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Biology

अलगाव और Chlamydomonas Centrioles के एकल कण पुनर्निर्माण के लिए प्रतिदीप्ति इमेजिंग

Published: September 21, 2018 doi: 10.3791/58109
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Cell Biology, Sciences III, University of Geneva
* These authors contributed equally

Summary

हम एक रणनीति को शुद्ध और अलग झुकाव सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी और एकल कण औसत के लिए उत्तरदाई में centrioles की एक बड़ी संख्या में छवि विकसित की है ।

Abstract

Centrioles बड़े macromolecular विधानसभाओं जैसे कोशिका विभाजन, सेल गतिशीलता, या सेल संकेतन के रूप में मौलिक कोशिका जैविक प्रक्रियाओं के समुचित निष्पादन के लिए महत्वपूर्ण हैं । हरी शैवाल Chlamydomonas reinhardtii centriole वास्तुकला, समारोह के अध्ययन में एक व्यावहारिक मॉडल साबित हो गया है, और प्रोटीन संरचना । centriolar वास्तुकला को समझने की ओर महान प्रगति के बावजूद, मौजूदा चुनौतियों में से एक के लिए centriole के संरचनात्मक क्षेत्रों के भीतर centriolar घटकों के सटीक स्थानीयकरण का निर्धारण करने में बेहतर अपनी भूमिका को समझने के लिए है centriole उत्पत्ति । एक प्रमुख सीमा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, जो विवर्तन सीमा के करीब आयामों के साथ इस organelle में प्रोटीन स्थानीयकरण की व्याख्या पेचीदा के संकल्प में निहित है । इस सवाल से निपटने के लिए, हम एक विधि प्रदान कर रहे है के लिए एक शुद्ध और छवि reinhardtii centrioles की एक बड़ी संख्या में अलग झुकाव सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर के साथ । इस तकनीक की अनुमति देता है और फ्लोरोसेंट एकल कण औसत के माध्यम से डेटा के प्रसंस्करण (Fluo-SPA) centrioles की बड़ी संख्या के कारण अधिग्रहण कर लिया । Fluo-स्पा अलग झुकाव में दाग सी reinhardtii centrioles के औसत उत्पंन करता है, इस प्रकार centriolar उप क्षेत्रों में विशिष्ट प्रोटीन के स्थानीयकरण की सुविधा । महत्वपूर्ण बात यह विधि अन्य प्रजातियों या अन्य बड़े macromolecular सभाओं से इमेज centrioles पर लागू की जा सकती है ।

Introduction

centriole एक evolutionarily संरक्षित organelle है कि पशु कोशिकाओं में centrosome के मूल में निहित है और एक बेसल शरीर के रूप में कार्य कर सकते है (इसके बाद centrioles के रूप में संदर्भित) के लिए कई cilia1,2में कशाभिका या eukaryotes खाके । जैसे, centrioles बुनियादी कोशिका जैविक धुरी विधानसभा से सेल सिग्नलिंग को लेकर प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण हैं । इसलिए, centriole विधानसभा या समारोह में दोष ciliopathies और3कैंसर सहित कई मानव विकृतियों के साथ संबद्ध किया गया है ।

Centrioles नौ गुना कर रहे हैं, सममित, microtubule triplet आधारित बेलनाकार संरचनाओं कि कर रहे हैं, आमतौर पर, ~ ४५० एनएम लंबी और ~ २५० एनएम वाइड4,5,6,7। विभिंन प्रजातियों से centrioles के पारंपरिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी से पता चला है कि centrioles तीन अलग क्षेत्रों के साथ अपनी लंबी धुरी के साथ ध्रुवीकरण कर रहे हैं: एक समीपस्थ क्षेत्र, एक केंद्रीय कोर, और एक बाहर का क्षेत्र5 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. महत्वपूर्ण बात, इन क्षेत्रों में से प्रत्येक विशिष्ट संरचनात्मक सुविधाओं को प्रदर्शित करता है । सबसे पहले, १०० एनएम के लुमेन लंबे समीपस्थ क्षेत्र सिरा तत्व12के माध्यम से microtubule triplet से जुड़े गाड़ी का पहिया संरचना शामिल हैं । दूसरा, 300-400 एनएम लंबी मध्य क्षेत्र microtubules के भीतरी चेहरे के साथ लुमेन और संरचनात्मक सुविधाओं में रेशेदार घनत्व शामिल हैं: वाई के आकार का लिंकर, सी-tubule पूंछ, और एक-tubule डिटेल9. अंत में, 50-100 एनएम बाहर क्षेत्र प्रदर्शन उप बाहर और बाहर उपांग कि centriole5,13के बाहर का हिस्सा चारों ओर ।

पिछले दो दशकों centriolar प्रोटीन की एक बढ़ती हुई संख्या की खोज के द्वारा चिह्नित किया गया है, के बारे में १०० विशिष्ट प्रोटीन का एक मौजूदा आकलन करने के लिए अग्रणी centriole14,15,16का हिस्सा जा रहा है, 17. इन अग्रिमों के बावजूद, centriole के भीतर इन प्रोटीन का सटीक स्थानीयकरण, विशेष रूप से संरचनात्मक उप-क्षेत्रों के भीतर मायावी रहता है । महत्वपूर्ण बात, centriole के संरचनात्मक क्षेत्रों के लिए एक सटीक स्थानीयकरण निर्दिष्ट उनके समारोह की एक बेहतर समझ के लिए महत्वपूर्ण है । इस संबंध में, सी reinhardtii centrioles पहले सिलेंडर9,18,19है, जो फिर अनुमति के साथ विभिंन संरचनात्मक सुविधाओं delimitating द्वारा दोनों पहलुओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है शोधकर्ताओं ने एक उप संरचनात्मक क्षेत्र के लिए फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग प्रोटीन का एक सबसेट के स्थानीयकरण सहसंबंधी बनाना । यह शामिल है, उदाहरण के लिए, प्रोटीन Bld12p और Bld10p, जो समीपस्थ क्षेत्र में स्थानीयकरण, और गाड़ी का पहिया संरचना में विशेष रूप से20,21,22,23. उपसंरचना स्थानीयकृत प्रोटीन की सूची भी POB15 और POC16, दो उपंयास प्रोटीन मास स्पेक्ट्रोमेट्री कि सी reinhardtii centrioles17के भीतरी केंद्रीय कोर क्षेत्र को सजाने द्वारा की पहचान शामिल है ।

यह कागज बाद में सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी और एकल कण औसत के लिए अलग और छवि C. reinhardtii centrioles के लिए विकसित विधि का एक पूरा विवरण प्रदान करता है । इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए जरूरी है कि उन तकनीकी सीमाओं को चित्रित जाए, जिन्हें दूर करने की जरूरत है । सबसे पहले, centriole शुद्धि समग्र वास्तुकला को प्रभावित कर सकते हैं, गाड़ी का पहिया संरचना के साथ अक्सर9अलगाव के विभिंन चरणों के दौरान खो दिया जा रहा है । दूसरे, centriole के आयाम ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी में विवर्तन सीमा के बहुत करीब हैं । दरअसल, पार्श्व संकल्प है कि फोकल माइक्रोस्कोपी में प्राप्त किया जा सकता है के आसपास २०० एनएम24, centriole के व्यास के समान है, और जेडमें संकल्प-अक्ष के बारे में है 2-3x कम, एक अनिसोट्रोपिक मात्रा में अग्रणी । तीसरे, एंटीबॉडी लेबलिंग और centriole अभिविंयास के विविधता एक विशिष्ट centriolar उप क्षेत्र में एक प्रोटीन स्थानीयकरण की जरूरत व्याख्या सीमा सकता है । अंत में, centrioles सेल प्रति केवल दो प्रतियां में मौजूद हैं, यह मुश्किल छवियों की एक बड़ी संख्या में प्राप्त करने के लिए और एक अस्पष्ट centriole उंमुखीकरण खोजने के लिए बना । इन तकनीकी मुद्दों को दरकिनार, हम एक तरीका है कि अलग centrioles कि विभिंन झुकाव अपनाने की बड़ी संख्या पर सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी लागू करने पर निर्भर करता है विकसित की है । हम पहले सी reinhardtii centrioles कि संरचनात्मक रूप से बरकरार centrioles और procentrioles युक्त गाड़ी का पहिया की शुद्धि को सक्षम बनाता है शुद्ध करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करेंगे । फिर, हम एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए coverslips पर centrioles पारंपरिक या सुपर संकल्प फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग के लिए ध्यान केंद्रित करेंगे । यह महत्वपूर्ण कदम कई झुकाव में छवि centrioles की संख्या बढ़ाने के लिए अनुमति देता है । अंत में, हम एक प्रक्रिया का वर्णन करने के लिए एकल कण फ्लोरोसेंट सूक्ष्मदर्शी कि विभिंन झुकाव में centrioles का पता लगाने की सुविधा पर अधिग्रहीत आंकड़ों पर औसत प्रदर्शन करेंगे । कुल मिलाकर, इस विधि विभिंन प्रजातियों या अंय बड़े macromolecular विधानसभाओं से छवि centrioles के लिए लागू किया जा सकता है ।

Protocol

1. सी. reinhardtii कल्चर और Centriole अलगाव के लिए मीडिया की तैयारी

  1. कल्चरल सी. reinhardtii सेल को मीडिया की तैयारी
    नोट: नीचे दिए गए चरणों 1x नल (Tris-एसीटेट फॉस्फेट) मध्यम के लिए स्टॉक समाधान की तैयारी का वर्णन करें ।
    1. एक फॉस्फेट बफर (पीएच 7) तैयार करें, के २५० मिलीलीटर को मिलाकर 1 m k2HPO4 के (१७४.२ g को k2HPO4 से 1 l तक पूरित करने के साथ आसुत जल) के साथ ~ १७० मिलीलीटर की 1 m KH2पीओ4 (१३६.०९ ग्राम KH2po4 में 1 l) । पीएच 7 तक पहुंचने के लिए मिश्रण समायोजित करें ।
    2. Tris के ९६.८ जी, फॉस्फेट बफर की ४० मिलीलीटर (पीएच 7), और एसिटिक एसिड की ४० मिलीलीटर मिश्रण से समाधान एक (40x) तैयार है, और आसुत पानी के साथ 1 L के लिए समाधान को समायोजित ।
    3. तैयार समाधान B (40x) का उपयोग कर 16 जी के NH4सीएल, 2 CaClके g लए 2, और 4 गाम के MgSO4. यह अन्य घटकों को जोड़ने से पहले अलग आसुत पानी में CaCl2 भंग करने के लिए सावधान रहना. आसुत जल के साथ 1 एल के लिए समाधान समायोजित करें ।
    4. Hutner ट्रेस तत्वों25 बफ़र निम्नानुसार तैयार करें ।
      1. बफर के 1 एल के लिए, पानी की संकेत मात्रा में प्रत्येक यौगिक भंग: EDTA disodium नमक (५० ग्राम में २५० मिलीलीटर), ZnSO४. 7H२ओ (२२ ग्राम में १०० मिलीलीटर), एच३बो३ (११.४ ग्राम में २०० मि.), MnCl२. 4H२ओ (५.०६ ग्राम में) , CoCl2. 6H2ओ (५० एमएल में १.६१ ग्राम), CuSO४. 5H२ओ (१.५७ जी में ५० मि.), (NH४) 6Mo७हे२४. 4H२ओ (१.१० ग्राम में ५० मि.), तथा FeSO४. 7H२ओ (४.९९ ग्राम में ५० मि.).
        नोट: EDTA उबलते पानी में भंग किया जाना चाहिए, और FeSO4 पिछले ऑक्सीकरण से बचने के लिए तैयार किया जाना चाहिए ।
      2. एक साथ EDTA को छोड़कर सभी समाधान मिश्रण और उबाल लाने के लिए । फिर EDTA जोड़ें, और समाधान हरी बारी चाहिए । सब कुछ भंग करने के बाद, ७० डिग्री सेल्सियस के लिए समाधान शांत । इस तापमान पर, गर्म 20% KOH समाधान की ८५ मिलीलीटर जोड़ें (१०० मिलीलीटर में 20 ग्राम) । कमरे के तापमान (आरटी) में आसुत जल के साथ 1 एल के लिए समाधान समायोजित करें ।
      3. कुप्पी के लिए एक कपास प्लग जोड़ें और समाधान 1 या 2 सप्ताह के लिए खड़े हो जाओ, यह एक दिन 1x मिलाते हुए । समाधान शुरू में हरा होना चाहिए और फिर बैंगनी बारी, एक जंग छोड़ने-ब्राउन हाला; समाधान साफ़ होने तक फ़िल्टर काग़ज़ का उपयोग करके तेज़ी से निकालें । aliquots फ्रीज और-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    5. 1x मध्यम नल तैयार निंनलिखित घटकों को मिलाकर C. reinhardtii कोशिकाओं को विकसित करने के लिए: समाधान के 25 मिलीलीटर एक (40x) और समाधान बी के 25 मिलीलीटर (40x) के साथ 1 मिलीलीटर Hutner ट्रेस तत्वों25बफर, और आसुत जल के साथ 1 L के मिश्रण को समायोजित करें । एक ०.४ µm फिल्टर का उपयोग कर मिश्रण निष्फल ।
  2. centriole शुद्धिकरण के लिए मीडिया की तैयारी
    1. 10 मिमी HEPES में 5% सुक्रोज का उपयोग कर एक deflagellation बफर तैयार (पीएच 7) ५०० आसुत पानी के साथ समायोजित मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में ।
    2. ०.५ मीटर एसिटिक एसिड की २५० मिलीलीटर तैयार करें ।
    3. एक 1 एम K-पाइप्स स्टॉक समाधान (पीएच ७.२) के २५० मिलीलीटर पहले एच2के ५० मिलीलीटर जोड़ने के द्वारा तैयार पाइप पाउडर भंग करने के लिए, तो 10 N KOH जोड़ने जब तक समाधान स्पष्ट हो जाता है शुरू होता है । अनुमापन 10 n और 1 n KOH के साथ ७.२ पीएच और एच2ओ के साथ २५० मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के समाधान को समायोजित करने के लिए ।
    4. 5 सुक्रोज समाधान (w/w) निम्नानुसार तैयार करें ।
      नोट: सभी सुक्रोज समाधान solubilization एक सिरिंज में प्लग ०.४ µm फ़िल्टर का उपयोग करने के बाद फ़िल्टर किया जा करने की आवश्यकता है । ध्यान दें कि ६०%-और 70%-सुक्रोज समाधान solubilize के लिए मुश्किल है और एक पानी स्नान पूर्व में रखा जाना चाहिए solubilization की सुविधा के लिए ६० डिग्री सेल्सियस पर गर्म । सुक्रोज पूरी तरह से भंग हो गया है जब तक हर 10 मिनट मिश्रण.
      1. 25% सुक्रोज तैयार करने के लिए, सुक्रोज के 25 ग्राम वजन और 10 मिमी K-पाइप (पीएच ७.२) जोड़कर १०० g करने के लिए वजन समायोजित करें ।
      2. ६०% सुक्रोज तैयार करने के लिए, सुक्रोज के ६० g वजन और 10 मिमी K-पाइप (पीएच ७.२) के साथ १०० g करने के लिए वजन समायोजित करें ।
      3. सुक्रोज ग्रैडिएंट के लिए सुक्रोज समाधान तैयार करें । सुक्रोज के ४० g वजन द्वारा ४०% सुक्रोज तैयार करने और 10 मिमी K-पाइप (पीएच ७.२) के साथ १०० g करने के लिए समाधान का समायोजन । इसी प्रकार, ५०% (w/w) और ७०% (w/w) सुक्रोज तैयार करें ।
      4. समाधान-20 ° c पर संग्रहीत है । गल के बाद ठीक से सुक्रोज सॉल्यूशन को फिर से सस्पेंड करने के लिए सावधान रहें ।
    5. 1 मिमी HEPES (pH 7), ०.५ mm MgCl2, और 1% NP-४० को मिलाकर lysis बफर की १०० मिलीलीटर तैयार करें, और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें । प्रयोग के दिन इस बफर को हमेशा ताजा तैयार करें । centriole अलगाव के दिन विरोधी को छेड़ो गोलियाँ जोड़ें ।
    6. NaCl के 8 ग्राम मिलाकर 1x फास्फेट बफर खारा (पंजाब) (पीएच ७.४) तैयार करें, KCl के 2 गाम, १.४४ g के ऻना2HPO4, और ०.२४ ग्राम के KH2पो4 के ८०० मिलीलीटर में आसुत H2हे. एचसीएल के साथ पीएच को ७.४ पर एडजस्ट करें । मिश्रण की मात्रा को 1 पर लाएं के साथ L आसुत ज2हे ।

2. reinhardtii Centrioles का अलगाव

नोट: चित्र 1देखें ।

  1. C. reinhardtii कोशिकाओं की संस्कृति और विस्तार
    1. 1 दिन पर शाम में, एक ठोस थाली से एक संस्कृति Erlenmeyer कुप्पी नल के 10 मिलीलीटर युक्त में एक cw15- तनाव inoculate । 23 डिग्री सेल्सियस पर सफेद फ्लोरोसेंट रोशनी (६० µ ई/2के लिए-3 दिन) के तहत कोशिकाओं को विकसित ।
    2. दिन 3 पर, 1x नल में (१०० मिलीलीटर) 10x संस्कृति को पतला और 23 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 दिनों के लिए प्रकाश के तहत कोशिकाओं को विकसित ।
    3. 6 दिन पर, 1x में 10x संस्कृति पतला संस्कृति के 1 एल प्राप्त करने के लिए नल । 23 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश के तहत कोशिकाओं को विकसित जब तक संस्कृति एक गहरे हरे रंग कि ~ 1 x 107 कोशिकाओं/एमएल26 (9 दिन-10) के एक अनुमानित कोशिका घनत्व इंगित करता है तक पहुंचता है ।
  2. C. reinhardtii centrioles का शुद्धिकरण
    1. cw15- ६०० x g पर ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में 10 मिनट के लिए कोशिकाओं के केंद्रापसारक । 1x पंजाब के ५० मिलीलीटर के साथ 1x कोशिकाओं की गोली धो और 10 मिनट के लिए ६०० x g पर यह स्पिन । एक पिपेट के साथ कमरे-तापमान deflagellation बफर के १०० मिलीलीटर में गोली स्थगित ।
    2. Deflagellate धीरे से एक पीएच सदमे के साथ कोशिकाओं को जोड़ने से ०.५ एम एसिटिक एसिड की एक अंतिम पीएच करने के लिए 4.5 की बूंदें-4.7 एक चुंबकीय सरगर्मी पर और 2 मिनट के लिए कोशिकाओं की मशीन । धीरे से 1 N KOH की बूंदें जोड़ने के लिए ७.० पीएच बहाल ।
    3. 10 मिनट के लिए ६०० x g पर कोशिकाओं को किसी भी अलग कशाभिका हटाने के केंद्रापसारक । supernatant निकालें और बर्फ पर गोली की दुकान । 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा 1x पंजाबियों की ५० मिलीलीटर के साथ गोली 2x धो लें । फिर, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ६०० x g पर गोली स्पिन ।
    4. 1x पंजाब के 30 मिलीलीटर में गोली resuspend और धीरे-2 मिश्रण के बिना 20 मिलीलीटर की एक 25%-सुक्रोज तकिया पर निलंबन लोड (चित्रा 1बी) ।
    5. supernatant में शेष कशाभिका को दूर करने के लिए 4 ° c पर 15 मिनट के लिए ६०० x g पर स्पिन करें; यह कोशिकाएँ २५% सुक्रोज (चित्रा १सी) में फैलती हैं. केवल नीचे रखें-सबसे 20 मिलीलीटर (लाल तीर, चित्रा 1सी) सावधानी से एक aspirator का उपयोग कर supernatant aspirating ।
    6. शेष 20 मिलीलीटर कोल्ड 1x पंजाबियों के 20 मिलीलीटर जोड़कर धो लें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ६०० x g पर नमूना स्पिन । ठंड 1x पंजाब के 10 मिलीलीटर (4 डिग्री सेल्सियस से कम) में गोली resuspend । सुनिश्चित करें कि वहां कोई झुरमुट है ताकि निंनलिखित lysis एक बार में सभी कोशिकाओं हिट ।
    7. एक नया २५० मिलीलीटर की बोतल के लिए resuspend गोली स्थानांतरण । lysis बफर की १०० मिलीलीटर जोड़ें कोशिकाओं को DNase की ५,००० इकाइयों के साथ पूरक । यह lysis बफ़र को कक्षों में जोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है, और नहीं के आसपास अंय तरीका है । 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मिश्रण की मशीन और किसी भी बुलबुले के गठन के बिना हर 15 मिनट की बोतल पलटने से इसे ध्यान से मिश्रण ।
    8. लीजड ड कोशिकाओं को ६०० x g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में किसी भी सेल मलबे को दूर करने के लिए । यदि lysis सही ढंग से प्रदर्शन किया गया है, सेल गोली सफेद होना चाहिए (चित्रा 1डी). एक पिपेट के साथ supernatant लीजिए और यह एक 30 मिलीलीटर गोल-नीचे एक 60%-सुक्रोज तकिया, बर्फ पर रखा युक्त ट्यूब पर लोड । फिर, 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए १०,००० x g पर ट्यूब स्पिन ।
      नोट: कई गोल नीचे ट्यूबों (सामग्री की मेज) supernatant की मात्रा पर निर्भर करता है, की जरूरत हो सकती है ।
    9. supernatant को सुक्रोज तकिया के ऊपर 1 मिलीलीटर तक महाप्राण । शेष supernatant के 1 मिलीलीटर और सुक्रोज तकिया के 2 मिलीलीटर के बीच पीला इंटरफेस नोट करें । धीरे सुक्रोज और एक कट P1000 टिप के साथ शेष supernatant मिश्रण । इस कदम पर भंवर मत करो; अंयथा, procentrioles इस स्तर पर खो सकता है । सभी सुक्रोज कुशन पूल और बर्फ पर उंहें स्टोर ।
    10. एक ४०%-70%-सुक्रोज ढाल एक पतली घिरी ३८.५ मिलीलीटर ट्यूब में धीरे से ७०% सुक्रोज के 3 मिलीलीटर (4 डिग्री सेल्सियस), ५०% की 3 मिलीलीटर, और अंत में, के बाद 3 मिलीलीटर जोड़ने के द्वारा तैयार ४०% सुक्रोज । ४०%-से 70%-सुक्रोज ग्रेडिएंट पर pooled इंटरफ़ेस लोड करें; यह धीरे करो, क्योंकि ठंड सुक्रोज बहुत चिपचिपा है । 10 मिमी K-पाइप बफर के साथ ट्यूब संतुलन (पीएच ७.२) और उंहें ६८,३२० x g पर केंद्रापसारक (उदाहरणके लिए, एक SW32Ti रोटर के साथ) 1 एच और 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ।
    11. विभिन्न सुक्रोज परतों परेशान बिना एक ०.८ मिमी सुई के साथ ट्यूब के तल में एक छेद बनाने के द्वारा 4 डिग्री सेल्सियस पर 12x ५०० µ एल अंशों लीजिए. एक कट P200 पिपेट टिप के साथ, प्रत्येक अंश से अतिरिक्त 10 µ l aliquots तैयार करें जिसका उपयोग निम्न इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए किया जाएगा. स्नैप-जमा तरल नाइट्रोजन में अंशों ।
      नोट: पृथक centrioles इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है सुनिश्चित करने के लिए कि centrioles के समग्र ultrastructure संरक्षित है ।

3. Coverslips पर पृथक Centrioles का ठहराव: केंद्रापसारक और इम्यूनोफ्लोरेसेंस

नोट: चित्र 2देखें.

  1. ट्यूबों और coverslips की तैयारी
    1. centriolar अंशों (कुल में 12 ट्यूबों) का विश्लेषण करने के लिए अंश प्रति 1 ग्लास राउंड-बॉटम ट्यूब (15 मिलीलीटर) का उपयोग करें ।
    2. एक कस्टम coverslip समर्थन अनुकूलक रखो (इसके बाद अनुकूलक) राउंड-नीचे ट्यूब में । गोल-नीचे ट्यूब में एक बाँझ 12 मिमी coverslip प्लेस.
      नोट: यहाँ हम 12 मिमी coverslips इस्तेमाल किया, लेकिन प्रोटोकॉल 30 मिलीलीटर गोल-नीचे ट्यूबों का उपयोग कर coverslips 18 मिमी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व ठंडा 10 मिमी K-पाइप (पीएच ७.२) के 5 मिलीलीटर जोड़ें । सुनिश्चित करें कि coverslip फ़्लोटिंग नहीं है और एडेप्टर पर नीचे रहता है । बर्फ पर ट्यूबों प्लेस ।
  2. centrioles के केंद्रापसारक
    1. ठंड 10 मिमी K-पाइप (पीएच ७.२) के १०० µ एल के साथ प्रत्येक 10 µ एल अंश पतला । सुक्रोज (चित्रा 2ए) के पूर्ण गायब होने तक कमजोर पड़ने अच्छी तरह से स्थगित । एक गोल-नीचे ट्यूब में प्रत्येक पतला अंश लोड ।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट (उदाहरणके लिए, एक जे एस-१३.१ झूल बाल्टी रोटर के साथ) १०,००० x g पर ट्यूब स्पिन ।
    3. अनुकूलक के slotted एज में मौजूद छेद में एक हस्तनिर्मित झुका डिवाइस डालने के द्वारा coverslip पुनर्प्राप्त और धीरे से ऊपर उठा ।
      नोट: हस्तनिर्मित झुका डिवाइस सिरिंज सुई मैन्युअल रूप से झुका और एक घर का बना छड़ी (आंकड़े 2 बी-2d) पर ढाला के साथ बनाया जा सकता है ।
    4. गोल नीचे ट्यूब के शीर्ष तक पहुंचने पर, एक दस्ताने उंगली के साथ अनुकूलक के किनारे जाल और चिमटी के साथ coverslip हटा दें । coverslip के किस पक्ष को याद करने के लिए सावधान रहें centrioles शामिल हैं । इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए coverslips के इलाज के लिए आगे बढ़ें ।
  3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और पृथक C. reinhardtii centrioles की इमेजिंग
    नोट: चित्र 2देखें.
    1. इस प्रकार के रूप में धुंधला इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए सामग्री तैयार करते हैं ।
      1. एक कवर गिलास एक क्रिस्टल polystyrene संचरण लैब बॉक्स में कांच के दाग रैक तैयार (६० मिमी लंबाई में ५० मिमी द्वारा चौड़ाई में ४३ mm ऊंचाई में) । इसे १००% मेथनॉल के साथ भरें और इसे-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।
      2. एक आर्द्र कक्ष तैयार करें । इस के लिए, एक चौकोर पेट्री डिश (चित्रा 2ई) के अंदर किनारों के साथ एक पानी humidified ऊतक रखकर आर्द्र चैंबर इकट्ठा । प्रयोगशाला सील लपेटो का एक टुकड़ा जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) पेट्री पकवान जिस पर एंटीबॉडी घोला जा सकता है इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रक्रिया के दौरान रखा जाएगा के बीच में (कदम 3.3.2-3.3.3) । ढक्कन और एल्यूमीनियम पंनी के साथ आर्द्र चैंबर इसे प्रकाश से बचाने के लिए कवर ।
    2. पृथक centrioles को निम्नानुसार Immunostain.
      1. centrioles के साथ सीधे coverslips के बाद (कदम 3.2.4) उंहें 5 मिनट के लिए-20 ° c मेथनॉल (step 3.3.1.1) से भरे बॉक्स में मशीनिंग द्वारा फिक्स ।
      2. चिमटी के साथ coverslips निकालें और उन्हें एक पारदर्शी प्रयोगशाला बॉक्स में जगह ( सामग्री की तालिकादेखें) 1x पंजाबियों की ५० मिलीलीटर से भरा है और उन्हें कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए धोने ।
      3. प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण के पिपेट ६० µ एल [प्राथमिक एंटीबॉडी में पतला 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) और ०.०५% के बीच-20 पंजाब में आर्द्र कक्ष में प्रयोगशाला सील लपेटो के टुकड़े पर]. ध्यान से सीधे बूंद का सामना centrioles के साथ एंटीबॉडी मिश्रण के शीर्ष पर coverslips करना । प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ४५ मिनट के लिए coverslips मशीन ।
        नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी कि प्रतिनिधि परिणाम उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया गया खरगोश polyclonal Bld12 (1:300) और माउस α-tubulin (DM1A) (1:300) हैं ।
      4. coverslips निकालें और उन्हें 1x पंजाब में 5 मिनट के लिए धोने, के रूप में कदम 3.3.2.2 में वर्णित है । 1% BSA और ०.०५% के बीच-20 से युक्त पंजाबियों में माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ४५ मिनट के लिए coverslips की मशीन ।
        नोट: माध्यमिक एंटीबॉडी कि प्रतिनिधि परिणाम उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया गया बकरी विरोधी माउस alexa ४८८ (1:1000) और बकरी विरोधी खरगोश alexa ५६८ (1:1000) को युग्मित करने के लिए युग्मित कर रहे हैं ।
      5. coverslips निकालें और उन्हें 1x पंजाब में 5 मिनट के लिए धोने, के रूप में कदम 3.3.2.2 में वर्णित है ।
    3. स्लाइड पर बढ़ते माध्यम के 3 µ एल जोड़कर एक गिलास स्लाइड पर coverslips माउंट और ध्यान से शीर्ष पर coverslips रखने (centrioles बढ़ते माध्यम का सामना करना पड़) । नेल पॉलिश के साथ coverslip एज को सील कर दीजिये ।
    4. छवि १.४ के एक एनए के साथ एक 63X तेल उद्देश्य पर एक फोकल माइक्रोस्कोप पर अलग centrioles जबकि27 deconvolution लागू ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
      नोट: यहां, निंनलिखित सेटिंग्स का इस्तेमाल किया गया: 500-545 एनएम alexa ४८८ के लिए और 580 – 635 एनएम के लिए ५६८ ।

4. Coverslips के केंद्र पर Centrioles की एकाग्रता

नोट: चित्र 3देखें ।

  1. सामग्री की तैयारी
    1. बर्फ पर एक 15 मिलीलीटर गिलास गोल-नीचे ट्यूब तैयार, एक कस्टम coverslip समर्थन अनुकूलक (बुलाया अनुकूलक इसके बाद,. stl फ़ाइल अनुपूरक फ़ाइल 1के रूप में प्रदान की), एक कस्टम (. stl फ़ाइल अनुपूरक के रूप में प्रदान की फ़ाइल 2), और 10 मिमी K-पाइप (पीएच ७.२) पर 4 ° c.
    2. पॉली-डी-lysine (PDL)-लेपित coverslips तैयार करें । 10x 1 मिलीग्राम/एमएल PDL शेयर समाधान एच2ओ के साथ पतला सबसे पहले, ७०% ेतोः के साथ coverslips धो, इथेनॉल को दूर, और coverslips सूख जाने । कोट PDL के साथ coverslips और उंहें कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए गर्मी । coverslips 3x को पानी से धोएं और उन्हें सूखने दें ।
      नोट: कोट coverslips PDL के साथ coverslips से जुड़ी पृथक centrioles की संख्या को बढ़ाने के लिए ।
  2. होते हैं
    1. PDL कोट facedown रखते हुए, अवकाश पर, नीचे के अंत पर एक बाँझ 12 मिमी coverslip प्लेस । coverslip को सीधे टॉप पर रखकर ही कैप को सीधा कर लीजिये. दौर नीचे ट्यूब पलटना और यह ध्यान देने वाला, coverslip, और अनुकूलक पर जगह है ।
    2. धीरे चिमटी के साथ पहनावा धक्का जब तक यह गोल नीचे ट्यूब के नीचे तक पहुंच जाता है, और ट्यूब पलटना । 10 मिमी K-पाइप्स बफर (पीएच ७.२) गोल नीचे ट्यूब करने के लिए जोड़ें जब तक यह ध्यान देने वाले के शीर्ष पर आता है । सुनिश्चित करें कि ध्यान देने वाले के केंद्रीय सिलेंडर में कोई भी बुलबुले न रहें ।
    3. धीरे 10 मिमी K-पाइप बफर (पीएच ७.२) के १०० µ एल जोड़ने के लिए एक aliquot युक्त समृद्ध centriole अंश और अच्छी तरह से मात्रा में मिश्रण ।
    4. १०० µ एल के 10 मिमी k-पाइपों बफर (पीएच ७.२) के खोखले केंद्र से हटा दें और 10 मिमी k-पाइपों बफर (पीएच ७.२) में समृद्ध centriolar अंश के १०० µ l को ध्यान केंद्रित करने के खोखले केंद्र में जोड़ें, ध्यान रहे कि सामग्री खोखले केंद्र में रहते हैं ।
    5. 10 मिनट के लिए १०,००० x g पर केंद्रापसारक (उदाहरणके लिए, एक जे एस-१३.१ झूलते बाल्टी रोटर के साथ) एक पूर्व में 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा केंद्रापसारक ।
    6. चिमटी के साथ ध्यान केंद्रित निकालें ।
    7. अनुकूलक के slotted एज में मौजूद छेद में एक हस्तनिर्मित झुका डिवाइस डालने के द्वारा coverslip पुनर्प्राप्त और धीरे से ऊपर उठा । गोल नीचे ट्यूब के शीर्ष तक पहुंचने पर, एक दस्ताने उंगली के साथ अनुकूलक के किनारे जाल और चिमटी के साथ coverslip हटा दें । coverslip के किस पक्ष को याद रखने के लिए सावधान रहें centrioles होते हैं. इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए coverslips के इलाज के लिए आगे बढ़ें ।
      नोट: हस्तनिर्मित झुका डिवाइस एक सिरिंज सुई मैन्युअल रूप से झुका और एक घर का बना छड़ी (आंकड़े बी-डी) पर ढाला के साथ बनाया जा सकता है ।
    8. प्रदर्शन निर्धारण और केंद्रित centrioles के रूप में कदम 3.3.2-3.3.4 में किया इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला ।

5. एकल कण औसत

नोट: चित्रा 4देखें.

  1. एकल कण औसत के लिए इमेजिंग
    1. एक नियमित विरोधी लुप्त होती बढ़ते माध्यम का उपयोग कर एक स्लाइड पर coverslip माउंट । एक CFI Apochromat TIRF उद्देश्य (100X, NA १.४९, WD 0.12 mm) और एक वापस प्रबुद्ध EM सीसीडी कैमरा का उपयोग करते हुए संरचित दीप्ति माइक्रोस्कोपी (2d सिम) इमेजिंग प्रदर्शन ।
      नोट: अधिग्रहण के समय १०० ms के लिए सेट किया गया था एक कैमरा 3 मेगाहर्ट्ज से बाहर पढ़ें. एक 2.5 x लेंस सिम इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था ।
      नोट: यहाँ प्रस्तुत डेटासेट एक 3-डी सिम माइक्रोस्कोप पर अधिग्रहीत किया गया था ( सामग्री की तालिकादेखें).
    2. छवि कुल centriole संकेत शामिल छवियों का एक बड़ा ढेर प्राप्त करने के द्वारा centrioles, ऊपर और नीचे के ऊपर और नीचे की स्थिति की स्थापना करके centriole संकेत के नीचे, क्रमशः । स्टैक प्रोजेक्ट के लिए आगे बढ़ें और एकल-कण औसत के रूप में ५.२ और ५.३ चरणों के अनुसार निष्पादित करें ।
  2. टैक् स का प्रोजेक्शन
    1. ImageJ के साथ छवि स्टैक खोलें । तो ' पर क्लिक करेंछवि → ढेर → जेड परियोजना' । 'अधिकतम तीव्रता'के रूप में प्रक्षेपण प्रकार निर्धारित करें ।
    2. 'संपादित करें → उल्टे'पर क्लिक करके छवि उलटा । (. tif स्वरूप) जनरेट किया गया है जो प्रोजेक्शन सहेजें ।
  3. Scipion के साथ एकल-कण संरेखण
    1. पृष्ठ के शीर्ष पर लाल 'बनाएँ प्रोजेक्ट' बटन दबाकर Scipion में एक नया प्रोजेक्ट बनाएँ । बाएं पैनल पर, डबल क्लिक करें ' आयात→ आयात माइक्रोग्राफ'पर ।
    2. डेटा निर्देशिका और नामों के अनुसार 'फ़ाइलें निर्देशिका' और 'प्रतिमान ' फ़ील्ड भरें । डिफ़ॉल्ट पैरामीटर रखें । ' अंजाम 'पर क्लिक करें ।
    3. डबल क्लिक करें ' पर कण → उठा → xmipp3-मैनुअल उठा (चरण 1) '। आवर्धक कांच आइकन पर क्लिक करें ' इनपुट माइक्रोग्राफ ' मैदान के पास और कदम 5.3.1 से आयातित माइक्रोग्राफ का चयन करें । ' अंजाम 'पर क्लिक करें ।
    4. नई खोली गई विंडो में, उन पर क्लिक करके अलग माइक्रोग्राफ से कणों का चयन करें । जब हर micrograph के साथ समाप्त, लाल बटन पर क्लिक करें ' + निर्देशांक '.
    5. ' पर कणों → निकालें → xmipp3-निकालने कणों 'डबल क्लिक करें । ' इनपुट निर्देशांक ' क्षेत्र के लिए शीशा शीशे के पास आइकन पर क्लिक करें और कदम 5.3.4 से उठाया निर्देशांक का चयन करें. कण आयामों के अनुसार ' कण बॉक्स आकार (पिक्सल) ' भरें । ' प्रक्रिया ' टैब में, धूल हटाने सेट: नहीं (यह कलाकृतियों उत्पन्न कर सकते हैं); उलटा कंट्रास्ट: नहीं (काले कणों, सफेद पृष्ठभूमि); चरण flipping: नहीं (CTF सुधार करने के लिए लिंक); सामांय: हां ।
    6. फिर ' अंजाम 'पर क्लिक करें । जब काम किया है, नौकरी के बॉक्स का चयन करके निकाले कणों की जांच (सीमाओं मोटा हो) और ' पर क्लिक करेंपरिणाम का विश्लेषण ' (नीचे मुख्य मेनू के बाएं) ।
    7. डबल क्लिक करें ' पर 2d → संरेखित → xmipp3-cl2d के साथ संरेखित '। ' इनपुट कणों ' क्षेत्र के लिए शीशा शीशे के पास आइकन पर क्लिक करें और कदम 5.3.5 से निकाले कणों का चयन. संदर्भ छवि का उपयोग न करें । ' अंजाम 'पर क्लिक करें ।
    8. डबल क्लिक करें ' पर 2d → संरेखित → अधिक → xmipp3-संरेखण 2d लागू होतेहैं । ' इनपुट कणों ' क्षेत्र के लिए करीब आवर्धक कांच आइकन पर क्लिक करें और चरण 5.3.7 से गठबंधन कणों का चयन.
    9. चरण 5.3.6 के रूप में ' निष्पादित ' पर क्लिक करें । परिणाम ' पर क्लिक करके परिणाम विश्लेषण ' नौकरी बॉक्स के चयन के बाद की जांच की जा सकती है ।
    10. डबल क्लिक करें ' पर कण → मुखौटा → xmipp3-लागू 2d मुखौटा '।
    11. ' इनपुट कणों ' क्षेत्र के लिए करीब आवर्धक कांच आइकन पर क्लिक करें और चरण 5.3.9 से गठबंधन कणों का चयन. ' मास्क सोर्स ' को ' ज्यामिति 'के लिए सेट किया गया है । फिर, मुखौटा प्रकार के रूप में मुखौटा के मापदंडों सेट: परिपत्र; त्रिज्या (पिक्सल): एक कण के लिए खोज (एक centriole) इसके आसपास कुछ भी बिना, बाईं ओर 'जादू की छड़ी ' आइकन पर क्लिक करें जो एक खिड़की के लिए सही मूल्य खोजने में मदद खोलता है; शिफ्ट केंद्र: नहीं (यदि कण बिल्कुल केंद्रित है) या हां (यदि कण खिसक गया है); X-केंद्र ऑफ़सेट: कण स्थिति के अनुसार; Y-केंद्र ऑफ़सेट: कण स्थिति के अनुसार । ' अंजाम 'पर क्लिक करें ।
    12. मुखौटा सही ढंग से लागू किया जाता है की जाँच करने के लिए ' परिणाम विश्लेषण ' बटन का उपयोग करें. यदि नहीं, तो ' लागू मुखौटा 2d ' नौकरी पर राइट क्लिक करें और ' संपादित करें 'चुनें । मुखौटा के मापदंडों को संशोधित करें (आकार और/या शिफ्ट) और इसे फिर से चलाने के साथ ' निष्पादित ' बटन ।
    13. डबल क्लिक करें ' पर 2d → वर्गीकृत → xmipp3-cl2d '।
    14. आवर्धक कांच आइकन पर क्लिक करें ' इनपुट कणों ' क्षेत्र के करीब और कदम 5.3.11 से नकाबपोश कणों का चयन करें । वर्ग की संख्या प्रति कक्षा लगभग ५० कणों प्राप्त करने के लिए होना चाहिए । ' अंजाम 'पर क्लिक करें ।
    15. ' परिणाम विश्लेषण ' बटन पर क्लिक करके परिणामों की जाँच करें । खुली विंडो में, ' ' क्या दिखाने के लिए ' ' के बगल में ' आंख ' आइकन पर क्लिक करें ।
    16. नई विंडो ' ब्लॉक ' मेनू में ' Classes2D ' का चयन करके उत्पन्न कक्षाओं के निरीक्षण की अनुमति देता है । एक ही मेनू में ' Class00N_Particles ' का चयन करके प्रत्येक वर्ग की सामग्री की जाँच करें । जो लोग केवल खराब कणों को शामिल की पहचान करने के लिए प्रत्येक वर्ग का निरीक्षण करें । ' Classes2D ' देखने के लिए वापस जाओ और प्रत्येक पर क्लिक करके अच्छे कणों के साथ कक्षाओं का चयन करें । यह चयन के दौरान दबाया ' Ctrl ' कुंजी रखने के द्वारा कई वर्गों का चयन करने के लिए संभव है.
    17. जब अच्छे कणों के साथ सभी वर्गों का चयन किया गया है, इन कणों के साथ एक सबसेट बनाने के लिए ' + कणों ' पर क्लिक करें.
    18. एक ही विंडो में, वर्गों के कुछ सेट का चयन करें जो कणों के विभिन्न झुकाव का प्रतिनिधित्व करते हैं । ' + फलां 'पर क्लिक करके एक नया सबसेट बनाएं ।
    19. प्रत्येक अभिविंयास/औसत के लिए चयनित, निंनानुसार है ।
      1. डबल क्लिक करें ' पर 2d → संरेखित → xmipp3-cl2d के साथ संरेखित '।
      2. ' इनपुट कणों ' क्षेत्र के लिए करीब आवर्धक कांच आइकन पर क्लिक करें और कदम 5.3.17 से अच्छे कणों का चयन. सेट ' एक संदर्भ छवि ' के लिए ' हां' का उपयोग करें । आवर्धक कांच आइकन पर क्लिक करें ' संदर्भ ' छवि को बंद करने के लिए और सफेद तीर पर क्लिक करने के लिए छोड़ दिया ' बनाएं सबसेट ' काम से कदम 5.3.18 और छवि का चयन करने के लिए एक संदर्भ के रूप में उपयोग करें । एक अलग विंडो में खोलने के लिए एक वस्तु पर डबल क्लिक करें और यह किस वस्तु की जाँच करें. ' अंजाम 'पर क्लिक करें ।
      3. डबल क्लिक करें ' पर 2d → संरेखित → अधिक → xmipp3-संरेखण 2d लागू होतेहैं । ' इनपुट कणों ' क्षेत्र के लिए करीब आवर्धक कांच आइकन पर क्लिक करें और चरण 5.3.19.2 से गठबंधन कणों का चयन.
      4. ' अंजाम 'पर क्लिक करें ।
      5. संरेखण के परिणाम की जाँच करें ('परिणाम का विश्लेषण '); यह गठबंधन कणों और इन कणों के औसत दिखाएगा ।
      6. यदि औसत अच्छा है और कणों सभी एक ही तरीके से उन्मुख कर रहे हैं, ' उन्नत → ImageJ ' पर क्लिक करके औसत बचाने के लिए और ImageJ के साथ छवि को बचाने के.
      7. यदि औसत में सुधार किया जा सकता है, सभी अच्छी तरह से उंमुख छवियों का चयन करें और ' + कण ' बटन के साथ एक नया सबसेट बनाने के लिए । दोहराएं कदम 5.3.19.1-5.3.19.4 जब तक सबसेट साफ है (सभी खराब कणों को हटा दिया) । हर बार (चरण 5.3.19.2) संरेखण किया जाता है, तो संदर्भ (पुनरावृत्ति करने के लिए चलना, औसत गुणवत्ता बढ़ाता है) से अंतिम जनरेटेड औसत करने के लिए सेट है ।

Representative Results

C. reinhardtii Centriole अलगाव:
centrioles को अलग करने के लिए, cw15- C. reinhardtii कोशिकाओं को तरल संस्कृति में प्रकाश के तहत कई दिनों के लिए बड़े हो गए थे और बाद में ६०० x g पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा गोली । छर्रों कोशिकाओं पंजाब के साथ 1x धोया और एक में resuspend थे deflagellation बफर से पहले deflagellation के लिए एक पीएच ०.५ एम एसिटिक एसिड का उपयोग कर 4.5 के एक अंतिम पीएच-4.7 के लिए 2 मिनट (1 चित्राएक) के लिए सदमे प्रदर्शन से । 1 N KOH के एक अतिरिक्त करने के लिए ७.० पीएच बहाल किया गया था । कोशिका निकायों से पृथक कशाभिका को अलग करने के लिए, deflagellated कोशिकाओं को पहले कशाभिका के थोक हटाने के लिए केंद्रापसारक थे । गोली तो पंजाबियों के साथ 2x धोया और पंजाब के 30 मिलीलीटर में resuspend किया गया यह एक 25% पर धीरे-सुक्रोज तकिया (चित्रा 1बी) लोड करने से पहले । ट्यूब ६०० x g पर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर काता था अलग कशाभिका के अधिकांश को दूर करने के लिए । केंद्रापसारक के बाद, कोशिका निकायों सुक्रोज तकिया में फैले थे (चित्रा 1सी) और supernatant के लगभग 30 मिलीलीटर ( चित्रा 1सीमें लाल तीर तक) को हटाने के द्वारा बरामद किया । परिणामस्वरूप धोया कोशिकाओं के 20 मिलीलीटर तो ठंडे पंजाबियों के 20 मिलीलीटर में resuspend और 10 मिनट के लिए ६०० x g पर केंद्रापसारक थे । अगले, supernatant खारिज कर दिया गया था, और सेल पूरी तरह से पंजाब के 10 मिलीलीटर में resuspend कर दिया गया । कोशिकाओं को एक २५० मिलीलीटर की बोतल में स्थानांतरित किया गया और lysis बफर resuspend कोशिकाओं को एक बार में जोड़ा गया था । DNase lysis करने के लिए जोड़ा गया था और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मशीन । एक केंद्रापसारक कदम के बाद सेल मलबे को हटाने के लिए ( चित्रा 1डीमें सफेद गोली देखें), supernatant एकत्र किया गया था और ध्यान से एक 2 मिलीलीटर 60% पर लोड-सुक्रोज तकिया 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में १०,००० x g पर केंद्रापसारक से पहले । ध्यान दें कि lysis के १०० मिलीलीटर के लिए, 15 मिलीलीटर की 8 ट्यूबों के लिए इस कदम का उपयोग किया गया, इसी lysis बफर के १२.५ मिलीलीटर के लिए इसी पर लोड सुक्रोज के 2 मिलीलीटर ट्यूब प्रति । केंद्रापसारक के बाद, supernatant के अधिकांश तकिया के ऊपर 1 मिलीलीटर को हटा दिया गया था । शेष supernatant के 1 मिलीलीटर तो 2 मिलीलीटर तकिया के साथ एकत्र किया गया था और फिर मिश्रित और 24 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए परित । पूल तो एक ४०% पर लोड किया गया था-, ५०%-, 70%-सुक्रोज ढाल और 1 ज और 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ६८,३२० x जी में घूमती है । अंत में, अलग centrioles एक सुई का उपयोग कर केंद्रापसारक ट्यूब के नीचे भाग में एक छेद बनाने और बूंदों 12 x ५०० µ एल भागों में एकत्र किए गए द्वारा एकत्र किए गए थे । विभिंन सुक्रोज के उच्च घनत्व के कारण, ड्रॉप शुरू में बहुत धीरे (७०% सुक्रोज) और फिर अधिक तेजी से (४०% सुक्रोज) का गठन किया ।

