Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering och fluorescens Imaging för singel-partikel rekonstruktion av Chlamydomonas Centrioles

Published: September 21, 2018 doi: 10.3791/58109
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Cell Biology, Sciences III, University of Geneva
* These authors contributed equally

Summary

Vi har utvecklat en strategi för att rena och bild ett stort antal centrioles i olika inriktningar mottaglig för super-resolution mikroskopi och singel-partikel genomsnitt.

Abstract

Centrioles finns stora makromolekylära församlingar som är viktigt för ett korrekt genomförande av grundläggande cell biologiska processer såsom celldelning, cell motilitet eller cellsignalering. Gröna alger Chlamydomonas reinhardtii har visat sig vara en insiktsfull modell i studien av centriol arkitektur, funktion och protein sammansättning. Trots stora framsteg mot förståelse centriolar arkitektur är en av de nuvarande utmaningarna att avgöra exakt lokalisering av centriolar komponenter inom strukturella regioner av centriol för att bättre förstå deras roll i centriol biogenes. En stor begränsning ligger i resolutionen av fluorescensmikroskopi, vilket komplicerar tolkningen av protein lokalisering i denna organell med dimensioner nära diffraktionsgränsen. För att ta itu med denna fråga, tillhandahåller vi en metod för att rena och bild ett stort antal C. reinhardtii centrioles med olika inriktningar använder super-resolution mikroskopi. Denna teknik tillåter vidarebearbetning av data genom fluorescerande singel-partikel genomsnitt (Fluo-SPA) på grund av det stora antalet centrioles som förvärvats. Fluo-SPA genererar medelvärden av målat C. reinhardtii centrioles i olika riktningar, vilket underlättar lokaliseringen av olika proteiner i centriolar underregioner. Ännu viktigare, kan denna metod tillämpas på bilden centrioles från andra arter eller andra stora makromolekylära sammanställningar.

Introduction

Centriol är en evolutionärt bevarade organell som utgör kärnan av centrosome i djurceller och kan fungera som en basal kropp (kallad centrioles nedan) till mallen cilier eller flageller i många Eukaryoter1,2. Som sådan, är centrioles kritiska för grundläggande cell biologiska processer alltifrån spindelenhet till cell signalering. Därför har defekter i centriol montering eller funktion har associerats med flera mänskliga sjukdomar inklusive ciliopathies och cancer3.

Centrioles är niofaldig, symmetrisk, mikrotubuli triplet-baserade cylindriska strukturer som är, normalt ~ 450 nm lång och ~ 250 nm brett4,5,6,7. Konventionella elektronmikroskopi och cryo-elektron tomografi av centrioles från olika arter har visat att centrioles är polariserat längs deras långa axeln med tre distinkta regioner: en proximal region, en central kärna och en distala region5 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. viktigast av allt, var och en av dessa regioner visar strukturella särdrag. Först innehåller lumen i regionen som 100 nm lång proximala cartwheel struktur ansluten till mikrotubuli triplett genom de pinhead element12. Andra regionen 300 – 400 nm lång centrala innehåller fibrösa tätheter i lumen och strukturella funktioner längs mitotiska inre ansikte: den Y-formade länkaren, C-tubuli svansen och den A-tubuli stub-9. Slutligen, 50 – 100 nm distala regionen uppvisar sub distala och distala bihang som omger den distala delen av centriol5,13.

De senaste två decennierna har präglats av upptäckten av ett ökande antal centriolar proteiner, vilket leder till en aktuell uppskattning av ca 100 olika proteiner som en del av de centriol14,15,16, 17. Trots dessa framsteg, exakt lokalisering av dessa proteiner inom centriol förblir svårfångade, särskilt inom strukturella underregioner. Viktigt, är tilldela en exakt lokalisering till strukturella regioner i centriol avgörande för en bättre förståelse för deras funktion. I detta avseende har C. reinhardtii centrioles varit avgörande för båda aspekterna av första delimitating olika strukturella drag längs den cylinder9,18,19, som sedan får forskare att korrelera lokaliseringen av en delmängd av proteiner med hjälp av fluorescerande mikroskopi till en sub strukturella region. Detta omfattar till exempel proteiner Bld12p och Bld10p, som lokaliserar i regionen proximala och i strukturen cartwheel särskilt20,21,22,23. Listan av underkonstruktionen lokaliserade proteiner innehåller också POB15 och POC16, två nya proteiner identifierats av masspektrometri som pryder regionen inre central kärna av C. reinhardtii centrioles17.

Detta dokument innehåller en fullständig beskrivning av den metod som utvecklats för att isolera och bild C. reinhardtii centrioles för efterföljande super-resolution mikroskopi och singel-partikel genomsnitt. För att uppnå detta mål är det viktigt att avgränsa de tekniska begränsningar som måste övervinnas. Först kan centriol rening påverka den övergripande arkitekturen, med cartwheel struktur ofta försvinner under de olika stegen i isolering9. För det andra är centriol dimensioner mycket nära diffraktionsgränsen i optisk mikroskopi. Den laterala resolution som kan erhållas i konfokalmikroskopi faktiskt omkring 200 nm24, liknande till diametern på centriol och resolutionen som i z-axeln handlar om 2 – 3 x lägre, vilket leder till en Anisotrop volym. För det tredje, heterogenitet antikropp märkning och centriol läggning kunde begränsa tolkningen behövs för att lokalisera ett protein i en specifik centriolar delregion. Slutligen existerar centrioles i endast två exemplar per cell, vilket gör det svårt att förvärva ett stort antal bilder och hitta en otvetydig centriol orientering. För att kringgå dessa tekniska frågor, utvecklat vi en metod som bygger på att tillämpa super-resolution mikroskopi på stort antal isolerade centrioles att antar olika inriktningar. Först kommer vi att beskriva ett protokoll för att rena C. reinhardtii centrioles som möjliggör rening av strukturellt intakt centrioles och procentrioles som innehåller cartwheel. Sedan kommer vi att beskriva ett stegvisa protokoll för att koncentrera sig på centrioles på coverslips för avbildning av konventionella eller super-resolution fluorescerande mikroskopi. Detta viktiga steg tillåter för att öka antalet centrioles som avbildas i flera riktningar. Slutligen kommer vi att beskriva ett förfarande för att utföra enkel-partikel genomsnitt på data förvärvade den fluorescerande Mikroskop som underlättar upptäckt av centrioles i olika inriktningar. Sammantaget kan denna metod tillämpas på bilden centrioles från olika arter eller andra stora makromolekylära sammanställningar.

