Summary

Обнаружение вирусов от биоаэрозоли, используя анион обмен смолы

Published: August 22, 2018
doi:

Summary

Анион обмен метода на основе смолы, адаптированных к жидкости, продемонстрированную выборки на основе покушение Биоаэрозоль вирусов. При сочетании с течению молекулярной обнаружения, метод позволяет легким и чувствительных обнаружения вирусов из биоаэрозоли.

Abstract

Этот протокол демонстрирует метод выборки настроить Биоаэрозоль на вирусы. В этой системе анион обмен смолы в сочетании с жидкого воздуха, покушение на основе выборки устройства для эффективной концентрации отрицательно заряженные вирусов от биоаэрозоли. Таким образом смолы служит дополнительной концентрации шага в рабочем Биоаэрозоль выборки. Нуклеиновые кислоты добыча вирусных частиц затем выполняется непосредственно из смолы обмен анион, с результирующей выборки, подходит для молекулярного анализа. Кроме того этот протокол описывает заказ Биоаэрозоль камеры, способные генерировать вирус Ладена биоаэрозоли под разнообразные условия окружающей среды и позволяющие непрерывный мониторинг экологических переменных, таких как температура, влажность, скорость ветра и массовой концентрации аэрозолей. Главным преимуществом использования этого протокола является повышенная чувствительность обнаружения вирусных, как оценивать через прямое сравнение в неизмененном обычного жидкого Импинджера. Другие преимущества включают возможность сосредоточиться отрицательно заряженные различных видов вирусов, низкая стоимость анион обмен смолы (~$0.14 на сэмпл) и простота использования. Недостатки включают неспособность оценить инфективности смолы адсорбированные вирусных частиц настоящего Протокола, и потенциально потребность в оптимизации жидких проб буфера используется внутри Импинджера.

Introduction

Цель этого метода является обеспечение высокочувствительный Биоаэрозоль выборки платформы для облегчения молекулярной обнаружение отрицательно заряженные вирусов от биоаэрозоли. Микроорганизмов, в том числе вирусные частицы, могут выжить в биоаэрозоли для длительных периодов времени1. Биоаэрозоли могут путешествовать на относительно большие расстояния и поддерживать жизнеспособность и инфективности, о чем свидетельствует вспышка болезни легионеров, породивший от промышленных охладительных башен, расположенных на расстоянии 6 км от пострадавших лиц и в результате 18 погибших2. Косвенные передачи вирусов для людей при посредничестве биоаэрозоли может произойти в нескольких параметров и продемонстрировал норовирус вспышек в школах и ресторанов3,4. Аналогично Биоаэрозоль передачи вирусов может произойти в сельскохозяйственных параметры в фермах свиней и птицы, такие как с этот путь передачи, рассматривается как важный фактор в движении вирусов между производства зал5, 6 , 7 , 8 , 9.

Эффективное выборки вируса Ладена биоаэрозоли позволяет улучшить в быстрой диагностики и готовности к предотвращению вспышки, как показано в демонстрациях, в котором H5 от биоаэрозоли в живых животных были обнаружены вирусы гриппа рынков в Китае и Соединенные Штаты Америки10,11. Текущий Биоаэрозоль выборки технологии включают ряд различных частиц захвата принципов и может быть широко разделены на impingers, циклоны, ударных и фильтры12. Это выходит за рамки сферы охвата настоящего Протокола исчерпывающим образом охватывать все преимущества и недостатки этих платформ для выборки вирусов из биоаэрозоли; Однако можно отметить, что большинство этих устройств выборки не были оптимизированы для коллекции вирусы и бактериофаги13. Кроме того инфективности вирусных частиц часто негативно влияет, с жидким impingers, считается, что более эффективно, чем выборка устройств, таких как твердых ударных или фильтры14поддерживать вирусные инфективности. Однако недостатком жидкости покушение является целевой разрежающего эффект, который возникает потому, что вирусы собраны в относительно больших объемах (обычно каналов ≥20 мл) жидкости в сосуде сбора. Еще одним важным недостатком предполагает субоптимальные эффективность жидких impingers сконцентрировать частицы < 0,5 мкм в размер15. Однако эффективность захвата этих устройств может быть улучшена путем иммобилизации на твердой матрицы, как иммобилизация может повысить сохранность вирусных нуклеиновых кислот и вирусных инфективности16,17.

Ранее мы показали, что анион обмен смола является эффективным инструментом для захвата и концентрация вирусов из жидкого матриц, включая F-РНК бактериофагов, вирус гепатита А, человека аденовирус и ротавирусной18,19 ,20. Как это определено изготовителем, смола обмен анион, широко использовались в этой работе является смола обмен полистирола сильная база анион macroreticular в котором функционализированных четвертичные амины группы посредничества привлечения и захват анионов в жидкость средних21 . Следовательно обмен смолы анион ожидается захват вирусов с net отрицательные поверхности обвинения, включая многие кишечных вирусов, вирусов гриппа и других вирусов, касающихся здоровья населения и животных.

Текущий протокол включает в себя добавление анион обмен смолы для жидкого Импинджера. В этой системе смолы служит средней концентрации шаг для вирусных частиц, захваченных в Импинджера жидкости. Нуклеиновые кислоты может затем быть непосредственно этого eluted в небольших объемах, обеспечивая концентрированного образца для молекулярного анализа. Таким образом основным преимуществом этого метода является улучшение чувствительность обнаружения вирусных, главным образом за счет сокращения объема выборки. Кроме того, из-за присущего неспецифической захвата отрицательно заряженные вирусов, метод вряд ли применимо для обнаружения большого числа вирусов, представляющих интерес. Здесь метод продемонстрировал для вакцины против штаммов типа A и вирусы гриппа типа B и FRNA Колифаги мс2 (МС2). Впоследствии эти вирусы обнаруживаются с помощью стандартных qRT ПЦР-анализы как описано22. Конечного пользователя не следует ожидать сталкиваются с трудностями в выполнении этого метода, поскольку изменения в существующих в настоящее время оборудование не представляют собой серьезные нарушения обычного потока Биоаэрозоль отбора проб и анализа.

Protocol

1. Установка камеры Биоаэрозоль (см. Рисунок 2) Предварительно загрузите жидкого impingers с 20 мл 0,01 М фосфат буфер солевой, рН 7,5 (PBS). Добавить 0,5 г аниона обмен смолы и приостановить в PBS одного из жидкого impingers, с другой жидкости Импинджера, выступающей в кач…

Representative Results

Рисунок 1 демонстрирует принцип, лежащий в основе заряда захват вирусов от биоаэрозоли через включение смолы в основе жидких impingers. Рисунок 2 показывает настройку камеры на заказ Биоаэрозоль. Рисунок 3 описывает шаги по н…

Discussion

Этот протокол описывает метод для чувствительных вирусный захвата от биоаэрозоли, с использованием модифицированных жидкий impingers. Оптимизированный метод для обнаружения и количественного определения вирусной нагрузки в биоаэрозоли. Конкретные изменения, продемонстрировали здесь в?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана финансирование из CDC/NIOSH высокие равнины межгорной центра сельскохозяйственных здоровья и безопасности (5U54OH008085) и Программа грантов оценки Колорадо Bioscience обнаружения (14BGF-16).

Materials

Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1) American Type Culture Collection ATCC 15597-B1
FluMist Quadrivalent AstraZeneca Contact manufacturer Viral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855195
Primers and probes Integrated DNA Technologies NA
0.2 µM sterile filter NA NA
1 L pyrex bottles or equivalent NA NA
1 mL pipet tips NA NA
1 mL pipettor NA NA
50 mL serological pipet NA NA
PCR tubes NA NA
Pipet-aid or equivalent NA NA
QIAamp Viral RNA Mini Kit Qiagen 52904
QuantiTect Probe RT-PCR Kit Qiagen 204443
Amberlite IRA-900 chloride form Sigma-Aldrich 216585-500G
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P5368-10PAK
Water (molecular biology grade) Sigma-Aldrich W4502-1L
Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge Tubes ThermoFisher 13-698-791
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes  ThermoFisher 14-432-22
Falcon Polypropylene Centrifuge Tubes ThermoFisher 05-538-62
SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROX ThermoFisher 11745100
SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass set SKC Inc. 225-9593
Vac-u-Go sample pumps SKC Inc. 228-9695
Collison nebulizer (6-jet) BGI Inc. NA
HEPA capsule PALL 12144
Q-TRAK indoor air quality monitor 8554 TSI Inc. NA
Alnor velometer thermal anemometer AVM440-A TSI Inc. NA
SidePak AM510 personal aerosol monitor TSI Inc. NA
Bioaerosol chamber NA NA

References

  1. Pirtle, E. C., Beran, G. W. Virus survival in the environment. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). 10 (3), 733-748 (1991).
  2. Nguyen, T. M., et al. A community-wide outbreak of legionnaires disease linked to industrial cooling towers–how far can contaminated aerosols spread?. The Journal of Infectious Diseases. 193 (1), 102-111 (2006).
  3. Marks, P. J., et al. Evidence for airborne transmission of Norwalk-like virus (NLV) in a hotel restaurant. Epidemiology and Infection. 124 (3), 481-487 (2000).
  4. Marks, P. J., et al. A school outbreak of Norwalk-like virus: Evidence for airborne transmission. Epidemiology and Infection. 131 (1), 727-736 (2003).
  5. Corzo, C. A., Culhane, M., Dee, S., Morrison, R. B., Torremorell, M. Airborne detection and quantification of swine influenza a virus in air samples collected inside, outside and downwind from swine barns. PLoS One. 8 (8), e71444 (2013).
  6. Anderson, B. D., et al. Bioaerosol sampling in modern agriculture: A novel approach for emerging pathogen surveillance. The Journal of Infectious Diseases. 214 (4), 537-545 (2016).
  7. Hietala, S. K., Hullinger, P. J., Crossley, B. M., Kinde, H., Ardans, A. A. Environmental air sampling to detect exotic Newcastle disease virus in two California commercial poultry flocks. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 17 (2), 198-200 (2005).
  8. Jonges, M., et al. Wind-mediated spread of low-pathogenic avian influenza virus into the environment during outbreaks at commercial poultry farms. PLoS One. 10 (5), e0125401 (2015).
  9. Otake, S., Dee, S. A., Jacobson, L., Torremorell, M., Pijoan, C. Evaluation of aerosol transmission of porcine reproductive and respiratory syndrome virus under controlled field conditions. The Veterinary Record. 150 (26), 804-808 (2002).
  10. Wu, Y., et al. Aerosolized avian influenza A (H5N6) virus isolated from a live poultry market, China. The Journal of Infection. 74 (1), 89-91 (2017).
  11. Choi, M. J., et al. Live animal markets in Minnesota: A potential source for emergence of novel influenza A viruses and interspecies transmission. Clinical Infectious Diseases. 61 (9), 1355-1362 (2015).
  12. Haig, C. W., Mackay, W. G., Walker, J. T., Williams, C. Bioaerosol sampling: Sampling mechanisms, bioefficiency and field studies. The Journal of Hospical Infection. 93 (3), 242-255 (2016).
  13. Anderson, B. D., Lednicky, J. A., Torremorell, M., Gray, G. C. The use of bioaerosol aampling for airborne virus surveillance in swine production facilities: A mini review. Frontiers in Veterinary Science. 4, 121 (2017).
  14. Verreault, D., Moineau, S., Duchaine, C. Methods for sampling of airborne viruses. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 413-444 (2008).
  15. Hogan, C. J. Sampling methodologies and dosage assessment techniques for submicrometre and ultrafine virus aerosol particles. Journal of Applied Microbiology. 99 (6), 1422-1434 (2005).
  16. Yu, K. -. P., Chen, Y. -. P., Gong, J. -. Y., Chen, Y. -. C., Cheng, C. -. C. Improving the collection efficiency of the liquid impinger for ultrafine particles and viral aerosols by applying granular bed filtration. Journal of Aerosol Science. 101, 133-143 (2016).
  17. Perez-Mendez, A., et al. Evaluation of a simple and cost effective filter paper-based shipping and storage medium for environmental sampling of F-RNA coliphages. J Virol Methods. 194 (1-2), 60-66 (2013).
  18. Chandler, J. C., et al. Field-based evaluation of a male-specific (F+) RNA coliphage concentration method. Journal of Virological Methods. 239, 9-16 (2017).
  19. Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. Concentration of enteric viruses from tap water using an anion exchange resin-based method. Journal of Virological Methods. 206, 95-98 (2014).
  20. Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. Evaluation of an anion exchange resin-based method for concentration of F-RNA coliphages (enteric virus indicators) from water samples. Journal of Virological Methods. 204, 109-115 (2014).
  21. Kammerer, J., Carle, R., Kammerer, D. R. Adsorption and ion exchange: Basic principles and their application in food processing. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (1), 22-42 (2011).
  22. Chandler, J. C., et al. A method for the improved detection of aerosolized influenza viruses and the male-specific (F+) RNA coliphage MS2. Journal of Virological Methods. 246, 38-41 (2017).
  23. Friedman, S. D., Cooper, E. M., Calci, K. R., Genthner, F. J. Design and assessment of a real time reverse transcription-PCR method to genotype single-stranded RNA male-specific coliphages (Family Leviviridae). Journal of Virological Methods. 173 (2), 196-202 (2011).
  24. Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of three influenza A and B real-time reverse transcription-PCR assays and a new 2009 H1N1 assay for detection of influenza viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 3870-3875 (2010).
  25. Cademartiri, R., et al. Immobilization of bacteriophages on modified silica particles. Biomaterials. 31 (7), 1904-1910 (2010).
  26. Michen, B., Graule, T. Isoelectric points of viruses. Journal of Appled Microbiology. 109 (2), 388-397 (2010).
  27. Turgeon, N., Toulouse, M. J., Martel, B., Moineau, S., Duchaine, C. Comparison of five bacteriophages as models for viral aerosol studies. Applied and Environmental Microbiology. 80 (14), 4242-4250 (2014).
  28. Vergara, G. G., et al. Evaluation of FRNA coliphages as indicators of human enteric viruses in a tropical urban freshwater catchment. Water Research. 79, 39-47 (2015).
  29. Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L., Jaykus, L. A. Aerosolization of a human norovirus surrogate, bacteriophage MS2, during simulated vomiting. PLoS One. 10 (8), e0134277 (2015).

Play Video

Cite This Article
Schaeffer, J. W., Chandler, J. C., Davidson, M., Magzamen, S. L., Pérez-Méndez, A., Reynolds, S. J., Goodridge, L. D., Volckens, J., Franklin, A. B., Shriner, S. A., Bisha, B. Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin. J. Vis. Exp. (138), e58111, doi:10.3791/58111 (2018).

View Video