पृथक Centrioles की इम्यूनोफ्लोरेसेंस
अलगाव प्रक्रिया की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए, प्रत्येक एकत्र ग्रैडिएंट अंश के 10 µ l को एक coverslip समर्थन अनुकूलक (चित्रा 2a-2d) का उपयोग करते हुए coverslip पर किया गया था । महत्वपूर्ण बात, सुरक्षित coverslip को दूर करने के लिए, एक कस्टम झुका डिवाइस (चित्रा 2बी) डिजाइन किया गया था । अगले, coverslips इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा विश्लेषण किया गया । CrSAS-६ (Bld12p) के विरुद्ध एंटीबॉडी का उपयोग इस अध्ययन में गाड़ी का पहिया संरचना की उपस्थिति और α-tubulin (DMA1) centriolar दीवार को उजागर करने के लिए किया गया. centrioles की संख्या है कि दोनों CrSAS-6 के लिए सकारात्मक थे और देखने के प्रति क्षेत्र α-tubulin और फिर अंशों प्रति centrioles की कुल संख्या की गणना करके, यह निर्धारित करने के लिए जो भिन्न अलग centrioles के लिए समृद्ध थे संभव था ( चित्रा 2F-2H) । दिलचस्प है, 6 अंश centrioles (चित्रा 2F और 2 जी, भागों #1-6) के लिए समृद्ध थे, अंश #3 के लिए एक चोटी के साथ, जबकि पिछले भागों नहीं थे, संकेत है कि शुद्धि काम किया । ध्यान दें कि इस विशेष प्रयोग में कुल centrioles के ९५% CrSAS-6 और α-tubulin अंश #3 के लिए सकारात्मक थे । यह इंगित करता है कि सबसे अलग centrioles उनके cartwheels बनाए रखा । यदि centrioles का कोई संवर्धन पहले भागों में मनाया जाता है, अलगाव की प्रक्रिया काम नहीं किया है और दोहराया जाना चाहिए । ध्यान दें कि कुछ flagellar टुकड़े ज्यादातर centrioles के अंश विहीन में मनाया जा सकता है ।

अगले, µ एल प्रति centrioles की कुल संख्या की गणना करने के लिए, देखने के प्रति क्षेत्र centriole की संख्या अनुपात से गुणा किया जाना चाहिए के रूप में चित्रा 2एचमें प्रस्तुत किया । परिणामी संख्या तब µ प्रति centrioles की संख्या प्राप्त करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए उपयोग किया गया अंश की मात्रा द्वारा विभाजित किया जाना चाहिए । इस विशेष अलगाव प्रक्रिया में, सबसे समृद्ध अंश ०.००८४६ mm2 (९२ x ९२ µm2के देखने के एक क्षेत्र के साथ) के एक क्षेत्र के लिए लगभग ३७ centrioles समाहित । ट्यूब खंड की सतह १७६ मिमी2की कुल सतह के साथ त्रिज्या में ७.५ mm था । इसी अनुपात में तो 176/0.00846 = २०,८०३.८ था, इसलिए कुल ७६९,७४० centrioles (37x20, 803.8) में 10 µ एल. इसलिए 1 µ l में centrioles की संख्या ७६,९७४ थी ।

Coverslips पर पृथक Centrioles की एकाग्रता:
क्षेत्र प्रति centrioles की संख्या बढ़ रही है अस्पष्ट centriole उंमुखीकरण का पता लगाने का मौका बढ़ जाती है, साथ ही साथ समान झुकाव है कि आगे के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है का पता लगाने की संभावना बढ़ कण औसत प्रक्रियाओं । के रूप में केंद्रित भागों से centrioles अभी भी coverslip पर विरल हैं, हम एक केंद्रापसारक गौण विकसित करने के लिए coverslip के बीच में centrioles ध्यान केंद्रित (चित्रा 3ए) एक केंद्रित नाम । ध्यान दें कि 3-डी मुद्रण के लिए सटीक उपायों के साथ एक. stl फ़ाइल इस पांडुलिपि के साथ प्रदान की जाती है ।

पहला, 12 मिमी का एक coverslip (चित्रा 3बी) पर रखा गया था । अनुकूलक coverslip के शीर्ष पर रखा गया था और गोल नीचे ट्यूब औंधा और इकट्ठे अनुकूलक और ध्यानी पर रखा गया था । गोल नीचे ट्यूब फिर धीरे औंधा था, इस प्रकार नमूना (प्रोटोकॉल कदम ४.२) की लोडिंग की अनुमति । centrioles तो 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १०,००० x g पर केंद्रापसारक थे । उसके बाद, centrioles इम्यूनोफ्लोरेसेंस के अधीन थे और CrSAS के लिए दाग-6/Bld12p और α-tubulin (चित्रा 3सी-3E) । महत्वपूर्ण बात, बिना संकेंद्रण, के बारे में 30 centrioles देखने के क्षेत्र के प्रति देखा गया (चित्रा 3सी), जबकि १८३ centrioles देखने के क्षेत्र के प्रति देखा गया था जब संकेंद्रक (चित्रा 3d3F) का इस्तेमाल किया गया था । ध्यान दें कि centrioles coverslip के बीच में व्यास में 4 मिमी की केवल एक डिस्क को कवर किया । यह परिणाम दर्शाता है कि एकाग्रता कदम काम करता है और एक 6 coverslips के एक परिभाषित क्षेत्र में centrioles के गुना संवर्धन की अनुमति देता है, इस प्रकार उनके पता लगाने और इमेजिंग सहजता ।

फ्लोरोसेंट एकल-अलग का औसत कण C. reinhardtii Centrioles:
यहां, सिम माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर के बारे में १२० एनएम के एक संकल्प तक पहुंच सकते हैं, centrioles monoglutamylated tubulin के लिए सना हुआ (GT335, चित्रा 4), tubulin centriolar में मौजूद एक microtubules संशोधन,24छवि थे । C. reinhardtii centrioles के बारे में ५०० समुद्री मील लंबे होते हैं, हमेशा जोड़े में, और अक्सर जुड़े के साथ मिला, नव बेसल निकायों (के रूप में procentrioles इसके बाद) और धारीदार microtubule-जुड़े फाइबर19कहा जाता है । इसलिए, इस अंतिम विधानसभा के बारे में 1 µm बड़ा था । इस कारण के लिए, और आदेश में उनकी संपूर्णता में centrioles छवि के लिए, हम एक जेड प्राप्त करने की सिफारिश अलग centrioles पर ढेर ।

यहां, अधिग्रहण के बाद, एक अंतिम छवि ImageJ28 (छवि/ढेर/जेड परियोजना/अधिकतम तीव्रता प्रोजेक्शन, चित्रा 4बी) का उपयोग कर एक अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण प्रदर्शन द्वारा उत्पंन किया गया था । ऐसी छवियों से, एक एकल कण विश्लेषण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए समान झुकाव के साथ centrioles की कक्षाएं बनाने के लिए प्रदर्शन किया गया था, और फिर औसत प्रदर्शन किया गया था । ऐसा करने के लिए, छवि रंग पहले औंधा किया गया था ताकि बेहतर वस्तुओं (चित्रा 4सी) की कल्पना करने के लिए । Centrioles एक प्रत्येक कण पर केंद्रित बॉक्स में मैंयुअल रूप से उठाया गया स्वतंत्र रूप से उपलब्ध Scipion सॉफ्टवेयर का उपयोग कर29 कि ऐसे Xmipp3 (चित्रा 4डी) के रूप में कई इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर प्रोग्राम को एकीकृत । ध्यान दें कि बॉक्स का आकार उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित किया जाना है । यहां, ३१.८४ एनएम के एक पिक्सेल आकार के लिए ५० x ५० पिक्सल के बक्से का इस्तेमाल किया गया । अगला, सभी कणों (चित्रा 4ई) निकाले गए और Xmipp3 (चित्रा 4एफ) का उपयोग कर गठबंधन किया गया । इसके बाद, त्रिज्या में 12 पिक्सेल का एक गोलाकार मास्क centriolar-युग्म (चित्रा 4G) से प्रत्येक centriole को अलग करने के लिए लागू किया गया था । कणों तो वर्गीकृत, Xmipp3 का उपयोग कर रहे थे, कई औसत उत्पंन करने के लिए । केवल समरूप वर्ग औसत रखा गया था, जिसका अर्थ है कि कणों कि वर्ग औसत से हट जाना मैंयुअल रूप से बाहर कर रहे थे । इस कदम के क्रम में एक चुना अभिविंयास के लिए एक के पास सही औसत उत्पंन करने के लिए दोहराया गया था । पांच पुनरावृत्तियों के बाद, औसत के दो वर्गों उत्पंन: ६३ वस्तुओं से एक शीर्ष दृश्य (चित्रा 4एच) और ९८ कणों से एक तरफ देखने (चित्रा 4मैं) monoglutamylated centrioles की । वस्तु के आयामों monoglutamylation संकेत के साथ तीव्रता भूखंड प्रोफ़ाइल की चोटियों के बीच की दूरी को मापने के द्वारा निर्धारित किया गया ।

महत्वपूर्ण बात, पक्ष को देखने की लंबाई वर्ग औसत २५० एनएम के व्यास के साथ २६० एनएम है, मापा monoglutamylated tubulin संकेत है कि centriole17के कोर के भीतर लंबाई में २८६ ± ३३ एनएम के एक क्षेत्र के लिए स्थानीयकरण दिखाया गया था के बराबर है ।

Figure 1
चित्रा 1 : का शुद्धिकरण C. reinhardtii centrioles. (क) यह प्रत्येक reinhardtii centrioles के अलगाव के लिए अग्रणी कदम का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व है । यह प्रोटोकॉल के प्रतिनिधि कदम शामिल है (ख) से पहले और (ग) 25%-सुक्रोज ढाल पर केंद्रापसारक के बाद । पैनल सी में लाल तीर ंयूनतम मात्रा को इंगित करता है कि केंद्रापसारक के बाद रखने के लिए । (घ) इस पैनल लीजड ड कोशिकाओं के केंद्रापसारक के बाद सफेद गोली से पता चलता है । काले तीर गोली इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 2
चित्रा 2 : केंद्रापसारक सेट अप अलग centrioles पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रदर्शन करने के लिए । (क) प्रत्येक एकत्र अंश के 10 µ एल १०० मिमी K-पाइप (पीएच ७.२) के µ एल में पहले पतला है । (ख) इस केंद्रापसारक उपकरणों का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व है, एक 15 मिलीलीटर गोल नीचे ट्यूब, एक 12 मिमी coverslip, coverslip के लिए एक अनुकूलक को शामिल किया है, और एक कस्टम निर्मित डिवाइस कांटे की शकल के बाद coverslip को ठीक करने के लिए बनाया है । पैनलों सी और डी दिखाने के लिए कैसे केंद्रापसारक के बाद coverslip उबरने के लिए चित्र । (ग) अनुकूलक के slotted एज में मौजूद होल में काँटे वाला उपकरण रखें और (घ) धीरे से खींचो. (ङ) ये आर्द्र कक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग प्रदर्शन की जरूरत की तस्वीरें हैं । तीर 12 मिमी coverslip इंगित करता है । (च) इन 63X पर प्रतिनिधि फोकल छवियां है (ज़ूम 2) ढाल भागों #1-8, शुद्धि प्रक्रिया के दौरान एकत्र और CrSAS के लिए दाग-6 (लाल) और α-tubulin (हरा) । प्रीसेट निचले आवर्धन दृश्यों में सफ़ेद बॉक्स द्वारा इंगित क्षेत्र के संगत होते हैं । स्केल बार = 10 µm. (G) यह प्रत्येक अंश में देखने के प्रति फ़ील्ड दोनों CrSAS-6 और α-tubulin के लिए धनात्मक centrioles की संख्या का प्रतिनिधित्व करने वाला एक ग्राफ़ है । अंशों में संवर्धन ध्यान दें #1-६. प्रत्येक अंश में प्रति फ़ील्ड centrioles की औसत संख्या: #1 = १६.३ ± ४.७, #2 = २४.० ± ४.६, #3 = ३७.० ± १७.०, #4 = २३.३ ± ११.४, #5 = १४.३ ± २.१, #6 = १३.७ ± ९.३, #7 = २.७ ± १.२, #8 = १.० ± ०.०, #9 = १.० ± ०.०, #10 = ०.० ± ०.०, #11 = ०.३ ± ०.६, #12 = ०.० ± ०.० । प्रत्येक अंश के लिए, 3 यादृच्छिक फ़ील्ड imaged थे । ध्यान दें कि, जब #3 सबसे समृद्ध अंश गिनती, हमने पाया कि centrioles के ९५% CrSAS-6 और α-tubulin (n = २०५ centrioles) के लिए सकारात्मक हैं । (ज) माइक्रोग्राफ के मापा क्षेत्र में मौजूद centrioles की संख्या का अनुपात ट्यूब के क्षेत्र में मौजूद centrioles की कुल संख्या की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है. µ एल प्रति centriole संख्या 10 µ एल मूल रूप से केंद्रापसारक भागों से गणना की जा सकती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 3
चित्रा 3 : पृथक centrioles का उपयोग कर रहे है केंद्रापसारक । (क) इस पैनल के केंद्रापसारक को coverslips पर centrioles ध्यान केंद्रित की जरूरत उपकरणों से पता चलता है इम्यूनोफ्लोरेसेंस से पहले, एक 15 मिलीलीटर गोल नीचे ट्यूब, एक संकेंद्रक, एक 12 मिमी coverslip, और एक समर्थन अनुकूलक उपकरण शामिल हैं । (ख) इस पैनल के लिए कदम केंद्रापसारक डिवाइस इकट्ठा दिखाता है । पैनलों सी-ई centrioles के फोकल छवियां शो CrSAS के लिए सना हुआ-6 (लाल) और α-tubulin (हरा) (सी) के बिना या (डी-ई) के लिए ध्यानी के साथ । प्रीसेट निचले आवर्धन दृश्यों में सफ़ेद बॉक्स द्वारा इंगित क्षेत्र के संगत होते हैं । स्केल बार 10 µm है । ध्यान दें कि centrioles coverslip के बीच में समृद्ध कर रहे हैं (बिंदीदार रेखा केंद्रित क्षेत्र की सीमा का प्रतिनिधित्व करता है) । (च) इस ग्राफ के बिना देखने के क्षेत्र प्रति centrioles की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है और के साथ ध्यान देने की । देखने के पांच यादृच्छिक क्षेत्रों का विश्लेषण किया गया । centrioles की औसत संख्या है, बिना ध्यानी, २९.८ ± २.९, और के साथ ध्यानी, १८२.६ ± ११.५, पी < 0.0001 । सांख्यिकीय महत्व एक ख़राब टीपरीक्षण द्वारा मूल्यांकन किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : एक अलग पर औसत कण C. reinhardtii centrioles. (क) इस पैनल GT335 के साथ सना हुआ centrioles के जेड ढेर छवियों से पता चलता है और एक सिम माइक्रोस्कोप का उपयोग कर हासिल की । (ख) इन पैनलों खड़ी छवियों के एक अधिक से अधिक तीव्रता Z प्रक्षेपण दिखा । स्केल बार = 1 µm. (C) ये पैनल एक व्युत्क्रम कंट्रास्ट के साथ एक प्रतिनिधि छवि दिखाते हैं । इनसेट एक ज़ूम में centrioles बेहतर कल्पना करने के लिए का प्रतिनिधित्व करता है । (घ) ये पैनल कण उठा दिखा. इनसेट इंगित करता है कि कणों को कैसे उठाया गया । (ङ) ये ५ निकाले हुए कणों के उदाहरण हैं. (च) इस पैनल के संरेखण के बाद कणों से पता चलता है । (छ) यह पैनल एक मुखौटा लगाने के बाद कणों से पता चलता है । पैनलों एच और मैं दो वर्ग औसत दिखा: (एच) एक शीर्ष दृश्य (६३ कण) और (i) एक तरफ देखें (९८ कण) । दोहरे तीर GT335 संकेत के आयामों को इंगित करते हैं । स्केल बार = २५० एनएम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

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Discussion

जीव विज्ञान में चुनौतियों में से एक एक वास्तु संदर्भ में प्रोटीन की सटीक स्थानीयकरण को समझने के लिए है । centriole एक आदर्श संरचना है इन तरीकों को लागू करने के लिए, के रूप में अपनी वास्तुकला क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी का उपयोग कर अध्ययन किया गया है, अपनी लंबाई के साथ दिलचस्प ultrastructural सुविधाओं का खुलासा । हालांकि, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी में संकल्प सीमा के करीब अपने आयामों के कारण, यह ठीक से पारंपरिक सूक्ष्मदर्शी30का उपयोग कर centriole के एक संरचनात्मक उप-क्षेत्र के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा एक प्रोटीन स्थानीयकृत करने के लिए मुश्किल है ।

ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी में संकल्प प्रकाश की विवर्तन है कि देता है, मोटे तौर पर, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी24में २०० एनएम के एक पार्श्व अधिकतम संकल्प द्वारा सीमित है । हालांकि, इस सीमा से किया गया है-ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप में पिछले 20 वर्षों के प्रमुख सफलताओं में से एक द्वारा पारित: सुपर संकल्प तरीकों का आविष्कार । इन तरीकों अलग संकल्प पर विवर्तन सीमा से परे छवि कर सकते हैं: सिम के लिए १२० एनएम, प्रेरित उत्सर्जन कम करने के लिए के बारे में ५० एनएम (STED), और 20-एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (SMLM)24के लिए 40 एनएम । सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के इन नए घटनाक्रम के साथ, centriole के संरचनात्मक उप क्षेत्रों प्राप्य हैं । हालांकि, व्यवहार में, यह अभी भी सही मुख्य कारण है कि परिपक्व centrioles कक्ष प्रति केवल 2 प्रतियों में मौजूद है और यादृच्छिक झुकाव है, जो की व्याख्या करता है के लिए एक संरचनात्मक तत्व के लिए एक प्रोटीन के स्थानीयकरण निर्धारित करना मुश्किल है स्थानीयकरण वाटतो. इस कारण से, एक प्रोटोकॉल की स्थापना की है कि सुपर संकल्प द्वारा छवि के लिए शोधकर्ताओं centrioles की एक बड़ी संख्या की अनुमति देता है, के लिए गैर देखने का मौका अस्पष्ट झुकाव बढ़ रही थी । महत्वपूर्ण बात, इस विधि के रूप में पृथक centrioles के उपयोग पर निर्भर करता है, हम एक विधि प्रदान कर रहे है बरकरार C. reinhardtii centrioles कि परिपक्व centrioles और procentrioles शामिल शुद्ध ।

अंत में, centriole झुकाव है कि इस प्रोटोकॉल के साथ imaged किया जा सकता की सीमा के कारण, एकल कण विश्लेषण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर लागू किया जा सकता है । यह एक विशेष अभिविंयास में centrioles की औसत वर्गों की पीढ़ी में परिणाम है । महत्वपूर्ण बात, इन परिणामस्वरूप 2-डी छवियों तो centriole साथ एक विशिष्ट प्रोटीन के स्थानीयकरण का आकलन किया जा सकता है । वास्तव में, इस विधि दोहरे रंग सुपर संकल्प छवियों को लागू किया जा सकता है, और एक रंग के लिए centriole कंकाल प्रकट किया जा सकता है (जैसे, tubulin), जबकि अंय रंग एक विशिष्ट centriolar प्रोटीन के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । एक रंग या दो रंगों के साथ प्राप्त औसत घटाकर, यह centriole (समीपस्थ, मध्य, या बाहर) के साथ एक प्रोटीन रजिस्टर करने के लिए आसान हो जाता है । ध्यान दें कि दोनों चैनलों को किसी भी भ्रामक व्याख्या को रोकने के लिए सही ढंग से संरेखित होना चाहिए । इसके अलावा, शीर्ष विचारों का औसत समझने में मदद मिलेगी अगर एक प्रोटीन centriolar लुमेन के अंदर स्थानीयकरण, microtubule दीवार के साथ, या centriole के बाहर ।

इस विधि के लिए विशिष्ट प्रोटीन है कि अंयथा विषम लेबलिंग के कारण स्थानीयकरण मुश्किल हो सकता है की स्थानीयकरण का पता लगाने के लिए लाभ है । ध्यान दें कि अंय तरीकों centrioles के भीतर प्रोटीन नक्शा करने के लिए correlative 3 में वर्णित किया गया है डी सिम/SMLM के साथ, उदाहरण के लिए, एक के आसपास एक टोरस्र्स बनाने मार्कर के अंडाकार प्रोफ़ाइल का निर्धारण करके centrioles के विशिष्ट झुकाव का आकलन सिम इमेजिंग द्वारा centriole । इस पैरामीटर का प्रयोग, यह प्रोटीन की एक परिशुद्धता के साथ करने के लिए संभव है 4 – 5 एनएम30. ध्यान दें भी कि विधि यहां वर्णित बरकरार procentrioles, एक संकेत है कि centriole वास्तुकला सबसे अधिक संभावना काफी हद तक संरक्षित है के साथ पृथक centrioles का उपयोग करता है । हालांकि, हम बाहर नहीं कर सकते कि कुछ वास्तु सुविधाओं शुद्धि के दौरान परेशान कर रहे हैं, जैसे centriole व्यास divalent cations की एकाग्रता के साथ बदलती के रूप में मानव centrosome5के अलगाव के साथ परिवर्धित ।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों में से एक अलग झुकाव में पर्याप्त रूप से केंद्रित पृथक centrioles प्राप्त करने के लिए Fluo-स्पा के लिए उत्तरदाई है । ऐसा करने के लिए, सबसे पहले शुद्धता और centriole आइसोलेशन प्रक्रिया की दक्षता सुनिश्चित करें । अलग centrioles की एक कम एकाग्रता उचित इमेजिंग और आगे छवि प्रसंस्करण को रोकने जाएगा । इस प्रयोजन के लिए, हम एक विधि को देखने के क्षेत्र के प्रति centrioles की संख्या को समृद्ध प्रदान कर रहे हैं । उपयोग किए गए अंश में centrioles की संख्या के आधार पर, २५० µ l की अधिकतम मात्रा के साथ, ध्यानकर्ता में लोड की गई वॉल्यूम समायोजित की जानी चाहिए.

महत्वपूर्ण बात, इस विधि एक सेल दीवार शूंय से cw15-C. reinhardtii कोशिकाओं के लिए विकसित किया गया है । इस तनाव में, कोशिका दीवार की कमजोरी कोशिकाओं की एक उचित lysis के लिए अनुमति देता है और, इस प्रकार, अपनी सामग्री की मुक्ति । इस प्रोटोकॉल जंगली प्रकार सी. reinhardtii कोशिकाओं के लिए कुशल नहीं है, के रूप में सेल दीवार एक उचित lysis रोकता है । ऐसे sonication के रूप में वैकल्पिक रणनीतियों या autolysin, एक एंजाइम है कि सेल की दीवार31नीचा कर सकते है के साथ कोशिकाओं की एक पूर्व-मशीन, जगह में डाल करने के लिए सेल की दीवार को बदलने के लिए यहां प्रस्तुत अलगाव प्रोटोकॉल लागू करने से पहले होगा ।

इस सेट अप सूक्ष्मदर्शी के विभिंन प्रकारों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, पारंपरिक फोकल सूक्ष्मदर्शी से उच्च सुपर संकल्प सूक्ष्मदर्शी समर्पित प्रवाह को लेकर । ध्यान दें कि जब SMLM कर रही है, एक विशेष बफर उचित इमेजिंग के लिए आवश्यक है और, इस प्रकार, एक चैंबर coverslip के शीर्ष पर बफर के साथ एक 12 मिमी coverslip के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । बाद इमेजिंग औंधा सूक्ष्मदर्शी के साथ प्रदर्शन किया जाएगा । यदि माइक्रोस्कोप सेट अप एक 12 मिमी coverslip की अनुमति नहीं है, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक 30 मिलीलीटर गोल नीचे ट्यूब और एक संशोधित अनुकूलक और ध्यानी का उपयोग कर coverslips 18 मिमी करने के लिए लागू किया जा सकता है । यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि SMLM में अंतिम पुनर्निर्माण की गुणवत्ता के दाग और प्राथमिक एंटीबॉडी इस्तेमाल की गुणवत्ता पर निर्भर करेगा, साथ ही साथ निर्धारण की विधि है ।

संक्षेप में, हम एक तरीका है कि कई Fluo-स्पा कि विभिंन झुकाव में centrioles के औसत उत्पंन करेगा द्वारा पीछा किया centrioles छवि को लागू कर रहे हैं, इस प्रकार परिशुद्धता के साथ centriolar प्रोटीन स्थानीयकृत मदद प्रदान कर रहे हैं । महत्वपूर्ण रूप से, इस विधि और अधिक आम तौर पर अंय प्रजातियों से अलग centrioles, अंय organelles के लिए, या बड़े macromolecular विधानसभाओं के लिए लागू किया जा सकता है । अंत में, नमूना तैयारी दृष्टिकोण यहां प्रस्तुत है, एकल-फ्लोरोसेंट SMLM डेटा३२के कण विश्लेषण के लिए हाल ही में एल्गोरिथ्म विकास के साथ संयुक्त, बड़े macromolecular के आणविक नक्शानवीसी में आगे सुधार खोल सकता है विधानसभाओं.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम इकोले पॉलीटेक्निक Fédérale de लौसने (EPFL), लौसने, स्विट्जरलैंड, जहां centrioles के सिम छवियों को प्राप्त किया गया था पर पियरे Gönczy और ' इमेजिंग और प्रकाशिकी मंच (BIOP) धंयवाद । निकलाय Klena और दाऊद Gambarotto यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) शुरू अनुदान (StG) ७१५२८९ (एक्सेंट) और Maeva Le Guennec, पॉल Guichard, और वर्जीनी Hamel स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (SNSF) PP00P3_157517 द्वारा समर्थित हैं । सुसैन Borgers जिनेवा विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse monoclonal anti-apha tubulin (clone DM1A) Abcam ab7291  dilution 1:300
DNaseI Roche 10104159001
12 mm coverslips Roth YX03.1
18 mm coverslips Roth LH23.1
K2HPO4 Fluka 60355
KH2PO4 Fluka 60230
Tris base Biosolve Chimie SARL 0020092391BS
acetic acid Carlo Erba Reagents 524520
NH4Cl Sigma A-4514
CaCl2 Sigma C-7902
MgSO4 Sigma 63140-500G-F
steritop filter Millipore SCGPT05RE
sucrose Sigma S7903-1KG
HEPES AppliChem PanReac A3724,0250
PIPES Sigma P6757-500G
MgCl2 ACROS ORGANICS 197530010
NP-40 AppliChem PanReac A1694,0250
Round-bottom (Kimble) tubes 15 mL Fisherscientific 09-500-34
Round-bottom (Kimble) tubes 30 mL Fisherscientific 09-500-37
cover glass staining rack Thomas scientific 8542E40
crystal polystyrene transmission lab box FISHERS 11712944
Methanol VWR 20864.32
BSA Roche 10735086001
Triton X100 Roth 3051.3
goat anti-mouse coupled to Alexa 488  invitrogen A11029 dilution 1:1,000
goat anti-rabbit coupled to Alexa 568 invitrogen A11036 dilution 1:1,000
mounting medium abcam ab188804
Tube, thinwall polypropylene Beckman Coulter 326823
Poly-D-Lysine 1 mg/mL SIGMA  A-003-E
Mouse monoclonal anti-Polyglutamylation modification mAb (GT335) Adipogen AG-20B-0020 dilution 1:1,000
glycerol mounting medium with DAPI and DABCO Abcam ab188804
50 mL conical tubes Falcon 14-432-22
Eppendorf 5810R centrifuge Eppendorf 5811000622
Beckman JS-13.1 swinging bucket rotor Beckman Coulter 346963
Beckman SW 32Ti rotor Beckman Coulter 369694
parafilm Bemis  13-374-10
Leica TCS SP8 with Hyvolution mode Leica 
OSRAM L18W/954 LUMILUX  Luxe Daylight/ OSRAM
Whatman filter paper Sigma  WHA1001325
CrSAS-6/Bld12 antibody dilution 1:300 (Hamel el al., 2014)
Scipion http://scipion.i2pc.es/
EM CCD camera (Andor iXON DU897) Andor

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जीव विज्ञान अंक १३९ Centrioles बेसल शरीर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी organelle अलगाव एकल कण औसत Chlamydomonas reinhardtii सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी
अलगाव और <em>Chlamydomonas</em> Centrioles के एकल कण पुनर्निर्माण के लिए प्रतिदीप्ति इमेजिंग
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Klena, N., Gambarotto, D., Le Guennec, M., Borgers, S., Guichard, P., Hamel, V. Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles. J. Vis. Exp. (139), e58109, doi:10.3791/58109 (2018).

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