Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Evaluering af Zika Virus-specifikke T-celle respons i Immunoprivileged organer af inficerede Ifnar1- / - mus

Published: October 17, 2018 doi: 10.3791/58110
Automatic Translation
*1,2, *2, *3, 1,2, 4, 2, 5, 6, 3, 1,2,4,6, 1,2
1School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 2NHC Key Laboratory of Medical Virology and Viral Diseases, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 3State Key Laboratory of Agrobiotechnology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, 4Research Network of Immunity and Health (RNIH), Beijing Institutes of Life Science, Chinese Academy of Sciences, 5Laboratory Animal Center, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 6CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences
* These authors contributed equally

Summary

En protokol til at evaluere antigen-specifikke T-celle respons i immunoprivileged organerne i Ifnar1- / - murine model for Zika virusinfektion (ZIKV) er beskrevet. Denne metode er afgørende for at undersøge de cellulære mekanismer i beskyttelse og immunpatogenese af ZIKV vacciner og er også værdifulde for deres effekt evaluering.

Abstract

Zika virus (ZIKV) kan fremkalde betændelse i immunoprivileged organer (fxhjerne og testiklerne), fører til Guillain-Barre syndrom og beskadige testiklerne. Under en infektion med ZIKV, har immun celler vist sig at infiltrere væv. Men de cellulære mekanismer, der definerer beskyttelse og/eller immunpatogenese af disse immunceller under en ZIKV infektion er stadig stort set ukendt. Heri, beskriver vi metoder til at evaluere den virus-specifikke T-celle funktion i disse immunoprivileged organer af ZIKV-inficerede mus. Disse metoder omfatter en) en ZIKV infektion og vaccine indpodning i Ifnar1- / - mus; b) histopatologi, immunofluorescens og Immunhistokemi assays til at opdage virusinfektion og betændelse i hjernen, testiklerne og milt; c) udarbejdelse af en tetramer af ZIKV-afledte T-celle epitoper; d) påvisning af ZIKV-specifikke T-celler i monocytter isoleret fra hjernen, testiklerne og milt. Via disse tilgange, er det muligt at opdage de antigen-specifikke T-celler, der har infiltreret i immunoprivileged organerne og evaluere funktioner af disse T-celler i løbet af infektionen: potentielle immun beskyttelse via virus clearance og / eller immunpatogenese til at forværre betændelse. Disse resultater kan også bidrage til at afklare T celler induceret af immunisering mod ZIKV bidrag.

Introduction

ZIKV er en myg-bårne flavivirus, der blev først isoleret i 1947 i Uganda fra en febril rhesus makak. For nylig, ZIKV er blevet en offentlig sundhed nødsituation, på grund af sin hurtige udbredelse i Amerika og dens uventede link til mikrocefali og Guillain-Barre syndrom1,2,3. Fra epidemiologiske data, har været mistænkt ZIKV, at være årsag til Guillain-Barre syndrom i omkring 1 pr. 4.000 inficerede voksne4. Endvidere, en sammenhæng mellem ZIKV og testiklerne infektion/skader i en musemodel har påvist, tyder på, at ZIKV infektion, under visse omstændigheder kan omgå blod-testis barriere og i sidste ende føre til mandlig infertilitet5 . Disse resultater fremhæve betydningen af helt forstå induktion af beskyttende eller patologiske immunrespons under en ZIKV infektion.

Er stadig meget for at lære om cellulære immunrespons til ZIKV. CD4+ og CD8+ T-celle svar til kapsid, kuvert og nonstructural protein 1 (NS1) er blevet observeret i ZIKV-smittede aber og mennesker6,7,8. I mus, flere undersøgelser har vist at CD8+ T celler spiller en beskyttende rolle i at kontrollere ZIKV replikering9,10,11. Vigtigere, Jurado et al. viste, at en ZIKV infektion resulterer i nedbrydning af blod - hjerne barrieren og perivascular infiltration af CD8+ effektor T celler i testiklerne af Ifnar1- / - mus. Derudover viste de at CD8+ T celler igangsætte ZIKV-associerede lammelse og synes at spille en rolle i neonatal hjernen immunopathology. I en tidligere undersøgelse, vi forberedte ZIKV-E294-302 tetramer og viste, at ZIKV-specifikke CD8+ T celler findes i hjerne og rygmarv i ZIKV-smittede Ifnar1- / - mus, som kan have stor betydning for design og udvikling af ZIKV vacciner10.

Som svar på det presserende behov for vaccination mod ZIKV infektion, er flere vacciner i de prækliniske udviklingstrin, herunder RNA vacciner, rekombinant vektor-baserede vacciner og renset protein-underenheder vacciner. Plasmid DNA-vaccine er i fase 1 kliniske forsøg12. Evaluering af sikkerheden og effekten af ZIKV vacciner er derfor vigtig. En fordel ved vaccinerne er deres evne til at fremkalde specifikke T-celle svar, som kan være vigtige for beskyttelse mod ZIKV. Ved hjælp af ZIKV-afledte T-celle epitop-relaterede tetramers, T-celle immunoreactivity forårsaget af en adenovirus-vektor-baseret ZIKV vaccine kunne påvises i immuniserede mus, og både M og E glykoproteiner blev vist sig at fremkalde robust antigen-specifikke CD8+ T-celle immunoreactivity13.