Protocol

1. Media förberedelse för C. reinhardtii kultur och centriol isolering

  1. Förberedelse av media, kultur C. reinhardtii celler
    Obs: Stegen nedan beskriva beredning av stamlösningar för 1 x TAP (Tris-acetat fosfat) medium.
    1. Förbered en fosfatbuffert (pH 7), genom att blanda 250 mL 1 M K2HPO4 (174.2 g K2HPO4 kompletteras till 1 L med destillerat vatten) med ~ 170 mL 1 M KH2PO4 (136.09 g KH2PO4 i 1 L). Justera blandningen för att nå pH 7.
    2. Bered en (40 x) genom att blanda 96,8 g av Tris, 40 mL fosfatbuffert (pH 7) och 40 mL ättiksyra och justera lösningen till 1 L med destillerat vatten.
    3. Förbereda lösning B (40 x) med 16 g NH4Cl, 2 g CaCl2och 4 g MgSO4. Var försiktig med att upplösa CaCl2 i destillerat vatten separat innan den läggs till de andra komponenterna. Justera lösningen till 1 L med destillerat vatten.
    4. Förbereda Hutners spårämnen buffert25 enligt följande.
      1. För 1 L av buffert, lös varje förening i den angivna vattenmängden: EDTA dinatrium salt 50 g i 250 mL, ZnSO4.7H2O (22 g i 100 mL), H3BO3 (11,4 g i 200 mL), MnCl2.4h2O (5.06 g i 50 mL) , CoCl2.6H2O (1.61 g i 50 mL), CuSO4.5H2O (1,57 g i 50 mL), (NH4) 6Mo7O24.4h2O (1.10 g i 50 mL) och FeSO4.7H2O (4,99 g i 50 mL).
        Obs: EDTA skall upplösas i kokande vatten, och den FeSO4 bör förberedas senast att undvika oxidation.
      2. Blanda alla lösningar utom EDTA och koka upp. Tillsätt sedan EDTA och lösningen ska bli grön. Efter upplösning allt, cool lösningen på 70 ° C. Vid denna temperatur, tillsätt 85 mL varm 20% KOH-lösning (20 g i 100 mL). Justera lösningen till 1 L med destillerat vatten vid rumstemperatur (RT).
      3. Lägg en bomull-plug till kolven och låt lösningen stå i 1 eller 2 veckor, skaka den 1 x per dag. Lösningen bör inledningsvis vara gröna och slå sedan lila, lämnar en rost-brun fällning; ta bort fällningen med filterpapper tills lösningen är klar. Frysa alikvoter och förvaras vid-20 ° C.
    5. Förbereda 1 x TAP medium att växa C. reinhardtii celler genom att blanda följande komponenter: 25 mL av lösning A (40 x) och 25 mL av lösning B (40 x) med 1 mL Hutners spårelement buffert25och justera blandningen till 1 L med destillerat vatten. Sterilisera blandningen med 0,4 µm filter.
  2. Media inför centriol rening
    1. Förbereda en deflagellation buffert med 5% sackaros i 10 mM HEPES (pH 7) på en slutlig volym av 500 mL med destillerat vatten.
    2. Bereda 250 mL 0,5 M ättiksyra.
    3. Bereda 250 mL av en 1 M K-PIPES stamlösning (pH 7,2) av första lägga 50 mL H2O att upplösa rör pulvret och sedan lägga till 10 N KOH tills lösningen börjar bli klart. Titrera till pH 7,2 med 10 N och 1 N KOH och justera lösningen till en slutlig volym av 250 mL med H2O.
    4. Förbereda 5 sackaros lösningar (w/w) enligt följande.
      Obs: Alla sackaros lösningar måste filtreras efter lösbarhet med 0,4 µm filter inkopplad i en spruta. Observera att 60% - och 70%-sackaros-lösningar är svåra att solubilize och bör placeras i vattenbad pre värmas vid 60 ° C att underlätta lösbarhet. Blanda varje 10 min tills sackaros är helt upplöst.
      1. Att förbereda 25% sackaros, väger 25 g sackaros och anpassa vikt att 100 g genom att lägga till 10 mM K-rör (pH 7,2).
      2. Att förbereda 60% sackaros, väger 60 g sackaros och anpassa vikt att 100 g med 10 mM K-rör (pH 7,2).
      3. Förbereda sackaros lösningar för sackaros övertoningen. Förbereda 40% sackaros genom väger 40 g sackaros och justera lösningen på 100 g med 10 mM K-rör (pH 7,2). På samma sätt förbereda 50% (w/w) och 70% (w/w) sackaros.
      4. Lagra lösningarna vid-20 ° C. Var försiktig med att resuspendera sackaros lösningarna ordentligt efter upptining.
    5. Bereda 100 mL lyseringsbuffert av blandande 1 mM HEPES (pH 7), 0,5 mM MgCl2, och 1% NP-40 och hålla det vid 4 ° C. Alltid förbereda denna buffert färska på dagen för experimentet. Lägg till anti proteas tabletter på dagen för centriol isolering.
    6. Bered 1 x fosfat buffert saltlösning (PBS) (pH 7,4) genom att blanda 8 g NaCl, 2 g av KCl, 1,44 g av Na2HPO4och 0.24 g KH2PO4 i 800 mL destillerat H2O. Justera pH till 7,4 med HCl. Bring volymen av blandningen till 1 L med destillerat H2O.

2. isolering av C. reinhardtii Centrioles

Obs: Se figur 1.

  1. Kultur och expansion av C. reinhardtii celler
    1. På kvällen dag 1 Inokulera en cw15 - stam från en solid platta i en kultur Erlenmeyerkolv, innehållande 10 mL 1 x TAP. Odla cellerna under vit fluorescerande ljus (60 µE/m2s) för 2 – 3 dagar vid 23 ° C.
    2. Dag 3, späd kulturen 10 x (till 100 mL) i 1 x trycker och odla cellerna under ljus för 2 – 3 dagar vid 23 ° C.
    3. På dag 6, späd kulturen 10 x i 1 x tryck för att erhålla 1 L av kultur. Odla cellerna under ljus vid 23 ° C tills kulturen når en mörkgrön färg som anger en ungefärlig cell densiteten av ~ 1 x 107 celler/mL26 (dag 9 – 10).
  2. Rening av C. reinhardtii centrioles
    1. Centrifugera cw15 - cellerna vid 600 x g i 10 min i 50 mL koniska rör. Tvätta pelleten av celler 1 x med 50 mL 1 x PBS och spinna vid 600 x g i 10 min. återsuspendera pelleten i 100 mL rumstempererat deflagellation buffert med en pipett.
    2. Deflagellate cellerna med en pH-chock genom att långsamt droppar 0,5 M ättiksyra till ett slutligt pH på 4,5 – 4,7 på en magnetisk omrörare och inkubera cellerna för 2 min. Tillsätt långsamt droppar 1 N KOH att återställa pH-värdet till 7,0.
    3. Centrifugera cellerna vid 600 x g i 10 min att ta bort någon fristående flageller. Avlägsna supernatanten och lagra pelleten på isen. Tvätta pelleten 2 x med 50 mL 1 x PBS förhandskyld vid 4 ° C. Sedan, snurra pelleten på 600 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
    4. Återsuspendera pelleten i 30 mL 1 x PBS och långsamt laddar suspensionen till en 25%-sackaros kudde av 20 mL utan blandning (figur 1B).
    5. Snurra vid 600 x g i 15 minuter vid 4 ° C att ta bort de återstående flageller i supernatanten; cellerna är fördelade i 25% sackaros (figur 1C). Håll bara de nedersta 20 mL (röd pil, figur 1C) genom noggrant Aspirera supernatanten med en insugningsventil.
    6. Tvätta de återstående 20 mL genom tillsats av 20 mL kallt 1 x PBS. Snurra provet vid 600 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Återsuspendera pelleten i 10 mL kallt 1 x PBS (vid 4 ° C). Se till att det finns inga klumpar så att följande Lys träffar alla celler på en gång.
    7. Överföra den återsuspenderade pelleten till en ny 250 mL flaska. Tillsätt 100 mL lyseringsbuffert kompletteras med 5.000 enheter av DNAS till cellerna. Det är viktigt att lägga lyseringsbuffert till cellerna, och inte tvärtom. Inkubera blandningen för 1 h vid 4 ° C och blanda noggrant genom att vända flaskan varje 15 min utan att bilda eventuella bubblor.
    8. Centrifugera lyserat cellerna vid 600 x g i 10 minuter vid 4 ° C i en 50 mL konisk tub att ta bort eventuella cellfragment. Om Lys har utförts korrekt, cellpelleten bör vara vit (figur 1D). Samla in supernatanten med en pipett och lasta det på en 30 mL runda-botten tub som innehåller en 60%-sackaros kudde, placeras på is. Sedan, snurra röret vid 10.000 x g under 30 minuter vid 4 ° C.
      Obs: Flera runda-botten rör (Tabell för material) kan behövas, beroende på volymen av supernatanten.
    9. Sug ut supernatant upp till 1 mL ovan sackaros dynan. Observera gul gränssnittet mellan de 1 mL av återstående supernatanten och de 2 mL av sackaros dynan. Blanda försiktigt sackaros och återstående supernatanten med skurna P1000 spets. Inte snurra på detta steg; Annars kan procentrioles förloras i detta skede. Samla alla sackaros kuddar och lagra dem på isen.
    10. Förbereda en 40% - till 70%-sackaros övertoning i en tunna 38,5 mL polypropylen rör genom att försiktigt tillsätta 3 mL 70% sackaros (vid 4 ° C), följt av 3 mL 50% och slutligen 3 mL av 40% sackaros. Ladda de poolade gränssnitt på 40% - till 70%-sackaros övertoningen; gör detta långsamt eftersom den kalla sackaros är mycket trögflytande. Balansera rören med 10 mM K-PIPES bufferten (pH 7,2) och centrifugera dem 68,320 x g (t.ex., med en SW32Ti rotor) för 1 h och 15 min vid 4 ° C.
    11. Samla 12 x 500 µL fraktioner vid 4 ° C genom att göra ett hål i botten av röret med en 0,8 mm nål utan att störa olika sackaros lagren. Med en skära P200 pipettspetsen, förbereda ytterligare 10 µL portioner från varje fraktion som ska användas för den följande immunofluorescens. Snapin-frysa fraktioner i flytande kväve.
      Obs: Isolerade centrioles kan analyseras genom elektronmikroskopi att se till att den övergripande ultrastruktur av centrioles bevaras.

