Generering av lukkede femur brudd i mus: en modell for å studere bein Healing
Summary
Murine lukket femur fraktur modellen er en kraftig plattform å studere brudd healing og romanen strategier akselerere bein gjenfødelse. Målet med denne kirurgiske protokollen er å generere ensidige lukket femur brudd i mus med en mulig intramedulær stål stang for å stabilisere femur.
Abstract
Benbrudd pålegge en enorm sosio-økonomisk byrde på pasienter, i tillegg til betydelig påvirker deres livskvalitet. Strategier som fremmer effektiv benet healing er fraværende og i høy etterspørsel. Effektiv og reproduserbar dyr modeller av brudd healing er nødvendig å forstå de komplekse biologiske prosessene knyttet bein gjenfødelse. Mange dyr modeller av brudd healing er generert gjennom årene; imidlertid murine brudd modeller har nylig dukket opp som kraftige verktøy for å studere bein helbredelse. En rekke åpne og lukkede modeller har blitt utviklet, men lukket femur fraktur modellen skiller seg ut som en enkel metode for å generere raske og reproduserbar resultater i en fysiologisk relevant måte. Målet med denne kirurgiske protokollen er å generere ensidige lukket femur brudd i mus og tilrettelegge en post brudd stabilisering av femur ved å sette inn en mulig intramedulær stål stang. Selv om en spiker eller en skrue større aksial og roterende stabilitet, gir bruk av en mulig intramedulær stang en tilstrekkelig stabilisering for konsekvent helbredende resultater uten produserer nye feil i benvevet eller skade nærliggende myk vev. Røntgen imaging brukes til å overvåke utviklingen av callus formasjon, benete union og påfølgende ombygging av benete callus. Bein helbredende resultatene er vanligvis forbundet med styrke helbredet benet og målt med torsjonsmessig testing. Likevel er forstå tidlige cellulære og molekylære hendelser knyttet til brudd reparasjon kritisk i studiet av bein vev gjenfødelse. Lukket femur fraktur modellen i mus med mulig intramedulær innfesting fungerer som en attraktiv plattform å studere bein brudd healing og vurdere strategier for å akselerere healing.
Introduction
Frakturer er blant de mest vanlige skadene oppstår i bevegelsesapparatet og er forbundet med en enorm sosioøkonomiske byrde, inkludert behandlingskostnader som er anslått til å overgå 25 milliarder dollar årlig i USA1, 2. Selv om fleste frakturer leges uten problemer, er healing knyttet til betydelige nedetid og produktivitetstap. Ca 5-10% av alle brudd føre til forsinket helbredelse eller ikke-union, på grunn av alder eller andre underliggende kroniske helseproblemer, som osteoporose og diabetes mellitus3,4,5. Ingen FDA-godkjent farmakologiske behandlinger er tilgjengelige til å fremme effektiv benet helbredelse og forkorte utvinning tid.
Brudd healing er en kompleks og svært dynamisk prosess som involverer koordinering av flere celletyper. Derfor er en omfattende forståelse av mobilnettet og molekylære hendelser knyttet bein gjenfødelse avgjørende for identifikasjon av terapeutiske mål som akselerere denne prosessen. Som med andre menneskelige sykdommer er etablering av en svært mottakelig og reproduserbar dyremodell avgjørende i studiet av bein helbredelse. Større dyr, som sauer og svin, har bein remodeling egenskaper og biomekanikk ligner på mennesker, men er dyre, krever betydelig helbredende tid, og er ikke lett mottakelig for genetisk manipulasjon6. På den annen side, tilbyr små dyr modeller, for eksempel rotter og mus, mange fordeler, inkludert en enkel håndtering, lave kostnader vedlikehold, kort avl sykluser og en kortere helbredende tid7. Videre er musen genomet fullt sekvensielt, slik at for rask manipulasjon og generasjon av genetisk varianter. Dermed er musen en effektiv modellsystem å studere menneskelig sykdom, skade, og reparere8. Hos mennesker øke samtidige som osteoporose og diabetes mellitus sannsynligheten for en forsinket helbredelse. En rekke eksisterende musen modeller er tilgjengelig for å studere virkningene av samtidige som osteoporose og diabetes mellitus på benet skade og helbredelse. Pasienter som lider av osteoporose har en markert redusert Ben formasjon under fasen av brudd healing9. Ovariectomized (OVX) mus utstilling rask bentap og forsinket bein healing samme som observert i postmenopausal osteoporose10,11. I tillegg mange musen modeller av type I og type II diabetes etterligne i lav bein masse fenotyper og svekket brudd healing sett i mennesker11. Videre murine brudd modellene tjene som en allsidig plattform å studere komplekse biologiske prosessene som oppstår i callus og utforske romanen strategier som akselerere bein vev gjenfødelse.
Til tross for forskjeller i benbygning og metabolisme, prosessen til beinbrudd healing er svært like i mus og mennesker, involverer en kombinasjon av endochondral og intramembranous forbening etterfulgt av ubalanse. Endochondral forbening innebærer rekruttering av progenitor celler til mindre mekanisk stabile regioner rundt brudd gapet, hvor de differensieres til chondrocytes hypertrofi og mineralize brusk for å produsere en myk callus. Den andre bølgen av progenitor celler infiltrere callus og differensiere i eldre osteoblasts som skiller nye bein matrix12,13,14,15. Under intramembranous forbening, progenitors av periostal og endosteal flater direkte skille ut matrix sekresjon osteoblasts og lette den bygge bro av brudd gapet9,11,12 ,13. Sammen, resultere endochondral og intramembranous ossifications i utviklingen av en hard callus, som er videre remodeled over tid å danne en sterk sekundær bein støtter mekaniske belastninger13,14 ,15. Hos friske mennesker tar den helbredende prosessen ca 3 måneder, sammenlignet med bare 35 dager i mus16.
Brudd healing har ofte blitt studert bruker enten åpen eller lukket kirurgisk modeller17. Åpne kirurgiske metoder, som generering av en kritisk størrelse defekt eller fullføre osteotomi, standardisere skade plasseringen og geometri å redusere avvik forårsaket av comminuted sprekker. Rotasjonsosteotomi tjene som en utmerket modell å studere underliggende mekanismen bak en ikke-union fordi healing er ofte forsinket i forhold til lukket frakturer. Videre er en rigid ytre fiksering nødvendig for å stabilisere osteotomized bein, betyr fornyelse primært avhengig av den intramembranous forbening. Åpne kirurgiske metoder bruke enheter som låsing negler, pin-klipp og låsing plater for å gi aksial og roterende stabilitet brukket lem; men slike enheter er dyrt og krever betydelig mer tid i kirurgi18,19,20,21. På den annen side, er lukket modeller stabilisert med en enkelt mulig intramedulær fiksering enhet, slik at nok ustabilitet å stimulere endochondral healing. Resultatet lukket brudd modeller ikke lett etterligne betingelsene for en ikke-union. Intern fiksering teknikker, som mulig intramedulær pinner, negler og komprimering skruer, er fordelaktig som de er billige, enkle å bruke, og minimere tiden i kirurgi21,22,23. I noen tilfeller mulig intramedulær pinner settes før brudd, men bøying av mulig intramedulær pin kan føre til angulation eller forskyvning av brukket femur, bidra til en variabel callus størrelse og helbredelse. Frakturstedet plasseringen og geometri er vanskeligere å standardisere i lukket modeller, som er generert ved hjelp av en tre-punkts bøying enhet, der en vekt slippes på diaphysis. Men med riktig teknikk tilbyr denne kirurgiske rask og konsekvent resultater. Videre fungerer lukket brudd modellen som et klinisk relevante verktøy for å studere brudd skyldes høy kraft effekt eller mekanisk stress22.
Denne kirurgiske protokollen ble tilpasset fra tidligere beskrevet metoder ved hjelp av et mulig intramedulær pin for å stabilisere brukket femurs i rotter og mus22,24,25. Først en mulig intramedulær p med liten diameter settes inn gjennom intracondylar hakket å etablere et punkt av oppføringen, og en guidewire er innført før generering tverrgående brudd på femur midshaft bruker en gravitasjon-avhengige tre-punkts bøyd enhet. Etter den vellykkede generasjonen av en lukket femur brudd, en mulig intramedulær stang med større diameter er innarbeidet over guidekabelen å stabilisere brukket femur. Denne metoden unngår risikoen for forsinket healing skyldes angulation av mulig intramedulær pin under sprekken, som plassering av rod etter brudd tillater reposisjonering og optimalisert stabilisering av skadde femur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Målet med denne kirurgiske prosedyren er å generere standardisert lukket femur brudd i mus. En viktig fordel med denne modellen er at interne fiksering foregår etter generering av sprekken, og dermed unngå en angulation av mulig intramedulær stangen. Kanskje er det viktigste aspektet ved denne protokollen generasjon av en standardisert tverrgående brudd på femur midshaft, som brudd geometrien er avhengig anvendt bøying kraften og plasseringen av hind lem. Upassende plassering av femur under bøying øyeblikket ka…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av bevilgninger fra Department of Defense (DoD) oss hæren medisinsk forskning og materiell kommandoen (USAMRMC) Congressionally regissert Medical Research programmer (CDMRP) (PR121604) og nasjonale institutter for Arthritis og Musculoskeletal og hudsykdommer (NIAMS), NIH R01 AR068332 til Uma Sankar.
Materials
| Oster Minimax Trimmer | Animal World Network | 78049-100 | |
| POVIDONE-IODINE | Thermo Fisher Scientific | 395516 | |
| OPHTHALMIC OINTMENT | Thermo Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Styker T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific Corporation | TP-700 | |
| 1ml Sub-Q Syringe | Thermo Fisher Scientific | 309597 | |
| ENCORE Sensi-Touch PF | Moore Medical LLC | 30347 | Latex, powder-free surgical glove |
| PrecisionGlide 25G Hypodermic Needles | Thermo Fisher Scientific | 14-826-49 | |
| Ultra-High-Temperature Tungsten Wire, | McMaster-Carr | 3775K37 | 0.005" Diameter, 1/16 lb. Spool, 380' Long |
| 304 stainless steel, 24G thin walled tubing | Microgroup Inc | 304h24tw-5ft | |
| #15 Scalpel Blades | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| #10 Scalpel Blades | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Narrow Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | Serrated/Straight/12cm |
| Iris Forceps | Fine Science Tools | 11066-07 | 1×2 Teeth/Straight/7cm |
| Dissector Scissors | Fine Science Tools | 14081-09 | Slim Blades/Angled to Side/Sharp-Sharp/10cm |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | ToughCut/Straight/Sharp-Sharp/11.5cm |
| Olsen-Hegar Needle Holder with Suture Cutter | Fine Science Tools | 12002-12 | Straight/Serrated/12cm/with Lock |
| Crile Hemostat | Fine Science Tools | 13004-14 | Serrated/Straight/14cm |
| Tungsten Wire Cutter | ACE Surgical Supply Co., Inc. | 08-051-90 | ACE #150 Wire Cutter, tungsten carbide tips |
| 3-0 VICRYL Suture | Ethicon Suture | J423H | 3-0 VICRYL UNDYED 27" FS-2 CUTTING |
| piXarray 100 Digital Specimen Radiography System | Bioptics, Inc | Cabinet x-ray system | |
| Einhorn 3-Point Bending Device | N/A | N/A | Custom Built |
References
- Schnell, S., Friedman, S. M., Mendelson, D. A., Bingham, K. W., Kates, S. L. The 1-Year Mortality of Patients Treated in a Hip Fracture Program for Elders. Geriatric Orthopaedic Surgery & Rehabilitation. 1 (1), 6-14 (2010).
- Burge, R., et al. Incidence and economic burden of osteoporosis-related fractures in the United States, 2005-2025. Journal of Bone and Mineral Research. 22 (3), 465-475 (2007).
- Cunningham, B. P., Brazina, S., Morshed, S., Miclau, T. Fracture healing: A review of clinical, imaging and laboratory diagnostic options. Injury. 48, S69-S75 (2017).
- Einhorn, T. A. Can an anti-fracture agent heal fractures?. Clinical Cases in Mineral and Bone Metabolism. 7 (1), 11-14 (2010).
- Hak, D. J., et al. Delayed union and nonunions: epidemiology, clinical issues, and financial aspects. Injury. 45, S3-S7 (2014).
- Decker, S., Reifenrath, J., Omar, M., Krettek, C., Muller, C. W. Non-osteotomy and osteotomy large animal fracture models in orthopedic trauma research. Orthopaedic Reviews (Pavia). 6 (4), 5575 (2014).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Jacenko, O., Olsen, B. R. Transgenic mouse models in studies of skeletal disorders. Journal of Rheumatology Supplement. 43, 39-41 (1995).
- Nikolaou, V. S., Efstathopoulos, N., Kontakis, G., Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. The influence of osteoporosis in femoral fracture healing time. Injury. 40 (6), 663-668 (2009).
- Bain, S. D., Bailey, M. C., Celino, D. L., Lantry, M. M., Edwards, M. W. High-dose estrogen inhibits bone resorption and stimulates bone formation in the ovariectomized mouse. Journal of Bone and Mineral Research. 8 (4), 435-442 (1993).
- Haffner-Luntzer, M., Kovtun, A., Rapp, A. E., Ignatius, A. Mouse Models in Bone Fracture Healing Research. Current Molecular Biology Reports. 2 (2), 101-111 (2016).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews in Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Seminar in Cellular and Developmental Biology. 19 (5), 459-466 (2008).
- Ai-Aql, Z. S., Alagl, A. S., Graves, D. T., Gerstenfeld, L. C., Einhorn, T. A. Molecular mechanisms controlling bone formation during fracture healing and distraction osteogenesis. Journal of Dental Research. 87 (2), 107-118 (2008).
- Gerstenfeld, L. C., et al. Three-dimensional Reconstruction of Fracture Callus Morphogenesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (11), 1215-1228 (2006).
- Marsell, R., Einhorn, T. A. Emerging bone healing therapies. Journal of Orthopaedic Trauma. 24, S4-S8 (2010).
- Lybrand, K., Bragdon, B., Gerstenfeld, L. Mouse models of bone healing: fracture, marrow ablation, and distraction osteogenesis. Current Protocols of Mouse Biology. 5 (1), 35-49 (2015).
- Garcia, P., et al. The LockingMouseNail–a new implant for standardized stable osteosynthesis in mice. Journal of Surgical Research. 169 (2), 220-226 (2011).
- Histing, T., et al. An internal locking plate to study intramembranous bone healing in a mouse femur fracture model. Journal of Orthopaedic Research. 28 (3), 397-402 (2010).
- Garcia, P., et al. A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing. Journal of Biomechistry. 41 (8), 1689-1696 (2008).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. Journal of Orthopaedic Trauma. 23 (5 Suppl), S31-S38 (2009).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
- Holstein, J. H., Menger, M. D., Culemann, U., Meier, C., Pohlemann, T. Development of a locking femur nail for mice. Journal of Biomechistry. 40 (1), 215-219 (2007).
- McBride-Gagyi, S. H., McKenzie, J. A., Buettmann, E. G., Gardner, M. J., Silva, M. J. Bmp2 conditional knockout in osteoblasts and endothelial cells does not impair bone formation after injury or mechanical loading in adult mice. Bone. 81, 533-543 (2015).
- Williams, J. N., et al. Inhibition of CaMKK2 Enhances Fracture Healing by Stimulating Indian Hedgehog Signaling and Accelerating Endochondral Ossification. Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).