Under en virusinfektion er anerkendelsen af peptid antigener præsenteret af større histocompatibility complex (MHC) molekyler til T-celle receptoren (TCR) en vigtig T-celle-medieret mekanisme til at beskytte værten14. Baseret på denne teori, er tetramer teknologi et unikt værktøj til at belyse de roller at antigen-specifikke T celler spiller i at regulere immunrespons15. Denne protokol beskriver etableringen af Ifnar1- / - musen model for ZIKV infektioner og påvisning af reaktive T celler i milt, hjerne og testikler af mus ved hjælp af tetramer teknologi. Derudover brugte vi ZIKV-E294-302 tetramer til at registrere og evaluere T-celle immunoreactivity induceret af en ZIKV vaccine (AdC7-M/E) i immuniserede mus. Denne undersøgelse giver vejledning til undersøgelse af T-celle respons i immunoprivileged organer og indeholder en henvisning til de potentielle anvendelser i moderkagen eller fostrets hjerne.

Protocol

Dyreforsøg blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af National Institute for Viral sygdomskontrol og forebyggelse, Kina CDC. Alle eksperimenter blev udført efter institutionelle Animal Care og brug Udvalget godkendte animalske protokoller.

1. virus infektion

  1. Holde voksen (6-8 uger gamle) Ifnar1- / - (50% mænd og 50% kvinder) mus i standard særlige patogenfri (SPF) betingelser, og give dem mulighed for regelmæssig adgang til mad og vand.
  2. Inficere Ifnar1- / - mus med ZIKV via en retro-orbital podning af 100 µL af ZIKV i en fosfatbufferet saltvand (PBS) buffer indeholdende 1 x 104 fokus-dannende enheder (FFUs) af virussen. Ligeledes give kontrol mus med et lige saa stort volumen af PBS.
    Forsigtig: Inficere mus ABSL2 betingelser og udføre disse procedurer med virus-inficerede mus i biosikkerhed kabinet.
  3. Overvåge vægt og kliniske tegn (rystelser, forskudt marts, bilaterale slatne hind lemmer) af musene dagligt for 15 dage.

2. vaccination med vaccinen, ZIKV

  1. Brug Ifnar1- / - (50% mænd og 50% kvinder) mus mellem 6-8 ugens i alder. Holde musene i SPF standardbetingelser for 18-29 ° C og en 12-timers lys/mørke cyklus med adgang til mad og vand.
  2. Immunisere Ifnar1- / - mus med ZIKV vaccinen: indsprøjtes 100 µL af AdC7-M/E [4 x 1010 (viruspartikler)] i PBS buffer via en intramuskulær injektion (ruten i.m.) ved hjælp af en 1 mL sprøjte med en 23-G kanyle.
  3. Ligeledes injicere kontrol mus med et lige saa stort volumen af PBS.

3. isolering af monocytter fra milten

Bemærk: Isolering af monocytter fra milten er beskrevet som tidligere nævnt16.

  1. Bedøver immuniserede og ZIKV-inficerede mus 7 d efter podning, ved hjælp af en 5% isofluran concentrationin 100% ilt (med en gennemstrømningshastighed på 1 L/min). Aflive mus af cervikal dislokation. Derefter straks dyppe hele musen i 75% ethanol.
    FORSIGTIGHED: fra dette skridt videre, alle eksperimentelle procedurer bør udføres under aseptiske forhold i en biosikkerhed kabinet.
  2. Ved hjælp af nåle, lave lemmer af (aflivede, tidligere inficeret/immuniseret) mus på skum plade med maven opad.
  3. Skære huden langs abdominal midterlinjen til thorax med en steril skalpel, skære mavemusklerne med saks, afsløre i bughulen, og forsigtigt fjerne leveren.
    Bemærk: Den lange, mørke-røde orgel til venstre for maven er milten.
  4. Fjerne milten, skyl det 3 x i PBS til at fjerne enhver blod, og læg det i 1,5 mL iskold Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI). Holde milt på is.
  5. For at generere en enkelt celle suspension fra milten, placere organer(med) på en steril 40 µm-mesh celle si på toppen af en 50 mL tube og der tilsættes 2 mL iskold RPMI medium indeholdende 10% føtal bovint serum (FBS). Bruge stemplet en 5 mL sprøjte, mekanisk mash organer(med) og tilføje medium indtil orglet har været fuldt jorden gennem trådnet.
  6. Overføre cellesuspension til en 15 mL tube og centrifugeres ved 600 x g i 5 min. ved 4 ° C. Fjern supernatanten.
  7. Resuspend celler med 5 mL af en røde blodlegemer (RBC) lysisbuffer (NH4Cl, Na2EDTA og KHCO3; Se Tabel af materialer), og der inkuberes lysis reaktion ved stuetemperatur i 5-6 min.
  8. Stop RBC lysis med 10 mL iskold RPMI/FBS medium og centrifugeres tube på 600 x g i 5 min. ved 4 ° C. Fjern supernatanten.
  9. Resuspend celler med 10 mL af komplet RPMI medium (RPMI med 10% vol/vol FBS og 100 U/mL penicillin-streptomycin). Overfør 10 µL af cellesuspension til en lille tube, bland det med 10 µL af 0,4% wt/vol trypan blå og tæller antallet af celler ved hjælp af en hemocytometer.

4. isolering af monocytter fra hjerne og testikler

  1. Bedøver ZIKV-inficerede mandlige mus 7 d efter podning, ved hjælp af 5% isofluranein 100% ilt (med en gennemstrømningshastighed på 1 L/min). Aflive mus af cervikal dislokation. Derefter straks dyppe hele musen i 75% ethanol.
    FORSIGTIGHED: Fra dette trin og fremefter, alle eksperimentelle procedurer skal udføres under aseptiske forhold i en biosikkerhed kabinet. Isolering af monocytter fra hjerne og testikler er beskrevet som tidligere nævnt17.
  2. Immobilisere (aflivede, tidligere inficerede) mandlige musen i den liggende stilling på et skærebræt.
  3. Sikre hovedbunden med en lige 1 x 2 tænder pincet, og bruge Iris saks til at gøre en midterlinjen snit på hovedbunden for at udsætte kraniet.
  4. Spænd de to sider af baner med skarpe pincet og lave hjernen. Placer et tip skarpe Iris saks i foramen magnum og skåret sideværts i kraniet. Gentag dette trin for de andre side.
  5. Brug skarpe Iris saks til at omhyggeligt skæres fra den samme hulrum, op med midterlinjen, mod næsen. Prøv at holde slutningen af saksen så overfladisk som muligt for at undgå skade hjernen.
  6. Løft hjernen med pincet og bruger skarpe Iris saks til omhyggeligt dissekere kranienerver fibre. Fjerne hjernen med pincet og placere det i en 15 mL tube der indeholder 5 mL iskold RPMI/10% FBS medium.
  7. Grab abdominal huden med pincet og bruger skarpe Iris saks til at lave en langsgående snit gennem integument og bugvæggen og udsætte den nederste del af maven. Skubbe testiklerne op til snit. Forsigtigt trække det fedtlag med pincet og udsætte en kugleformet testiklerne på begge sider.
  8. Brug skarpe Iris saks til at omhyggeligt dissekere fedtlag og epididymis. Placer testiklerne i en 15 mL tube der indeholder 5 mL iskold RPMI/10% FBS medium med pincet.
  9. For at generere en enkelt celle suspension fra hjernen eller testiklerne, placere orglet på en steril celle si med en 100 µm mesh på toppen af en 50 mL tube og der tilsættes 2 mL iskold RPMI/10% FBS medium. Bruge stemplet en 5 mL sprøjte, mash orgel og føje medium indtil orglet har været fuldt jorden gennem trådnet.
  10. Overføre cellesuspension til en 15 mL tube og centrifugeres ved 600 x g i 5 min. ved 4 ° C. Fjern supernatanten.
  11. Resuspend celler med 5 mL 30% tæthed gradient medium, og derefter føje dem meget langsomt til 2 mL af 70% tæthed gradient medium i en 15 mL tube.
  12. Sluk bremsen og centrifugeres rør ved 4 ° C ved 800 x g i 30 min. Hent lymfocytter fra det midterste lag.
  13. Overføre interfasen til en frisk 15 mL tube, der tilsættes 10 mL af kolde RPMI/10% FBS medium og centrifugeres rør på 300 x g i 10 min. ved 4 ° C. Fjern supernatanten.
  14. Resuspend celler med 10 mL iskold RPMI/FBS medium og centrifugeres dem ved 600 x g i 5 min. ved 4 ° C. Fjern supernatanten.
  15. Resuspend celler med 10 mL af komplet RPMI medium og tæller antallet af celler som trin 3.9.

5. tetramer forberedelse

  1. Konstruere plasmider at udtrykke de ekstracellulære domæner af H-2Db med en biotinylated websted tag på C-terminus α3 domæne og β2m ved hjælp af pET28a vektor med en NdeI og XohI begrænsning site18.
  2. Express og forberede optagelsen organer af H-2Db og β2m som beskrevet tidligere20.
  3. Renaturere og rense den MHC/peptid kompleks H-2Db-E294-302.
    1. Forberede 200 mL af en refolding løsning [100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 400 mM L-arginin, 2 mM EDTA-Na, 5 mM GSG og 0,5 mM GSSG]. Tilføje proteasehæmmere: 2 mL phenylmetylsulfonylfluorid (PMSF, stock 100 mM), 100 µL af pepstatin (bestand 2 mg/mL) og 100 µL af leupeptin (bestand 2 mg/mL). Cool buffer ved 4 ° C i 30 min.
    2. Tilføje H-2Db, β2m og peptid til den refolding løsning.
      1. Injicér 500 µL af β2m opløst i en guanidin løsning (30 mg/mL lager) ved hjælp af en sprøjte. Til dette, bruge en 23 G nål med en 5 mL sprøjte og tilføre den refolding løsning dråbevis β2m. Opløsningen konstant og langsomt under omrøring på 150 omdr. / min. ved 4 ° C.
      2. Efter β2m er blevet opløst i refolding-løsningen, løse 2 mg E294-302 peptid i 200 µL af DMSO og hurtigt tilføre det i den refolding løsning ved hjælp af en pipette. Langsomt røre løsningen på 150 omdr. / min. ved 4 ° C i 15 min.
      3. Injicere 1,5 mL H-2Db opløst i en guanidin løsning. Hold opsigt bar roterende på 150 rpm for hvorved man genfolder af H-2Db ved 4 ° C i 8-10 timer.
        Bemærk: Løsningen blev placeret i en lukket kasse i et koldt rum.
    3. Koncentrere den refolded protein i et tryk kammer med en 10 kDa membran. Udveksle buffer [20 mM Tris-HCl (pH8.0), 50 mM NaCl] til kammeret og koncentrere det til en endelige mængden af 30-50 mL.
    4. Den refolding opløsning overføres til et centrifugeglas og spinde det på 2.500 x g i 15 min. ved 4 ° C.
    5. Omhyggeligt overføre supernatanten til en 10 kDa centrifugal filter og yderligere koncentrere det til en endelige mængden af 500 µL på 2.500 x g i 30 min.
    6. Overføre supernatanten til en frisk tube og spinde det på 12.000 x g i 15 min. rense protein med S200 10/300 GL gel filtration kromatografi.
    7. Indsamle MHC kompleks peak og koncentrere det til en endelige mængden af 350 µL.
  4. For at generere en 500 µL reaktion volumen for biotinylation, tilføje regents i følgende rækkefølge: 100 µL af opløsning A [0.5M bicine (pH 8.3)], 100 µL af løsning B (100 mM ATP, 100 mM MgOAc, 200 µΜ biotin), 100 µL af ekstra d-biotin (500 µΜ biotin) , 20 µL af BirA enzym (60 µg), 0,5 µL af pepstatin (2 mg/mL) og 0,5 µL af leupeptin (2 mg/mL). Inkuber reaktion tube natten over ved 4 ° C.
    Forsigtig: Må ikke tilsættes nogen EDTA til biotinylating reaktion.
  5. Rense MHC ved hjælp af en S200 10/300 GL gel filtrering kolonne for at fjerne eventuelle ekstra biotin.
  6. Afgøre biotinylating effektivitet med en streptavidin-Skift assay18.
    1. Forberede tre prøver, A, B og C, på is i 30 min. Derefter analysere resultaterne af en 10% SDS-PAGE. Prøve A består af 8 µL af biotinylated MHC molekyler og 2 µL af exchange buffer, prøve B af 8 µL af biotinylated MHC molekyler og 2 µL af streptavidin (20 mg/mL), og 2 µL af streptavidin (20 mg/mL) prøve C og 8 µL exchange buffer.
      Forsigtig: Ikke koge prøven.
  7. Danne multimerer biotinylated MHC molekyler.
    1. Producere tetramer ved at blande den biotinylated E294-302 peptid-H2Db kompleks med phycoerythrin-mærket streptavidin på en muldvarp forhold på 1:5 til at sikre en komplet bindende i alle biotinylated MHC molekyler.
    2. Beregning af streptavidin-konjugat behov for tetramerization.
      1. Bestemme modermærker af MHC/peptid komplekser tegner sig for proteinkoncentration og den kindtand vægt (eksempel: 1,8 mg af total protein = 40 nmol).
      2. Beregne modermærker af streptavidin-konjugat behov ved at dividere modermærker af MHC/peptid med 5 (eksempel: 40/5 = 8 nmol af streptavidin-konjugat).
      3. Beregning af streptavidin (i µg) afhængigt af streptavidin-konjugat (eksempel: streptavidin-PE [300.000 g/M] → 8 nmol behov = 2.400 g).
    3. Opdele streptavidin-phycoerythrin i 10 prøver. Tilføje hver prøve til et rør, der indeholder de biotinylated E294-302 peptid-H2Db kompleks, med et interval på 20 min. Efter indlæsning af den sidste prøve, Ruger reaktionen røret ved 4 ° C natten over i mørke.
  8. Anvende multimerized reagenser i en 100 kDa spin rør og koncentrere den ved centrifugering ved 2.000 x g ved 4 ° C til en volumen på < 100 µL.
  9. Fortyndes prøven i spin tube til 4 mL ved hjælp af PBS (pH 8,0) og koncentrere det igen til < 100 µL.
  10. Gentag buffer exchange trin i PBS (pH 8,0) 4 x.
  11. Fylde de samlede igen til 500 µL ved hjælp af PBS (pH 8.0). Koncentrere prøven til en anslået koncentration på 2-2,5 mg/mL på 2.000 x g ved 4 ° C. Butik prøven i mørke ved 4 ° C.

6. flowcytometri

  1. Inkuber celle suspensioner (fra trin 3,9 og/eller trin 4.15) ved 4 ° C med 0,1 µL anti-murine CD16/CD32 Fc-Receptor blokerende reagens pr. 20 µL (fortynding faktor 1:200) i 10 min, for at forhindre enhver uspecifik bindende.
  2. Centrifugeres tetramer røret på 20.000 x g i mindst 15 min. ved 4 ° C.
  3. Tilføj 20 µL af cellesuspension til en 96-brønd platecontaining 1 x 106 celler hver godt.
  4. Forberede en tilstrækkelig mængde af E294-302 tetramer mix at plette alle eksperimentelle rør. Forberede et overskud af 15% af den samlede mængde af denne blanding til konto for pipettering fejl. Fortynd E294-302 tetramers (2 mg/mL, 1 µL/test) i FACS buffer (PBS, 0,5% FBS) således at 20 µL af E294-302 tetramer mix er tilføjet til hver prøvebrønd.
  5. Tilføj 20 µL af E294-302 tetramer mix til 96-brønd pladen. Ved udgangen af dette skridt bør den endelige mængden i hver brønd 40 µL.Incubate plade i mørke ved stue temp i 30 min.
  6. Tilføje primære antistoffer (FITC-konjugeret eller APC-konjugerede anti-CD3 (0,2 mg/mL), PerCP-konjugerede anti-CD8 (0,2 mg/mL)) på 1 µL/test til cellesuspension, og derefter inkuberes det ved 4 ° C i 30 min. i mørke.
  7. Vaske celler 2 x med 2 mL af FACS buffer, og der centrifugeres dem på 600 x g i 5 min. omhyggeligt Aspirér supernatanten og resuspend celler med 200 µL af FACS buffer.
  8. Opbevare prøver midlertidigt ved 4 ° C i mørke indtil flow cytometric analyse.
  9. Brug de følgende gating strategi for flow cytometric analyse.
    1. Oprette en gate på diagonalt grupperet slåbrokker ved plotte en forward scatter (FSC) versus side scatter (SSC) område.
    2. Derefter, gate på CD3+ celler ved side scatter (SSC) versus CD3; Næste, gate på CD3+ CD8+ celler; Endelig vil skitsere CD8+ tetramer+ celler19.

