og 1% NP-40 og holde det på 4 ° C. Alltid forberede denne bufferen frisk på dagen for eksperimentet. Legg til anti-protease tabletter ved centriole isolasjon.
    6. Forberede 1 x fosfat buffer saltvann (PBS) (pH 7.4) ved å blande NaCl 8 g, 2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4og 0,24 g KH2PO4 800 mL destillert H2O. justere pH 7,4 med HCl. Bring volumet av blandingen til 1 L med destillert H2O.

2. isolering av C. reinhardtii Centrioles

Merk: Se figur 1.

  1. Kultur og utvidelse av C. reinhardtii celler
    1. Om kvelden på dag 1, vaksinere en cw15 - stamme fra en solid plate til en kultur Erlenmeyer kolbe som inneholder 10 mL 1 x trykk. Vokse cellene i hvite lysrør (60 µE/m2s) for 2-3 dager på 23 ° C.
    2. Dag 3, fortynne kulturen 10 x (100 mL) 1 x trykk og vokse cellene under lys for 2-3 dager på 23 ° C.
    3. På dag 6, fortynne kulturen 10 x 1 x Trykk for å få 1 L kultur. Vokse cellene under lys på 23 ° C til kultur når en mørkegrønne fargen som angir et omtrentlig celle tetthet av ~ 1 x 107 celler/mL26 (dag 9-10).
  2. Rensing av C. reinhardtii centrioles
    1. Sentrifuge cw15 - cellene på 600 x g i 10 min i 50 mL konisk rør. Vask pellet av celler 1 x med 50 mL 1 x PBS og spinn på 600 x g for 10 min. Resuspend pellets i 100 mL romtemperatur deflagellation buffer med en pipette.
    2. Deflagellate cellene med en pH-sjokk ved langsomt å legge dråper 0,5 M eddiksyre en siste pH på 4,5-4.7 på en magnetisk rørestang og ruge cellene for 2 min. sakte legge dråper 1 N KOH gjenopprette pH 7.0.
    3. Sentrifuge cellene på 600 x g i 10 min å fjerne noen frittstående flagella. Fjern nedbryting og lagre pellet på is. Vask pellet 2 x med 50 mL 1 x PBS forkjøles og lagres på 4 ° C. Deretter spinne pellet 600 x g i 10 min på 4 ° C.
    4. Resuspend pellet i 30 mL 1 x PBS og sakte laste suspensjon på en 25%-sukrose pute 20 ml uten blanding (figur 1B).
    5. Spinn på 600 x g i 15 min på 4 ° C til å fjerne gjenværende flagella i nedbryting; cellene er spredt i 25% sukrose (figur 1C). Hold bare den nederste 20 mL (rød pil, figur 1C) ved nøye aspirating nedbryting ved hjelp av en aspirator.
    6. Vask det resterende 20 mL ved å legge til 20 mL kaldt 1 x PBS. Spin prøven på 600 x g i 10 min på 4 ° C. Resuspend pellet i 10 mL kaldt 1 x PBS (på 4 ° C). Kontroller at det er ingen klumper slik at den følgende lysis treff alle cellene samtidig.
    7. Overfør urinprøven til en ny 250 mL flaske. Legge til 100 mL lyseringsbuffer supplert med 5000 enheter av DNase til cellene. Det er viktig å legge lyseringsbuffer til cellene, og ikke omvendt. Inkuber blandingen 1t på 4 ° C og bland det nøye vaskeløsningen hvert 15 min uten danner bobler ved.
    8. Sentrifuge lysed cellene på 600 x g i 10 min på 4 ° C i et 50 mL konisk rør til fjern celle rusk. Hvis lyse er utført riktig, celle pellet bør være hvit (figur 1D). Samle nedbryting med en pipette, og laste den inn i en 30 mL runde bunn rør som inneholder en 60%-sukrose pute, plassert på is. Deretter spinne røret på 10.000 x g i 30 min på 4 ° C.
      Merk: Flere runde bunn rør (Tabell for materiale) kan være nødvendig, avhengig av nedbryting.
    9. Sug opp den supernatant opptil 1 mL over sukrose pute. Merk det gule grensesnittet mellom 1 mL av gjenværende nedbryting og 2 mL av sukrose pute. Bland forsiktig i sukrose og gjenværende nedbryting med kutt P1000 tips. Gjør ikke vortex på dette trinnet; ellers, procentrioles tapt på dette stadiet. Samle alle sukrose puter og lagre dem på isen.
    10. Forberede en 40% til 70% sukrose forløpning i et tynnvegget 38,5 mL polypropylen rør ved forsiktig å legge 3 mL 70% sukrose (på 4 ° C), etterfulgt av 3 mL 50% og til slutt, 3 mL 40% sukrose. Laste gruppert grensesnittene på 40% til 70% sukrose graderingen; gjøre dette sakte fordi den kalde sukrose er svært tyktflytende. Balansere rør med 10 mM K-rør bufferen (pH 7.2) og sentrifuge dem 68,320 x g (f.eksmed en SW32Ti rotoren) i 1 h og 15 min på 4 ° C.
    11. Samle 12 x 500 µL fraksjoner på 4 ° C ved å lage et hull i bunnen av røret med en 0,8 mm nål uten å forstyrre forskjellige sukrose lagene. Med et kutt P200 pipette tips, forberede ytterligere 10 µL dele fra hver fraksjon som blir brukt for den følgende immunofluorescence. Snapin-fryse fraksjoner i flytende nitrogen.
      Merk: Isolert centrioles kan analyseres av elektronmikroskop slik at den samlede ultrastructure av centrioles beholdes.

3. kvantifisering av isolerte Centrioles på Coverslips: sentrifugering og Immunofluorescence

Merk: Se figur 2.