3. kvantifiering av isolerade Centrioles på Coverslips: centrifugering och immunofluorescens

Obs: Se figur 2.

  1. Förbereda rör och coverslips
    1. Använd 1 glasrör runda-botten (15 mL) per fraktion för att analysera centriolar fraktioner (12 rör totalt).
    2. Sätta en anpassad täckglas stöd adapter (kallas adapter nedan) i round-botten röret. Placera ett sterilt 12 mm täckglas runda-botten röret.
      Obs: Använde här vi 12 mm coverslips, men protokollet kan anpassas för 18 mm coverslips med 30 ml runda-botten rör.
    3. Tillsätt 5 ml av nedkylda 10 mM K-rör (pH 7,2) vid 4 ° C. Kontrollera att täckglaset inte är flytande och stannar nere på adaptern. Placera rören på is.
  2. Centrifugering av centrioles
    1. Späd respektive 10 µL fraktion med 100 µL kallt 10 mm K-rör (pH 7,2). Återsuspendera utspädning väl till komplett försvinnandet av sackaros (figur 2A). Fyll varje utspädda bråkdel i en runda-botten rör.
    2. Snurra röret vid 10.000 x g i 10 min (t.ex., med en JS-13,1 svängande hink rotor) vid 4 ° C.
    3. Återställa täckglaset genom att infoga en handgjord hooked enhet i hålet i den slitsade kanten av adaptern och lyft upp försiktigt.
      Obs: Handgjorda hooked enheten kan göras med injektionsnålen manuellt hooked och formas till en hemmagjord minne (siffror 2B-2D).
    4. När du når toppen av runda-botten röret kan fälla kanten av adaptern med en behandskade fingrar och ta bort täckglaset med pincett. Var noga med att komma ihåg vilken sida av täckglaset innehåller centrioles. Fortsätt att behandla coverslips för immunofluorescens.
  3. Immunofluorescens färgning och avbildning av isolerade C. reinhardtii centrioles
    Obs: Se figur 2.
    1. Förbered materialet för immunofluorescens färgning enligt följande.
      1. Förbereda en skyddsglaset färgning rack i en kristall polystyren överföring lab box (60 mm i längd av 50 mm i bredd av 43 mm i höjd). Fyll den med 100% metanol och lagra den på-20 ° C.
      2. Förbereda en fuktkammare. För detta, montera den fuktig kammaren genom att placera en vatten-fuktad vävnad tillsammans med insidan kanterna på ett torg petriskål (figur 2E). Lägg en bit av laboratoriet tätning wrap (se Tabell för material) till mitten av petriskål där antikropp mixar kommer att placeras under förfarandet för immunofluorescens (steg 3.3.2–3.3.3). Täcka locket och fuktig kammare med aluminiumfolie att skydda den från ljus.
    2. Immunostain de isolerade centrioles som följer.
      1. Fixa coverslips med centrioles direkt efter centrifugering (steg 3.2.4) av inkubering under 5 minuter i rutan fylld med-20 ° C metanol (steg 3.3.1.1).
      2. Ta bort coverslips med pincett och placera dem i en genomskinlig laboratorium låda (se Tabell för material) fylld med 50 mL 1 x PBS och tvätta dem för 5 min i rumstemperatur.
      3. Pipettera 60 µL av primär antikropp mix [primär antikroppar utspätt i 1% bovint serumalbumin (BSA) och 0,05% Tween-20 i PBS] på bit av laboratoriet tätning wrap i en fuktig kammare. Lägg försiktigt coverslips ovanpå antikropp mixen med de centrioles som vetter mot nedgången. Inkubera i coverslips för 45 min med primära antikroppar.
        Obs: De primära antikroppar som användes för att generera de representativa resultat är kanin polyklonala Bld12 (1:300) och mus α-tubulin (DM1A) (1:300).
      4. Ta bort coverslips och tvätta dem för 5 min i 1 x PBS, som beskrivs i steg 3.3.2.2. Inkubera i coverslips för 45 min med sekundära antikroppar i PBS med 1% BSA och 0,05% Tween-20.
        Obs: De sekundära antikroppar som användes för att generera de representativa resultat är geten antimus kopplat till Alexa 488 (1:1, 000) och get anti-kanin kopplat till Alexa 568 (1:1, 000).
      5. Ta bort coverslips och tvätta dem för 5 min i 1 x PBS, som beskrivs i steg 3.3.2.2.
    3. Montera coverslips på en glasskiva genom att lägga till 3 µL av montering medium på bilden och försiktigt placera coverslips på toppen (centrioles inför monteringsmedium). Försegla kanten täckglaset med nagellack.
    4. Bild de isolerade centrioles på en confocal Mikroskop på en 63 X olja mål med en N.A. 1.4 samtidigt ansöker deconvolution27 (se Tabell för material).
      Obs: Här, användes följande inställningar: 500 – 545 nm för Alexa 488 och 580 – 635 nm för Alexa 568.

4. koncentrationen av Centrioles på mitten av Coverslips

Obs: Se figur 3.