7. histopatologi, immunofluorescens og Immunhistokemi Assay

  1. Histopatologisk assay
    1. Indsamle hjernen og testiklerne væv i ZIKV-inficeret Ifnar1- / - mus 7 d efter podning og ordne dem i 4% neutralt-buffered formaldehyd.
      Forsigtig: PARAFORMALDEHYD er giftige; bære passende personlige værnemidler.
    2. Integrere vævet i paraffin.
    3. Afsnit væv på 5 mm ved hjælp af en vibratome.
    4. Pletten væv med hæmatoxylin og eosin (H & E).
  2. Immunhistokemi assay
    1. Deparaffinize, rehydrere og antigen-Hent vævet sektioner, baseret på procedurer beskrevet tidligere21.
    2. Behandle væv sektioner med 3% H2O2 i PBS (pH 7,6) i 10 min og blokere dem med 1% bovint serumalbumin (BSA) i 10 min.
    3. Inkuber væv sektioner med rotte anti-mus CD3 antistof (fortynding: 1/1.000) i 8 timer ved stuetemperatur og derefter inkuberes dem ved 4 ° C natten over.
    4. Skyl væv med PBS og derefter inkuberes dem med 3 dråber af biotinylated sekundær antistof (fortynding: 1/1.000) i 2 timer ved stuetemperatur, efterfulgt af 3 dråber af begærlighed-biotin-peroxidase (fortynding: 1/200) ved stuetemperatur i 30 min.
    5. Binde, med 3 dråber af 30, 30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (fortynding: 1/1.000), som tidligere beskrevet22.
    6. Counterstain væv sektioner med Mayers hæmatoxylin.
  3. Immunfluorescens assay
    1. Lufttørre afsnittene frosne testis (6 mm) i 10 min ved stuetemperatur.
    2. Fastgør dem med iskold acetone i 10 min.
    3. Vaske sektioner med PBS for 3 x og blokere dem med en blokerende buffer (1% BSA, 0,3% Triton, 1 x PBS) ved 37 ° C i 30 min.
    4. Inkuber væv sektioner med primær antistof (Z6) (20 µg/mL) ved 4 ° C natten over.
    5. Skyl væv med PBS og anvende den sekundær antistof (fortyndingsfaktoren: 1/200) i 1 time ved 37 ° C.
    6. Vaske væv sektioner med PBS og counterstain dem for kerner ved hjælp af 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (fortyndingsfaktoren: 1/1.000), efter fabrikantens anvisninger.

Representative Results

Efter disse metoder, har vi udviklet en murine model til ZIKV infektioner. Ifnar1- / - mus på 6-8 ugens i alder var smittet med 1 x 104 fokus-dannende enheder (FFU) af ZIKV af retroorbital injektion. Patologiske symptomer og tegn (fig. 1A) samt vægtændringer (figur 1B), der blev konstateret i Ifnar1- / - mus efter en infektion med ZIKV. Murine hjerner viste indlysende ødem og hyperæmi (figur 1C). I mellemtiden, testikler faldt gradvist (fig. 1D). Desuden, patologiske ændringer og ødelæggelse af væv blev fundet i hjerne og testikler (fig. 2A). Vi udførte en immunofluorescens assay til påvisning af ZIKV i hjerne og testikler (figur 2B). Høj viral belastninger blev opdaget i hjernen og testiklerne af immunfarvning (figur 2B). Immunhistokemi viste en robust infiltration af CD3+ T celler ind i musene hjernen efter infektion med ZIKV (figur 2C).

For at registrere og evaluere ZIKV-specifikke T-celle svar, vi forberedt en mus MHC-jeg H-2Db-E294-302 tetramer. Peptid E294-302 kan hjælpe H-2Db renaturere korrekt og give en høj mængde af opløselig MHC-jeg (fig. 3A). I Skift assay, kunne en høj effektivitet i biotinylation observeres (fig. 3B). Efterfølgende tre streptavidin-fluorescens (APC, PE, og BV421) - mærket pMHC - jeg tetramers blev produceret for at opdage ZIKV-specifikke T-celler (figur 3C). PE-mærket tetramer havde en højere effektivitet til at påvise den specifikke CD8+ T celle i forhold til APC - og BV421-mærket tetramers, men forskellen ikke var statistisk signifikant.

Bruger E294-302 tetramer, opdaget vi ZIKV-specifikke T-lymfocytter i milten af de inficerede mus ved flowcytometri på 7 d efter podning af ZIKV (3.49 ± 0,45%). Også, svarende til metoden beskrevet i afsnit 3 i denne protokol, med 4 uger efter vaccination med AdC7-M/E vaccine, ZIKV-specifikke T-lymfocytter blev opdaget i milten (6.89 ± 1,36%) (Figur 4).