  1. Forberede rør og coverslips
    1. Bruke 1 runde bunn røret (15 mL) per brøkdel for å analysere centriolar fraksjoner (12 rør totalt).
    2. Legge en egendefinert dekkglassvæske støtte adapter (kalt adapter heretter) i runde bunn røret. Plass et sterilt 12 mm dekkglassvæske i runde bunn røret.
      Merk: Vi brukte her 12 mm coverslips, men protokollen kan tilpasses til 18 mm coverslips med 30 ml runde bunn rør.
    3. Legge til 5 ml av pre-avkjølt 10 mM K-rør (pH 7.2) på 4 ° C. Kontroller at dekkglassvæske ikke er flytende og holder nede på adapteren. Plass rørene på isen.
  2. Sentrifugering av centrioles
    1. Fortynn hver 10 µL brøk med 100 µL av kaldt 10 mM K-rør (pH 7.2). Resuspend fortynning godt til den komplette forsvinningen av sukrose (figur 2A). Legg hver utvannet fraksjon i en runde bunn rør.
    2. Spin røret på 10.000 x g i 10 min (f.eksmed en JS-13.1 svingende bøtte rotor) på 4 ° C.
    3. Gjenopprette dekkglassvæske ved å sette inn en håndlaget hekta enhet i hullet i spor kanten av adapteren og løfte det forsiktig opp.
      Merk: Håndlaget hekta enheten kan gjøres med sprøyte nål manuelt hekta og formet på en hjemmelaget pinne (tall 2B-2D).
    4. På å nå toppen av den runde bunn, felle kanten av adapteren med en hansker finger og fjerne dekkglassvæske med pinsett. Pass på å huske hvilken side av dekkglassvæske inneholder centrioles. Fortsette å behandle coverslips for immunofluorescence.
  3. Immunofluorescence flekker og tenkelig av isolert C. reinhardtii centrioles
    Merk: Se figur 2.
    1. Forberede materialet for immunofluorescence flekker som følger.
      1. Forberede en cover-glass flekker rack i en krystall Polystyren overføring lab boks (60 mm i lengde med 50 mm i bredden av 43 mm i høyden). Fyll den med 100% metanol og lagre den på 20 ° C.
      2. Forberede en fuktig kammer. For dette, montere fuktig kammeret ved å plassere en vann-fuktet vev langs innsiden kantene på en firkant Petriskål (figur 2E). Legg et stykke laboratorium tetting wrap (se Tabell of Materials) til midten av Petriskål som antistoff mikser plasseres under immunofluorescence prosedyren (trinn 3.3.2–3.3.3). Dekk lokket og fuktig chamber med aluminiumsfolie å beskytte den mot lyset.
    2. Immunostai de isolerte centrioles som følger.
      1. Fastsette coverslips med centrioles direkte etter sentrifugering (trinn 3.2.4) av rugende dem i 5 min i boksen fylt med 20 ° C metanol (trinn 3.3.1.1).
      2. Fjern coverslips med pinsett og legg dem i en gjennomsiktig laboratorium (se Tabell for materiale) fylt med 50 mL 1 x PBS og vaske dem i 5 minutter ved romtemperatur.
      3. Pipetter 60 µL av primære antistoff [primær antistoffer fortynnet i 1% bovin serum albumin (BSA) og 0,05% Tween-20 i PBS] på stykke laboratorium tetting sjal i fuktig kammeret. Nøye lå coverslips over antistoff blandingen med centrioles vender mot fall. Inkuber coverslips for 45 min med primære antistoffer.
        Merk: Primære antistoffer som ble brukt til å generere representant resultatene er kanin polyklonale Bld12 (1:300) og mus α-tubulin (DM1A) (1:300).
      4. Fjerne coverslips og vask dem i 5 min i 1 x PBS, som beskrevet i trinn 3.3.2.2. Inkuber coverslips for 45 min med sekundær antistoffer i PBS som inneholder 1% BSA og 0,05% Tween-20.
        Merk: Sekundær antistoffer som ble brukt til å generere representant resultatene er geit anti-mus koblet til Alexa 488 (1:1, 000) og geit anti-kanin koblet til Alexa 568 (1:1, 000).
      5. Fjerne coverslips og vask dem i 5 min i 1 x PBS, som beskrevet i trinn 3.3.2.2.
    3. Montere coverslips på et glass lysbilde ved å legge til 3 µL av montering medium på lysbildet og forsiktig plassere coverslips på toppen (centrioles mot montering medium). Forsegle dekkglassvæske kanten med neglelakk.
    4. Bilde av isolerte centrioles på AC confocal mikroskop på en 63 X oljeobjektiv med en N.A. 1.4 mens søknad deconvolution27 (se Tabell for materiale).
      Merk: Her, følgende innstillinger ble brukt: 500-545 nm for Alexa 488 og 580-635 nm for Alexa 568.

4. konsentrasjon av Centrioles på midten av Coverslips

Merk: Se Figur 3.

  1. Materielle forberedelse
    1. Forberede 15 mL runde bunn røret på is, en egendefinert dekkglassvæske støtte adapter (kalt adapter heretter, .stl filen leveres som supplerende fil 1), egendefinerte konsentrator (.stl fil som supplerende fil 2) og 10 mM K-rør (pH 7.2) på 4 ° C.
    2. Forberede poly-D-lysine (PDL)-belagt coverslips. Fortynne 10 x 1 mg/mL PDL lager løsningen med H2O. Først vask coverslips med 70% EtOH, Fjern etanol og la coverslips tørr. Coat coverslips med PDL og ruge dem i 30 min ved romtemperatur. Vask coverslips 3 x med vann og la dem tørke.
      Merk: Coat coverslips med PDL å øke antall isolerte centrioles knyttet til coverslips.
  2. Sentrifugering
    1. Plasser et sterilt 12 mm dekkglassvæske på den innfelte, bunnen konsentrator, holde PDL strøk med forsiden ned. Cap i dekkglassvæske ved å plassere adapteren direkte på toppen. Invertere runde bunn røret og plasser den over konsentrator, dekkglassvæske og adapter.
    2. Forsiktig skyve ensemble med pinsett før den når bunnen av runden bunn røret, og Inverter røret. Legge til 10 mM K-rør buffer (pH 7.2) runde bunn røret før den kommer til toppen av presisjonstørking. Kontroller at det ikke værende bobler i sentrale sylinderen til konsentrator.
    3. Forsiktig legge 100 µL av 10 mM K-rør buffer (pH 7.2) til en aliquot som inneholder beriket centriole brøk og grundig blande volumet.
    4. Fjern 100 µL av 10 mM K-rør buffer (pH 7.2) fra hule center til konsentrator og legge 100 µL av den berike centriolar fraksjon i 10 mM K-rør buffer (pH 7.2) til hule center til konsentrator, omsorg at innholdet blir værende i hule sentrum.
    5. Sentrifuge 10.000 x g i 10 min (f.eksmed en JS-13.1 svingende bøtte rotor) i en pre-avkjølt sentrifuge på 4 ° C.
    6. Fjerne presisjonstørking med pinsett.
    7. Gjenopprette dekkglassvæske ved å sette inn en håndlaget hekta enhet i hullet i spor kanten av adapteren og løfte det forsiktig opp. På å nå toppen av den runde bunn, felle kanten av adapteren med en hansker finger og fjerne dekkglassvæske med pinsett. Pass på å huske hvilken side av dekkglassvæske inneholder centrioles. Fortsette å behandle coverslips for immunofluorescence.
      Merk: Håndlaget hekta enheten kan gjøres med en sprøyte nål manuelt hekta og formet på en hjemmelaget pinne (Tall 2B-D).
    8. Utføre fiksering og immunofluorescence flekker av konsentrert centrioles som gjort i trinn 3.3.2–3.3.4.

5. single-partikkel snitt

Merk: Se Figur 4.

  1. Imaging for Single-partikkel snitt
    1. Montere dekkglassvæske på et lysbilde ved hjelp av en vanlig anti-filtrert montering medium. Utføre strukturert belysning mikroskopi (2D SIM) bildevisning en CFI Apochromat TIRF målsetting (100 X, NA 1,49, WD 0,12 mm) og en tilbake opplyst EM CCD kamera.
      Merk: Anskaffelsestiden ble satt til 100 ms på et kamera lese ut av 3 MHz. En 2,5 X linsen ble brukt for SIM bildebehandling.
      Merk: Datasettet presenteres her ble kjøpt på 3D SIM mikroskop (se Tabell for materiale).
    2. Bilde av centrioles ved å kjøpe en stor bunke med bilder som består av den totale centriole signal, ved å angi øverst og nederst stillingen av Z-stakken over og under centriole signalet, henholdsvis. Videre til prosjektet stakken og utføre én-partikkel gjennomsnitt per trinn 5.2 og 5.3.
  2. Projeksjon av en stabel
    1. Åpne bildestakk med ImageJ. Klikk på 'bildestakker → → Z prosjektet'. Angi projeksjon somMax intensitet'.
    2. Inverterer bildet ved å klikke på 'Rediger → Inverter'. Lagre projeksjon som genereres (TIF-format).
  3. Single-partikkel innretting med Scipion
    1. Opprette et nytt prosjekt i Scipion ved å trykke på røde "Opprette Project' øverst på siden. Venstre panel, dobbeltklikk på "Import → Import micrographs'.
    2. Fyll den 'filkatalogen' og 'mønster " felt i henhold til datamappen og navn. Beholde den standardparametere. Klikk på "Kjør".
    3. Dobbeltklikk på "Partikler → plukking → xmipp3 - manuell plukke (trinn 1)". Klikk på forstørrelsesglasset ikon nær feltet 'Input micrographs' og velg de importerte micrographs fra trinn 5.3.1. Klikk på "Kjør".
    4. Velg partikler fra de ulike micrographs ved å klikke på dem i vinduet nyåpnede. Når ferdig med hver mikroskop-bilde, klikk på den røde knappen "+ koordinerer".
    5. Dobbeltklikk på 'Partikler → ekstrakt → xmipp3 - ekstrakt partikler'. Klikk på forstørrelsesglasset ikon nær feltet 'Input koordinater' og velg plukket koordinatene fra trinn 5.3.4. Fyll 'Partikkel boksen størrelse (px)' ifølge partikler dimensjonene. I kategorien 'Preprocess' angir støvfjerning: Nei (det kan generere gjenstander); Invertere kontrast: ingen (svart partikler, hvit bakgrunn). Fase Bla: Nei (koblet til CTF korreksjon); Normalisere: Ja.
    6. Klikk på "Kjør". Når jobben er gjort, sjekk ut partiklene ved å merke av for jobben (kantlinjer blir tykkere) og klikk på "analysere resultater (nederst til venstre på hovedmenyen).
    7. Dobbeltklikk på '2D → justere → xmipp3 - align med cl2d'. Klikk på forstørrelsesglasset ikon nær feltet 'Input partikler' og velg utdraget partikler fra trinn 5.3.5. Ikke bruk en referanseavbildning. Klikk på "Kjør".
    8. Dobbeltklikk på ' 2D → justere → mer → xmipp3 - bruke justeringen 2d'. Klikk på forstørrelsesglasset ikon nær feltet 'Input partikler' og velg justert partikler fra trinn 5.3.7.
    9. Klikk på "Kjør" som i trinn 5.3.6. Resultatene kan kontrolleres ved å klikke på "Analysere resultatene" etter at boksen jobb.
    10. Dobbeltklikk på 'Partikler → maske → xmipp3 - bruke 2d maske'.
    11. Klikk på forstørrelsesglasset ikon nær feltet 'Input partikler' og velg justert partikler fra trinn 5.3.9. "Maske kilde" er satt til 'Geometri'. Deretter angir parameterne for masken som maske: sirkelformet; RADIUS (px): leter etter en partikkel (en centriole) uten noe rundt det, klikk på den 'tryllestav ' ikonet til venstre som åpner et vindu for å finne den perfekte verdien; Skift Center: Nei (hvis partikkelen er midtstilt) eller Ja (hvis partikkelen er forskjøvet). X-senter forskyvning: Ifølge partikkel posisjonen. Y-senter forskyvning: i henhold til partikkel posisjon. Klikk på "Kjør".
    12. Bruke knappen ' analysere resultater ' for å sjekk hvis masken brukes riktig. Hvis ikke, høyreklikk på "Apply maske 2d" jobb og velg 'Endre'. Endre parameterne i masken (størrelse og/eller Skift) og løpe det igjen med den "Kjøre" -knappen.
    13. Dobbeltklikk på "2D → klassifisere → xmipp3 - cl2d".
    14. Klikk på forstørrelsesglasset ikon nær feltet 'Input partikler' og velg maskert partikler fra trinn 5.3.11. Hvor mange klasser bør være å få omtrent 50 partikler per klasse. Klikk på "Kjør".
    15. Sjekk resultatene ved å klikke på knappen "analysere resultatene" . I vinduet, klikk på ikonet "øyet" ved "Hva å vise".
    16. Det nye vinduet lar inspeksjon av de genererte klassene ved å velge 'Classes2D' i 'Hindre' -menyen. Sjekk innholdet i hver klasse ved å velge 'Class00N_Particles' i den samme menyen. Kontroller hver klasse for å identifisere hvilke inneholde bare dårlig partikler. Gå tilbake til visningen 'Classes2D' og velge hvilke klasser med god partikler ved å klikke på hver. Det er mulig å velge flere klasser ved å holde Ctrl- tasten trykkes under valget.
    17. Når alle klasser med god partikler er valgt, klikk på "+ partikler" opprette et delsett med disse partiklene.
    18. Velg et par sett med klasser som representerer forskjellige retninger på partikler i samme vindu. Opprette en ny del ved å klikke på "+ gjennomsnitt".
    19. For hver orientering/gjennomsnittlig valgt, gjør du som følger.
      1. Dobbeltklikk på '2D → justere → xmipp3 - align med cl2d'.
      2. Klikk på forstørrelsesglasset ikon nær feltet 'Input partikler' og velg god partikler fra trinn 5.3.17. Angi 'Bruk en referanseavbildning' til 'Ja'. Klikk på forstørrelsesglasset ikon nær feltet 'Referanse bilde' og klikk på hvit pil venstre 'Opprette delsett' prosjekt fra trinn 5.3.18 og velge bildet skal brukes som referanse. Dobbeltklikk på et objekt til å åpne det i et eget vindu og se hvilket objekt det er. Klikk på "Kjør".
      3. Dobbeltklikk på ' 2D → justere → mer → xmipp3 - bruke justeringen 2d'. Klikk på forstørrelsesglasset ikon nær feltet 'Input partikler' og velg justert partikler fra trinn 5.3.19.2.
      4. Klikk på "Kjør".
      5. Sjekke justeringen ('Analysere resultater '); Det viser justert partikler og gjennomsnittet av disse partiklene.
      6. Hvis gjennomsnittet er bra og partikler er alle orientert på samme måte, lagrer gjennomsnittet ved å klikke på ' avansert → ImageJ' og lagre bildet med ImageJ.
      7. Hvis gjennomsnittet kan forbedres, velge alle godt orientert bildene og opprette en ny delsett med knappen "+ partikler" . Gjenta trinn 5.3.19.1–5.3.19.4 før de er renset (alle dårlig partikler fjernet). Hver gang justeringen er utført (trinn 5.3.19.2), referansen til siste genererte gjennomsnittet (fra gjentakelse for gjentakelse, den gjennomsnittlige kvalitet øker).

Representative Results

C. reinhardtii Centriole isolasjon:
Isolere centrioles, cw15- C. reinhardtii celler ble dyrket i flytende kultur i flere dager under lys og senere pelleted med sentrifugering 600 x g for 10 min. Pelleted celler ble vasket 1 x med PBS og resuspended i en deflagellation buffer før deflagellation ved å utføre en pH støt med 0,5 M eddiksyre til en siste pH på 4,5-4.7 i 2 minutter (figur 1en). Et tillegg på 1 N KOH ble brukt til å gjenopprette pH 7.0. Separate frittliggende flagella fra cellen legemer, ble deflagellated celler først sentrifugeres for å fjerne meste av flagella. Pellet var så vasket 2 x med PBS og resuspended i 30 mL PBS før lasting det sakte på en 25%-sukrose pute (figur 1B). Røret ble spunnet på 600 x g i 15 min på 4 ° C for å fjerne det meste av frittstående flagella. Etter sentrifugering, cellen legemer var spredt i sukrose pute (figur 1C) og gjenopprettet ved å fjerne den ca 30 mL av nedbryting (til den røde pilen i figur 1C). Den resulterende 20 mL vasket celler ble deretter resuspended i 20 mL kaldt PBS og sentrifugeres 600 x g i 10 min. Deretter nedbryting ble forkastet, og cellene var helt resuspended i 10 mL PBS. Cellene ble overført til en 250 mL flaske og lyseringsbuffer ble lagt til resuspended cellene samtidig. DNase ble lagt til lyse og ruges 1t på 4 ° C. Etter sentrifugering trinn fjerne celle rusk (se den hvite pellet i figur 1D), nedbryting ble samlet inn og nøye lastet inn en 2 mL 60%-sukrose pute før sentrifugering 10.000 x g i 30 min på 4 ° C. Merk at for 100 mL lysis, 8 rør på 15 mL ble brukt til å utføre dette trinnet tilsvarer 12.5 mL lyseringsbuffer lastet på 2 mL av sukrose per rør. De fleste av nedbryting ble fjernet etter sentrifugering, opp til 1 mL over pute. 1 mL av gjenværende nedbryting ble deretter samlet med 2 mL pute blandet og samlet for å få et endelig antall 24 mL. Bassenget var deretter lastet på en 40% - 50%-, 70%-sukrose gradient og spunnet 68,320 x g i 1 h og 15 min på 4 ° C. Endelig de isolerte centrioles samlet inn ved å lage et hull i den nederste delen av sentrifugeringsrøret med en nål og dråpene ble samlet i 12 x 500 µL fraksjoner. På grunn av de ulike sukrose, drop dannet veldig sakte i begynnelsen (70% sukrose) og deretter mer raskt (40% sukrose).

Immunofluorescence av isolerte Centrioles
For å vurdere kvaliteten på isolering prosedyren, ble 10 µL av hver samlet gradient fraksjon deretter sentrifugeres på en dekkglassvæske med en dekkglassvæske støtte adapter (figur 2A-2D). Viktigere, for å fjerne trygt på dekkglassvæske, en egendefinert hekta enhet ble utformet (figur 2B). Neste, coverslips ble analysert av immunofluorescence. Antistoffer mot CrSAS-6(Bld12p) ble brukt i denne studien for å indikere tilstedeværelse av cartwheel struktur og α-tubulin (DMA1) for å markere centriolar veggen. Telle antall centrioles som var positivt for både CrSAS-6 og α-tubulin per synsfelt og deretter antall centrioles per fraksjoner, var det mulig å fastslå hvilke fraksjoner ble beriket for isolert centrioles ( Finne 2F-2 H). Interessant, var 6 fraksjoner beriket for centrioles (figur 2F og 2 G, brøker #1-6), med en topp for brøkdel #3, mens de siste fraksjonene ikke var indikerer at rensing jobbet. Merk at i dette bestemte eksperimentet, 95% av de totale centrioles var positivt for CrSAS-6 og α-tubulin i brøkdel #3. Dette indikerer at mest isolerte centrioles beholdt sine cartwheels. Hvis ingen anriking av centrioles er observert i første fraksjoner, isolasjon prosedyren fungerte ikke og skal gjentas. Merk at noen flagellar stykker kan observeres hovedsakelig i fraksjoner uten centrioles.

Deretter vil beregne antall centrioles per µL, skal antall centriole per synsfelt multipliseres med forholdet som vises i figur 2H. Resultatet skal deretter deles av volumet av brøken brukes for immunofluorescence for å få antall centrioles per µL. Her bestemt isolasjon inneholdt mest beriket brøken ca 37 centrioles for et område av 0.00846 mm2 (med en synsfelt av 92 x 92 µm2). Overflaten av slangeseksjonen var 7,5 mm i radius et totalt areal på 176 mm2. Tilsvarende forholdet var 176/0.00846 = 20,803.8, så 769,740 centrioles (37 x 20, 803.8) i 10 µL totalt. Antall centrioles i 1 µL var derfor 76,974.

Konsentrasjonen av isolerte Centrioles på Coverslips:
Øke antall centrioles per felt øker sjansen for å oppdage entydig centriole retning, i tillegg til å øke sjansen for å oppdage lignende orientering som kan brukes for ytterligere partikkel snitt prosedyrer. Som centrioles fra konsentrert fraksjoner er fortsatt er sparsommelig på dekkglassvæske, utviklet vi et sentrifugering tilbehør å konsentrere seg centrioles i dekkglassvæske (Figur 3A) kalt en konsentrator. Merk at en .stl fil med presis tiltak for 3D utskriften er utstyrt med dette manuskriptet.

Først en dekkglassvæske 12 mm var montert på presisjonstørking (Figur 3B). Adapteren ble plassert på toppen av dekkglassvæske og runde bunn røret var invertert og plasseres over monterte adapter og konsentrator. Runde bunn røret ble deretter forsiktig invertert, slik at lasting av prøven (protokollen trinn 4.2). Centrioles ble deretter sentrifugeres 10.000 x g i 10 min på 4 ° C. Etter at ble centrioles utsatt for immunofluorescence og farget for CrSAS-6/Bld12p og α-tubulin (Figur 3 c-3E). Viktigere, uten konsentrator, ble ca 30 centrioles sett per synsfelt (Figur 3C), mens 183 centrioles ble sett per synsfelt når du konsentratoren ble brukt (figur 3D-3F). Merk at centrioles dekket bare en diskett 4 mm i diameter i dekkglassvæske. Dette resultatet viser at konsentrasjonen trinnet fungerer og gir en 6-fold anriking av centrioles i et definert område av coverslips, dermed lettelser gjenkjenningen og tenkelig.

Fluorescerende Single-partikkel snitt av isolerte C. reinhardtii Centrioles:
Her bruker SIM mikroskopi som kan nå en oppløsning på rundt 120 nm, centrioles farget for monoglutamylated tubulin (GT335, Figur 4), en tubulin endring i centriolar piskehale som henger, ble fotografert24. C. reinhardtii centrioles er ca 500 nm lang, alltid i par, og ofte funnet med forbundet, nylig duplisert probasal organer (referert til som procentrioles heretter) og striated microtubule-assosiert fiber19. Derfor var denne siste samlingen ca 1 µm store. Av denne grunn, og for å image centrioles i sin helhet, anbefales det å anskaffe en Z-stabel på de isolerte centrioles.

Her etter kjøpet, ble en endelige bildet generert ved å utføre en maksimal intensitet projeksjon bruker ImageJ28 (bilde/stabler/Z prosjekt/max intensitet projeksjon, Figur 4B). En enkelt-partikkel analyse bruker cryo-elektron mikroskopi programvare ble utført for å gjøre klasser av centrioles med lignende orientering slike bilder, og deretter gjennomsnitt ble utført. Gjør var bildet fargen først invertert for å bedre bilde objektene (Figur 4C). Centrioles ble plukket manuelt i en sentrert over hver partikkel ved hjelp av fritt tilgjengelig Scipion programvare29 som integrerer flere elektronmikroskop programmer som Xmipp3 (Figur 4D). Merk at størrelsen på boksen defineres av brukeren. Her, esker med 50 x 50 piksler for en pikselstørrelse 31.84 nm ble brukt. Deretter alle partikler ble pakket ut (Figur 4E) og justert med Xmipp3 (Figur 4F). Deretter ble en sirkulær maske av 12 piksler i radius brukt til å isolere hver centriole fra centriolar-paret (Figur 4G). Partiklene var så klassifisert, bruke Xmipp3, til å generere flere gjennomsnitt. Bare ble homogen klasse gjennomsnitt holdt, betyr at partikler som avviker fra klassen gjennomsnitt ble manuelt ekskludert. Dette trinnet ble gjentatt for å generere en nesten perfekt gjennomsnittet for hver valgte orientering. Etter fem gjentakelser, to klasser av gjennomsnitt ble generert: topp utsikt fra 63 objekter (Figur 4H) og en side utsikt fra 98 partikler (Figur 4jeg) av monoglutamylated centrioles. Dimensjoner av objektet ble bestemt ved å måle avstanden mellom toppene av intensitet tomten profilen langs monoglutamylation signalet.

Viktigere, lengden på side-visning klasse gjennomsnittet er 260 nm med en diameter på 250 nm, sammenlignes med målte monoglutamylated tubulin signalet som ble vist å lokalisere til et område av 286 ± 33 nm i lengde i kjernen av centriole-17.

Figure 1
Figur 1 : Rensing av C. reinhardtii centrioles. (A) Dette er en skjematisk fremstilling av hvert trinn som fører til isolasjon av C. reinhardtii centrioles. Det inkluderer representant trinnene i protokoll (B) før og (C) etter sentrifugering på 25%-sukrose graderingen. Den røde pilen i C -panelet angir minimum volumet beholde etter sentrifugering. (D) dette panelet viser den hvite pellet lysed celler etter sentrifugering. Svarte pilen viser pellet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 2
Figur 2 : Sentrifugering satt opp til å utføre immunofluorescence på isolert centrioles. (A) 10 µL av hver samlet fraksjon er utvannet først i 100 µL av 10 mM K-rør (pH 7.2). (B) Dette er en skjematisk fremstilling av sentrifugering enhetene, omfatter et 15 mL runde bunn rør, en 12 mm dekkglassvæske, en adapter for dekkglassvæske, og en skreddersydd hekta enhet til å gjenopprette dekkglassvæske etter sentrifugering. Paneler C og D Vis tegninger forklarer hvordan gjenopprette dekkglassvæske etter sentrifugering. (C) sted verktøyet hektet i hullet i spor kanten av adapteren og (D) trekk forsiktig. (E) Dette er bilder av fuktig chamber måtte utføre immunofluorescence bildebehandling. Pilen viser 12 mm dekkglassvæske. (F) Dette er representativt AC confocal bilder på 63 X (zoom 2) gradient fraksjoner #1-8, samlet under den rensing prosedyren og farget for CrSAS-6 (rød) og α-tubulin (grønn). Senkninger tilsvarer området angitt av en hvit boks i visningene for lavere forstørrelse. Skala bar = 10 µm. (G) Dette er en graf som representerer antall centrioles positivt for både CrSAS-6 og α-tubulin per synsfelt i hver fraksjon. Merk anriking i fraksjoner #1-6. Gjennomsnittlig antall centrioles per i hver fraksjon: #1 = 16,3 ± 4.7, #2 = 24.0 ± 4.6, #3 = 37.0 ± 17.0, #4 = 23.3 ± 11.4, #5 = 14,3 ± 2.1, #6 = 13,7 ± 9.3, #7 = 2,7 ± 1.2, #8 = 1.0 ± 0,0, #9 = 1.0 ± 0,0, #10 = 0.0 ± 0,0, #11 = 0,3 ± 0,6, #12 = 0.0 ± 0,0. For hver fraksjon, ble 3 tilfeldige felt fotografert. Merk at når teller mest beriket brøken #3, fant vi at 95% av centrioles er positivt for CrSAS-6 og α-tubulin (n = 205 centrioles). (H) A forholdet mellom antall centrioles i micrographs målte området brukes til å beregne antall centrioles i området av røret. Hvor centriole per µL kan beregnes fra 10 µL opprinnelig sentrifugeres fraksjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 3
Figur 3 : Isolert centrioles er centrifuged bruker konsentratorer. (A) dette panelet viser sentrifugering enhetene måtte konsentrere centrioles på coverslips før immunofluorescence, inkludert et 15 mL runde bunn rør, en konsentrator, en 12 mm dekkglassvæske og en støtte adapter apparater. (B) dette panelet viser fremgangsmåten for å montere sentrifugering enheten. Paneler C-E viser AC confocal bilder av centrioles farget CrSAS-6 (rød) og α-tubulin (grønn) (C) uten eller (D-E) med presisjonstørking. Senkninger tilsvarer området angitt av en hvit boks i visningene for lavere forstørrelse. Baren skala er 10 µm. Merk at centrioles er anriket i dekkglassvæske (den stiplede linjen representerer grensen av konsentrert området). (F) denne grafen representerer antall centrioles per synsfelt uten og med presisjonstørking. Fem tilfeldige synsfelt ble analysert. Gjennomsnittlig antall centrioles er, uten konsentrator, 29.8 ± 2.9, og konsentrator, 182.6 ± 11,5, P < 0,0001. Den statistiske betydningen ble vurdert av en kort t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Single-partikkel snitt på isolerte C. reinhardtii centrioles. (A) dette panelet viser Z stakk bilder av centrioles farget med GT335 og anskaffes ved hjelp av en SIM mikroskop. (B) disse panelene viser en maksimal intensitet Z projeksjon stablede bilder. Skala bar = 1 µm. (C) disse panelene viser et representativt bilde med en invertert kontrast. Rammemargen representerer en zoome inn å visualisere centrioles bedre. (D) disse panelene Vis partikkel plukking. Rammemargen angir hvordan partiklene ble plukket. (E) Dette er eksempler på 5 utdraget partikler. (F) dette panelet viser partikler etter justeringen. (G) dette panelet viser partikler etter å bruke en maske. Paneler H og jeg vise to klasse gjennomsnitt: (H) en topp utsikt (63 partikler) og (jeg) en side-visning (98 partikler). Dobbeltpilene angir dimensjonene av GT335. Skala bar = 250 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Supplerende filen 1. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende filen 2. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

En av utfordringene i biologi er å dechiffrere den nøyaktige lokaliseringen av proteiner i arkitektonisk sammenheng. Centriole er en ideell struktur bruke disse metodene, som sin arkitektur har studert ved bruk av cryo-elektron tomografi, avslørende interessante ultrastructural funksjoner langs. Men fordi dimensjoner nær oppløsning grensen i optisk mikroskopi er det vanskelig å nøyaktig lokalisere et protein av immunofluorescence til en strukturell sub regionen centriole bruker konvensjonell mikroskop30.

Oppløsningen i optisk mikroskopi er begrenset av Diffraksjon lys som gir, grovt, lateral maksimal oppløsning på 200 nm i optisk mikroskopi24. Men denne grensen har vært består av en av de store gjennombrudd i de siste 20 årene i optisk mikroskopi: oppfinnelsen av super-oppløsning metoder. Disse metodene kan bildet utover Diffraksjon grensene i forskjellige oppløsninger: 120 nm for SIM, 50 nm for tilsvarende nedbryting (STED) og 20-40-nm for single-molekylet lokalisering mikroskopi (SMLM)24. Med denne nye utviklingen av super-oppløsning mikroskopi er de strukturelle underregionene av centriole oppnåelig. Men i praksis er det fortsatt vanskelig å nøyaktig bestemme lokaliseringen av et protein til en strukturell element for den viktigste grunnen til at de eldre centrioles finnes bare 2 eksemplarer per celle og ha tilfeldig orientering, som gjør tolkningen av lokalisering er vanskelig. Derfor ble en protokoll satt opp som tillater forskere å bilde av super-oppløsning et stort antall centrioles, øke sjansen til å observere ikke-tvetydig orientering. Viktigere, som denne metoden er avhengig av bruken av isolerte centrioles, vi gir en metode for å rense intakt C. reinhardtii centrioles som inneholder eldre centrioles og procentrioles.

Til slutt, på grunn av området av centriole retninger som kan avbildes med denne protokollen, enkelt-partikkel analyse kan brukes med elektronmikroskop programvare. Dette resulterer i generasjon av gjennomsnittlig klasser av centrioles i en bestemt retning. Viktigere, kan disse 2D bildene deretter brukes til å vurdere lokaliseringen av et bestemt protein langs centriole. Faktisk denne metoden kan brukes på to-farge super oppløsning, og én farge kan brukes til å vise centriole skjelettet (f.eks, tubulin) mens andre fargen kan tilskrives en bestemt centriolar protein. Ved å trekke gjennomsnitt med én eller to farger, blir det enklere å registrere et protein langs centriole (proksimale, sentral eller distale). Merk at de to kanalene skal justeres nøyaktig for å hindre noen villedende tolkninger. Videre hjelper gjennomsnitt over topp utsikt dechiffrere hvis et protein regionaliserer inne det centriolar lumen, langs microtubule veggen, eller utenfor centriole.

Denne metoden har fordelen å fastslå lokaliseringen av spesifikke proteiner som kan være vanskelig å lokalisere ellers på grunn av heterogene merking. Merk at andre metoder for å tilordne proteiner i centrioles er beskrevet i correlative 3D SIM/SMLM, for eksempel vurdere spesifikk retningene av centrioles ved å bestemme elliptiske profilen på en markør danner en torus rundt den centriole av SIM tenkelig. Bruke denne parameteren, er det mulig å lokalisere protein med en presisjon på 4-5 nm30. Merk også at metoden beskrevet her bruker isolert centrioles med intakt procentrioles, et tegn på at centriole arkitektur er mest sannsynlig i stor grad konservert. Men kan ikke vi utelukke at noen arkitekturdetaljer er forstyrret under rensing, som centriole diameter varierende med konsentrasjonen av divalent kasjoner som forsterket med isolering av menneskelig centrosome5.

En av de viktige trinnene av protokollen presenteres her er å skaffe tilstrekkelig konsentrert isolerte centrioles i forskjellige retninger mottakelig for Fluo-SPA. Gjør først sørge for renhet og effektiviteten av centriole isolasjon prosedyren. En lav konsentrasjon av isolerte centrioles forhindrer riktig bildebehandling og ytterligere bildebehandling. For dette formålet gir vi en metode for å berike antall centrioles per synsfelt. Hvor mange centrioles i fraksjonen brukes, skal volumet i presisjonstørking justeres med største volum 250 µL.

Viktigere, har denne metoden blitt utviklet for en cellevegg minus cw15-C. reinhardtii celler. I denne stammen gir cellen vegg skjørhet en riktig lysis av celler, og dermed frigjøringen av innholdet. Denne protokollen er ikke effektiv for vill-type C. reinhardtii celler, som cellen vegg forhindrer en riktig lysis. Alternative strategier som sonication eller en pre-inkubering av cellene med autolysin, et enzym som kan redusere cellevegg31, må settes på plass å endre cellen vegg før du installerer isolasjon protokollen presenteres her.

Dette oppsettet kan brukes med ulike typer mikroskoper, alt fra konvensjonelle AC confocal mikroskop til høy gjennomstrømning dedikert super-oppløsning mikroskop. Merk at når du gjør SMLM, en spesiell buffer er nødvendig for riktig bildebehandling, og dermed et kammer tilpasset en 12 mm dekkglassvæske med buffer på dekkglassvæske skal brukes. Etterfølgende imaging utføres med invertert mikroskop. Hvis mikroskop oppsett ikke tillater en 12 mm dekkglassvæske, brukes protokollen presenteres her til 18 mm coverslips bruker en 30 mL runde bunn rør og en modifisert adapter og konsentrator. Det er også viktig å Merk at kvaliteten på den endelige rekonstruksjonen i SMLM vil avhenge av kvaliteten på den flekker og den primære antistoff brukes, samt metoden fiksering.

I sammendraget gir vi en metode som kan brukes på bildet mange centrioles etterfulgt av Fluo-SPA som vil generere gjennomsnitt av centrioles i forskjellige retninger, dermed bidra til å lokalisere centriolar protein med presisjon. Viktigere, brukes denne metoden mer generelt til isolerte centrioles fra andre arter, andre, eller store macromolecular samlinger. Endelig utvalg forberedelse tilnærming presenteres her, kombinert med ny algoritme utvikling for single-partikkel analyse av fluorescerende SMLM data32, kan åpne ytterligere forbedring i den molekylære kartografi av store macromolecular samlinger.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Pierre Gönczy og BioImaging & optikk plattform (BIOP) på École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), Lausanne, Sveits, hvor SIM bilder av centrioles ble anskaffet. Nikolai Klena og Davide Gambarotto støttes av europeiske Research Council (ERC) starter Grant (StG) 715289 (aksent) og Maeva Le Guennec, Paul Guichard og Virginie Hamel av det sveitsiske National Science Foundation (SNSF) PP00P3_157517. Susanne Borgers er støttet av universitetet i Geneve.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse monoclonal anti-apha tubulin (clone DM1A) Abcam ab7291  dilution 1:300
DNaseI Roche 10104159001
12 mm coverslips Roth YX03.1
18 mm coverslips Roth LH23.1
K2HPO4 Fluka 60355
KH2PO4 Fluka 60230
Tris base Biosolve Chimie SARL 0020092391BS
acetic acid Carlo Erba Reagents 524520
NH4Cl Sigma A-4514
CaCl2 Sigma C-7902
MgSO4 Sigma 63140-500G-F
steritop filter Millipore SCGPT05RE
sucrose Sigma S7903-1KG
HEPES AppliChem PanReac A3724,0250
PIPES Sigma P6757-500G
MgCl2 ACROS ORGANICS 197530010
NP-40 AppliChem PanReac A1694,0250
Round-bottom (Kimble) tubes 15 mL Fisherscientific 09-500-34
Round-bottom (Kimble) tubes 30 mL Fisherscientific 09-500-37
cover glass staining rack Thomas scientific 8542E40
crystal polystyrene transmission lab box FISHERS 11712944
Methanol VWR 20864.32
BSA Roche 10735086001
Triton X100 Roth 3051.3
goat anti-mouse coupled to Alexa 488  invitrogen A11029 dilution 1:1,000
goat anti-rabbit coupled to Alexa 568 invitrogen A11036 dilution 1:1,000
mounting medium abcam ab188804
Tube, thinwall polypropylene Beckman Coulter 326823
Poly-D-Lysine 1 mg/mL SIGMA  A-003-E
Mouse monoclonal anti-Polyglutamylation modification mAb (GT335) Adipogen AG-20B-0020 dilution 1:1,000
glycerol mounting medium with DAPI and DABCO Abcam ab188804
50 mL conical tubes Falcon 14-432-22
Eppendorf 5810R centrifuge Eppendorf 5811000622
Beckman JS-13.1 swinging bucket rotor Beckman Coulter 346963
Beckman SW 32Ti rotor Beckman Coulter 369694
parafilm Bemis  13-374-10
Leica TCS SP8 with Hyvolution mode Leica 
OSRAM L18W/954 LUMILUX  Luxe Daylight/ OSRAM
Whatman filter paper Sigma  WHA1001325
CrSAS-6/Bld12 antibody dilution 1:300 (Hamel el al., 2014)
Scipion http://scipion.i2pc.es/
EM CCD camera (Andor iXON DU897) Andor

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bornens, M. The centrosome in cells and organisms. Science. 335 (6067), 422-426 (2012).
  2. Nigg, E. A., Holland, A. J. Once and only once: mechanisms of centriole duplication and their deregulation in disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 297-312 (2018).
  3. Nigg, E. A., Raff, J. W. Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease. Cell. 139 (4), 663-678 (2009).
  4. Gönczy, P. Towards a molecular architecture of centriole assembly. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (7), 425-435 (2012).
  5. Paintrand, M., Moudjou, M., Delacroix, H., Bornens, M. Centrosome organization and centriole architecture: their sensitivity to divalent cations. Journal of Structural Biology. 108 (2), 107-128 (1992).
  6. Winey, M., O'Toole, E. Centriole structure. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).
  7. Dippell, R. V. The development of basal bodies in paramecium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 461 (1968).
  8. Allen, R. D. The morphogenesis of basal bodies and accessory structures of the cortex of the ciliated protozoan Tetrahymena pyriformis. The Journal of Cell Biology. 40 (3), 716-733 (1969).
  9. Li, S., Fernandez, J. -J., Marshall, W. F., Agard, D. A. Three-dimensional structure of basal body triplet revealed by electron cryo-tomography. The EMBO Journal. 31 (3), 552-562 (2012).
  10. Guichard, P., Chrétien, D., Marco, S., Tassin, A. -M. Procentriole assembly revealed by cryo-electron tomography. The EMBO Journal. 29 (9), 1565-1572 (2010).
  11. Guichard, P., et al. Native architecture of the centriole proximal region reveals features underlying its 9-fold radial symmetry. Current Biology. 23 (17), 1620-1628 (2013).
  12. Hirono, M. Cartwheel assembly. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).
  13. Bornens, M., Paintrand, M., Berges, J., Marty, M. C., Karsenti, E. Structural and chemical characterization of isolated centrosomes. Cell Motility and the Cytoskeleton. 8 (3), 238-249 (1987).
  14. Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R., Marshall, W. F. Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes. Current Biology. 15 (12), 1090-1098 (2005).
  15. Kilburn, C. L., et al. New Tetrahymena basal body protein components identify basal body domain structure. The Journal of Cell Biology. 178 (6), 905-912 (2007).
  16. Bauer, M., Cubizolles, F., Schmidt, A., Nigg, E. A Quantitative analysis of human centrosome architecture by targeted proteomics and fluorescence imaging. The EMBO Journal. 35 (19), 1-15 (2016).
  17. Hamel, V., et al. Identification of Chlamydomonas Central Core Centriolar Proteins Reveals a Role for Human WDR90 in Ciliogenesis. Current Biology. 27 (16), 2486-2498 (2017).
  18. Cavalier-Smith, T. basal body and flagellar development during the vegetative cell cycle and the sexual cycle of Chlamydomonas reinhardii. Journal of Cell Science. 16 (3), 529 (1974).
  19. Geimer, S., Melkonian, M. The ultrastructure of the Chlamydomonas reinhardtii basal apparatus: identification of an early marker of radial asymmetry inherent in the basal body. Journal of Cell Science. 117, Pt 13 2663-2674 (2004).
  20. Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole. Current Biology. 17 (24), 2169-2174 (2007).
  21. Hamel, V., et al. Correlative multicolor 3D SIM and STORM microscopy. Biomedical Optics Express. 5 (10), 3326 (2014).
  22. Guichard, P., et al. Cell-free reconstitution reveals centriole cartwheel assembly mechanisms. Nature Communications. 8, 14813 (2017).
  23. Hiraki, M., Nakazawa, Y., Kamiya, R., Hirono, M. Bld10p constitutes the cartwheel-spoke tip and stabilizes the 9-fold symmetry of the centriole. Current Biology. 17 (20), 1778-1783 (2007).
  24. Sahl, S. J., Hell, S. W., Jakobs, S. Fluorescence nanoscopy in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (11), 685-701 (2017).
  25. Hutner, S. H., Provasoli, L., Schatz, A., Haskins, C. P. Some Approaches to the Study of the Role of Metals in the Metabolism of Microorganisms. Proceedings of the American Philosophical Society. 94 (2), 152-170 (1950).
  26. Keller, L. C., Marshall, W. F. Isolation and proteomic analysis of chlamydomonas centrioles. Methods in Molecular Biology. 432 (1), 289-300 (2008).
  27. Borlinghaus, R. T., Kappel, C. HyVolution-the smart path to confocal super-resolution. Nature Methods. 13 (3), (2016).
  28. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  29. de la Rosa-Trevín, J. M., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  30. Gartenmann, L., et al. A combined 3D-SIM/SMLM approach allows centriole proteins to be localized with a precision of ∼4-5 nm. Current Biology. 27 (19), 1054-1055 (2017).
  31. Jaenicke, L., Kuhne, W., Spessert, R., Wahle, U., Waffenschmidt, S. Cell-wall lytic enzymes (autolysins) of Chlamydomonas reinhardtii are (hydroxy)proline-specific proteases. European Journal of Biochemistry. 170 (1-2), 485-491 (1987).
  32. Salas, D., et al. Angular reconstitution-based 3D reconstructions of nanomolecular structures from superresolution light-microscopy images. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9273-9278 (2017).

Tags

Biologi problemet 139 Centrioles basal kroppen fluorescens mikroskopi organelle isolasjon enkelt-partikkel gjennomsnitt Chlamydomonas reinhardtii super-oppløsning mikroskopi
Isolasjon og fluorescens Imaging for Single-partikkel rekonstruksjon av <em>Chlamydomonas</em> Centrioles
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klena, N., Gambarotto, D., Le… More

Klena, N., Gambarotto, D., Le Guennec, M., Borgers, S., Guichard, P., Hamel, V. Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles. J. Vis. Exp. (139), e58109, doi:10.3791/58109 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter