Parakrin och juxtacrine cellulära interaktioner har en viktig roll i många biologiska processer, inklusive tumör progression, immunsvar, angiogenes och utveckling. Här, en proximal kultur metoden används för att studera parakrin signalering där lokaliserade koncentrationerna av de utsöndrade faktorerna upprätthålls samtidigt förhindra cellulära direktkontakt.
Intercellulära interaktioner har en viktig roll i många biologiska processer, inklusive tumör progression, immunsvar, angiogenes och utveckling. Parakrin eller juxtacrine signalering förmedlar sådana interaktioner. Användning av en betingad medium och coculture studier är de vanligaste metoderna att diskriminera mellan dessa två typer av interaktioner. Dock effekten av lokaliserade höga koncentrationer av utsöndrade faktorer i mikromiljö under parakrin interaktioner är inte korrekt återgetts av konditionerat medium och, således, kan leda till otydliga slutsatser. För att lösa detta problem, har vi utarbetat en proximal kultur metod för att studera parakrin signalering. De två celltyper odlas på ytorna av en 10 µm tjockt polykarbonat membran med 0,4 µm porer. Porerna möjliggör utbyte av utsöndrade faktorer och, samtidigt, hämmar juxtacrine signalering. Cellerna kan samlas och lyserat på slutpunkten att avgöra effekterna av den parakrin signalering. Förutom att ge för lokaliserade koncentration övertoningar utsöndrade faktorer, är denna metod mottagliga för experiment med längre perioder av kultur, liksom användningen av hämmare. Medan vi använder denna metod för att studera interaktioner mellan äggstockscancer och de mesothelial celler som de stöter på platsen för metastaser, kan det anpassas till eventuella två vidhäftande celltyper för forskare att studera parakrin signalering i olika områden, inklusive tumör mikromiljö, immunologi och utveckling.
Rollen av produktiva ömsesidiga växelverkan mellan cancerceller och den tumör närmiljön i tumör progression etablerad väl och har blivit ett stort fokus på forskning inom cancer biologi1. Liknande instanser av dubbelriktad signalering är avgörande under sårläkning, immunsvar, angiogenes, stamceller nischer, och under utveckling2,3,4,5,6 , 7 , 8. ett vanligt tema i alla dessa biologiska processer är att cellerna svarar på olika sätt till extracellulära signaler från sin mikromiljö som avgör cell öde, vävnad fysiologi och sjukdomsprogression. Därför har fokus alltmer vände mot utveckla en bättre förståelse för mekanismerna som är involverade i sådan cell-cell kommunikation. En majoritet av sådana interaktioner innebära parakrin eller juxtacrine signalering mellan celler. Parakrin signalering involverar utsöndringen av särskilda signalering faktorer en cell som uppfattas av motsvarande receptorer på en annan cell i närheten, utlöser ett svar i det9,10, medan juxtacrine signalering kräver direktkontakt mellan cellulära komponenter av två celler inblandade11,12.
Sådan signalering är en avgörande komponent i vävnad homeostas, liksom i den tumör mikromiljö. Cancercellerna nytta parakrin och juxtacrine faktorer från celler i tumör stroma, inklusive cancer-associerade fibroblaster (CAFs), immunceller och adipocyter13,14,15,16. Den parakrin signalering kan medlas av tillväxtfaktorer, cytokiner, chemokiner, etc., medan den juxtacrine signalering innebär bredvid ligander och receptorer som i Notch signalering eller interaktioner mellan integriner och deras respektive extracellulära matrix proteiner. Vi har visat betydelsen av ömsesidiga interaktioner mellan äggstockscancer celler och CAFs i tumör progression och metastasering14. Likaså reglera interaktioner av metastaserande äggstockscancer celler med mesothelial celler som täcker platsen för metastaser nyckel mikroRNA och transkriptionsfaktorer i cancercellerna som främjar metastaserande colonization17, 18.
De flesta studier på parakrin signalering innebär användning av en betingad medium samlas in från en celltyp att behandla den andra celltypen med. Medan detta tillvägagångssätt har använts i stor utsträckning, replikerar det effektivt inte de lokaliserade hög-halter av utsöndrade faktorn i närmiljön i den mottagande cellen. Det också misslyckas att reproducera kineticsen av ett kontinuerligt flöde av utsöndrade faktor som produceras av en cell och tas emot av den intilliggande cellen. Parakrin signalering är effektiv över korta avstånd som de utsöndrade faktorerna är vid koncentrationerna som krävs endast i närheten av cellen källa och tenderar att diffus och späd ut när avståndet ökar. Detta lokaliserade hög koncentration av utsöndrade faktorn är viktigt att utlösa en reaktion i cellen receptor. Dessutom är svaret i de mottagande cellerna också beroende av saldot av nyligen utsöndrade faktorer och deras kontinuerliga utarmning genom nedbrytning, bindande och internalisering i mottagarens celler och diffusion från cellen källa. Konditionerat medium kan vara koncentrerad till konto för de högre lokaliserade koncentrationerna som är närvarande i närmiljön, men som inte kan exakt replikera de exakta koncentrationerna. Dessutom kan inte det efterliknar naturliga kineticsen av produktion och utarmning av faktorn som är inblandade. För att mer exakt replikera parakrin signalering och skilja det från juxtacrine signalering mekanismer, har vi utarbetat en roman proximala kultur metod, som innebär växande de två celltyper på antingen ytan av ett poröst membran. Porerna är tillräckligt små för att förhindra juxtacrine interaktioner och ändå tillåta utbyte av utsöndrade faktorer vid lokaliserade höga koncentrationer. På så sätt behåller detta system kineticsen av produktion och utarmning av de parakrin faktorerna.
Förstå mekanismen av parakrin och juxtacrine signalering mellan celler är nödvändig för att få bättre kunskap om normal vävnad homeostas och sjukdom villkor7,8. De flesta parakrin signalering studier utförs genom att samla luftkonditionerade medium från en celltyp och använda den för att behandla de andra celltypen. Denna metod har en fördel i dess inneboende enkelhet. Dock det inte korrekt sammanfatta lokaliserade koncentrationerna av de utsöndrad…
The authors have nothing to disclose.
Vi står i skuld till patienter för deras deltagande i samlingen vävnad för dessa experiment. En DoD OCRP ovariell Cancer Academy Award (W81XWH-15-0253) och en pilot award från Colleen’s Dream Foundation till Anirban K. Mitra stöds denna forskning.
24 mm Transwell permeable support with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert | Corning (Costar) | 3412 | • 10 µm thick translucent polycarbonate membrane • Treated for optimal cell attachment • Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case • Membrane must be stained for cell visibility • Sterilized by gamma radiation |
6 well plate | Corning (Falcon) | 353046 | Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid |
15 cm culture dish | Corning (Falcon) | 353025 | Sterile, TC-treated Cell Culture Dish |
DMEM | Corning (Cellgro) | 10-013-CV | |
Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
MEM Nonessential amino acids | Corning (Cellgro) | 25-025-CI | |
MEM Vitamins | Corning (Cellgro) | 25-020-CI | |
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
Pipets | Any make is fine | ||
CO2 Incubator | Any make is fine | ||
Biosafety level II cabinet | Any make is fine | ||
FN1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01549976_m1 | |
TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs00998133_m1 | |
CDH1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01023895_m1 | |
GAPDH TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs99999905_m1 | |
miRNeasy mini RNA isolation Kit | Qiagen | 217004 | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 43-688-13 | |
HeyA8 ovarian cancer cells | Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago | ||
TGFβ Neutralizing Antibody | R&D Systems | MAB1835-100 |