Evaluering af Zika Virus-specifikke T-celle respons i Immunoprivileged organer af inficerede Ifnar1^{- / -} mus

Under Zika virusinfektion, T-celler kan infiltrere immunoprilegerede organer for virus elimination, men kan også bidrage til immunpatogenese, såsom Guillain-Barre syndrom eller testiklerne skade. Den største fordel ved denne teknik er, at det letter tetramer-baseret påvisning af antigenspecifik T-celler i immunoprivilegerede organer, både under zikavirusinfektion og efter vaccineimmunisering. I denne model, Zika virus infektion er indledt i interferon alfa / beta receptor knockout mus, så sporing af Zika virus-specifikke T-celler i hjernen, testikler, og milt.

Ved hjælp af en tetramer farvning tilgang, er det muligt at undersøge blot karakteristika immunoprivilegeret organ infiltrere zika virus-specifikke T-celler til at udforske T-celle bidrag til immunbeskyttelse og immunopatiske celler. For Zika virusinfektion, levere en gange 10 til de fire fokusdannende enheder af Zika virus i 100 mikroliter af PBS via retro-orbital vaccination i seks-til otte uger gamle interferon alfa / beta receptor knockout mus. Derefter overvåge vægten og kliniske tegn på de inficerede dyr dagligt i 15 dage.

Syv dage efter inokulering, sikre det inficerede dyr i liggende stilling på en kirurgisk skum, og bruge en steril skalpel til at gøre en hud snit langs midterlinjen af maven. Brug saks til at åbne mavemusklerne, og forsigtigt udtrække leveren. Derefter fjernes milten, og skyl vævet tre gange i PBS for at fjerne blodet.

Efter den sidste vask skal milten sættes på 1,5 milliliter iskoldt RPMI-medium på is, indtil alle milterne er opsamlet. For at generere en enkeltcellesuspension anbringes milten i et sterilt, 40 mikrometer meshcellesal oven på et 50-milliliterrør, og der tilsættes to milliliter iskoldt RPMI-medium suppleret med 10 % føtalt kvægserum eller FBS til sien. Brug derefter stemplet af en fem-milliliter sprøjte til macerate vævet gennem filteret, ved hjælp af frisk medium til at skylle de frigivne celler gennem masken.

Encelledefjedringen overføres til et konisk rør med 15 milliliter til centrifugering, og pelletsussuseres igen i fem milliliter lysisbuffer for røde blodlegemer. Efter fem til seks minutter ved stuetemperatur stoppes lysisen med 10 milliliter iskold RPMI plus FBS for endnu en centrifugering, og pelleten skal opsbruges igen i 10 milliliter komplet medium til optælling. Syv dage efter inokulering, immobilisere en aflivet, inficeret, mandlig mus i den udsatte position på et skærebræt, og sikre hovedbunden med lige en-by-to-tænder scerægt.

Brug iris saks til at gøre en midterlinjen snit på hovedbunden, udsætter kraniet, og bruge skarpe pincet til at klemme de to sider af baner med skarpe pincet, fastsættelse af hjernen. Placering en spids af skarpe iris saks i foramen magnum, skåret sideisk ind i kraniet på hver side. Skær forsigtigt fra samme hulrum op ad midterlinjen mod næsen, så saksspidserne bliver så overfladiske som muligt for at undgå at skade hjernen.

Løft hjernen med kraftstændik, og brug skarpe iris saks til omhyggeligt dissekere kranienerverfibre. Brug derefter kraftbefæddet til at overføre hjernen til et 15-milliliterrør indeholdende fem milliliter iskold RPMI plus FBS. For at isolere testiklerne, løft bughulen med snævler, og bruge iris saks til at gøre en langsgående snit gennem integument og bugvæggen og udsætte den nederste del af maven.

Skub testiklerne op til snittet, og brug pincet til forsigtigt at trække fedtlaget, at udsætte en kugleformede testis på begge sider. Brug iris saks til omhyggeligt dissekere fedt lag og epididymis, og overføre testiklerne til en 15-milliliter rør, der indeholder fem milliliter iskold RPMI plus FBS. For at generere en enkeltcellesuspension fra et af de høstede væv skal du placere organet på en steril celles si med et 100 mikron mesh oven på et 50-milliliterrør og tilføje to milliliter iskold RPMI plus FBS til sien.

Brug stemplet fra en fem milliliter sprøjte, mos vævet, og vask filteret med frisk medium, indtil orglet er blevet helt malet gennem masken. Encelledefjedringen overføres til et 15-milliliterrør til centrifugering, og pelletsussuseres i fem milliliter 30% tæthedsgradientium. Laget omhyggeligt celleopløsningen over to milliliter 70% tæthedsgradient i et nyt 15-milliliterrør, og adskaf cellerne ved tæthedsgradientuering.

Derefter overføres cellerne fra interfasen mellem de to tæthedsgradienter til et nyt 15-milliliterrør indeholdende 10 milliliter kold RPMI plus FBS til endnu en centrifugering, og pelletsen opslækkes i 10 milliliter iskold RPMI/FBS til optælling. For at analysere cellerne ved flowcytometri skal cellerne fortyndes til fem gange 10 til de seks celler pr. 100 mikroliter i FACS-bufferkoncentrationen, og celleprøverne inkuberes med 10 mikroliter antimuse-CD16/CD32-blokerende antistof pr. prøve. Efter 10 minutter ved stuetemperatur tilsættes 20 mikroliter af celler til et passende antal brønde i en 96-brønd, rundbundet plade i henhold til den eksperimentelle flow cytometri farvning protokol, og tilsæt 20 mikroliter af E-protein tetramet mix til hver brønd for en 30-minutters inkubation ved stuetemperatur i mørke.

Ved slutningen af inkubationen tilsættes celleoverfladeantistoffer af interesse til cellerne i en 30-minutters inkubation ved fire grader Celsius, beskyttet mod lys. Dernæst vaskes cellerne to gange med 200 mikroliter FACS buffer pr vask, og omhyggeligt resuspend cellerne i hver brønd med 200 mikroliter frisk FACS buffer. Derefter opbevares prøverne ved fire grader Celsius, beskyttet mod lys, indtil deres analyse på et flow cytometer.

Patologiske symptomer og tegn såsom myeloparalyse og motorparaparese observeres i interferon alfa/beta receptor 1 knockout mus syv dage efter inokulering med Zika virus. Vægtændringer i de inficerede interferon alfa/beta receptor 1 knockout dyr blev overvåget i 15 dage, med vægttab først observeret fire dage efter infektion og vægt opsving begynder på dag syv efter infektion. Repræsentative billeder af inficerede murine hjerner afslører indlysende ødem og hyperæmi syv dage efter inokulering med Zika virus.

Repræsentative billeder af murine Zika-inficerede testikler viser en gradvis faldende fra dag syv til 30 dage efter infektion. Histopatologisk analyse af Zika-inficerede hjerne og testikelvæv sektioner illustrerer også effekten af de destruktive patologiske ændringer i forhold til ikke-inficerede kontroller. Som forventet fra makro- og histopatologiske analyser påvises der også høje virusbelastninger i hjernen og testiklerne for zikavirus-inficerede mus ved immunstaining.

Det er ledsaget af en robust CD3-positiv T-celle infiltration i hjernen post-Zika infektion. Zika virus-specifikke CD3-positive, CD8-positive T lymfocytter påvises både i Zika virus-inficerede og vaccine-immuniserede mus ved E-protein tetramer farvning. E-protein tetramer-specifikke CD8-positive T-celler kan også påvises i hjernen og testikler syv dage efter inokulering med Zika virus.

Efter sin udvikling, denne teknik banede vejen for forskere i studiet af patogen-specifikke T-celle karakterisering i immunoprevalente organer under naturlige infektioner i dyremodeller. Denne metode kan også anvendes på andre immun-udbredte organer, såsom moderkagen eller øjet, samt til både virusinfektion og kræft. Efter denne procedure kan MHC-I tetramers anvendes til immunhistokemisk eller immunfluorescerende påvisning af patogenspecifikke T-celler for at få adgang til fordelingen af hjerne- eller testiklerne-infiltrerende T-celler.