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Biology

Un metodo di coltura prossimale per studiare segnalazione paracrina tra celle

Published: August 28, 2018 doi: 10.3791/58144
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,3,4
1Indiana University School of Medicine, 2Urology, Indiana University Health Southern Indiana Physicians, 3Indiana University Melvin and Bren Simon Cancer Center, 4Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine

Summary

Interazioni cellulari paracrine e juxtacrine gioca un ruolo importante in molti processi biologici, tra cui la progressione del tumore, le risposte immunitarie, angiogenesi e sviluppo. Qui, un metodo di coltura prossimale viene utilizzato per studiare segnalazione paracrina dove le concentrazioni localizzate dei fattori secreti sono mantenute, evitando il diretto contatto cellulare.

Abstract

Le interazioni intercellulari svolgono un ruolo importante in molti processi biologici, tra cui la progressione del tumore, le risposte immunitarie, angiogenesi e sviluppo. Paracrino o juxtacrine segnalazione media tali interazioni. L'uso di un medium condizionato e coculture studi sono i metodi più comuni di discriminare tra questi due tipi di interazioni. Tuttavia, l'effetto di localizzate elevate concentrazioni di fattori secreti nel microambiente durante le interazioni paracrine con precisione non è ricapitolata dal medium condizionato e, così, può portare a conclusioni imprecise. Per ovviare a questo problema, abbiamo messo a punto un metodo di cultura prossimale per studiare segnalazione paracrina. I due tipi cellulari sono coltivati su entrambe le superfici di una membrana di policarbonato spessore µm 10 con 0,4 µm pori. I pori consentono lo scambio di fattori secreti e, allo stesso tempo, inibiscono la segnalazione di juxtacrine. Le cellule possono essere raccolte e lisate sull'endpoint per determinare gli effetti della segnalazione di paracrine. Oltre a consentire per gradienti di concentrazione localizzate di fattori secreti, questo metodo è favorevole agli esperimenti che coinvolgono periodi prolungati di cultura, così come l'uso di inibitori. Mentre usiamo questo metodo per studiare le interazioni tra cellule tumorali ovariche e le cellule mesoteliali che incontrano nel sito di metastasi, può essere adattato a qualsiasi due tipi di cellule aderenti per i ricercatori a studiare paracrine segnalazione in vari campi, compreso lo sviluppo, immunologia e microambiente tumorale.

Introduction

Il ruolo di produttivi interazioni reciproche tra cellule tumorali e del microambiente tumorale nella progressione del tumore è stata ben stabilito ed è diventato degli obiettivi principali della ricerca nel cancro biologia1. Casi simili di segnalazione bidirezionale sono cruciali durante la guarigione delle ferite, le risposte immunitarie, angiogenesi, nicchie di cellule staminali e durante lo sviluppo2,3,4,5,6 , 7 , 8. un tema comune a tutti questi processi biologici è che le cellule rispondono in vari modi a segnali extracellulari da loro microambiente che determinano il destino delle cellule, la fisiologia del tessuto e progressione della malattia. Pertanto, la messa a fuoco, diventato sempre più verso lo sviluppo di una migliore comprensione dei meccanismi coinvolti in tali comunicazioni cellula-cellula. Una maggioranza di tali interazioni coinvolgono paracrine o juxtacrine segnalazione tra le cellule. Segnalazione di paracrine coinvolge la secrezione di fattori di segnalazione specifici da una cella che sono percepiti da recettori corrispondenti su un'altra cella nelle vicinanze, innescando una risposta in esso9,10, mentre juxtacrine segnalazione richiede un contatto diretto tra componenti cellulari delle due cellule coinvolte11,12.

Tale segnalazione è una componente fondamentale nell'omeostasi del tessuto, così come nel microambiente tumorale. Le cellule tumorali beneficiano di fattori paracrini e juxtacrine dalle cellule nello stroma del tumore, compreso cancro-collegati di fibroblasti (CAFs), cellule immunitarie e adipociti13,14,15,16. Il paracrine segnalazione può essere mediata da citochine, chemochine, fattori di crescita, ecc., mentre la segnalazione di juxtacrine coinvolge giustapposti ligandi e recettori come tacca di segnalazione, o interazioni tra integrine e delle loro rispettive proteine della matrice extracellulare. Abbiamo dimostrato l'importanza delle interazioni reciproche tra cellule tumorali ovariche e CAFs, progressione e la metastasi del tumore14. Allo stesso modo, le interazioni delle cellule di carcinoma ovarico metastatico con le cellule mesoteliali che copre il sito delle metastasi regolano chiavi microRNA e fattori di trascrizione nelle cellule tumorali che promuovono la colonizzazione metastatica17, 18.

Maggior parte degli studi sulla segnalazione di paracrine implicano l'uso di un raccolto da tipo una cella per trattare il secondo tipo di cella con il medium condizionato. Mentre questo approccio è stato ampiamente utilizzato, non vengono replicate in modo efficace i livelli di alta concentrazione localizzati del fattore secernuto nel microambiente della cellula ricevente. Inoltre non riesce a riprodurre la cinetica del flusso continuo del fattore secreto prodotto da una cellula e ricevuto dalla cella vicina. Paracrino segnalazione è efficace su brevi distanze in quanto i fattori secreti sono alle concentrazioni necessarie solo in prossimità della cella di origine e tendono a diffondere e diluire fuori come la distanza aumenta. Questa alta concentrazione localizzata di fattore secernuto è essenziale per innescare una reazione nella cella del ricevitore. Inoltre, la risposta nelle cellule del destinatario è anche dipenda l'equilibrio dei fattori appena secrete e loro svuotamento continuo attraverso la degradazione, l'associazione e interiorizzazione nella cellule recettive e diffusione dalla cella di origine. Il medium condizionato può essere concentrato sul conto per le più alte concentrazioni localizzate presenti nel microambiente, ma che non può replicare con precisione l'esatta concentrazione. Inoltre, esso non può simulare la cinetica naturale della produzione e lo svuotamento del fattore coinvolto. Per maggiore precisione replicare segnalazione paracrina e separarla da juxtacrine meccanismi di segnalazione, abbiamo messo a punto un metodo novello cultura prossimale, che coinvolge coltivare due tipi cellulari su entrambe le superfici di una membrana porosa. I pori sono abbastanza piccoli per evitare interazioni juxtacrine e ancora permettere lo scambio di fattori secreti alle alte concentrazioni localizzate. In questo modo, questo sistema mantiene la cinetica di produzione e lo svuotamento dei fattori paracrini.

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Protocol

Il protocollo segue le linee guida del Consiglio normativo istituzionale dell'Università Indiana.

1. cella preparazione

  1. Isolamento e coltura di cellule mesoteliali primarie umane
    1. Cellule mesoteliali primarie umane isolate (HPMCs) dall'omento umano come descritto in precedenza17,18 e farle crescere in completano crescita medio [dell'Aquila per volta di Dulbecco Medium (DMEM) contenente 10% di siero fetale bovino, 1% penicillina-streptomicina, gli aminoacidi non essenziali di 1% e 1% vitamine] a 37 ° C e 5% CO2.
      Nota: I HPMCs sono in genere cresciuta fino a 100% confluenza (Figura 1A).
  2. Condizioni di crescita delle cellule tumorali ovariche
    1. Crescere le cellule tumorali ovariche HeyA8 nel mezzo di crescita completa a 37 ° C e 5% CO2.
      Nota: Uso HeyA8 cellule coltivate a circa 80% confluenza (Figura 1B).

2. coltura cellulare

  1. Set-up cultura prossimale
    1. Uso Transwell inserti per piastre da 6 pozzetti con una membrana di 10 μm di spessore del tessuto-cultura-trattati in policarbonato con 0,4 μm pori (108 pori/cm2) e una zona di crescita di 4,67 cm2 . Se necessario, ottimizzare per diverse misure ridimensionando il numero delle cellule seminate secondo l'area di superficie di crescita. Medium di crescita completa calda, tripsina e tampone fosfato salino (PBS) a 37 ° C prima dell'uso.
  2. Preparare gli inserti
    1. Per le cellule di HeyA8 sulla superficie inferiore della membrana dell'inserto del seme, rimuovere l'inserto dalla confezione usando pinze sterili e posizionarlo invertito in una piastra di coltura sterile cm 15.
    2. Utilizzare un piatto di 15 cm, come ha la profondità di ospitare l'inserto invertito, o sostituirlo con qualsiasi contenitore sterile appropriato. A seconda dell'esperimento, è necessario inserire il numero desiderato di inserti nel piatto 15 cm.
    3. Etichetta di conseguenza i tre controlli e tre condizioni sperimentali con un pennarello sul bordo degli inserti.
  3. Preparare le cellule tumorali
    1. Tripsinizzano le cellule di HeyA8 cresciute alla confluenza di 80% in un pallone da2 di 25 cm (~ 2 x 106 cellule), aggiungere 1 mL di tripsina (0,25%) per 40-60 s e neutralizzare la tripsina con 6 mL di medium di crescita completa.
    2. Centrifugare le cellule a 500 x g a temperatura ambiente (TA) per 3 min, eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 5 mL di terreno di crescita completa. Contare le celle dal vivo utilizzando il metodo di esclusione del colorante blu di trypan.
  4. Semina le cellule tumorali
    1. Sospendere 100.000 cellule/mL di cellule vive HeyA8 nel mezzo di crescita completa. Attentamente seme 80.000 HeyA8 cellule sospese in 800 μL di medium di crescita completa sul fondo dell'inserto (che è ora rivolto verso l'alto, poiché esso è invertito).
    2. Seme le cellule per formare una forma a cupola, così le cellule rimangono sull'inserto (Figura 1). Iniziare dal centro della membrana e spostare verso l'esterno in cerchi concentrici, mentre lentamente il pipettaggio. Evitare di andare più di 3 mm dal bordo per impedire qualsiasi fuoriuscita del mezzo.
      Nota: Il numero delle cellule seminate dipenderà il tasso di crescita delle cellule e la durata dell'esperimento. Il numero di cellule HeyA8 seminato per questa cultura prossimale sono stato ottimizzato e le cellule sarà 80 – 90% confluenti alla fine del terzo giorno.
  5. Collegamento delle cellule di cancro
    1. Coprire il piatto di 15cm e spostare con cautela il piatto contenente gli inserti per l'incubatrice di CO2 . È fondamentale per non disturbare la goccia di medium e cellule sull'inserto in questa fase. Lasciare le cellule a 37 ° C per 4 h per consentire le cellule tumorali di allegare all'inserto.
  6. Preparare le cellule mesoteliali
    1. Dopo circa 4 h, tripsinizzano la HPMCs cresciuta alla confluenza del 100% in un pallone da2 cm 75 (~ 4 x 106 cellule) con 2 mL di tripsina (0,25%) per 1 – 2 min e neutralizzare la tripsina con 12 mL di medium di crescita completa.
    2. Centrifugare le cellule a 500 x g per 3 min a RT, risospendere il pellet cellulare in 10 mL di medium di crescita completa e contare le celle dal vivo utilizzando il metodo di esclusione del colorante blu di trypan.
  7. Semina le cellule mesoteliali
    1. Sospendere 300.000 cellule/mL di HPMCs live nel mezzo di crescita completa. Aggiungere 2,5 mL di mezzi freschi di sviluppo completo in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Attentamente e portare il piatto di 15cm contenente gli inserti fuori alla cappa di biosicurezza. Utilizzando pinze sterili, capovolgere l'inserto e posizionarlo nel pozzetto della piastra 6 pozzetti in modo che è in posizione verticale, con le cellule di HeyA8 attaccate alla superficie inferiore immersa nel mezzo di crescita completa (Figura 1).
    2. HPMCs seme 450.000 sospeso in 1,5 mL di terreno di crescita all'interno degli inserti con le cellule di HeyA8 attaccate alla superficie rivolta verso la parte inferiore del pozzo (Figura 1) o agli inserti senza eventuali cellule di HeyA8 per i controlli HPMC. Aggiungere 1,5 mL di terreno di coltura senza cellule ai controlli HeyA8.
  8. Cresce la cultura prossimale
    1. Lasciate che la cultura prossimale crescere nell'incubatore CO2 a 37 ° C e 5% CO2 per 72 h. Se necessario, le medie possono essere ricostituite come segue.
      1. Per l'interno dell'inserto, rimuovere µ l 750 e 750 µ l di terreno di coltura fresco completo.
      2. Per l'esterno dell'inserto (la piastra 6 pozzetti), prelevare 1 mL e aggiungere 1 mL di terreno di coltura fresco completo. 1 mL è stato scelto per la comodità di cambiare il mezzo in un unico passaggio. Se lo si desidera, 1,25 mL può essere rimosso e sostituito invece.
  9. Raccogliendo le cellule
    1. Raccogliere le cellule dopo 72 h della cultura prossimale. Faccia particolare attenzione in questa fase per evitare contaminazioni delle cellule HeyA8 e HPMCs. Trypsinize le cellule, centrifugare li e lisare il pellet invece di fare l'elettrolisi le cellule sulla membrana per evitare una contaminazione incrociata.
  10. Trypsinizing le cellule
    1. Risciacquare entrambi i lati dell'inserto con PBS 1X.
    2. Trasferire gli inserti per un nuovo pozzo e aggiungere tripsina. Aggiungere 0,5 mL di tripsina all'interno dell'inserto e aggiungere 2 mL di tripsina alla piastra 6 pozzetti per tripsinizzano le cellule tumorali fissate alla superficie inferiore dell'inserto. Incubare la piastra per 2 min a 37 ° C.
  11. Neutralizzare la tripsina
    1. Aggiungere 1 mL di medium di crescita completa all'interno dell'inserto per neutralizzare la tripsina, pipettare su e giù e poi prendere le cellule e trasferirli in una provetta di raccolta contrassegnati. Aggiungere un ulteriore 2 mL di medium di crescita completa per una completa neutralizzazione. Dovrebbe prestare attenzione a non forare la membrana durante il pipettaggio per evitare una contaminazione incrociata delle cellule.
    2. Per raccogliere le cellule sul fondo dell'inserto, dispensare la tripsina 2 mL che è stato aggiunto nel passaggio 12.2 sulla superficie inferiore 2 – 3 x affinché le cellule cadono nella parte inferiore della piastra 6 pozzetti. Neutralizzare la tripsina sul fondo del piatto con 6 mL di terreno di coltura e trasferire il contenuto della piastra in una provetta di raccolta contrassegnati.
  12. Raccolta e la lisi delle cellule
    1. Centrifugare le cellule a 500 x g per 3 min e aspirare i media. Risospendere e lisare il pellet cellulare con 0,7 mL di fenolo e guanidina tiocianato-basati - reagente di lisi per l'estrazione di RNA. Isolare il RNA usando qualsiasi kit adatto.

3. quantitativa Real-Time Polymerase Chain Reaction

Nota: I passaggi seguenti descrivono una reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qPCR) per studiare i cambiamenti di espressioni del gene come risultato la cultura prossimale.

  1. Preparare cDNA da campioni di RNA per qPCR. Utilizzare qualsiasi adatto della trascrittasi inversa con un buffer corrispondente e casuale primer per assicurare la trascrizione inversa di tutti gli mRNA (Vedi Tabella materiali).
  2. Valutare i cambiamenti nei livelli di espressione di mRNA di fibronectina (FN1) ed E-caderina (CDH1) e trasformare il fattore di crescita beta 1 (TGFβ1) da qPCR con gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) come controllo interno. È possibile utilizzare standardizzato analisi di espressione genica disponibili in commercio (Vedi Tabella materiali) o per disegnare primers.
  3. Confrontare le cellule HeyA8 in coltura prossimale con HPMCs con i controlli di HeyA8 e il HPMCs in coltura prossimale con i controlli HPMC.

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Representative Results

Le cellule di cancro ovarico metastatico ritrovarvi con cellule mesoteliali presso il sito di metastasi all'interno della cavità peritoneale19. Interazioni paracrine e juxtacrine produttive con l'aiuto di cellule mesoteliali nell'indurre risposte adattative nelle cellule del cancro ovarico, che consentono di riuscita metastasi17,18,20,21 . Per testare l'efficacia del metodo cultura prossimale, abbiamo testato le interazioni paracrine tra cellule tumorali ovariche HeyA8 e HPMCs. Precedentemente è stato segnalato che un coculture delle cellule HeyA8 con HPMCs si traduce in un incremento dell'espressione di fibronectina nel HPMCs21. Questa induzione dell'espressione di fibronectina è mediata da un'aumentata secrezione di TGFβ da cellule HeyA821. Di conseguenza, abbiamo verificato l'effetto di una cultura prossimale delle cellule HeyA8 e HPMCs sui livelli di mRNA di fibronectina e TGFβ in entrambe queste cellule. Come previsto, prossimale coltura con le cellule HeyA8 ha provocato un incremento dell'espressione di fibronectina in HPMCs rispetto ai controlli che sono stati seminati su inserti senza HeyA8 cellule attaccate alla superficie inferiore (Figura 2A). Allo stesso modo, la cultura prossimale del HPMCs con HeyA8 cellule ha provocate un'espressione aumentata del TGFβ nel primo caso (Figura 2B). L'espressione di fibronectina e di TGFβ anche significativamente aumentata in cellule HeyA8, sulla cultura prossimale con HPMCs rispetto ai comandi, dove HPMCs non sono state seminate sulla superficie superiore degli inserti (Figura 2 e 2D).

Per confrontare l'effetto del classico approccio media condizionato, abbiamo effettuato un esperimento trattando le cellule HeyA8 con un mezzo di HPMC-condizionati. C'era una diminuzione nell'espressione di fibronectina e un cambiamento significativo del TGFβ in HeyA8 cellule trattate con il mezzo di HPMC-condizionati. (Figura 3A e 3B). Abbiamo provato anche il potenziale di bloccare il TGFβ secreto con un anticorpo neutralizzante nella cultura prossimale. Trattamento con l'anticorpo neutralizzante TGFβ ha provocato una diminuzione significativa nell'induzione del TGFβ nelle cellule HeyA8 nella cultura prossimale con HPMCs (Figura 3). Tuttavia, l'anticorpo neutralizzante TGFβ leggermente aumentato l'espressione del TGFβ nelle cellule del controllo HeyA8, probabilmente come una risposta compensativa (Figura 3).

Inoltre, abbiamo anche testato l'effetto della cultura prossimale sui livelli di espressione del marcatore epiteliale E-caderina. Mentre la cultura prossimale con HeyA8 cellule leggermente aumentato l'espressione di E-caderina in HPMCs (Figura 2E), una profonda diminuzione nell'E-caderina è stata osservata in cellule di HeyA8 sviluppate in prossimità del HPMCs rispetto ai comandi (Figura 2F). Presi insieme, questi risultati dimostrano l'efficacia del sistema cultura prossimale nello studiare il paracrine segnalazione tra cellule tumorali ovariche e le cellule normali presso il sito di metastasi che influenzano l'espressione genica in entrambi i tipi cellulari durante il processo di colonizzazione metastatica.

Figure 1
Figura 1: montaggio del sistema prossimale cultura. (A), questo pannello spettacoli umano cellule mesoteliali primarie (HPMCs). (B), questo pannello mostra cellule tumorali ovariche HeyA8. Scala bar = 200 µm (A-B). HeyA8 (C) le cellule sono state seminate sull'intradosso di un transwell inserire con 0,4 µm pori. Una volta che le cellule sono state fissate, l'inserto è stato disposto in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti contenenti terreno di coltura. Cellule mesoteliali sono state seminate nell'inserto del modo che attaccato alla superficie superiore e sono stati separati dalle cellule HeyA8 dalla membrana. I 0,4 µm pori nella membrana ha permesso lo scambio di secreti fattori ma ha inibito qualsiasi contatto diretto tra le cellule. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: effetto della cultura prossimale sull'espressione del mRNA. La presentazione di primi due pannelli la qPCR per la fibronectina (A) e (B) TGFβ1 espressione nelle cellule mesoteliali primarie umane (HPMCs) coltivate prossimalmente a cellule HeyA8, rispetto al controllo HPMCs. Lo spettacolo di due pannelli la qPCR per fibronectina (C) e (D) TGFβ1 espressione in cellule HeyA8 coltivate prossimalmente a HPMCs, rispetto al controllo Heya8 cellule. Le ultime due pannelli mostrano la qPCR per l'espressione di E-caderina nella (E) HPMCs prossimalmente in coltura delle cellule HeyA8 e (F) HeyA8 cellule coltivate prossimalmente a HPMCs. N = 3, * p < 0.01. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard delle tre ripetizioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: effetto di umano primario delle cellule mesoteliali (HPMC)-condizionata trattamento medio sull'espressione di mRNA delle cellule di HeyA8. I due pannelli superiori Visualizza la qPCR per la fibronectina (A) e (B) TGFβ1 espressione in cellule di HeyA8. (C), questo ultimo pannello mostra l'effetto di inibizione TGFβ1 secrete con un anticorpo neutralizzante (TGFβ1 Ab) sull'espressione HeyA8 TGFβ1 su una cultura prossimale con HPMCs. N = 3, * p < 0.01. p < 0.05. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard delle tre ripetizioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

La comprensione del meccanismo di paracrine e juxtacrine segnalazione tra cellule è essenziale per lo sviluppo di una migliore conoscenza del tessuto normale omeostasi e malattia condizioni7,8. Maggior parte paracrine studi vengono condotti attraverso la raccolta di segnalazione condizionata medio da una cella tipo e usarlo per trattare l'altro tipo di cellula. Questo metodo ha un vantaggio nella sua intrinseca semplicità. Tuttavia, esso non accuratamente ricapitolano le concentrazioni localizzate dei fattori secreti nel microambiente cellulare o la cinetica di produzione e lo svuotamento dei fattori coinvolti. Mentre i primi possono essere affrontati in una certa misura, anche se non precisamente, concentrando il medium condizionato, è molto difficile da ricreare la cinetica. L'uso di inserti di transwell a crescere cellule nell'inserto e nella parte inferiore del pozzo può, in qualche misura, riconquistare gli effetti della cinetica di produzione e di svuotamento. Tuttavia, le cellule sono separate dalla distanza tra l'inserto e il fondo del pozzo e, quindi, non è possibile ricreare le concentrazioni localizzate dei fattori paracrini. Abbiamo segnalato lo sviluppo di un metodo di semplice cultura prossimale per studiare segnalazione paracrina reciproco, che ha mantenuto le alte concentrazioni localizzate dei fattori secreti, così come la dinamica del tasso di produzione e lo svuotamento dei fattori.

In uno studio di prova-de-principio, abbiamo dimostrato l'efficacia del metodo cultura prossimale nel riprodurre gli effetti riferiti delle interazioni tra cellule tumorali ovariche e HPMCs. Inoltre, abbiamo anche mostrato gli effetti opposti di paracrine reciproche interazioni sull'espressione del marcatore epiteliale E-caderina in cellule di HeyA8 e HPMCs. Mentre il nostro esperimento ha coinvolto coltivando le cellule in un periodo di 3 giorni, può essere adattato a più brevi o più lunghi intervalli di tempo regolando il numero iniziale delle cellule seminate. Questo consente ai ricercatori di studiare gli effetti a breve termine, così come a lungo termine della segnalazione di paracrine o effettuare studi di tempo-corso. Questo semplice metodo può essere applicato potenzialmente a qualsiasi ricerca su paracrine segnalazione tra due tipi di cellule aderenti, tra cui l'immunologia, l'angiogenesi, lo sviluppo delle cellule e delle ferite, oltre agli studi sul microambiente tumorale.

I passaggi critici di questo metodo sono semina le cellule sulla superficie inferiore della membrana e la raccolta le cellule da entrambe le superfici all'endpoint. Abbiamo raggiunto una semina sulla superficie inferiore di prima lanciando l'inserto e poi semina le cellule come una grande goccia di medie. La cella più aderente dei due studiato dovrebbe essere seminata sulla superficie inferiore. Cura deve essere presa per non disturbare l'inserto durante l'incubazione per evitare questo blob di mezzo da interrompere. Gel di silicone può essere applicato ai bordi dell'inserto per evitare l'irruzione e la fuoriuscita della bolla di liquido. Alla fine dell'esperimento cultura prossimale, le cellule su entrambi i lati della membrana sono in sequenza tripsinizzate anziché lisate direttamente, perché li Lisi sulla membrana rischi cross-contaminazione dei lisati attraverso i pori. Li trypsinizing nei propri scomparti individuali e avendo cura che il volume medio e tripsina mai supera l'importo stabilito del protocollo, di evitare qualsiasi contaminazione. Ogni tipo di cellula è raccolti in un tubo separato, centrifugato, e il pellet cellulare è poi lisato.

Sebbene questa tecnica permette lo studio efficace delle interazioni paracrine, evitando interazioni dirette evidenti, non possiamo escludere interazioni tramite tunneling nanotubuli (TNTs). Alcuni di questi TNTs possono essere abbastanza stretto per passare attraverso i pori 0,4 µm e abbastanza a lungo per coprire i 10 µm spessore della membrana. Mentre i nostri tentativi di verificare la loro presenza nei pori mediante microscopia confocale erano inconcludenti (dati non mostrati), microscopia elettronica potenzialmente potrebbe essere impiegata per confermare la loro presenza. Pertanto, questo metodo non esclude la comunicazione cellula-cellula potenziale attraverso TNTs se le cellule di candidati sono in grado di formarli e interagire attraverso di loro. Allo stesso modo, non possiamo escludere autocrino aumentata segnalazione come risultato il potenziale blocco dei pori dalle cellule su entrambi i lati della membrana, prevenire croce-diffusione.

Crescita delle cellule su entrambe le superfici di una membrana con 0,4 µm pori consente inoltre lo scambio potenziale di esosomi. Esosomi sono stati tradizionalmente considerati come sacchi di immondizia delle cellule, ma la ricerca recente ha indicato che queste vescicole con il loro carico di proteine, microRNA e persino i mRNAs e DNA fungono da mediatori importanti di paracrine comunicazioni cellulari22 , 23 , 24. Pertanto, il metodo di cultura prossimale può essere efficacemente utilizzato per studiare comunicazione cellulare attraverso esosomi. Inoltre, questo metodo è favorevole al trattamento con inibitori specifici degli anticorpi neutralizzanti o segnalazione contro il ligando secreta o recettore corrispondente. In sintesi, abbiamo segnalato lo sviluppo di un metodo di coltura prossimale semplice e versatile, che può riprodurre accuratamente paracrine segnalazione evitando interazioni dirette fra le cellule. La semplicità di questo metodo consente la sua applicazione diffusa in diversi campi come la biologia del cancro, sviluppo e immunologia.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Siamo grati ai pazienti per la loro partecipazione nella raccolta di tessuto per questi esperimenti. Un DoD OCRP ovarica cancro Academy Award (W81XWH-15-0253) e un pilota premio di Colleen Dream Foundation a Anirban K. Mitra supportato questa ricerca.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 mm Transwell permeable support with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert Corning (Costar) 3412 • 10 µm thick translucent polycarbonate membrane
• Treated for optimal cell attachment
• Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case
• Membrane must be stained for cell visibility
• Sterilized by gamma radiation
6 well plate Corning (Falcon) 353046 Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid
15 cm culture dish Corning (Falcon) 353025 Sterile, TC-treated Cell Culture Dish
DMEM Corning (Cellgro) 10-013-CV
Penicillin Streptomycin Corning 30-002-CI
MEM Nonessential amino acids Corning (Cellgro) 25-025-CI
MEM Vitamins Corning (Cellgro) 25-020-CI
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA Corning 25-053-CI
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals S11150
Pipets Any make is fine
CO2 Incubator Any make is fine
Biosafety level II cabinet Any make is fine
FN1 TaqMan Gene Expression Assay ThermoFisher Scientific Hs01549976_m1
TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay ThermoFisher Scientific Hs00998133_m1
CDH1 TaqMan Gene Expression Assay ThermoFisher Scientific Hs01023895_m1
GAPDH TaqMan Gene Expression Assay ThermoFisher Scientific Hs99999905_m1
miRNeasy mini RNA isolation Kit Qiagen 217004
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit ThermoFisher Scientific 43-688-13
HeyA8 ovarian cancer cells Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago
TGFβ Neutralizing Antibody R&D Systems MAB1835-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologia problema 138 segnalazione di Paracrine secreto medium condizionato fattore microambiente recettore ligando esosomi
Un metodo di coltura prossimale per studiare segnalazione paracrina tra celle
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Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., … More

Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells. J. Vis. Exp. (138), e58144, doi:10.3791/58144 (2018).

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