  1. Material förberedelse
    1. Förbereda en 15 mL glasrör runda-botten på isen, en anpassad täckglas stöd adapter (kallas adapter hädanefter .stl fil som tillhandahålls som kompletterande fil 1), anpassade koncentrator (.stl fil som kompletterande fil 2) och 10 mM K-rör (pH 7.2) vid 4 ° C.
    2. Förbereda poly-D-lysin (PDL)-belagda coverslips. Späd 10 x 1 mg/mL PDL stamlösning med H2O. Tvätta först, coverslips med 70% EtOH, avlägsna etanolen och låt coverslips torka. Täck coverslips med PDL och inkubera dem i 30 min i rumstemperatur. Tvätta coverslips 3 x med vatten och låt dem torka.
      Obs: Coat coverslips med PDL att öka antalet isolerade centrioles bifogas coverslips.
  2. Centrifugering
    1. Placera ett sterilt 12 mm täckglas på den infällda, botten-slutet av anrikningsverket, hålla PDL pälsen nedåt. Cap täckglaset genom att placera adaptern direkt ovanpå. Invertera runda-botten röret och placera den över koncentrator, täckglas och adapter.
    2. Tryck ensemblen med pincett tills den når botten av runda-botten röret försiktigt, och Invertera röret. Tillsätt 10 mM K-PIPES buffert (pH 7,2) till runda-botten röret tills den kommer till toppen av anrikningsverket. Kontrollera att det inte förblir eventuella bubblor i centralcylindern av anrikningsverket.
    3. Varsamt Tillsätt 100 µL av 10 mM K-PIPES buffert (pH 7,2) till en alikvot innehållande berikad centriol bråkdel och grundligt blanda volymen.
    4. Ta bort 100 µL av 10 mM K-PIPES buffert (pH 7,2) från stadens ihåliga koncentratorn och tillsätt 100 µL av den berikade centriolar fraktionen i 10 mM K-PIPES buffert (pH 7,2) till anrikningsverket, ta hand att innehållet förblir i stadens ihåliga ihåliga centrum.
    5. Centrifugera 10 000 x g i 10 min (t.ex., med en JS-13,1 svängande hink rotor) i en nedkylda Centrifugera vid 4 ° C.
    6. Ta bort fönmunstycket med pincett.
    7. Återställa täckglaset genom att infoga en handgjord hooked enhet i hålet i den slitsade kanten av adaptern och lyft upp försiktigt. När du når toppen av runda-botten röret kan fälla kanten av adaptern med en behandskade fingrar och ta bort täckglaset med pincett. Var noga med att komma ihåg vilken sida av täckglaset innehåller centrioles. Fortsätt att behandla coverslips för immunofluorescens.
      Obs: Handgjorda hooked enheten kan göras med en sprutans nål manuellt hooked och formas till en hemmagjord minne (Siffror 2B-D).
    8. Utför fixering och immunofluorescens färgning av koncentrerade centrioles som görs i steg 3.3.2–3.3.4.

5. singel-partikel genomsnitt

Obs: Se figur 4.

  1. Tänkbar för singel-partikel genomsnitt
    1. Montera täckglaset på en bild med en vanlig anti-fading monteringsmedium. Utföra strukturerade belysningen mikroskopi (2D SIM) imaging använder ett CFI Apochromat Frida mål (100 X, NA 1,49, WD 0,12 mm) och en back belysta EM CCD-kamera.
      Obs: Förvärv tiden sattes till 100 ms på en kamera som läser av 3 MHz. Ett 2,5 X objektiv användes för SIM-avbildning.
      Obs: Förvärvades den datamängd som presenteras här på en 3D-SIM-Mikroskop (se Tabell för material).
    2. Bild av centrioles genom att förvärva en stor bunt med bilder som omfattar den totala centriol signal, genom att ställa in den övre och nedre positionen Z-stacken ovan och nedan centriol signalen, respektive. Fortsätt projektet stacken och utföra singel-partikel genomsnitt per steg 5.2 och 5.3.
  2. Projektion av en stack
    1. Öppna bildstapel med ImageJ. Klicka sedan på 'bildstaplar → → Z Project'. Ange vilket projektion somMax intensitet'.
    2. Invertera bilden genom att klicka på 'Redigera → Invertera'. Spara projektionen som genereras (.tif format).
  3. Singel-partikel anpassningen till Scipion
    1. Skapa ett nytt projekt i Scipion genom att trycka på röda 'Skapa projekt' -knappen överst på sidan. På den vänstra panelen, dubbelklicka på 'import → importera micrographs'.
    2. Fyll den 'katalogen' och 'mönster ' fält enligt datakatalogen och namn. Hålla den förvalda parametrar. Klicka på 'Kör'.
    3. Dubbelklicka på 'Partiklar → plockning → xmipp3 - manuell plockning (steg 1)'. Klicka på förstoringsglasikonen nära fältet 'Input micrographs' och välj de importerade micrographs från steg 5.3.1. Klicka på 'Kör'.
    4. Välj partiklar från de olika micrographs genom att klicka på dem i det nyöppnade fönstret. När du är klar med varje mikrofotografi, klicka på den röda knappen '+ samordnar'.
    5. Dubbelklicka på 'Partiklar → extrakt → xmipp3 - extrakt partiklar'. Klicka på förstoringsglasikonen nära fältet 'Input koordinater' och välj plockade koordinater från steg 5.3.4. Fyll 'Box partikelstorlek (px)' enligt de partiklar mått. 'Preprocess' på fliken Ställ in Dust Removal: ingen (det kan generera artefakter); Invertera kontrast: ingen (svarta partiklar, vit bakgrund); Fas vändning: nr (kopplat till CTF korrigering); Normalisera: Ja.
    6. Klicka på 'Kör'. När jobbet är gjort, kontrollera de extraherade partiklarna genom att markera rutan i den jobb (gränser blivit tjockare) och klicka på 'analysera resultaten (nedre vänstra hörnet av huvudmenyn).
    7. Dubbelklicka på '2D → anpassa → xmipp3 - justera med cl2d'. Klicka på förstoringsglasikonen nära fältet 'Input partiklar' och välj extraherade partiklarna från steg 5.3.5. Använd inte en referensavbildning. Klicka på 'Kör'.
    8. Dubbelklicka på ' 2D → anpassa → mer → xmipp3 - tillämpa justeringen 2d'. Klicka på förstoringsglasikonen nära fältet 'Input partiklar' och välj justerad partiklarna från steg 5.3.7.
    9. Klicka på 'Kör' som i steg 5.3.6. Resultaten kan kontrolleras genom att klicka på 'Analysera resultat' efter val av jobb boxen.
    10. Dubbelklicka på 'Partiklar → Mask → xmipp3 - tillämpa 2d mask'.
    11. Klicka på förstoringsglasikonen nära fältet 'Input partiklar' och välj justerad partiklarna från steg 5.3.9. 'Mask source' är inställt på ”geometri”. Ange sedan parametrarna för masken som masktyp: cirkulär; Radie (px): Letar du efter en partikel (en centriol) utan något runt det, klicka på den 'trollspö ' ikonen till vänster som öppnar ett fönster för att hitta det perfekta värdet; Skift Center: Nej (om partikeln är perfekt centrerad) eller Ja (om partikeln är skiftat); X-center offset: enligt partikel position; Y-center offset: enligt partikel position. Klicka på 'Kör'.
    12. Använda knappen ' analysera resultat ' för att kontrollera om masken tillämpas korrekt. Om inte, högerklicka på 'Verkställ maskera 2d' jobbet och välj 'Redigera'. Ändra parametrarna för masken (storlek eller SKIFT) och kör det igen med den 'Kör' knappen.
    13. Dubbelklicka på '2D → → xmipp3 - klassificera, cl2d'.
    14. Klicka på förstoringsglasikonen nära fältet 'Input partiklar' och välj maskerade partiklarna från steg 5.3.11. Antalet klasser bör vara att få cirka 50 partiklar per klass. Klicka på 'Kör'.
    15. Kolla resultaten genom att klicka på knappen ' analysera resultat ' . I det öppna fönstret, klicka på ikonen 'öga' intill ”vad Visa”.
    16. Det nya fönstret tillåter inspektion av de genererade klasserna genom att välja 'Classes2D' i menyn 'Block' . Kontrollera innehållet i varje klass genom att välja 'Class00N_Particles' i samma meny. Inspektera varje klass för att identifiera vilka som innehåller endast dåliga partiklar. Gå tillbaka till vyn 'Classes2D' och välja klasser med bra partiklar genom att klicka på varje. Det är möjligt att välja flera klasser genom att hålla 'Ctrl' -tangenten intryckt under valet.
    17. När alla klasser med bra partiklar har valts, klicka på '+ partiklar' skapa en delmängd med dessa partiklar.
    18. Välj ett par uppsättningar av klasser som representerar olika inriktningar av partiklarna i samma fönster. Skapa en ny delmängd genom att klicka på '+ medelvärden'.
    19. För varje orientering/Genomsnittligt vald, gör följande.
      1. Dubbelklicka på '2D → anpassa → xmipp3 - justera med cl2d'.
      2. Klicka på förstoringsglasikonen nära fältet 'Input partiklar' och välj bra partiklarna från steg 5.3.17. Ange 'Användning en referensavbildning' till 'Ja'. Klicka på förstoringsglasikonen nära fältet 'Referens bild' och klicka på vit pil vänster till 'Skapa delmängd' jobb från steg 5.3.18 och välj bilden att använda den som referens. Dubbelklicka på ett objekt att öppna den i ett separat fönster och kontrollera vilket objekt som det är. Klicka på 'Kör'.
      3. Dubbelklicka på ' 2D → anpassa → mer → xmipp3 - tillämpa justeringen 2d'. Klicka på förstoringsglasikonen nära fältet 'Input partiklar' och välj justerad partiklarna från steg 5.3.19.2.
      4. Klicka på 'Kör'.
      5. Kontrollera resultatet av justeringen ('Analysera resultat '); Det visar de justerade partiklarna och medelvärdet av dessa partiklar.
      6. Om genomsnittet är bra och partiklarna är alla orienterade på samma sätt, spara Genomsnittligt genom att klicka på ' avancerade → ImageJ' och spara bilden med ImageJ.
      7. Om Genomsnittligt kan förbättras, Välj alla väl orienterad bilder och skapa en ny delmängd med knappen '+ partiklar' . Upprepa steg 5.3.19.1–5.3.19.4 tills delmängden rengörs (alla dåliga partiklar tas bort). Varje gång är justeringen utförs (steg 5.3.19.2), hänvisningen är satt till sista genererade genomsnittet (från iteration till iteration, den genomsnittliga kvalitet ökar).

