Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Syntes och karakterisering av 1,2-Dithiolane modifierade själv montering peptider

Published: August 20, 2018 doi: 10.3791/58135
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, Fairfield University

Summary

Ett protokoll för syntesen av en 1,2-dithiolane modifierade peptid och karakterisering av supramolekylär strukturer som härrör från peptiden självmontering.

Abstract

Denna rapport fokuserar på syntesen av en N-terminalen 1,2-dithiolane modifierade själv montering peptid och karakterisering av den resulterande monterade själv supramolekylär strukturer. Syntetiska rutten tar fördel av fasta fasen peptidsyntesen med på-harts kopplingen av dithiolane föregångaren molekyl, 3-(acetylthio) -2-(acetylthiomethyl) propansyra syra och den mikrovågsugn-assisted thioacetate deprotection av peptiden N-terminalen innan slutlig klyvning från kådan ge den 1,2-dithiolane modified peptid. Efter högpresterande vätskekromatografi (HPLC) rening av 1,2-dithiolane peptiden, härrör från nucleating kärnan av Aβ peptiden är associerad med Alzheimers sjukdom, visas peptiden att själv montera in cross-β amyloid fibrerna. Protokoll att karakterisera amyloid fibrerna av Fourier-transform infraröd spektroskopi (FT-IR), cirkulärdichroism spektroskopi (CD) och transmissionselektronmikroskopi (TEM) presenteras. Metoderna för N-terminala modifiering med en 1,2-dithiolane del till välkarakteriserad själv montering peptider kan nu utforskas som modellsystem att utveckla efter montering modifiering strategier och utforska dynamiska kovalent kemi på supramolekylär peptid nanofiber ytor.

Introduction

Den robusta peptidbindning bildas kemi deltar i fasta fasen peptidsyntesen och möjligheten att styra sekvensen längd och sammansättning gör de peptider som själv monterar i supramolekylär strukturer ett kraftigt utforskade fält. De faktorer som styr och stabilisera peptid själv monterade strukturer, däribland sidokedjan sterisk och elektrostatisk interaktioner, väte bindning och hydrofoba effekter1, fungera som en uppsättning designregler. Som forskningen om dessa grundläggande designregler fortsätter att göra framsteg, innefattar det logiska nästa steget i peptid självmontering utöka mångfalden av peptid-baserad strukturer och funktioner. Samtidigt självmonterande peptider är en mångsidig biomaterial som har använts för många biomedicinska tillämpningar av tuning peptid sekvens eller församlingen villkor2,3,4, utveckling av strategier för efter montering ändringar peptid nanofibrer5,6,7,8,9 är fortfarande ett relativt outforskat område.

Dynamiska disulfid utbyte och thiol kemi vid ytan av supramolekylär strukturer är ett område som har potential att ge nya och funktionella biomaterial. Införlivandet av 1,2-dithiolane beståndsdelarna (vanligen ett derivat av liponsyra (la) eller asparagusic syra (aa)) har rapporterats i Liposom system10,11, block sampolymerer12,13, och som organisera ankare ytor14,15. Häri, rapporterar vi syntes och karakterisering av en egen montering peptid som härrör från nucleating kärnan av Aβ peptiden är associerad med Alzheimers sjukdom som ändras vid N-terminalen med en 1,2-dithiolane funktionell grupp16, 17. Den resulterande Supramolekylära fibrerna nu fungera som en experimentell plattform att studera disulfid-exchange och thiol reaktiviteten på supramolekylär ytan av amyloid fibrer18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Sammanfattning och rening av 1,2-Dithiolane modifierade peptid

  1. Syntes av dithiolane föregångare, 3-(acetylthio) -2-(acetylthiomethyl) propansyra syra19.
    1. Tillsätt 1 g 3-bromo - 2-(bromomethyl) propionsyra (1 motsv.) upplöst i minimal mängd 1 M NaOH (cirka 4 mL) till en 25 mL rund botten reaktionskolven under omrörning vid 55 ° C. Försegla reaktionskolven med en septa och placera under kväveatmosfär.
    2. Bered en lösning som innehåller 1.49 g kalium thioacetate (3.2 motsv.) i 4 mL avjoniserat vatten och 3 mL 2 M svavelsyra (H2SO4) att skapa thioacetic syra i situ.
    3. Dra thioacetic syra lösningen i en plast disponibel 10 mL-spruta och placera en nål på sprutan. Tillsätt blandningen droppvis till reaktionskolven av piercing genom septa med nålen. Fortsätta reaktionen över natten vid 55 ° C.
    4. Övervaka reaktionen genom tunnskiktskromatografi (TK) på kiselgel 60 F254 tallrikar med en blandning av metanol och diklormetan (1:9). Visualisera de reaktion framsteg av bromkresolgrönt gröna fläcken. Produkten har ett Rf = 0,57.
    5. Efter reaktionen är komplett och kylas till rumstemperatur, syrsätt blandningen till pH 1 med 2 M H2så4. En gul olja separerar ur lösningen.
    6. Extrahera produkten med kall kloroform (40 mL x 3). Kombinera de organiska skikt och torka över magnesiumsulfat. Ta bort kloroform under minskat tryck.
    7. Bekräfta identiteten hos den isolera produkten, 1, av kärnmagnetisk resonans (NMR) som visas i siffror 1B och C. Räkna med följande resultat: 1H NMR, CDCl3, 300 MHz: d = 10.1 (b, 1 H), 3.2 (m, 4 H), 2,9 (m, 1 H) 2,4 (s, 6 H); 13 C NMR, CDCl3, 75 MHz: d = 195,1 (CH3COS-), 177,6 (-COOH), 45,1 (-CH2S-), 30,5 (CH), 29,2 (-SCOCH3).
      Obs: Produkten är en gul olja och har en total avkastning på 83%. Använda produkten utan ytterligare rening.
  2. SPPS och på-harts kopplingen av Dithiolane föregångare
    Obs: Den fasta fasen peptidsyntesen beskrivs nedan utfördes på en automatiserad peptid synthesizer, efter tillverkarens rekommenderade protokoll. Inställningar och reagenser kan anpassas för andra kommersiella instrument eller när du använder specialiserade aminosyror.
    1. Väg ut 0,156 g Rink amide 4-methylbenzhydrylamine (MBHA) harts (0,1 mmol) och placera i ett reaktionskärl. Svälla kådan i dimetylformamid (DMF) i minst 15 min före start av syntesen.
    2. Väga ut 4 motsvarigheter till varje fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) skyddade aminosyra (0,4 mmol) i sekvens och 0,152 g N, N, N', N'- tetrametyl-O-(1H- benotriazol-1-yl) uran hexafluorofosfat (0,4 mmol, HBTU) för varje aminosyra i sekvensen. Varje cylinderampull innehåller både Fmoc-skyddade aminosyra- och HBTU.
    3. Efter att ha kört alla före syntes kontroller på syntet (refill reagenser, spolas reagens linjer och trycksatt alla reagensflaskor), placera aminosyra patronerna i karusellen i C' n ' terminus riktning. Placera en tom patron efter sista aminosyra positionen för det sista N-terminala Fmoc deprotection steget.
    4. Syntetisera peptiden med standard rekommenderade inställningar.
      1. DEPROTECT gruppen Fmoc från kådan med 5 mL av 20% Piperidin i DMF (5 min x 2).
      2. Tvätta kådan med DMF (6 x 5 mL) för steget koppling.
      3. För en gemensam koppling steg, lägga till 4 mL 0,4 M N-methylmorpholine i DMF i Fmoc-skyddade aminosyra och HBTU. Aktivera Fmoc-skyddade amino syra lösningen för 30 s innan du överför lösningen till reaktionskärlet.
        Obs: Automatiserad peptid syntet blandar kådan och lösningen av bubblande N2 gas varje 30 s för 20 min medan kopplingen reaktionen tar platser. För manuell peptidsyntesen, placera reaktionskärlet i orbitalskak vid låg hastighet under hela steget koppling.
      4. Rinna lösningen och tvätta kådan med DMF (3 x 5 mL).
      5. Upprepa steg 1.2.4.1 genom 1.2.4.4 för varje Fmoc-skyddade aminosyra i C'-n '-terminus riktning att syntetisera peptiden sevärdheter.
    5. Efter det sista N-terminala deprotection steget över jonbytarmassan till en fritted engångsspruta. Tvätta kådan med DMF (3 x 5 mL) och diklormetan (DCM, 3 x 5 mL).
      Obs: Kådan kan lagras efter DCM tvätt i vakuum exsickator. Om kådan lagrades tidigare koppling, säkerställa för att svälla kådan i DMF för koppling reaktionen.
    6. Par dithiolane föregångare (1) till N-terminalen av på-harts peptiden genom att lägga till 4 motsvarigheter till 1, 5 mL DMF, 4 medel av HBTU och 10 medel av N, N-diisopropylethylamine (DIPEA). Pre-aktivera koppling blandningen i 10 min innan du lägger till harts innehållande fritted spruta.
    7. Skaka den koppling reaktionen för 2 h. Efter 2 h, tvätta kådan med DMF (3 x 5 mL) och upprepa koppling reaktion med skakningar under natten.
    8. Efter andra kopplingen, tvätta kådan med DMF (3 x 5 mL) och DCM (3 x 5 mL).
      Obs: Kådan kan lagras på denna punkt under vakuum tills klyvning.
  3. Thioacetate Deprotection och peptid klyvning från harts
    1. För att deprotect gruppen thioacetate från N-terminalen dithiolane föregångare, överför torkade kådan till en 10 mL mikrovågsugn reaktionsröret och tillsätt 2 mL DMF. Låt massan svälla, lägga till en liten magnetiska rör fartyget och resuspendera med en låg hastighet av magnetisk omrörning i 15 min.
    2. Tillsätt 2 mL koncentrerad ammoniumhydroxid, cap reaktionskärlet med silikon septa och placera reaktion fartyget i en mikrovågsugn reaktor med mikrovågsugn inställningar 75 ° c i 45 min under omrörning.
    3. När mikrovågsugnen reaktion är klar, över jonbytarmassan till en ren fritted engångsspruta. Tvätta med DMF (2 x 5 mL) och metanol (MeOH, 2 x 5 mL).
    4. Lägga till en lösning av koncentrerad ammoniumhydroxid i metanol (1:4), till en total volym på 5 mL. Låt skaka över natten för att öka intramolekylära oxidation av disulfide bond i dithiolane ringen.
    5. Tvätta kådan med MeOH (2 x 5 mL) och DCM (3 x 5 mL).
      Obs: Torkade kådan kan lagras i ett vakuum exsickator på denna punkt.
    6. Lägg till klyvning cocktail till harts innehållande spruta med försiktigt skaka för 1,5 h. Klyvning cocktail används är 95% trifluorättiksyra (TFA), 2,5% triisopropylsilane (TIPS) och 2,5% vatten med en total volym på 5 mL.
      FÖRSIKTIGHET: Arbeta under kemiska spiskåpa endast. Transfettsyror är flyktiga och frätande.
      Obs: För flesta av peptid sekvenser och aminosyra sidechain skydda grupper, ovanstående klyvning cocktail lösning är tillräcklig. alternativa klyvning cocktails kan dock behövas för vissa aminosyra sidokedjan skydda grupper (i synnerhet peptider som innehåller Cys, Met, Trp och Arg) eller andra harts kemi20.
    7. Fällningen rå peptiden till 25 mL kall dietyleter i en 50 mL konisk slang genom droppvis tillägg från fritted sprutan. Peptiden fällningar som en vit solid. Pellet peptiden genom centrifugering vid 1300 x g i 10 min. Häll försiktigt dietyletern i en separat behållare för avfallshantering.
    8. Tillsätt ytterligare 25 mL dietyleter till konisk röret och slamma fällningen av vortexa. Upprepa centrifugeringen vid 1300 x g i 10 min och Dekantera dietyletern igen. Torka pelleten under vakuum.
  4. Rening av 1,2-Dithiolane modifierade peptid
    Obs: Rena råa peptiden genom HPLC med omvänd fas. Samla in och kombinera peptid topparna och bekräfta massan av MALDI-TOF-masspektrometri.
    1. Lös upp rå peptid pelleten i minimal mängd acetonitril med 0,1% transfettsyror. På grund av peptidens vattenavvisande egenskaper och aggregering benägenhet, försiktigt värma provet vid 40 ° C till stöd i löslighet.
      Obs: Undvik högre temperaturer och ultraljudsbehandling av peptiden för att förhindra potentiella disulfid exchange reaktioner21,22,23.
    2. För att förbereda 1 mL rå peptid för HPLC rening, Lägg 400 μL av koncentrerad peptid lager in acetonitril till 600 μL av H2O med 0.1% TFA och filtrera genom ett 22 μm spruta filter i en HPLC-injektionsflaska. En ytterligare 5% isopropanol kan läggas för att förhindra peptid aggregering och nederbörd.
    3. Rena peptiden hjälp C-18 semi preparativ kolumn med en flödeshastighet av 3 mL/min över en linjär övertoning 15-55 procent acetonitril i 20 min. Ställ UV detektorerna till 222 nm (amide ryggrad) och 330 nm (disulfide bond). Samla in och kombinera topparna av intresse (figur 2A).
    4. Bekräfta det peptid produkt samlas vid MALDI-TOF masspektrometer i reflectron läge (figur 2B). För analys, blanda 0,5 μL av insamlade peak på MALDI plattan med 0,5 μL av 2,5-dihydroxybenzoic syra (DHB) matrix (10 mg/mL DHB i 50% acetonitril, 0,1% TFA).
      Obs: Common addukter i MALDI-TOF masspektrometri innehåller natrium och kaliumsalt addukt ([M + Na]+ och [M + K]+) toppar. Avsaltning provet före analys rekommenderas om salt addukt topparna undertrycka signalen huvudsakliga [M + H]+ topp. Dessutom en oxiderad topp av [M + O]+ upptäcks också i 1,2-dithiolane modified peptiden. En rapport om laser inducerad oxidation från MALDI joniseringen med DHB matris antyder att faktorer inklusive prov koncentration, lösningsmedel och laser intensitet kan ändras för att begränsa den MALDI inducerad oxidation artefakt24.
    5. Efter MALDI-TOF bekräftelse av rätt massan, lyophilize peptiden efter flash frysning. Håll det frystorkade peptid pulvret under vakuum till församlingen.

2. karakterisering av supramolekylär strukturer självmontering

  1. Bildningen av Amyloid fibrer
    1. För att förbereda självmontering lösning, väga på 1 mg av peptid pulvret med hjälp av en Analysvåg. Lös upp i en blandning (pH 7,5) 20% acetonitril och 10 mM (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syra (HEPES) i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör, till en slutlig koncentration av 1 mg/mL peptid församlingen blandning. Vortex församlingen lösningen och låt montera rumstemperatur.
  2. Spektroskopiska karakterisering av Amyloid fibrer
    1. Följ processen peptid montering via Fourier-transform infraröd (FTIR) spektroskopi varje några dagar. En bred topp centrerad kring 1670 cm-1 är den IR-signatur som härrör från omonterad peptider i provet17. Peptid församlingen proverna ta brukar en till två veckor för bred omonterad topp att försvinna och nå mognad.
      1. Torr en alikvot av 8-10 μL av församlingen lösningen som en tunn film på ATR diamond kristallen. Övervaka försvinnandet av ett stort och brett vatten topp från 1640 till 1630 cm-1 som formulären torr film.
      2. Förvärva IR spectra från 1500-1800 cm-1 genomsnitt 50 skanningar med en 2 cm-1 upplösning. Förvärva och subtrahera bakgrunden skanningar före varje prov skanning. Den IR-signaturen för β-ark montering är en skarp topp mellan 1625 och 1635 cm-1 (figur 3A)25,26.
    2. Karakterisera peptid församlingen i β-ark rika supramolekylär strukturer av cirkulärdichroism (CD). Spela in spektra med en CD-spectropolarimeter med ett Peltier temperatur kontrollsystem.
      1. Tillsätt 30 μL av församlingen lösningen i en 0,1 mm sökvägen längd microcuvette.
        Obs: En cell hållare behövs att klämma och placera den korta väg längd cellen i instrumentet.
      2. För varje spektrum, ställa CD instrumentet till följande parametrar: skanning våglängder av 300 nm till 180 nm, scanningen klassar av 100/min, bandbredd av 1 nm, 25 ° C, medelvärde av tre skanningar.
      3. Samla ett spektrum av bufferten (20% acetonitril/10 mM HEPES, pH 7.5) och subtrahera från varje prov skanning som en kontroll. CD-signaturen för β-ark är en ellipticity minsta centrerad runt 220 nm (figur 3B)27.
  3. Mikroskopi av Amyloid fibrer
    1. Kan ta två till tre veckor för peptid prover att mogna i β-ark rika supramolekylär strukturer.
      Obs: Sammansättningarna kan avbildas med transmissionselektronmikroskopi (TEM) i tidigare stadier av församlingen processen samt.
      1. Tillsätt 10 μL av peptid församlingen lösningen på ytan av TEM kol rutnät.
        Obs: var noga inte på spetsen på pipetten till rutnätet ytan. Hög precision, självstängande pincett används att hålla rutnätet TEM under beredning.
      2. Vänta 1-2 min för att tillåta församlingarna att adsorbera tryckytan rutnät. Ta bort överflödigt prov genom att trycka på filterpapper till kanten av rutnätet.
      3. Förbereda en 2% uranyl acetat fläcken genom att tillsätta 100 μL av avjoniserat vatten till kommersiellt tillgängliga 4% uranyl Acetat lösning. Tillsätt 10 μL av 2% uranyl acetat fläcken tryckytan rutnät och inkubera i 2-3 min. Efter inkubering, ta bort överflödig fläcken genom att trycka på filterpapper till kanten av rutnätet.
      4. Placera TEM rutnäten i vakuum exsickator över natten. Förvara under vakuum tills imaging.
      5. Bild av beredda prov med TEM (figur 3 c). Typiska parametrar för mikroskopi är följande: bilder på förstoringar alltifrån 9,300 X till 23, 000 X, glödtråden med en accelererande spänning 120 kV.
        Obs: ImageJ kan användas för att mäta genomsnittlig fiber bredd av förvärvade TEM bilder28supramolekylär strukturer.
        Varning: Läs alla relevanta säkerhetsdatablad (SDS) före användning. Flera kemikalier används i syntesen, rening, och karakterisering av de beskrivna 1,2-dithiolane modified själv montering Peptiderna är frätande eller giftiga och bör endast användas under kemiska spiskåpa. Använd alltid lämplig personlig skyddsutrustning (inklusive labbrock, skyddsglasögon, stängd tå skor, full längd byxor) när du arbetar i laboratoriet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bortsett från den inledande one-step syntesen av dithiolane föregångaren molekyl sker resten av 1,2-dithiolane modified peptidsyntesen på fasta stöd (figur 1A). Omvandlingen av 3-bromo - 2-(bromomethyl) propionsyra till 3-(acetylthio) -2-(acetylthiomethyl) propansyra syra, dithiolane föregångare, bekräftas av 1H och 13C NMR (figur 1B och C) innan den är kopplad till den fria N-terminalen amine av en peptid fortfarande på-harts. Deprotection av thioacetate att tioler med ammoniumhydroxid utförs med hjälp av en mikrovågsugn reaktor och den 1,2-dithiolane oxideras under natten i metanol innan 1,2-dithiolane modified peptiden är klyvs från kådan. Den råa peptiden renas genom omvänd fas HPLC (figur 2A) och produktens massa bekräftas av MALDI-TOF-masspektrometri (figur 2B).

Den rena 1,2-dithiolane peptiden monterar själv i mogen amyloid fibrerna under en 2-3 veckors period. FT-IR (figur 3A) och CD-spektroskopi (figur 3B) används att följa församlingen processen och att karakterisera utökade β-ark konformation. Fibrerna är fotograferad av TEM (figur 3 c).

Figure 1
Figur 1. Syntetiska system för karakterisering av 1,2-dithiolane föregångare molekyl. (A) syntetiska systematiken i den slutliga 1,2-dithiolane modified peptiden, 1,2-dithiolane-KLVFFAQ-NH2. (B) 1H-NMR av 3-(acetylthio) -2-(acetylthiomethyl) propansyra syra i CDCl3 300 MHz. (C)13C-NMR av 3-(acetylthio) -2-(acetylthiomethyl) propansyra syra i CDCl3 på 75 MHz. vänligen klicka här att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Syntesen av 1,2-dithiolane modified peptid. (A) HPLC kromatogrammet från rening av 1,2-dithiolane - KLVFFAQ-NH2. (B) MALDI-TOF masspektrum av huvudsakliga toppen från HPLC rening (retentionstiden för ~17.5 min) i reflectron läge med hjälp av DHB matris bekräftar den beräkna massan av 1,2-dithiolane-KLVFFAQ-NH2. Common addukter identifieras också. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Supramolekylär karakterisering av 1,2-dithiolane modified peptid. (A) FT-IR 1 mg/mL 1,2-dithiolane-KLVFFAQ-NH2 fibrer monteras i 10 mM HEPES, pH 7,5 i 20% CH3KN. Toppen vid 1627 cm-1 är förenlig med de peptider som monteras i en β-ark konformation. (B) CD 1 mg/mL 1,2-dithiolane-KLVFFAQ-NH2 fibrer monteras i 10 mM HEPES, pH 7,5 i 20% CH3KN. Ellipticity minst 218 nm är förenlig med de peptider som monteras i en β-ark konformation. (C) bild av 1,2-dithiolane-KLVFFAQ-NH2 amyloid fiber (negativa fläcken av 2% uranyl acetat) av TEM. Skalstapeln är 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Artikeln detaljerna i både syntes och rening av en N-terminal 1,2-dithiolane modified själv montering peptid och karakterisering av de resulterande Supramolekylära strukturerna. Syntesen av 1,2-dithiolane peptiden redovisas här har fördelar, inklusive en one-step syntes för att producera dithiolane föregångare, 3-(acetylthio) -2-(acetylthiomethyl) propansyra syra och på-kådan mikrovågsugn deprotection reaktion av den föregångaren thioacetate skydda gruppen för att ge den oxiderade 1,2-dithiolane biexponentiellt utnyttja ammoniumhydroxid som ett säkrare alternativ till den giftiga hydrazin deprotection rapporterats tidigare29. Totala fasta fasen peptidsyntesen av 1,2-dithiolane peptiden (figur 1A) kan enkelt ändras genom att ändra sekvensen längd och sammansättning, inklusive med hjälp Fmoc-skyddade onaturliga aminosyror och C-terminal harts kemi att passa många olika forskningsansökningar.

För att förhindra oönskade peptid biprodukter när aminosyror med nukleofil sida kedjor eller aminosyror med skydda grupper har reaktiv sönderdelningsprodukterna, bör ytterligare asätare läggas till klyvning cocktail20. En test klyvning av en liten del (mindre än 10% av totala harts) utföras innan steget på-harts mikrovågsugn deprotection att säkerställa en hög avkastning av koppling reaktion. Med hjälp av kolumnen och HPLC-villkor som beskrivs i rapporten, eluerar thioacetate skyddade 1,2-dithiolane föregångare peptid toppen 5 min efter uncoupled gratis amine peptiden. Om en betydande mängd gratis amine peptid förblir, en annan koppling steg med 3-(acetylthio) -2-(acetylthiomethyl) propansyra syra rekommenderas. De intramolekylära 1,2-dithiolane disulfide bond upptäcks på HPLC genom att övervaka svag disulfide bond absorbansen vid 330 nm. HPLC toppen som motsvarar den oxiderade 1,2-dithiolane bekräftas genom att lägga till 100 L av 100 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) en peptid provet i en separat HPLC kör. TCEP minskas thiol innehållande peptid kommer att ha en annan retentionstid än den oxiderade disulfid peptiden. Den thiol innehållande peptid eluerar ca 1 min senare än disulfid peptiden med hjälp av kolumnen och villkor som beskrivs i rapporten. En lämplig alternativ MALDI matris för peptider är α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) och bereds genom tillsats av 1 mL 50% acetonitril med 0,1% TFA 5 mg CHCA. Proverna kan vara desalted med en C18 zip-spets före MALDI-TOF massa analys om salt addukt (Na+ och K+) topparna avsevärt undertrycka [M + H]+ toppen.

Peptid sekvensen valt för dessa studier härstammar från holländska mutant av Aβ-peptiden är associerad med Alzheimers sjukdom30och har tidigare visats att själv montera in amyloid fibrerna parallella β-ark16,17 . Som visas i de representativa resultat, figur 3A-C, monterar 1,2-dithiolane-KLVFFAQ-NH2 peptiden också in amyloid fibrerna. Den FTIR amide jag sträcka centrerad på 1627cm-1 och CD ellipticity minst 218 nm är spektroskopiska signaturer av β-ark församlingar25,26,27, och karbonyl CO stretch vid 1676 cm-1 motsvarar beställde glutamin sidokedjan interaktioner föreslår att Peptiderna är organiserade i parallella β-strands16,31,32.

Överföring elektronmikroskopi bilder, med 2% uranyl acetat negativa fläcken, Visa utökade och vridande supramolekylär fibrerna som är cirka 10 nm i bredd. Fibrerna i den N-terminala acetylerade peptiden, Ac-KLVFFAQ-NH2, är jämna och raka, med en något större bredd på nästan 12 nm16. Sedan förbereder TEM rutnät och bilder är en dags intensiv process, är det bäst att förbereda flera TEM rutnät från samma församling prov på en gång av varierande peptid koncentrationer. Förbereda en utspädda provet för TEM (1:50 eller 1: 100) tillsammans med det ursprungliga församling lösning provet. Amyloid fibrerna vid höga koncentrationer kan följa rutnätet i klumpar eller patchar och bilder av enskilda fibrer kan vara svårt. Det är viktigt att se kanterna av enskilda fibrer för breddmätning och visualisering av fiber helicity skyms ofta av överfulla prover.

Som mer program med hjälp Supramolekylära biomaterial utforskas, finns det ett behov av att integrera potentiellt reaktiva funktionella grupper som är ortogonal mot den självmontering process i egen montering monomerer. De metoder som beskrivs i denna rapport belysa en på-harts strategi för syntesen av en 1,2-dithiolane modified själv montering peptid och spektroskopiska karakterisering av supramolekylär strukturerna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Dr B. Ellen Scanley för hennes teknisk utbildning och hjälp med TEM vid Connecticut State Colleges och universitet (CSCU) Center för nanoteknologi och Dr Ishita Mukerji vid Wesleyan University för tillgång till hennes CD spektrofotometer. Det arbete som rapporterats var delvis stöds av den Science Institute vid Fairfield University, NASA Connecticut utrymme bevilja konsortiet, och National Science Foundation under Grant nummer CHE-1624774.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rink amide MBHA resin, high load Gyros Protein Technologies RAM-5-HL Avoid contact with skin and eyes; do not inhale
N,N-Dimethylformamide Fisher Scientific D119-4 Flammable liquid and vapor; irritating to eyes and skin; Use personal protective equipment; keep away from open flame
Fmoc-L-Val-OH Gyros Protein Technologies FLA-25-V Wear personal protective equipment; do not inhale
Fmoc-L-Leu-OH Gyros Protein Technologies FLA-25-L Wear personal protective equipment; do not inhale
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH Gyros Protein Technologies FLA-25-KBC Wear personal protective equipment; do not inhale
Fmoc-L-Phe-OH Gyros Protein Technologies FLA-25-F Wear personal protective equipment; do not inhale
Fmoc-L-Ala-OH Gyros Protein Technologies FLA-25-A Wear personal protective equipment; do not inhale
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH Gyros Protein Technologies FLA-25-QT Wear personal protective equipment; do not inhale
N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate Gyros Protein Technologies 26432 Causes skin, eye and respiratory irritation; do not inhale; use under hood or in well ventilated area
0.4 M N-methylmorpholine in DMF Gyros Protein Technologies PS3-MM-L highly flammable; wear personal protective equipment; keep away from heat and keep container tightly closed; do not inhale or swallow; wash skin thoroughly after handling
20% piperidine in DMF Gyros Protein Technologies PS3-PPR-L Causes severe eye and skin burns; Flammable Liquid and vapor; Do not inhale
dichloromethane Fisher Scientific D37-4 May cause cancer; Do not inhale; Wear personal protective equipment; use under hood only; if contacted rise with water for at least 15 minutes and obtain medical attention
acetonitrile Fisher Scientific A998-4 Flammable; irritating to eyes; Use personal protective equipment; Use only under a fume hood; keep away from open flame or hot surface; if contacted rinse wiith water for at least 15 minutes and obtain medical attention
trifluoroacetic acid Fisher Scientific A116-50 Causes severe burns; do not inhale; harmful to aquatic life; use personal protective equipment; use only under fume hood; if contacted rinse with water for at least 15 minutes and obain immediate medical attention
4% uranyl acetate Electron Microscopy Sciences 22400-4 Do not inhale; harmful to aquatic life
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid Acros Organics AC172571000 Do not inhale; use outdoors or in well-ventilated area
nitrogen Gas TechAir Contents under pressure, may explode if heated
3-bromo-2-(bromomethyl)propionic acid Alfa Aesar AAA1963014 Do not inhale; causes irritation to skin and eyes; corrosive
sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100 Use personal protective equipment; use only under fume hood; if contact rinse area for at least 15 minutes and obtain medical attention
potassium thioacetate Acros Organics AC221300250 Causes skin and eye irritation; do not inhale; use personal protective equipment
sulfuric acid Fisher Scientific SA213 Causes burns; keep away from water; keep away from combustible material; do not inhale; use personal protective equipment; if contact rinse area for at least 15 minutes and obtain medical attention
chloroform-d Acros Organics AC320690075 Possible cancer hazard; irritating to skin and eyes; do not inhale; Use personal protective equipment; use only under fume hood; If contact rinse area for at least 15 minutes and obtain medical attention
chloroform Fisher Scientific C298-4 Possible cancer hazard; irritating to skin and eyes; do not inhale; Use personal protective equipment; use only under fume hood; If contact rinse area for at least 15 minutes and obtain medical attention
N,N-diisopropylethylamine Acros Organics AC367841000 Highly flammable; harmful to aquatic life; wear personal protective equipment; do not swallow
ammonium hydroxide Fisher Scientific A669S-500 Corrosive; do not inhale
methanol Fisher Scientific A452-4 Flammable liquid and vapor; use personal protective equipment; do not inhale; If contact rinse area for at least 15 minutes and obtain medical attention
triisopropylsilane Sigma Aldrich 233781 Flammable; use personal proctective safety equipment; keep container tightly closed
diethyl ether Fisher Scientific E138-1 Extremely flammable; Irritating to skin and eyes; Use personal protective equipment
2,5-dihydroxybenzoic acid Sigma Aldrich 39319-10x10MG-F do not inhale; irritating to skin and eyes
alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid Alfa Aesar AAJ67635EXK
c18 zip-tip Millipore ZTC18S096
tris(2-carboxyethyl) phospine hydrochloride Thermo Scientific PI20490
silica gel 60 F254 coated aluminum-backed TLC sheets EMD Millipore 1.05549.0001
Thin walled Precision NMR tubes Bel-Art 663000585 5mm O.D.
All-plastic Norm-Ject syringes Air Tite AL10
single-use needle BD PrecisionGlide BD 305185 used needles get disposed on in sharps waste container
disposable fritted syringe Torviq SF1000LL 10mL fritted syringes were used in the report, but larger syringes are avaibale if needed for larger scale synthesis.
carbon grid Ted Pella, Inc. CF200-CU Make sure to prepare samples and staining on the carbon grid side, not the shiny copper side of grid
self-closing tweezers Electron Microscopy Sciences 78318-3X very sharp tips, length: 120 mm
0.1 mm short path length cell Starna Cells, Inc. 20/C-Q-0.1 Fragile
10mL Vessel Caps CEM 909210
10mL Pressure Vessels CEM 908035
Aeris Semi-Prep HPLC column Phenomenex 00F-4632-N0 150 x 10mm
cell holder Starna Cells, Inc. CH-2049 Needed when using short pathlength cells
PS3 peptide synthesizer Gyros Protein Technologies
DiscoverSP Microwave Reactor CEM
centrifuge HERMLE Z 206 A used a fixed 6x50 mL rotor
HPLC Shimadzu UV Detector
nuclear magnetic resonance spectrometer Avance, Bruker 300 MHz
MALDI-TOF mass spectrometer Axima Confidence, Shimadzu
lyophilizer Millrock Technology BT85A
Fourier-Transform Infrared Spectrometer Alpha Tensor, Bruker
Transmission Electron Microscope Tecnai Spirit, FEI Used with Gatan Orius Fiberoptic CCD digital camera. Accessed at CSCU Center for Nanotechnology
Circular Dichroism Spectropolarimeter J-810, JASCO Used with a six-cell Peltier temperature controller. Accessed at Wesleyan University.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, J., Liu, K., Xing, R., Yan, X. Peptide self-assembly: Thermodynamics and kinetics. Chemical Society Reviews. 45, 5589-5604 (2016).
  2. Dong, R., et al. Functional supramolecular polymers for biomedical applications. Advanced Materials. 27, 498-526 (2015).
  3. Edwards-Gayle, C. J. C., Hamley, I. W. Self-assembly of bioactive peptides, peptide conjugates, and peptide mimetic materials. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 5867-5876 (2017).
  4. Goor, O. J. G. M., Hendrikse, S. I. S., Dankers, P. Y. W., Meijer, E. W. From supramolecular polymers to multi-component biomaterials. Chemical Society Reviews. 46, 6621-6637 (2017).
  5. DiMaio, J. T. M., Doran, T. M., Ryan, D. M., Raymond, D. M., Nilsson, B. L. Modulating supramolecular peptide hydrogel viscoelasticity using biomolecular recognition. Biomacromolecules. 18, 3591-3599 (2017).
  6. DiMaio, J. T. M., Raymond, D. M., Nilsson, B. L. Display of functional proteins on supramolecular peptide nanofibrils using a split-protein strategy. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 5279-5283 (2017).
  7. Mahmoud, Z. N., Gunnoo, S. B., Thomson, A. R., Fletcher, J. M., Woolfson, D. N. Bioorthogonal dual functionalization of self-assembling peptide fibers. Biomaterials. 32, 3712-3720 (2011).
  8. Petkau-Milroy, K., Uhlenheuer, D. A., Spiering, A. J. H., Vekemans, J. A. J. M., Brunsveld, L. Dynamic and bio-orthogonal protein assembly along a supramolecular polymer. Chemical Science. 4, 2886-2891 (2013).
  9. Li, A., et al. Neurofibrillar tangle surrogates: Histone H1 binding to patterned phosphotyrosine peptide nanotubes. Biochemistry. 53, 4225-4227 (2014).
  10. Sadownik, A., Stefely, J., Regen, S. L. Polymerized liposomes formed under extremely mild conditions. Journal of the American Chemical Society. 108, 7789-7791 (1986).
  11. Zhang, N., et al. ATN-161 Peptide functionalized reversibly cross-linked polymersomes mediate targeted doxorubicin delivery into melanoma-bearing C57BL/6 mice. Molecular Pharmaceutics. 14, 2538-2547 (2017).
  12. Margulis, K., et al. Formation of polymeric nanocubes by self-assembly and crystallization of dithiolane-containing triblock copolymers. Angewandte Chemie International Edition. 56, 16357-16362 (2017).
  13. Zhang, X., Waymouth, R. 1,2-Dithiolane-Derived Dynamic, Covalent Materials: Cooperative Self-Assembly and Reversible Cross-Linking. Journal of the American Chemical Society. 139, 3822-3833 (2017).
  14. Sakia, N., Matile, S. Stack exchange strategies for the synthesis of covalent double-channel photosystems by self-organizing surface-initiated polymerization. Journal of the American Chemical Society. 133, 18542-18545 (2011).
  15. Uji, H., Morita, T., Kimura, S. Molecular direction dependence of single-molecule conductance of a helical peptide in molecular junction. Physical Chemistry Chemical Physics. 15, 757-760 (2013).
  16. Liang, C., Ni, R., Smith, J. E., Childers, W. S., Mehta, A. K., Lynn, D. G. Kinetic intermediates in amyloid assembly. Journal of the American Chemical Society. 136, 15116-15149 (2014).
  17. Smith, J. E., et al. Defining the dynamic conformational network of cross-β peptide assembly. Israel Journal of Chemistry. 55, 763-769 (2015).
  18. Black, S. P., Sanders, J. K. M., Stefankiewicz, A. R. Disulfide exchange: Exposing supramolecular reactivity through dynamic covalent chemistry. Chemical Society Reviews. 43, 1861-1872 (2014).
  19. Vendetti, A., et al. Dihydroasparagusic acid: Antioxidant and tyrosinase inhibitory activities and improved synthesis. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 6848-6855 (2013).
  20. Stawikowski, M., Fields, G. B. Introduction to peptide synthesis. Current Protocols in Protein Science. 26, (2002).
  21. Canadell, J., Goossens, H., Klumperman, B. Self-healing materials based on disulfide links. Macromolecules. 44, 2536-2541 (2011).
  22. Lafont, U., van Zeijl, H., van der Zwaag, S. Influence of cross-linkers on the cohesive and adhesive self-healing ability of polydisulfide-based thermosets. ACS Applied Materials and Interfaces. 4, 6280-6288 (2012).
  23. Komaromy, D., Stuart, M. C. A., Santiago, G. M., Tezcan, M., Krasnikov, V. V., Otto, S. Self-assembly can direct dynamic covalent bond formation toward diversity or specificity. Journal of the American Chemical Society. 139, 6234-6241 (2017).
  24. McAvery, K. M., Guan, B., Fortier, C. A., Tarr, M. A., Cole, R. B. Laser-induced oxidation of cholesterol observed during MALDI-TOF mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22, 659-669 (2011).
  25. Krimm, S., Bandekar, J. Vibrational spectroscopy and conformation of peptides, polypeptides, and proteins. Advances in Protein Chemistry. 38, 181-364 (1986).
  26. Halverson, K. J., Sucholeiki, I., Ashburn, T. T., Lansbury, P. T. Location of β-sheet-forming sequences in amyloid proteins by FTIR. Journal of the American Chemical Society. 113, 6701-6703 (1991).
  27. Greenfield, N., Fasman, G. D. Computed circular dichroism spectra for the evaluation of protein confirmation. Biochemistry. 8, 4108-4116 (1969).
  28. Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: https://imagej.nih.gov/ij (2016).
  29. Roy, S., Shinde, S., Hamilton, G. A., Hartnett, H. E., Jones, A. K. Artificial [FeFe]-hydrogenase: On resin modification of an amino acid to anchor a hexacarbonyldiiron cluster in a peptide framework. European Journal of Inorganic Chemistry. 2011, 1050-1055 (2011).
  30. Van Duinen, S. G., Castano, E. M., Prelli, F., Bots, G. T. A. B., Luyendijk, W., Frangione, B. Hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis in patients of Dutch origin is related to Alzheimer disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 5991-5994 (1987).
  31. Barth, A. The infrared absorption of amino acid sidechains. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 74, 141-173 (2000).
  32. Jayaraman, M., et al. Slow amyloid nucleation via α-helix-rich oligomeric intermediates in short polyglutamine-containing Huntingtin fragments. Journal of Molecular Biology. 415, 881-899 (2012).

Tags

Kemi fråga 138 fasta fasen peptidsyntesen på-harts självmontering 1,2-dithiolane β-ark amyloid fibrer
Syntes och karakterisering av 1,2-Dithiolane modifierade själv montering peptider
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Neves, R., Stephens, K.,… More

Neves, R., Stephens, K., Smith-Carpenter, J. E. Synthesis and Characterization of 1,2-Dithiolane Modified Self-Assembling Peptides. J. Vis. Exp. (138), e58135, doi:10.3791/58135 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter