En anion udveksle harpiks-baserede metode, tilpasset til flydende impingement-baserede bioaerosol prøvetagning af virus er påvist. Når kombineret med downstream molekylær detektion, giver metoden mulighed for facile og følsomme påvisning af virus fra bioaerosols.
Denne protokol viser en tilpasset bioaerosol stikprøvemetoden for virus. I dette system, er anion ionbytteren kombineret med flydende impingement-baseret luft prøvetagning enheder for effektiv koncentration af negativt ladede vira fra bioaerosols. Således, harpiks, der fungerer som en yderligere koncentration trin i arbejdsprocessen bioaerosol sampling. Nukleinsyre ekstraktion af virale partikler foretages så direkte fra anion ionbytteren, med den deraf følgende prøve egnet til molekylære analyser. Yderligere, denne protokol beskriver et specialbygget bioaerosol kammer i stand til at generere virus-laden bioaerosols under en række miljøforhold og giver mulighed for løbende overvågning af miljømæssige variabler såsom temperatur, fugtighed, Vindhastighed og aerosol massekoncentration. Den vigtigste fordel ved at bruge denne protokol er øget viral påvisningsfølsomhed, der vurderes via direkte sammenligning med en umodificeret konventionel flydende impinger. Andre fordele omfatter potentiale til at koncentrere sig mangfoldigt negativt ladede virus, de lave omkostninger af anion ionbytteren (~$0.14 per prøve) og brugervenlighed. Ulemper omfatter denne protokol manglende evne til at vurdere smitteevne af harpiks-adsorberet viruspartikler, og potentielt behov for optimering af flydende prøveudtagning buffer anvendes inden for impinger.
Formålet med denne metode er at skabe en yderst følsom bioaerosol prøvetagning platform for at lette molekylær detektion af negativt ladede vira fra bioaerosols. Mikroorganismer, herunder viruspartikler, kan overleve i bioaerosols i længere perioder af tid1. Bioaerosols kan rejse over relativt lange distancer og vedligeholde levedygtighed og smitteevne, som det fremgår af et udbrud af legionærsyge ‘ sygdom, der stammer fra industrielle køletårne beliggende i en afstand af 6 km fra de berørte personer og resulterede i 18 dræbte2. Indirekte overførsel af virus til mennesker medieres af bioaerosols kan forekomme i flere indstillinger og er påvist for norovirus udbrud i skoler og restauranter3,4. Tilsvarende, bioaerosol overførsel af virus kan forekomme i landbruget indstillinger såsom i svin og fjerkræ gårde, med denne transmission rute anses som en væsentlig faktor i bevægelse af virus mellem produktion faciliteter5, 6 , 7 , 8 , 9.
Effektiv prøveudtagning af virus-laden bioaerosols giver mulighed for forbedring i hurtig diagnostik og beredskabet med henblik på forebyggelse af udbrud, som vist i demonstrationer i hvilke H5 influenza en virus blev opdaget fra bioaerosols i levende dyr markeder i Kina og den USA10,11. Nuværende bioaerosol prøvetagning teknologier indebærer en række forskellige partikel capture principper og kan groft inddeles i impingers, cykloner, slaglegemer og filtre12. Det er ud over anvendelsesområdet for denne protokol til udtømmende dækning af alle fordele og ulemper ved disse platforme for udtagning af prøver af virus fra bioaerosols; dog kan det konstateres, at fleste af disse stikprøver enheder ikke er blevet optimeret til indsamling af vira og Bakteriofager13. Derudover er smitteevne af virale partikler ofte negativt berørt, med flydende impingers anses for at opretholde viral infektivitet mere effektivt end prøveudtagning enheder såsom solid slaglegemer eller filtre14. En ulempe ved flydende impingement er dog target fortynding virkning, som opstår, fordi virus er indsamlet i relativt store mængder (typisk ≥20 mL) af væske i indsamlingen fartøjets. En anden vigtig ulempe indebærer suboptimal effektiviteten af flydende impingers at koncentrere partikler < 0,5 µM i størrelse15. Dog kan opsamling effektivitet af disse enheder forbedres ved immobilisering på solid matricer, som immobilisering kan forbedre bevarelsen af viral nukleinsyrer og viral infektivitet16,17.
Vi har tidligere vist, at anion ionbytteren er et effektivt værktøj til opsamling og koncentration af virus fra flydende matricer, herunder F-RNA Bakteriofager, hepatitis A virus, human adenovirus, og rotavirus18,19 ,20. Som defineret af fabrikanten, er anion ionbytteren udnyttet i dette arbejde en macroreticular polystyren stærk base anion ionbytteren, hvor functionalized kvaternære amine grupper mægle tiltrækning og fange af anioner i en flydende medium21 . Derfor forventes anion ionbytteren til at fange virus med net-negative overfladeladninger, herunder mange enteriske virus, influenza-vira og andre vira, der er relevante for menneskers og dyrs sundhed.
Den nuværende protokol omfatter tilføjelse af anion ionbytteren til et flydende impinger. I dette system fungerer harpiks som en sekundær koncentration skridt for virale partikler fanget i impinger væske. Nukleinsyrer kan derefter direkte elueret i små mængder, giver en koncentreret prøve til molekylære analyser. Således, den største fordel ved denne metode er forbedringen af viral påvisning følsomhed, primært gennem reduktion i stikprøven volumen. Desuden, på grund af den iboende uspecifikke erobringen af negativt ladede vira, metoden er sandsynligt anvendes til påvisning af et stort antal virus af interesse. Her, er metoden, der påvist for vaccinestammer af type A og type B-influenzavira og FRNA coliphage MS2 (MS2). Disse vira detekteres efterfølgende ved hjælp af standard qRT-PCR assays som tidligere beskrevet22. End-point brugeren skal ikke forvente at støde på vanskeligheder ved udførelsen af denne metode, fordi ændringer i øjeblikket eksisterende udstyr ikke udgør større afbrydelser i den konventionel flow af bioaerosol prøvetagning og analyse.
Denne protokol beskriver en metode til følsomme viral opsamling fra bioaerosols ved hjælp af modificerede flydende impingers. Metoden er optimeret til påvisning og kvantificering af virusmængde i bioaerosols. Den specifikke ændring demonstrerede her omfatter tilføjelse af anion ionbytteren til flydende indeholdt i en fælles flydende impinger. Denne metode blev udviklet for sin enkelhed i downstream prøve behandling, mens andre prøve behandling teknikker såsom centrifugering, filtrering og nedbør-baserede metod…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af midler fra CDC/NIOSH High Plains Intermountain Center for landbruget og sundhed (5U54OH008085) og Colorado Bioscience Discovery evaluering Grant Program (14BGF-16).
Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1) | American Type Culture Collection | ATCC 15597-B1 | |
FluMist Quadrivalent | AstraZeneca | Contact manufacturer | Viral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
Primers and probes | Integrated DNA Technologies | NA | |
0.2 µM sterile filter | NA | NA | |
1 L pyrex bottles or equivalent | NA | NA | |
1 mL pipet tips | NA | NA | |
1 mL pipettor | NA | NA | |
50 mL serological pipet | NA | NA | |
PCR tubes | NA | NA | |
Pipet-aid or equivalent | NA | NA | |
QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
QuantiTect Probe RT-PCR Kit | Qiagen | 204443 | |
Amberlite IRA-900 chloride form | Sigma-Aldrich | 216585-500G | |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
Water (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher | 13-698-791 | |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 14-432-22 | |
Falcon Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 05-538-62 | |
SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROX | ThermoFisher | 11745100 | |
SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass set | SKC Inc. | 225-9593 | |
Vac-u-Go sample pumps | SKC Inc. | 228-9695 | |
Collison nebulizer (6-jet) | BGI Inc. | NA | |
HEPA capsule | PALL | 12144 | |
Q-TRAK indoor air quality monitor 8554 | TSI Inc. | NA | |
Alnor velometer thermal anemometer AVM440-A | TSI Inc. | NA | |
SidePak AM510 personal aerosol monitor | TSI Inc. | NA | |
Bioaerosol chamber | NA | NA |