Representative Results

C. reinhardtii centriol isolering:
För att isolera centrioles, cw15- C. reinhardtii celler odlas i flytande kultur i flera dagar under ljus och därefter pelleterat genom centrifugering vid 600 x g för 10 min. Pelleted celler spolades 1 x med PBS och återsuspenderade i en deflagellation buffert före deflagellation genom att utföra en pH chock med 0,5 M ättiksyra till ett slutligt pH på 4,5 – 4,7 för 2 min (figur 1A). Ett tillägg av 1 N KOH användes för att återställa pH till 7,0. För att separera fristående flageller från cellen organ, var deflagellated celler först centrifugeras för att ta bort huvuddelen av flageller. Pelleten sedan tvättades 2 x med PBS och resuspended i 30 mL PBS före lastningen det långsamt på en 25%-sackaros kudde (figur 1B). Röret var snurrade vid 600 x g i 15 minuter vid 4 ° C att ta bort de flesta av de fristående flageller. Efter centrifugering, cell organ var spridda i sackaros dynan (figur 1C) och återvinns genom att ta bort de cirka 30 mL av supernatanten (tills den röda pilen i figur 1C). De resulterande 20 mL av tvättade cellerna var sedan resuspended i 20 mL kall PBS och centrifugeras vid 600 x g i 10 min. Därefter supernatanten förkastades, och cellerna helt var resuspended i 10 mL PBS. Cellerna har överförts till en 250 mL-flaska och lyseringsbuffert lades till de återsuspenderade cellerna på en gång. DNAS lades till Lys och inkuberas i 1 h vid 4 ° C. Efter en centrifugeringssteget ta bort cellfragment (se den vita pelleten i figur 1D), supernatanten samlades in och noggrant lastas en 2 mL 60%-sackaros kudde före centrifugering vid 10 000 x g under 30 minuter vid 4 ° C. Observera att för 100 mL lysis, 8 rör 15 ml användes för att utföra det här steget, motsvarande 12,5 mL lyseringsbuffert lastas på 2 mL av sackaros per rör. Efter centrifugering, de flesta av supernatanten togs bort till 1 mL ovan dynan. 1 mL av återstående supernatanten var sedan samlas in med 2 mL dynan och sedan blandas och poolade för att erhålla en slutlig volym av 24 mL. Poolen var sedan lastas på en 40% - 50%, 70%-sackaros lutning och snurrade vid 68,320 x g i 1 h och 15 min vid 4 ° C. Slutligen, de isolerade centrioles samlades in genom ett hål i nedre delen av centrifugering röret med hjälp av en nål och dropparna samlades 12 x 500 µL fraktioner. På grund av den höga tätheten av olika sackaros, drop bildas mycket långsamt i början (70% sackaros) och sedan mer snabbt (40% sackaros).

Immunofluorescens av isolerade Centrioles
För att bedöma kvaliteten på förfarandet för isolering, var 10 µL av varje insamlat gradienten bråkdel sedan centrifugeras på ett täckglas som använder ett täckglas stöd adapter (figur 2A-2D). Ännu viktigare, för att ta bort säkert täckglaset, en anpassad hooked enhet utformades (figur 2B). Därefter analyserades coverslips av immunofluorescens. Antikroppar mot CrSAS-6(Bld12p) användes i denna studie för att indikera närvaron av cartwheel struktur och α-tubulin (DMA1) för att markera centriolar väggen. Genom att räkna antalet centrioles som var positiva för både CrSAS-6 och α-tubulin per synfält och sedan beräkna det totala antalet centrioles per fraktioner, var det möjligt att fastställa vilka fraktioner berikades för isolerade centrioles ( Figur 2F-2 H). Intressant, berikades 6 fraktioner för centrioles (figur 2F och 2 G, fraktioner #1 – 6), med en topp för bråkdel #3, medan de senaste bråk var inte, som anger att rening arbetat. Observera att i detta särskilda experiment, 95% av de totala centrioles var positiva för CrSAS-6 och α-tubulin i bråkdel #3. Detta indikerar att mest isolerade centrioles behållit sin cartwheels. Om ingen berikning av centrioles observeras i de första fraktionerna, förfarandet för isolering fungerade inte och bör upprepas. Observera att vissa flagellar bitar kan observeras oftast i fraktionerna saknar centrioles.

Nästa, för att beräkna det totala antalet centrioles per µL, antalet centriol per synfältet ska multipliceras kvoten som presenteras i figur 2H. Resultatet ska sedan delas med volymen av det bråk som används för immunofluorescens för att erhålla antalet centrioles per µL. I detta särskilda isolering förfarande innehöll den mest berikat fraktionen ca 37 centrioles för ett område av 0.00846 mm2 (med ett synfält 92 x 92 µm2). Ytan av avsnittet tube var 7,5 mm radie med en total yta av 176 mm2. Motsvarade förhållande var sedan 176/0.00846 = 20,803.8, så sammanlagt 769,740 centrioles (37 x 20, 803.8) i 10 µL. Antalet centrioles i 1 µL var därför 76,974.

Koncentrationen av isolerade Centrioles på Coverslips:
Öka antalet centrioles per fält ökar chansen att upptäcka entydiga centriol orientering, samt öka chansen att upptäcka liknande riktlinjer som kan användas för ytterligare partikel genomsnitt förfaranden. Centrioles från koncentrerad fraktioner är fortfarande gles på täckglaset, utvecklat vi ett centrifugering tillbehör för att koncentrera centrioles mitt i den täckglas (figur 3A) heter en koncentrator. Observera att en .stl fil med de precisa åtgärderna för 3D-utskrift är försedd med detta manuskript.

Först, ett täckglas av 12 mm var monterad på koncentratorn (figur 3B). Adaptern placerades ovanpå täckglaset och runda-botten röret var inverterad och placeras över monterade adaptern och koncentrator. Runda-botten röret var sedan försiktigt inverterad, vilket möjliggör lastning av provet (protokoll steg 4.2). Centrioles var sedan centrifugeras vid 10 000 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Efter det, centrioles utsattes för immunofluorescens och färgas för CrSAS-6/Bld12p och α-tubulin (figur 3 c-3E). Viktigast av allt, utan koncentrator sågs ca 30 centrioles per synfält (figur 3C), medan 183 centrioles sågs per synfält när anrikningsverket var används (figur 3D-3F). Observera att centrioles täcks endast en disk 4 mm i diameter i mitten på täckglas. Detta resultat visar att steget koncentration fungerar och gör en 6-fold anrikning av centrioles i en definierad region i den coverslips, således lättnader deras upptäckt och imaging.

Fluorescerande-singel-partikel som genomsnitt av isolerade C. reinhardtii Centrioles:
Här, med SIM-mikroskopi som kan nå en upplösning på omkring 120 nm, centrioles färgas för monoglutamylated tubulin (GT335, figur 4), en tubulin ändring i centriolar mikrotubuli, var avbildad24. C. reinhardtii centrioles är omkring 500 nm lång, alltid i par, och ofta finns med associerade, nyligen dupliceras probasal organ (kallade procentrioles nedan) och tvärstrimmig mikrotubulära-associerade fibrer19. Detta slutmontering var därför ca 1 µm stora. Av denna anledning och för bild av centrioles i sin helhet, rekommenderar vi att förvärva en Z-stack på de isolerade centrioles.

Här, efter förvärvet genererades en slutbild genom att utföra en maximal intensitet projektion med ImageJ28 (bild/travar/Z project/max intensitet projektion, figur 4B). En enda-partikel analys med kryo-elektron mikroskopi programvara utfördes för att göra klasser av centrioles med liknande riktlinjer från sådana bilder, och sedan genomsnitt utfördes. Gör var bilden färgen först inverterad så att bättre visualisera objekten (figur 4C). Centrioles plockades manuellt i en låda centrerad över varje partikel med hjälp av fritt tillgängliga Scipion programvara29 som integrerar flera elektronmikroskopi programvaror såsom Xmipp3 (figur 4D). Observera att storleken på rutan som definieras av användaren. Här, lådor med 50 x 50 pixlar för en pixelstorlek på 31.84 nm användes. Nästa, alla partiklar var extraheras (figur 4E) och justeras med hjälp av Xmipp3 (figur 4F). Därefter tillämpades en cirkelformad mask av 12 pixlar i radie för att isolera varje centriol från den centriolar-par (figur 4G). Partiklarna klassificerades sedan, med Xmipp3, för att generera flera medelvärden. Endast hölls homogen klass medelvärden, vilket innebär att partiklar som avviker från klass genomsnitten exkluderades manuellt. Detta steg upprepades för att generera ett nästan perfekt medelvärde för varje valt orientering. Efter fem iterationerna, två klasser av medelvärden genererades: en ovanifrån från 63 objekt (figur 4H) och en sida Visa från 98 partiklar (figur 4jag) av monoglutamylated centrioles. Måtten på objektet bestämdes genom att mäta avståndet mellan topparna av intensitet tomt profilen längs monoglutamylation signalen.

Ännu viktigare, sida Visa klass genomsnittliga längd är 260 nm med en diameter på 250 nm, jämförbar med den uppmätta monoglutamylated tubulin signal som visades att lokalisera till en region av 286 ± 33 nm i längd i kärnan av centriol17.

Figure 1
Figur 1 : Rening av C. reinhardtii centrioles. (A) Detta är en schematisk representation av varje steg som leder till isolering av C. reinhardtii centrioles. Det omfattar representativa steg protocol (B) innan och (C) efter centrifugering på 25%-sackaros övertoningen. Den röda pilen i panel C visar den minsta volymen att hålla efter centrifugering. (D), denna panel visar vita pelleten lyserat celler efter centrifugering. Den svarta pilen anger pelleten. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 2
Figur 2 : Centrifugering set-up att utföra immunofluorescens på isolerade centrioles. (A) 10 µL av varje insamlade bråkdel späds först i 100 µL 10 mM K-PIPES (pH 7,2). (B) Detta är en schematisk representation av centrifugering enheter, som omfattar ett 15 mL runda-botten rör, ett 12 mm täckglas, en adapter för täckglaset, och en specialanpassad hooked produkt att återvinna täckglaset efter centrifugering. Paneler C och D Visa ritningar som förklarar hur till återvinna täckglaset efter centrifugering. (C) plats hooked verktyget i hålet i den slitsade kanten av adaptern och (D) försiktigt. (E) dessa är bilder av den fuktig kammare som behövs för att utföra immunofluorescens imaging. Pilen anger det 12 mm täckglaset. (F) dessa är representativa confocal bilder på 63 X (zooma 2) av gradient fraktioner #1-8, insamlade under förfarandet för rening och färgas för CrSAS-6 (röd) och α-tubulin (grön). Inläggningar motsvarar regionen indikeras av en vit ruta i vyerna lägre förstoring. Skalstapeln = 10 µm. (G) Detta är en graf som representerar antalet centrioles positivt för både CrSAS-6 och α-tubulin per synfält i respektive fraktion. Observera berikning i fraktioner #1-6. Det genomsnittliga antalet centrioles per fält i respektive fraktion: #1 = 16,3 ± 4,7, #2 = 24,0 ± 4,6, #3 = 37,0 ± 17,0, #4 = 23,3 ± 11,4, #5 = 14.3 ± 2,1, #6 = 13,7 ± 9,3, #7 = 2,7 ± 1,2, #8 = 1,0 ± 0,0, #9 = 1,0 ± 0,0, #10 = 0,0 ± 0,0, #11 = 0.3 ± 0,6, #12 = 0,0 ± 0,0. För varje fraktion, var 3 slumpmässiga fält avbildade. Observera att vid inventering den mest berikat fraktionen #3, Vi hittade att 95% av centrioles är positivt för CrSAS-6 och α-tubulin (n = 205 centrioles). (H) A förhållandet mellan antalet centrioles närvarande i det uppmätta området av micrographs används för att beräkna det totala antalet centrioles i området av röret. Centriol antalet per µL kan beräknas från 10 µL ursprungligen centrifugeras fraktioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 3
Figur 3 : Isolerade centrioles centrifugeras använda koncentratorer. (A) denna panel visar centrifugering apparater som behövs att koncentrera centrioles till coverslips före immunofluorescens, inklusive en 15 mL runda-botten tub, en koncentrator, ett 12 mm täckglas och en support adapter apparatur. (B) denna panel visar stegen för att montera centrifugering enheten. Paneler C-E visar confocal bilder av centrioles målat för CrSAS-6 (röd) och α-tubulin (grön) (C) utan eller (D-E) med koncentratorn. Inläggningar motsvarar regionen indikeras av en vit ruta i vyerna lägre förstoring. Skalstapeln är 10 µm. Notera att centrioles är berikade mitt i den täckglas (den streckade linjen representerar gränsen till området koncentrerad). (F), denna graf representerar antalet centrioles per synfält utan och med koncentratorn. Fem slumpmässiga synfält analyserades. Det genomsnittliga antalet centrioles är, utan koncentrator, 29,8 ± 2,9, och med koncentrator, 182,6 ± 11.5, P < 0,0001. Den statistiska signifikansen bedömdes genom ett oparat t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Singel-partikel genomsnitt på isolerade C. reinhardtii centrioles. (A) denna panel visar Z stack bilder av centrioles färgas med GT335 och förvärvade med SIM-Mikroskop. (B) dessa paneler visar en maximal intensitet Z projektion av staplade bilder. Skalstapeln = 1 µm. (C) dessa paneler visar en representativ bild med en inverterad kontrast. Infällt representerar en zooma in att visualisera de bättre centrioles. (D) dessa paneler Visa partikel plockning. Infällt anger hur partiklarna plockades. (E) är exempel på 5 extraherade partiklarna. (F) panelen visar partiklar efter justering. (G), denna panel visar partiklar efter applicering en mask. Paneler H och jag Visa två klass medelvärden: (H), en top view (63 partiklar) och (jag) sidoutsikt (98 partiklar). De dubbla pilarna anger måtten på GT335 signalen. Skalstapeln = 250 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Kompletterande fil 1. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 2. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Discussion

En av utmaningarna i biologi är att dechiffrera den exakt lokaliseringen av proteiner i arkitektoniska sammanhang. Centriol är en idealisk struktur att tillämpa dessa metoder, eftersom dess arkitektur har studerats med hjälp av cryo-elektron tomografi, avslöjar intressanta ultrastrukturella funktioner längs dess längd. På grund av dess dimensioner nära gränsen på upplösning i optisk mikroskopi är det dock svårt att exakt lokalisera ett protein genom immunofluorescens till en strukturell delregion av den centriol som använder konventionella Mikroskop30.

Upplösningen i optisk mikroskopi begränsas av diffraktion av ljus som ger, ungefär, en lateral maximal upplösning på 200 nm i optisk mikroskopi24. Denna gräns har dock varit förbi en av de stora genombrotten under de senaste 20 åren i optisk mikroskopi: uppfinningen av super-upplösning metoder. Dessa metoder kan bilden utanför diffraktion gränserna vid olika upplösningar: 120 nm för SIM-kort, ca 50 nm för stimulerad emission utarmning (STED) och 20 – 40 nm för singel-molekyl lokalisering mikroskopi (SMLM)24. Med dessa nya utvecklingar av super-resolution mikroskopi är strukturella underregionerna av centriol uppnåeliga. I praktiken är det dock fortfarande svårt att exakt bestämma localizationen av ett protein till ett strukturelement för den främsta anledningen att de mogna centrioles existerar i endast 2 exemplar per cell och har slumpmässiga riktlinjer, vilket gör tolkningen av lokalisering svårt. Av denna anledning inrättades ett protokoll som tillåter forskare att bilden av super-upplösning ett stort antal centrioles, ökar chansen att iaktta icke-tvetydigt riktlinjer. Ännu viktigare, eftersom denna metod förlitar sig på användningen av isolerade centrioles, vi tillhandahåller en metod för att rena intakt C. reinhardtii centrioles som innehåller mogen centrioles och procentrioles.

Slutligen, på grund av spänna av centriol riktlinjer som kan avbildas med detta protokoll, singel-partikel analys kan tillämpas med hjälp av elektronmikroskopi programvara. Detta resulterar i framtagningen av genomsnittliga klasser av centrioles i en viss läggning. Ännu viktigare, kan dessa resulterande 2D-bilder sedan användas till bedöma lokaliseringen av ett specifikt protein längs centriol. Ja, denna metod kan tillämpas på tvåfärgad super-upplösning bilder, och en färg kan användas för att avslöja centriol skelettet (t.ex., tubulin), medan den andra färgen kan hänföras till ett visst centriolar protein. Genom att subtrahera de medelvärden som erhålls med en färg eller två färger, blir det lättare att registrera ett protein längs centriol (proximala, centrala eller distala). Observera att de två kanalerna bör anpassas exakt för att förhindra någon vilseledande tolkningar. Dessutom hjälper medelvärden av top vyer dechiffrera om ett protein lokaliserar inuti centriolar lumen, längs mikrotubuli väggen, eller utanför centriol.

Denna metod har fördelen att fastställa lokaliseringen av specifika proteiner som kan vara svåra att lokalisera annars på grund av heterogena märkning. Observera att andra metoder för att kartlägga proteiner inom centrioles har beskrivits i korrelat 3D-SIM/SMLM med, exempelvis att bedöma de särskilda riktlinjerna av centrioles genom att bestämma de elliptiska profilen av en markör som bildar en torus runt den centriol av SIM-imaging. Med denna parameter, är det möjligt att lokalisera protein med en precision av 4 – 5 nm30. Observera också att den metod som beskrivs här används isolerade centrioles med intakt procentrioles, ett tecken på att centriol arkitekturen är mest sannolikt till stor del bevarad. Dock kan vi inte utesluta att vissa arkitektoniska funktioner störs under reningen, såsom centriol diameter varierar med koncentrationen av divalenta katjoner som förstärks med isolering av den mänskliga centrosome5.

En av de kritiska steg i de protokoll som presenteras här är att erhålla tillräckligt koncentrerad isolerade centrioles i olika inriktningar mottagliga för Fluo-SPA. Gör först säkerställa renheten och effektiviteten i förfarandet centriol isolering. En låg koncentration av isolerade centrioles förhindrar korrekt imaging och ytterligare bildbehandling. För detta ändamål tillhandahåller vi en metod för att berika antalet centrioles per synfält. Beroende på antalet centrioles i det bråk som används, bör den volym som laddats i anrikningsverket justeras, med en maximal volym på 250 µL.

Viktigast av allt, har denna metod utvecklats för en cellvägg minus cw15-C. reinhardtii celler. I denna stam möjliggör bräckligheten i cellväggen en ordentlig Lysering av cellerna och därmed befrielsen av dess innehåll. Detta protokoll är inte effektivt för vildtyp C. reinhardtii celler, som cellväggen hindrar en korrekt lysis. Alternativa strategier såsom ultraljudsbehandling eller en före inkubering av cellerna med autolysin, ett enzym som kan försämra de cellvägg31, skulle behöva vidtas för att förändra cellväggen innan protokollet isolering som presenteras här.

Detta upplägg kan användas med olika typer av Mikroskop, allt från konventionella confocal Mikroskop till hög genomströmning dedikerade super-upplösning Mikroskop. Observera att när du gör SMLM, en särskild buffert krävs för korrekt avbildning och, således, en kammare som anpassats för ett 12 mm täckglas med bufferten ovanpå täckglaset bör användas. Efterföljande imaging utförs med inverterade Mikroskop. Om Mikroskop set-up inte tillåter ett 12 mm täckglas, kan det protokoll som presenteras här tillämpas på 18 mm coverslips använder en 30 mL runda-botten tub och en modifierad adapter och koncentrator. Det är också viktigt att Observera att kvaliteten på den slutliga återuppbyggnaden i SMLM kommer att bero på kvaliteten på färgningen och av primär antikropp används, liksom metoden för fixering.

Sammanfattningsvis tillhandahåller vi en metod som kan tillämpas på bilden talrika centrioles följt av Fluo-SPA som kommer att generera medelvärden av centrioles i olika riktningar, vilket bidrar till att lokalisera centriolar protein med precision. Viktigast av allt, kan denna metod tillämpas mer allmänt till isolerade centrioles från andra arter, till andra organeller, eller till stora makromolekylära sammanställningar. Slutligen den prov förberedelse metoden presenteras här, kombinerat med senaste algoritmutveckling för singel-partikel analys av fluorescerande SMLM data32, kunde öppna ytterligare förbättring i den molekylära cartography av stora makromolekylära församlingar.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Pierre Gönczy och BioImaging & Optik plattform (Vävnadsprover) vid École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), Lausanne, Schweiz, där SIM-bilderna av centrioles förvärvades. Nikolai Klena och Davide Gambarotto stöds av Europeiska forskningsrådet (ERC) Starting Grant (StG) 715289 (ACCENT) och Maeva Le Guennec, Paul Guichard och Virginie Hamel av den schweiziska National Science Foundation (SNSF) PP00P3_157517. Susanne Borgers stöds av universitetet i Genève.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse monoclonal anti-apha tubulin (clone DM1A) Abcam ab7291  dilution 1:300
DNaseI Roche 10104159001
12 mm coverslips Roth YX03.1
18 mm coverslips Roth LH23.1
K2HPO4 Fluka 60355
KH2PO4 Fluka 60230
Tris base Biosolve Chimie SARL 0020092391BS
acetic acid Carlo Erba Reagents 524520
NH4Cl Sigma A-4514
CaCl2 Sigma C-7902
MgSO4 Sigma 63140-500G-F
steritop filter Millipore SCGPT05RE
sucrose Sigma S7903-1KG
HEPES AppliChem PanReac A3724,0250
PIPES Sigma P6757-500G
MgCl2 ACROS ORGANICS 197530010
NP-40 AppliChem PanReac A1694,0250
Round-bottom (Kimble) tubes 15 mL Fisherscientific 09-500-34
Round-bottom (Kimble) tubes 30 mL Fisherscientific 09-500-37
cover glass staining rack Thomas scientific 8542E40
crystal polystyrene transmission lab box FISHERS 11712944
Methanol VWR 20864.32
BSA Roche 10735086001
Triton X100 Roth 3051.3
goat anti-mouse coupled to Alexa 488  invitrogen A11029 dilution 1:1,000
goat anti-rabbit coupled to Alexa 568 invitrogen A11036 dilution 1:1,000
mounting medium abcam ab188804
Tube, thinwall polypropylene Beckman Coulter 326823
Poly-D-Lysine 1 mg/mL SIGMA  A-003-E
Mouse monoclonal anti-Polyglutamylation modification mAb (GT335) Adipogen AG-20B-0020 dilution 1:1,000
glycerol mounting medium with DAPI and DABCO Abcam ab188804
50 mL conical tubes Falcon 14-432-22
Eppendorf 5810R centrifuge Eppendorf 5811000622
Beckman JS-13.1 swinging bucket rotor Beckman Coulter 346963
Beckman SW 32Ti rotor Beckman Coulter 369694
parafilm Bemis  13-374-10
Leica TCS SP8 with Hyvolution mode Leica 
OSRAM L18W/954 LUMILUX  Luxe Daylight/ OSRAM
Whatman filter paper Sigma  WHA1001325
CrSAS-6/Bld12 antibody dilution 1:300 (Hamel el al., 2014)
Scipion http://scipion.i2pc.es/
EM CCD camera (Andor iXON DU897) Andor

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bornens, M. The centrosome in cells and organisms. Science. 335 (6067), 422-426 (2012).
  2. Nigg, E. A., Holland, A. J. Once and only once: mechanisms of centriole duplication and their deregulation in disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 297-312 (2018).
  3. Nigg, E. A., Raff, J. W. Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease. Cell. 139 (4), 663-678 (2009).
  4. Gönczy, P. Towards a molecular architecture of centriole assembly. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (7), 425-435 (2012).
  5. Paintrand, M., Moudjou, M., Delacroix, H., Bornens, M. Centrosome organization and centriole architecture: their sensitivity to divalent cations. Journal of Structural Biology. 108 (2), 107-128 (1992).
  6. Winey, M., O'Toole, E. Centriole structure. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).
  7. Dippell, R. V. The development of basal bodies in paramecium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 461 (1968).
  8. Allen, R. D. The morphogenesis of basal bodies and accessory structures of the cortex of the ciliated protozoan Tetrahymena pyriformis. The Journal of Cell Biology. 40 (3), 716-733 (1969).
  9. Li, S., Fernandez, J. -J., Marshall, W. F., Agard, D. A. Three-dimensional structure of basal body triplet revealed by electron cryo-tomography. The EMBO Journal. 31 (3), 552-562 (2012).
  10. Guichard, P., Chrétien, D., Marco, S., Tassin, A. -M. Procentriole assembly revealed by cryo-electron tomography. The EMBO Journal. 29 (9), 1565-1572 (2010).
  11. Guichard, P., et al. Native architecture of the centriole proximal region reveals features underlying its 9-fold radial symmetry. Current Biology. 23 (17), 1620-1628 (2013).
  12. Hirono, M. Cartwheel assembly. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).
  13. Bornens, M., Paintrand, M., Berges, J., Marty, M. C., Karsenti, E. Structural and chemical characterization of isolated centrosomes. Cell Motility and the Cytoskeleton. 8 (3), 238-249 (1987).
  14. Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R., Marshall, W. F. Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes. Current Biology. 15 (12), 1090-1098 (2005).
  15. Kilburn, C. L., et al. New Tetrahymena basal body protein components identify basal body domain structure. The Journal of Cell Biology. 178 (6), 905-912 (2007).
  16. Bauer, M., Cubizolles, F., Schmidt, A., Nigg, E. A Quantitative analysis of human centrosome architecture by targeted proteomics and fluorescence imaging. The EMBO Journal. 35 (19), 1-15 (2016).
  17. Hamel, V., et al. Identification of Chlamydomonas Central Core Centriolar Proteins Reveals a Role for Human WDR90 in Ciliogenesis. Current Biology. 27 (16), 2486-2498 (2017).
  18. Cavalier-Smith, T. basal body and flagellar development during the vegetative cell cycle and the sexual cycle of Chlamydomonas reinhardii. Journal of Cell Science. 16 (3), 529 (1974).
  19. Geimer, S., Melkonian, M. The ultrastructure of the Chlamydomonas reinhardtii basal apparatus: identification of an early marker of radial asymmetry inherent in the basal body. Journal of Cell Science. 117, Pt 13 2663-2674 (2004).
  20. Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole. Current Biology. 17 (24), 2169-2174 (2007).
  21. Hamel, V., et al. Correlative multicolor 3D SIM and STORM microscopy. Biomedical Optics Express. 5 (10), 3326 (2014).
  22. Guichard, P., et al. Cell-free reconstitution reveals centriole cartwheel assembly mechanisms. Nature Communications. 8, 14813 (2017).
  23. Hiraki, M., Nakazawa, Y., Kamiya, R., Hirono, M. Bld10p constitutes the cartwheel-spoke tip and stabilizes the 9-fold symmetry of the centriole. Current Biology. 17 (20), 1778-1783 (2007).
  24. Sahl, S. J., Hell, S. W., Jakobs, S. Fluorescence nanoscopy in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (11), 685-701 (2017).
  25. Hutner, S. H., Provasoli, L., Schatz, A., Haskins, C. P. Some Approaches to the Study of the Role of Metals in the Metabolism of Microorganisms. Proceedings of the American Philosophical Society. 94 (2), 152-170 (1950).
  26. Keller, L. C., Marshall, W. F. Isolation and proteomic analysis of chlamydomonas centrioles. Methods in Molecular Biology. 432 (1), 289-300 (2008).
  27. Borlinghaus, R. T., Kappel, C. HyVolution-the smart path to confocal super-resolution. Nature Methods. 13 (3), (2016).
  28. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  29. de la Rosa-Trevín, J. M., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  30. Gartenmann, L., et al. A combined 3D-SIM/SMLM approach allows centriole proteins to be localized with a precision of ∼4-5 nm. Current Biology. 27 (19), 1054-1055 (2017).
  31. Jaenicke, L., Kuhne, W., Spessert, R., Wahle, U., Waffenschmidt, S. Cell-wall lytic enzymes (autolysins) of Chlamydomonas reinhardtii are (hydroxy)proline-specific proteases. European Journal of Biochemistry. 170 (1-2), 485-491 (1987).
  32. Salas, D., et al. Angular reconstitution-based 3D reconstructions of nanomolecular structures from superresolution light-microscopy images. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9273-9278 (2017).

Tags

Biologi fråga 139 Centrioles basala fluorescensmikroskopi organell isolering singel-partikel genomsnitt Chlamydomonas reinhardtii super-resolution mikroskopi
Isolering och fluorescens Imaging för singel-partikel rekonstruktion av <em>Chlamydomonas</em> Centrioles
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klena, N., Gambarotto, D., Le… More

Klena, N., Gambarotto, D., Le Guennec, M., Borgers, S., Guichard, P., Hamel, V. Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles. J. Vis. Exp. (139), e58109, doi:10.3791/58109 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter