Summary
אינטראקציות סלולרי Paracrine ו- juxtacrine תפקיד חשוב בתהליכים ביולוגיים רבים, כולל התקדמות הגידול, תגובות חיסוניות, אנגיוגנזה ופיתוח. כאן, שיטה תרבות proximal משמש כדי ללמוד paracrine איתות שבו ריכוז המותאמות לשפות אחרות של הגורמים המופרש נשמרים תוך מניעת מגע ישיר הסלולר.
Abstract
אינטראקציות המערכת תפקיד חשוב בתהליכים ביולוגיים רבים, כולל התקדמות הגידול, תגובות חיסוניות, אנגיוגנזה ופיתוח. Paracrine או juxtacrine איתות שמתווכת אינטראקציות כאלה. השימוש במדיום ממוזגים ולימודי coculture הן השיטות הנפוצות להפלות בין שני סוגים אלה של אינטראקציות. אולם, השפעת ריכוזים גבוהים המותאמות לשפות אחרות של גורמים המופרש microenvironment במהלך אינטראקציות paracrine לא recapitulated במדויק על-ידי מדיום ממוזגים, לפיכך, עשוי להוביל למסקנות מדויק. כדי להתגבר על בעיה זו, אנו המציאו שיטה תרבות proximal ללמוד paracrine איתות. סוגי תאים בשני גדלים גם פני קרום בעובי מיקרומטר פוליקרבונט 10 עם נקבוביות מיקרומטר 0.4. הנקבוביות לאפשר החליפין של גורמים המופרש ומעכבות, באותו זמן, juxtacrine איתות. התאים ניתן לאסוף ולהשתמש lysed-נקודת הקצה כדי לקבוע את ההשפעות של האיתות paracrine. בנוסף מאפשר למעברי ריכוז המותאמות לשפות אחרות של גורמים המופרש, שיטה זו היא לבצע ניסויים הקשורים תקופות ממושכות של תרבות, כמו גם השימוש של מעכבי. בעוד אנחנו להשתמש בשיטה זו כדי ללמוד את האינטראקציות בין תאים סרטניים בשחלות התאים mesothelial שהם נתקלים באתר של גרורות, אותה ניתן להתאים לכל סוגי תאים חסיד שני לחוקרים ללמוד paracrine איתות בתחומים שונים, כולל גידול microenvironment, אימונולוגיה ופיתוח.
Introduction
התפקיד של פורה אינטראקציות הדדיים בין תאים סרטניים microenvironment את הגידול בהתקדמות הגידול הוכח גם, הפך מוקד מרכזי מחקר הסרטן ביולוגיה1. מקרים דומים של איתות דו-כיווניים מכריעים במהלך ריפוי, תגובות חיסוניות, אנגיוגנזה, גומחות תאי גזע, הפצע ובמהלך ההתפתחות2,3,4,5,6 , 7 , 8. נושא משותף כל התהליכים הביולוגיים האלה הוא התאים מגיבים בדרכים שונות כדי רמזים חוץ-תאית מ שלהם microenvironment הקובעים גורל, פיזיולוגיה של רקמות, התקדמות המחלה. לכן, המוקד הפך יותר ויותר לכיוון פיתוח הבנה טובה יותר של המנגנונים המעורבים בתקשורת תא-תא כזה. רוב האינטראקציות כזה כרוך paracrine או juxtacrine איתות בין תאים. Paracrine איתות כרוך ההפרשה של גורמים איתות ספציפית בתא אחד אשר נתפסים על ידי רצפטורים המתאימים על תא אחר בסביבה, מפעילה תגובה בה9,10, ואילו juxtacrine איתות דורש מגע ישיר בין מרכיבי התא לשני תאים מעורב11,12.
איתות כזה הוא מרכיב קריטי רקמות הומאוסטזיס, כמו גם את microenvironment הגידול. התאים הסרטניים תועלת paracrine גורמים juxtacrine של תאי הגידול stroma, לרבות סרטן הקשורים fibroblasts (CAFs), תאים חיסוניים adipocytes13,14,15,16. Paracrine איתות להיות מתווכת על-ידי גורמי גדילה, ציטוקינים, נוגדנים, וכדומה, ואילו האיתות juxtacrine כרוך ליגנדים juxtaposed קולטנים חריץ איתות, או אינטראקציות בין אינטגרינים שלהם בהתאמה מטריצה חוץ-תאית חלבונים. הראו את החשיבות של אינטראקציות הדדיים בין תאים סרטניים בשחלות CAFs התקדמות, גרורות הגידול14. באופן דומה, לווסת האינטראקציות של תאים סרטניים בשחלות metastasizing עם התאים mesothelial כיסוי האתר של גרורות מיקרו Rna מפתח ואת גורמי שעתוק של תאים סרטניים אשר לקדם קולוניזציה גרורתי17, 18.
רוב המחקרים על paracrine איתות לערב את השימוש שנאספו מכל סוג תא אחד להתייחס את סוג התא השני עם מדיום ממוזגים. בעת גישה זו כבר בשימוש נרחב, זה ביעילות לא לשכפל את רמות ריכוז גבוהה המותאמות לשפות אחרות של הגורם המופרש microenvironment של התא המקבל. זה גם לא יצליח לשחזר את קינטיקה של הזרם רציפה של הגורם המופרש שיופקו בתא אחד, שהתקבלו על-ידי התא הסמוך. Paracrine איתות יעילה במרחקים קצרים כמו הגורמים המופרש נמצאים בריכוזים נדרש רק בקרבת מקור התא, נוטים לפזר ו לדלל את המרחק גודלת. זה הריכוז הגבוה המותאמות לשפות אחרות של הגורם המופרש חיונית כדי לעורר תגובה התא קולטן. יתר על כן, התגובה בתאים הנמען הוא גם תלוי האיזון של דלדול רציפה שלהם דרך השפלה, איגוד, הפנמה תאים הנמען, דיפוזיה מן התא מקור וגורמי לאחרונה המופרש. ממוזגים בינוני יכול להיות מרוכז לחשבון עבור ריכוז מקומי גבוה נוכח microenvironment, אבל זה לא במדויק לשכפל את הריכוזים המדויק. יתר על כן, זה לא יכול לחקות את קינטיקה הטבעית של ייצור, דלדול של הגורם מעורב. באופן מדויק יותר לשכפל paracrine איתות ולהפריד אותו מן juxtacrine איתות מנגנונים, אנחנו המציאו שיטה תרבות proximal חדשניים, אשר כולל גוברת על סוגי תאים שני במשטח או של קרום נקבובי. הנקבוביות הם קטנים מספיק כדי למנוע juxtacrine אינטראקציות, עדיין לאפשר החליפין של גורמים המופרש בריכוזים גבוהים לשפות אחרות. בדרך הזאת, המערכת שומרת את קינטיקה של ייצור, דלדול של הגורמים paracrine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול עוקב אחר הקווים המנחים של לוח רגולטוריים מוסדי של אינדיאנה האוניברסיטה.
1. תא הכנה
-
בידוד של התרבות התאים mesothelial האנושית ראשי
- ולבודד ראשי התאים mesothelial האנושית (HPMCs) מ omentum האנושי כפי שתואר לעיל17,18 . ותגדל אותם להשלים את מדיום הגידול [בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) המכילה סרום שור עוברית 10%, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 1% שאינם חיוניים חומצות אמינו וויטמינים 1%]-CO 37 ° C ו-5%2.
הערה: HPMCs גדלים בדרך כלל 100% הנהרות (איור 1 א').
- ולבודד ראשי התאים mesothelial האנושית (HPMCs) מ omentum האנושי כפי שתואר לעיל17,18 . ותגדל אותם להשלים את מדיום הגידול [בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) המכילה סרום שור עוברית 10%, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 1% שאינם חיוניים חומצות אמינו וויטמינים 1%]-CO 37 ° C ו-5%2.
-
תנאי הגידול של תאים סרטניים בשחלות
- לגדול HeyA8 תאים סרטניים בשחלות במדיום גידול מלאה-CO 37 ° C ו- 5%2.
הערה: שימוש HeyA8 תאים בוגרים עד כ 80% הנהרות (איור 1B).
- לגדול HeyA8 תאים סרטניים בשחלות במדיום גידול מלאה-CO 37 ° C ו- 5%2.
2. תרבית תאים
-
הגדרת התרבות צינתור
- שימוש Transwell מוסיף עבור 6-ובכן לוחות עם קרום μm בעובי רקמת תרבות-שטופלו פוליקרבונט 10 עם μm 0.4 נקבוביות (108 נקבוביות/cm2) ואזור הגדילה 4.67 ס מ2 . אם יש צורך, למטב לגדלים שונים הוספה בעזרת שינוי מספר התאים נזרע על פי הצמיחה את פני השטח. מדיום הגידול מלאה חמה טריפסין, באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) עד 37 ° C לפני השימוש.
-
הכנת את המכסים
- כדי להפיץ את התאים HeyA8 על המשטח התחתון של הקרום של הקדמי, הסר את תותב מאריזתו באמצעות מלקחיים סטרילי ולמקם אותו הפוך לצלחת תרבות סטרילי 15 ס מ.
- השתמש צלחת 15 ס מ, שכן יש את עומק כדי להכיל את תותב הפוכה, או תחליף את זה עם שום מיכל סטרילי המתאים. בהתאם הניסוי, הכנס את המספר הנדרש של מוסיף המנה 15 ס מ.
- תווית הפקדים, שלושה תנאים ניסיוני בהתאם עם סמן על קצה השרוול.
-
הכנת התאים הסרטניים
- כדי trypsinize את התאים HeyA8 גדל ב- 80% הנהרות בבקבוקון2 25 ס מ (~ 2 x 106 תאים), להוסיף 1 מ"ל של טריפסין (0.25%) עבור s 40-60 ולנטרל את טריפסין עם 6 מ של מדיום הגידול מלאה.
- Centrifuge התאים ב x 500 g בטמפרטורת החדר (RT) במשך 3 דקות, למחוק את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר תא ב 5 מ של מדיום הגידול מלאה. לספור את התאים הפועלים בשיטת אי-הכללה של צבע כחול של trypan.
-
זריעה של תאים סרטניים
- להשעות 100,000 תאים למ"ל של תאים חיים HeyA8 במדיום גידול מלאה. בזהירות זרע 80,000 HeyA8 תאים הושעו ב 800 μL של מדיום הגידול המלא בתחתית תותב (אשר כעת מול, מאז זה היא הפוכה).
- זרע התאים כדי ליצור צורת הכיפה, כמו אז התאים נשארים על תותב (איור 1C). מהמרכז של הקרום ומתחילים לנוע כלפי חוץ במעגלים תוך לאט pipetting. הימנע הולך יותר מ 3 מ מ מהקצה כדי למנוע כל שפיכת המדיום.
הערה: מספר התאים נזרע תלויות הצמיחה של התאים ושל משך הניסוי. מספר התאים HeyA8 נזרע לתרבות הזאת צינתור אופטימציה, התאים יהיה 80-90% confluent בסוף היום השלישי.
-
סרטן התא מצורף
- מכסים את הכלי 15 ס מ ולהעביר בזהירות את המנה המכיל את המכסים את החממה2 CO. זה חיוני לא לשבש את טיפת בינוני ותאים על תותב בשלב זה. להשאיר את התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות לאפשר את התאים הסרטניים לצרף הכנס.
-
הכנת התאים mesothelial
- לאחר כ 4 שעות, trypsinize את HPMCs גדלו ב 100% הנהרות בבקבוקון2 75 ס מ (~ 4 x 106 תאים) עם 2 מ של טריפסין (0.25%) 1-2 דקות, לנטרל את טריפסין עם 12 מ של מדיום הגידול מלאה.
- Centrifuge התאים ב 500 x g ב- RT למשך 3 דקות, resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של מדיום הגידול מלאה, ולספור את התאים הפועלים בשיטת אי-הכללה של צבע כחול של trypan.
-
זריעה התאים mesothelial
- להשעות 300,000 תאים למ"ל של HPMCs בשידור חי במדיום הגידול מלאה. להוסיף 2.5 מ של מדיה טריים צמיחה מלאה כל טוב של צלחת 6-. טוב. בקפידה להביא את המנה 15 ס מ המכיל את המכסים את מכסה המנוע אבטחה. באמצעות מלקחיים סטרילי, להפוך את תותב ומניחים אותו בתוך הבאר של צלחת 6-ובכן כך הוא זקוף, עם תאי HeyA8 המחובר למשטח התחתון שקוע בתוך מדיום הגידול מלאה (איור 1C).
- HPMCs זרע 450,000 הושעו ב- 1.5 מ של מדיום הגידול בתוך החלק הפנימי של התוספות עם תאי HeyA8 אל פני השטח פונה לחלק התחתון של הבאר (איור 1C) או מוסיף ללא תאים HeyA8 עבור הפקדים HPMC. להוסיף 1.5 מ של מדיום הגידול ללא תאים לפקדים HeyA8.
-
גדל את התרבות צינתור
- תן את התרבות proximal לגדל בחממה CO2 -37 ° C ו- 5% CO2 עבור 72 h. אם נדרש, המדיום ניתן לחידוש כדלקמן.
- הפנימי של תותב, להסיר 750 µL ולהוסיף µL 750 של מדיום הגידול שלם טרי.
- על החלק החיצוני של תותב (לוח 6-טוב), להסיר 1 מ"ל ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום הגידול שלם טרי. 1 mL נבחרה עבור הנוחות של שינוי המדיום בצעד אחד. אם רצונך בכך, 1.25 mL יכול להיות הוסר, החליף במקום.
- תן את התרבות proximal לגדל בחממה CO2 -37 ° C ו- 5% CO2 עבור 72 h. אם נדרש, המדיום ניתן לחידוש כדלקמן.
-
איסוף התאים
- לאסוף את התאים לאחר 72 h של תרבות הפרוקסימלית. לקחת טיפול מיוחד בשלב זה כדי למנוע זיהום צולב בין התאים HeyA8 HPMCs. Trypsinize את התאים, centrifuge אותם, ואת lyse בגדר במקום התאים על קרום למניעת זיהום צולב של lysing.
-
Trypsinizing תאים
- לשטוף את שני צידי תותב עם 1 x PBS.
- להעביר את הכיסויים באר חדשה והוסף טריפסין. להוסיף 0.5 מ של טריפסין הפנימי של תותב ולהוסיף 2 מ של טריפסין לצלחת 6-טוב כדי trypsinize את התאים הסרטניים המצורפת המשטח התחתון של הקדמי. דגירה את הצלחת למשך 2 דקות ב 37 º C.
-
נטרול של טריפסין
- להוסיף 1 מ"ל של מדיום הגידול מלאה בתוך התותב, כדי לנטרל את טריפסין, פיפטה למעלה ולמטה, לקחת את התאים ואז להעביר אותם ל צינור אוסף תוויות. הוסף אוטם 2 נוספים של מדיום הגידול מלאה על נטרול מוחלט. צריך לקחת לא לחדור את הקרום בעת pipetting כדי למנוע של זיהום צולב של התאים.
- כדי לאסוף את התאים על החלק התחתון של הקדמי, pipette של טריפסין 2 מ"ל שנוסף בשלב 12.2 על גבי המשטח התחתון 2 – 3 x כך התאים ליפול לתוך החלק התחתון של הלוח 6-. טוב. לנטרל את טריפסין בתחתית הצלחת עם 6 מ של מדיום הגידול ולהעביר את התוכן של הצלחת צינור אוסף תוויות.
-
איסוף של lysing את התאים
- Centrifuge התאים ב x 500 g למשך 3 דקות, וארוקן את המדיה. Resuspend ואת lyse כדורי תא 0.7 מ של ריאגנט פירוק פנול guanidine thiocyanate-מבוססות על החילוץ RNA. לבודד את הרנ א באמצעות כל ערכת מתאימים.
3. תגובת שרשרת של פולימראז כמותיים בזמן אמת
הערה: השלבים הבאים מתארים את תגובת שרשרת כמותיים פולימראז בזמן אמת (qPCR) ללמוד את השינויים ביטויים ג'ין בעקבות התרבות הפרוקסימלית.
- היכונו cDNA מדגימות RNA qPCR. השתמש רוורס טרנסקריפטאז מתאימים לכל עם מאגר המתאימים, תחל אקראי כדי להבטיח שעתוק לאחור של כל ה-mRNA (ראה טבלה של חומרים).
- להעריך את השינויים ברמות ביטוי mRNA של fibronectin (FN1) ו- E-קדהרין (CDH1), גורם הגדילה בטא 1 (TGFβ1) על ידי qPCR עם גליצראלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH) כפקד פנימי של שינוי צורה. זה אפשרי להשתמש מתוקננת מבחני ביטוי גנים זמינים מסחרית (ראו טבלה של חומרים) או לעצב תחל.
- להשוות את התאים HeyA8 גדלו בתרבות צינתור עם HPMCs עם הפקדים HeyA8, את HPMCs גדלו בתרבות צינתור עם הפקדים HPMC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metastasizing תאים סרטניים בשחלות נתקלים התאים mesothelial באתר של גרורות בתוך חלל הצפק19. אינטראקציות paracrine ו- juxtacrine פרודוקטיבי בעזרת התאים mesothelial ב גרימת תגובות מסתגלת בתאי סרטן השחלות, אשר מאפשרים גרורות מוצלחת17,18,20,21 . כדי לבדוק את האפקטיביות של שיטת תרבות צינתור, בדקנו את האינטראקציות paracrine בין תאים סרטניים בשחלות HeyA8 HPMCs. בעבר דווח כי coculture של תאים HeyA8 עם HPMCs התוצאה היא ביטוי מוגבר של fibronectin HPMCs21. זה אינדוקציה של הביטוי fibronectin מתווך על ידי הפרשת מוגברת של TGFβ על ידי תאים HeyA821. לכן, בדקנו את השפעת תרבות הפרוקסימלית של תאים HeyA8, HPMCs על רמות ה-mRNA fibronectin, TGFβ בשני התאים האלה. כצפוי, תרבות צינתור עם תאים HeyA8 הביא בביטוי מוגבר של fibronectin ב HPMCs לעומת פקדים אשר היו נזרע על הוספת ללא תאים HeyA8 המחובר למשטח התחתון (איור 2 א). באופן דומה, התרבות הפרוקסימלית של HPMCs עם HeyA8 תאים הביא בביטוי מוגבר של TGFβ ב לשעבר (איור 2B). הביטוי של fibronectin והן TGFβ גדל באופן משמעותי גם בתאים HeyA8 על תרבות צינתור עם HPMCs לעומת הפקדים שבו HPMCs היו לא נזרע השטח העליון של התוספות (איור 2C ו- 2D).
כדי להשוות את האפקט של הגישה הקלאסית בינוני ממוזגים, אנחנו ביצע ניסוי בטיפול HeyA8 תאים ממוזגים HPMC בינונית. היתה ירידה בביטוי fibronectin, שינוי משמעותי TGFβ בתאים HeyA8 שטופלו המדיום ממוזגים-HPMC. (איור 3A ו- 3B). בדקנו גם את הפוטנציאל של חוסם את TGFβ מופרשים עם נוגדן נטרול בתרבות הפרוקסימלית. טיפול עם הנוגדן נטרול TGFβ גרמו ירידה משמעותית אינדוקציה של TGFβ בתאים HeyA8 בתרבות צינתור עם HPMCs (איור 3C). עם זאת, הנוגדן נטרול TGFβ מעט מוגברת הביטוי TGFβ בתאים שליטה HeyA8, ככל הנראה כתגובה לתת פיצוי (איור 3C).
בנוסף, בדקנו גם את ההשפעה של התרבות proximal על רמות ביטוי של סמן אפיתל E-קדהרין ואילו התרבות צינתור עם תאים HeyA8 מעט מוגברת הביטוי E-קדהרין ב HPMCs (איור 2E), ירידה ניכרת ב- E-קדהרין נצפתה בתאים HeyA8 גדל בסמיכות של HPMCs לעומת פקדים (2F איור). יחדיו, תוצאות אלו ממחישות את האפקטיביות של מערכת התרבות proximal ללמוד את paracrine איתות בין תאים סרטניים בשחלות תאים נורמליים באתר של גרורות המשפיעות על ביטוי גנים בשני סוגי תאים במהלך תהליך של קולוניזציה גרורתי.
איור 1: הרכבה של מערכת התרבות הפרוקסימלית. (א) אדם מראה לוח ראשי התאים mesothelial (HPMCs). (B) לוח זה מראה HeyA8 תאים סרטניים בשחלות. גודל ברים = 200 מיקרומטר (A-B). HeyA8 (ג) התאים היו נזרע על המשטח התחתון של transwell הכנס עם נקבוביות מיקרומטר 0.4. ברגע התאים היו שמצמידים תותב הונח בטוב של צלחת 6-ובכן שמכיל מדיום הגידול. התאים mesothelial היו אז נזרע ב תותב כך שהם מחוברים אל פני השטח העליון הופרדו מן התאים HeyA8 על ידי הקרום. הנקבוביות מיקרומטר 0.4 ממברנה מותר חילופי מופרש גורמים אך עכבות מגע ישיר בין התאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: השפעת התרבות proximal על הביטוי mRNA. המופע הראשון שני לוחות qPCR עבור fibronectin (A) ו- (B) TGFβ1 ביטוי התאים mesothelial האנושית הראשי (HPMCs) תרבותי הציר הקרוב לתאים HeyA8, לעומת שליטה HPMCs. המופע הבא שני לוחות qPCR (ג) fibronectin וביטוי TGFβ1 (D) בתאים HeyA8 תרבותי הציר הקרוב כדי HPMCs, לעומת שליטה Heya8 תאים. שני לוחות הצג את qPCR עבור הביטוי E-קדהרין ב- HPMCs (E) תרבותי הציר הקרוב HeyA8 תאים ותאים HeyA8 (F) תרבותי הציר הקרוב ל- HPMCs. N = 3, * p < 0.01. קווי השגיאה לייצג סטיית התקן של חוזר שלוש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: השפעת תא mesothelial האנושית הראשי (HPMC)-ממוזגים הטיפול בינונית על הביטוי mRNA תאי HeyA8. שני הלוחות המובילים להראות את qPCR עבור fibronectin (A) ו- (B) TGFβ1 ביטוי בתאים HeyA8. (ג) לוח האחרון הזה מראה את השפעת מעכבים TGFβ1 מופרשים עם נוגדן נטרול (TGFβ1 אלב) על הביטוי HeyA8 TGFβ1 על תרבות צינתור עם HPMCs- N = 3, * p < 0.01. p < 0.05. קווי השגיאה לייצג סטיית התקן של חוזר שלוש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הבנת המנגנון של paracrine ו- juxtacrine איתות בין תאים חיוני לפיתוח ידע טוב יותר של הרקמות הומאוסטזיס ומחלות תנאים7,8. רוב paracrine איתות הלימודים מתנהלים על ידי איסוף ממוזגים בינוני בין תא אחד סוג משתמש בו כדי לטפל בסוג התא השני. בשיטה זו יש יתרון הפשטות הטבועה. עם זאת, זה לא מדויק מסכם את הדברים את ריכוזי הגורמים המופרש microenvironment הסלולר מקומי או את קינטיקה של ייצור, דלדול של הגורמים המעורבים. בעוד שהראשון ניתן לטפל במידה מסוימת, אבל לא במדויק, על ידי ריכוז של המדיום ממוזגים, קשה מאוד ליצור מחדש את קינטיקה. השימוש transwell מוסיף לגדול התאים את תותב, בתחתית הבאר יכול, במידה מסוימת, להחזיר את השפעות קינטיקה של ייצור ושל דלדול. עם זאת, התאים מופרדים על-ידי המרחק בין את תותב בתחתית הבאר, לפיכך, יכול ליצור מחדש את ריכוזי המותאמות לשפות אחרות גורמים paracrine. דיווחנו על התפתחות שיטה פשוטה תרבות proximal ללמוד paracrine הדדיים איתות, אשר שמר על ריכוז גבוה המותאמות לשפות אחרות של הגורמים המופרש, כמו גם את הדינמיקה של קצב הייצור, דלדול של הגורמים.
במחקר הוכחה של עקרון, להדגים את היעילות של שיטת תרבות proximal מתרבה ההשפעות המדווחת של אינטראקציות בין תאים סרטניים בשחלות HPMCs. בנוסף, גם הראנו את ההשפעות הנגדי של אינטראקציות paracrine הדדיים על הביטוי של דה מרקר אפיתל E-קדהרין בתאים HeyA8 ו- HPMCs. בזמן הניסוי שלנו מעורבים culturing התאים על פני תקופה של 3 ימים, זה ניתן להתאים קצר או ארוך יותר נקודות זמן על-ידי התאמת מספר התאים הראשונית נזרע. דבר זה מאפשר לחוקרים לחקור תופעות לטווח קצר, כמו גם לטווח ארוך של האיתות paracrine או לבצע מחקרים זמן-קורס. שיטה פשוטה זו פוטנציאל ניתן להחיל מחקר על paracrine איתות בין שני סוגי תאים חסיד, כולל אימונולוגיה, אנגיוגנזה, פיתוח תאים, פצע מרפא, בנוסף מחקרים על microenvironment הגידול.
השלבים הקריטיים בשיטה זו זריעת תאי על צידם התחתון של הקרום, קציר תאים מן שני המשטחים על נקודת הקצה. אנחנו מושגת של זריעה על צידם התחתון הראשון היפוך של תותב, ואז זריעה התאים כמו טיפת בינוני גדול. צריך להיות נזרע התא יותר חסיד של השניים למד על המשטח התחתון. טיפול צריכה להילקח שלא להפריע את תותב תוך המקננת כדי להימנע זו בועה של מדיום לנתק. ג'ל סיליקון ניתן ליישם את הקצוות של התותב, כדי למנוע את שבירת ונשפך הבועה של נוזל. בסוף הניסוי תרבות צינתור, התאים משני צידי הקרום הם ברצף trypsinized במקום lysed ישירות, כי lysing אותם על קרום סיכונים קרוס-הזיהום של lysates דרך הנקבוביות. על ידי trypsinizing אותם בתאים בודדים שלהם, הטיפול כי אמצעי האחסון בינונית, טריפסין עולה על הסכום כאמור בפרוטוקול, כל זיהום צולב הוא נמנע. כל סוג התא נאסף בשפופרת נפרדים, centrifuged, ולא בגדר התא הוא אז lysed.
למרות הטכניקה הזאת מאפשרת לימוד יעיל paracrine אינטראקציות תוך הימנעות אינטראקציות ישיר עבירה, לא נוכל לשלול אינטראקציות דרך מנהרות nanotubules (TNTs). חלק TNTs האלה יכול להיות מספיק צר לעבור דרך הנקבוביות מיקרומטר 0.4 מספיק זמן כדי להקיף את עובי 10 מיקרומטר של הקרום. בעוד הניסיונות שלנו כדי לאמת את הנוכחות שלהם בתוך הנקבוביות על-ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית היו חד משמעיות (נתונים לא מוצג), מיקרוסקופ אלקטרונים יכול פוטנציאלית להיות מועסק כדי לאשר את נוכחותם. לכן, בשיטה זו לא לשלול את פוטנציאל תקשורת דרך TNTs אם התאים המועמד מסוגלים להרכיב אותם ואינטראקציה דרכם. באופן דומה, לא נוכל לשלול autocrine מוגברת איתות בשל חסימת נקבוביות על ידי תאים משני צידי הממברנה, פוטנציאל מניעת הצלב דיפוזיה.
גידול תאים על השטח או של קרום עם נקבוביות מיקרומטר 0.4 גם מאפשר חילופי exosomes פוטנציאליים. Exosomes נחשבו באופן מסורתי כמו שקיות אשפה של תאים, אך מחקרים אחרונים מצביעים כי אלה שלפוחית עם שלהם מטען של חלבונים, מיקרו Rna, ואת mRNAs אפילו DNA לשמש כמתווכים חשוב של תקשורת סלולרית paracrine22 , 23 , 24. לפיכך, שיטת תרבות proximal יכול לשמש ביעילות ללמוד תקשורת סלולרית דרך exosomes. בנוסף, שיטה זו היא לבצע טיפול עם מעכבי ספציפי של איתות או נטרול נוגדנים נגד ליגנד המופרש או לקולטן המתאים. לסיכום, דיווחנו על התפתחות שיטה פשוטה ותרבות proximal רב-תכליתי, אשר יכולים לשחזר במדויק paracrine איתות תוך מניעת אינטראקציות ישיר בין התאים. הפשטות של שיטה זו מאפשרת את יישום נרחב בתחומים מגוונים כמו סרטן ביולוגיה, התפתחות, אימונולוגיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
. אנחנו חבים החולים בשל השתתפותם באוסף רקמות לניסויים אלה. משרד ההגנה OCRP השחלות סרטן האקדמיה פרס (W81XWH-15-0253) פרס פיילוט מקרן קולין החלום כדי מיטרה ק' חן תמיכה במחקר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 mm Transwell permeable support with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert | Corning (Costar) | 3412 | • 10 µm thick translucent polycarbonate membrane • Treated for optimal cell attachment • Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case • Membrane must be stained for cell visibility • Sterilized by gamma radiation |
| 6 well plate | Corning (Falcon) | 353046 | Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid |
| 15 cm culture dish | Corning (Falcon) | 353025 | Sterile, TC-treated Cell Culture Dish |
| DMEM | Corning (Cellgro) | 10-013-CV | |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| MEM Nonessential amino acids | Corning (Cellgro) | 25-025-CI | |
| MEM Vitamins | Corning (Cellgro) | 25-020-CI | |
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Pipets | Any make is fine | ||
| CO2 Incubator | Any make is fine | ||
| Biosafety level II cabinet | Any make is fine | ||
| FN1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01549976_m1 | |
| TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs00998133_m1 | |
| CDH1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01023895_m1 | |
| GAPDH TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs99999905_m1 | |
| miRNeasy mini RNA isolation Kit | Qiagen | 217004 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 43-688-13 | |
| HeyA8 ovarian cancer cells | Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago | ||
| TGFβ Neutralizing Antibody | R&D Systems | MAB1835-100 |
References
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Cupedo, T., Mebius, R. E. Cellular interactions in lymph node development. The Journal of Immunology. 174 (1), 21-25 (2005).
- Suvas, S. Role of Substance P Neuropeptide in Inflammation, Wound Healing, and Tissue Homeostasis. The Journal of Immunology. 199 (5), 1543-1552 (2017).
- Gnecchi, M., Danieli, P., Malpasso, G., Ciuffreda, M. C. Paracrine Mechanisms of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Repair. Methods in Molecular Biology. , 123-146 (2016).
- Lionetti, V., Bianchi, G., Recchia, F. A., Ventura, C. Control of autocrine and paracrine myocardial signals: an emerging therapeutic strategy in heart failure. Heart Failure Reviews. 15 (6), 531-542 (2010).
- Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
- Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (7), 497-512 (2014).
- Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).
- Elenbaas, B., Weinberg, R. A. Heterotypic signaling between epithelial tumor cells and fibroblasts in carcinoma formation. Experimental Cell Research. 264 (1), 169-184 (2001).
- Wilson, K. J., et al. EGFR ligands exhibit functional differences in models of paracrine and autocrine signaling. Growth Factors. 30 (2), 107-116 (2012).
- Kopan, R. Notch signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (10), (2012).
- Singh, A. B., Sugimoto, K., Harris, R. C. Juxtacrine activation of epidermal growth factor (EGF) receptor by membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor protects epithelial cells from anoikis while maintaining an epithelial phenotype. Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 32890-32901 (2007).
- Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Cancer Research. 72 (10), 2473-2480 (2012).
- Mitra, A. K., et al. MicroRNAs reprogram normal fibroblasts into cancer-associated fibroblasts in ovarian cancer. Cancer Discovery. 2 (12), 1100-1108 (2012).
- Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).
- Salimian Rizi, B., et al. Nitric oxide mediates metabolic coupling of omentum-derived adipose stroma to ovarian and endometrial cancer cells. Cancer Research. 75 (2), 456-471 (2015).
- Mitra, A. K., et al. Microenvironment-induced downregulation of miR-193b drives ovarian cancer metastasis. Oncogene. 34 (48), 5923-5932 (2015).
- Tomar, S., et al. ETS1 induction by the microenvironment promotes ovarian cancer metastasis through focal adhesion kinase. Cancer Letters. 414, 190-204 (2018).
- Mitra, A. K. Ovarian Cancer Metastasis: A Unique Mechanism of Dissemination. Tumor Metastasis. Xu, K. , InTechOpen. Available from: https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination 43-58 (2016).
- Iwanicki, M. P., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discovery. 1 (2), 144-157 (2011).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4614-4628 (2014).
- Boelens, M. C., et al. Exosome transfer from stromal to breast cancer cells regulates therapy resistance pathways. Cell. 159 (3), 499-513 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
- Kohlhapp, F. J., Mitra, A. K., Lengyel, E., Peter, M. E. MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment. Oncogene. 34 (48), 5857-5868 (2015).