Desuden, vi opdaget lymfocytter infiltreret i immunoprivileged organerne, såsom hjerne og testikler, efter ZIKV infektion. Portene blev sat til at vælge for CD3+CD8+ T-celler i samlede lymfocytter i hjerne og testikler. En høj forholdet mellem E294-302 tetramer-specifikke T-celler der kunne påvises i hjernen (42,2% i CD3+CD8+ T celler) og den testikel (26.4% i CD3+CD8+ T celler) lymfocytter (figur 5).

Figure 1
Figur 1 : Karakterisering af ZIKV infektion i Ifnar1- / - mus. Ifnar1- / - mus på 6-8 ugens i alder var smittet med 104 fokus-dannende enheder (FFU) af ZIKV af retroorbital injektion, og musene injiceret med PBS blev brugt som ikke-inficerede objekter. (A) morfologi og (B) vægtændringer af inficerede Ifnar1- / - mus blev overvåget. De røde pile viser Ifnar1- / - mus præsenteret med myeloparalysis og motor paraparesis efter infektionen. (C) hjerner på 7 d efter podning og (D) testikler på 0, 7, 14 og 30 dage efter podning er høstet. Repræsentative billeder af hjerne og testikler fra mus er vist med en lineal til at angive størrelserne. Fejllinjer udgør gennemsnit ± SEM. n = 10 mus pr. gruppe pr. eksperiment. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Påvisning af ZIKV og lymfocytter i hjernen og testiklerne af ZIKV-inficerede Ifnar1- / - mus. (A) dette panel viser histopatologiske forandringer i hjerne og testikler fra ZIKV-inficerede mus i forhold til negative kontroller på 7 d efter podning. Skalalinjen = 25 µm (venstre panel) og 50 µm (højre panel). (B) en immunofluorescens test blev udført med anti-ZIKV Z6 antistof (grøn). Alle vævsprøver blev indsamlet fra ZIKV-inficerede mus på 7 d efter podning. Atomkerner var plettet med DAPI (blå). Skalalinjen = 50 µm. (C) Immunhistokemi viser en robust infiltration af CD3+ T-celler i hjernen og testiklerne. Skalalinjen = 25 µm (venstre panel) og 50 µm (højre panel). Lilla angiver hæmatoxylin, brun repræsenterer CD3 antistof. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Fremstilling af ZIKV-specifikke pMHC-jeg tetramers. (A) binding af E294-302 til H-2Db er belyst ved en in vitro- hvorved man genfolder. Blå angiver H-2Db-E294-302 protein. Orange repræsenterer den negative kontrol uden peptid. (B) dette panel viser H-2Db-E294-302 Skift assay. (C) mock repræsenterer en PBS-kontrol. Tre streptavidin fluorescens (APC, PE, og BV421) - mærket pMHC - jeg tetramers blev brugt til at registrere ZIKV-specifikke T-celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Flow cytometric analyse af virus-specifikke CD8 + T-celler i milt af ZIKV-inficerede og vaccine-immuniseret mus. Ifnar1- / - mus på 6-8 ugens i alder var enten inficeret med 104 fokus-dannende enheder (FFU) af ZIKV eller modtaget en enkelt-dosis af 4 x 1010 virale partikler af AdC7-M/E eller PBS som en negativ kontrol. Efter 7 dage efter infektion eller 4 uger efter vaccination, var musen splenocytes høstet og analyseret ved flowcytometri. Dataene, der er vist som gennemsnit ± SD. statistisk analyse blev udført ved hjælp af en-vejs ANOVA (ikke signifikant: P > 0,05; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ***P < 0,0001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 5
Figur 5 : Gating strategi og repræsentative resultater af virus-specifikke CD8+ T-celler i hjerne og testikler af ZIKV-inficerede mus. Repræsentative parceller er vist for infiltreret lymfocytter i (A) hjerne og (B) i testiklerne. En arv af gates er indstillet til at vælge lymfoide-scatter+ og CD3+ begivenheder. Af disse, CD8+ begivenheder er låge til analyse af epitop-specifikke T-celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Discussion

Immunogen T-celle epitop spiller en væsentlig rolle i cellulær immunitet mod patogener23. Påvisning af ZIKV-specifikke T-celler i immunoprivileged organer er således en kritisk metode at forstå T-celle svar mod den naturlige ZIKV infektion. I mellemtiden, T-celle respons afsløring er et fremragende værktøj til at undersøge effekten af den viral vaccine. Her viser vi en omfattende protokol til at visualisere de eksperimenter, som omfatter isolering af lymfocytter fra milt, hjerne og testikler af ZIKV-inficerede mus, forberedelse af immundominant epitop E294-302 tetramer, og den anerkendelse af ZIKV-specifikke CD8+ T-celler i immunoprivileged organer af ZIKV-inficerede mus.

En tidligere undersøgelse viste, at et levende ZIKV eller dets RNA kan påvises i sæd af mandlige patienter, hvilket viser, at ZIKV kan omgå blod-testis barriere og formere sig i den reproduktive system24. Tidligere, viste vi også at ZIKV kan forårsage testiklerne skader og føre til mandlig infertilitet i mus25. ZIKV infektion kan føre til viræmi i rhesus aber, og viral RNA kan blive opdaget i centralnervesystemet (CNS), samt i de indre organer. Immunhistokemi afslørede, at ZIKV-specifikke antigener blev præsenteret i CNS og flere perifere organer26. Også, i murine modeller, ZIKV infektion kan fremkalde en stærk antiviral CD8+ T-celle respons i milt og CNS26.

I forhold til tidligere arbejde, denne undersøgelse etablerer systematiske metoder til at opdage ZIKV-specifikke CD8+ T-celle respons i hjerne og testikler, som er immunoprivileged websteder. Det er vigtigt at vurdere funktionaliteten af virus-specifikke T-celler i immunoprivileged organerne i de ZIKV-inficerede mus. Brugen af tetramers til at opdage ZIKV-specifikke CD8+ T-celle respons i immunoprivileged organer ville i høj grad forbedre vores forståelse af ZIKV infektioner og deres vært immunrespons. Bruger E294-302 tetramer, kan virus-specifikke T-celler i hjernen og testiklerne være isoleret ved flowcytometri, for at undersøge de cellulære mekanismer i beskyttelse og immunpatogenese under en ZIKV infektion. I mellemtiden, er det nyttigt for forskere at undersøge yderligere funktioner i CD8+ T-celler til at kontrollere ZIKV, eller til at forbedre immunpatogenese i disse organer under ZIKV infektion.

At analysere antigen-specifikke murine CD8+ T-celle svar i immunoprivileged organerne, vi forberedt H-2Db-E294-302 tetramer og opdaget CD8+ T celler ved flowcytometri. Tetramers er et kraftfuldt værktøj til at detektere antigen-specifikke T-celler. Her, blev tre typer af fluorokrom-konjugeret streptavidin (APC, PE, og BV421) genereret. Selv om der er ingen statistisk signifikante forskelle i den APC-, BV421- og PE-mærket tetramers til påvisning af antigen-specifikke T-celler, PE-mærket pMHC-jeg tetramers givet de bedste resultater. Derfor, PE-mærket tetramer blev brugt i hele denne undersøgelse. Interessant, opdaget baseret på PE-mærket H-2Db-E294-302 tetramer, vi højt nøgletal af antigen-specifikke T-celler i både hjerne og testikler, som angiver migration evne til virus-specifikke T-celler fra blod til immunoprivileged organer.

Der er dog nogle begrænsninger i protokollen. H-2Db-E294-302 tetramer er ikke nyttigt for human T-celle opdagelse, fordi tetramer opdagelse er afhængig af MHC begrænsning. Screening af immundominant HLA-begrænset peptider er stadig nødvendig. Udover, retro-orbital infektion er effektiv for en ZIKV infektion men muligvis ikke en bekvem handling for nogle efterforskere. Således anbefales andre ruter af infektion, herunder peritoneal, subkutane eller intravenøst, også.

I protokollen beskrevet her, er et kritisk skridt isolering af monocytter fra hjernen og testiklerne. Det er vigtigt at erhverve høj kvalitet lymfocytter; Det er således vigtigt at være opmærksom, for eksempel, centrifugal hastighed, styrke af slibning væv, og dissektion af væv, hjerne og testiklerne. Derudover for tetramer forberedelse er proteasehæmmere (PMSF, pepstatin, leupeptin) nyttige, når beskytte et protein fra nedbrydes. Derfor giver det mening at tilføje en protease-hæmmer til den refolding buffer og udveksle bufferen i løbet af processen af tetramer forberedelse.

Til sidst vil præsentere vi metoder til påvisning af antigen-specifikke T-celle svar i immunoprivileged organerne i Ifnar1- / - musen modellen for en ZIKV infektion. Denne platform kan anvendes bredt til at undersøge de immun mekanismer af emerging og genopståede vira, der kan omgå barriererne mellem blod og immunoprivileged organer. Desuden, denne undersøgelse kan bane vejen for den fremtidige udvikling af kandidat vacciner og immunoterapi.

Disclosures

Forfatterne har intet at erklære.

Acknowledgments

Forfatterne takke Gary Wong til dansk revision. Dette arbejde blev støttet af den nationale nøgle forskning og udvikling Program i Kina (grant 2017YFC1200202), Major særlige projekter for smitsomme sygdom forskning i Kina (grant 2016ZX10004222-003). George F. Gao er en førende hovedinvestigator National Natural Science Foundation i Kina Innovative Forskergruppens (grant 81621091).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Z6 our lab Ma W, Li S, Ma S, et al. Zika virus causes testis damage and leads to male infertility in mice. Cell, 2016, 167: 1511-1524 e1510
CD3 Santa Cruz sc-1127; RRID: AB_631128
Fluorescein-Conjuated Affinipure Goat anti-human IgG(H+L) ZSGB-BIO ZF-0308
Rabbit Anti-Goat IgG, FITC Conjugated CWBIO CW0115
FITC anti-mouse CD3 Biolegend 17A2
APC anti-mouse CD3 Biolegend 100236
PerCP anti-mouse CD8a Biolegend 100732
Percoll GE Healthcare P8370
PMSF Ameresco 0754-5G Toxic and corrosive reagent.
Handle with care
Streptadivin BD S4762-FZ Gives a clear solution at 10mg/ml in PBS and  stored at -20 °C
Pepstatin Sigma P4265-5MG 5 mg in 2.5 mL DMSO, aliquots stored at -20 ºC
Leupeptin Sigma L8511 5 mg in 2.5 mL dH2O, aliquots stored at - 20 ºC
Peptides Scilight-peptide Must be resuspended in DMSO and stored at -20 °C
RPMI 1640 Hyclone SH30809.01 Must be stored at 4 °C
DMSO MP 219605590 Store at room temperature.
APC-Streptadivin BD 554067 Must be stored and maintained at
4 °C. Do not freeze.
FITC-Streptadivin BD 554060 Must be stored and maintained at
4 °C. Do not freeze.
PE-Streptadivin BD 554061 Must be stored and maintained at
4 °C. Do not freeze.
BV421-Streptadivin BD 563259 Must be stored and maintained at
4 °C. Do not freeze.
PageRuler Unstained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific  26614 Must be stored at 4 °C
Cell Strainers BF BF10-5040 Store at room temperature.
Amicon Ultra 100 kDa Millipore UFC510024 Store at room temperature.
Ultracentrifuge Thermo Fisher Scientific 
FACS Cantol Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used.
Superdex 200 Increase 10/300 GL  GE healthcare 28990944
AKTA PURE GE healthcare
red blood cell lysis buffer Solarbio R1010 Store at 4 °C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
  2. Hazin, A. N., et al. Computed Tomographic Findings in Microcephaly Associated with Zika Virus. The New England Journal of Medicine. 374 (22), 2193-2195 (2016).
  3. Zhang, Y., et al. Highly diversified Zika viruses imported to China, 2016. Protein & Cell. 7 (6), 461-464 (2016).
  4. Cauchemez, S., et al. Association between Zika virus and microcephaly in French Polynesia, 2013-15: a retrospective study. The Lancet. 387 (10033), 2125-2132 (2016).
  5. Turtle, L., et al. Human T cell responses to Japanese encephalitis virus in health and disease. The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1331-1352 (2016).
  6. Dudley, D. M., et al. A rhesus macaque model of Asian-lineage Zika virus infection. Nature Communications. 7, 12204 (2016).
  7. Osuna, C. E., et al. Zika viral dynamics and shedding in rhesus and cynomolgus macaques. Nature Medicine. 22 (12), 1448-1455 (2016).
  8. Stettler, K., et al. cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection. Science. 353 (6301), 823-826 (2016).
  9. Zhao, M., Zhang, H., Liu, K., Gao, G. F., Liu, W. J. Human T-cell immunity against the emerging and re-emerging viruses. Science China Life Sciences. 60 (12), 1307-1316 (2017).
  10. Huang, H., et al. CD8+ T Cell Immune Response in Immunocompetent Mice during Zika Virus Infection. Journal of Virology. 91 (22), 00900-00917 (2017).
  11. Elong Ngono, A., et al. Mapping and Role of the CD8+ T Cell Response During Primary Zika Virus Infection in Mice. Cell Host & Microbe. 21 (1), 35-46 (2017).
  12. Marques, E. T. A., Burke, D. S. Tradition and innovation in development of a Zika vaccine. The Lancet. 391 (10120), 516-517 (2017).
  13. Xu, K., et al. Recombinant Chimpanzee Adenovirus Vaccine AdC7-M/E Protects against Zika Virus Infection and Testis Damage. Journal of Virology. , 01722-01817 (2018).
  14. Jama, B. P., Morris, G. P. Generation of human alloantigen-specific T cells from peripheral blood. Journal of Visualized Experiments. (93), e52257 (2014).
  15. Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. Journal of Visualized Experiments. (68), e4420 (2012).
  16. Govindarajan, S., Elewaut, D., Drennan, M. An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen. Journal of Visualized Experiments. (105), e53256 (2015).
  17. Posel, C., Moller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain. Journal of Visualized Experiments. (108), e53658 (2016).
  18. Altman, J. ohnD., et al. Phenotypic Analysis of Antigen-Specific T Lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
  19. Li, H., Zhou, M., Han, J., Zhu, X., Dong, T., Gao, G. F., Tien, P. Generation of murine CTL by a hepatitis B virus-specific peptide and evaluation of the adjuvant effect of heat shock protein glycoprotein 96 and its terminal fragments. J Immunol. 174 (1), 195-204 (2005).
  20. Valkenburg, S. A., et al. Preemptive priming readily overcomes structure-based mechanisms of virus escape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5570-5575 (2013).
  21. Shang, T., et al. Toll-like receptor-initiated testicular innate immune responses in mouse Leydig cells. Endocrinology. 152 (7), 2827-2836 (2011).
  22. Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. (99), e52293 (2015).
  23. Zhou, M., et al. Screening and identification of severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus-specific CTL epitopes. The Journal of Immunology. 177 (4), 2138-2145 (2006).
  24. Barzon, L., Lavezzo, E., Palu, G. Zika virus infection in semen: effect on human reproduction. The Lancet Infectious Diseases. 17 (11), 1107-1109 (2017).
  25. Ma, W., et al. Zika Virus Causes Testis Damage and Leads to Male Infertility in Mice. Cell. 167 (6), 1511-1524 (2016).
  26. Li, X. F., et al. Characterization of a 2016 Clinical Isolate of Zika Virus in Non-human Primates. EBioMedicine. 12, 170-177 (2016).

Tags

Immunologi og infektion spørgsmål 140 Zika virus antigen-specifikke T-celle vaccination immunoprivileged organer tetramer
Evaluering af Zika Virus-specifikke T-celle respons i Immunoprivileged organer af inficerede Ifnar1<sup>- / -</sup> mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y., Zhang, H., Ma, W., Liu,… More

Zhang, Y., Zhang, H., Ma, W., Liu, K., Zhao, M., Zhao, Y., Lu, X., Zhang, F., Li, X., Gao, G. F., Liu, W. J. Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice. J. Vis. Exp. (140), e58110, doi:10.3791/58110 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter